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Instrumentelle Bioanalytik in der Molekularbiologie Anke Neumann Platzhalter für Bild KIT die Kooperation von Forschungszentrum Karlsruhe GmbH und Universität Karlsruhe (TH) www.kit.edu

Motivation und Ziel Ziel: Verstehen wie DNA und RNA untersucht werden, wie aus Sequenzdaten Genome werden und was zum Verständnis einer Genomsequenz beiträgt Motivation: Große Anzahl sequenzierter Genome Das menschliche Genom ist sequenziert 2

Analytik in der Molekularbiologie I. In-vitro-Methoden th II. In-vivo-Methoden III. In-silico-Methoden 3

Analytik in der Molekularbiologie 1. In-vitro-Methoden Behandlung von DNA und RNA mit Enzymen PCR Sequenzierungsmethoden DNA- Mikroarrays 2. In-vivo-Methoden Transformation Heterologe Produktion von Proteinen Untersuchung der intrazellulären Lokalisation und der Wechselwirkung von Proteinen Analyse von Genfunktionen 3. In-silico-Methoden Datenbanken und Genbanken Werkzeuge 4

1. In-vitro-Methoden Behandlung von DNA und RNA mit Enzymen Reinigung von Nucleinsäuren Gelelektrophorese Restriktionsendonucleasen Ligasen Polymerasen und Reverse Transkriptasen PCR PCR Quantitative PCR RT-PCR Sequenzierungsmethoden Sanger Sequenzierung Pyrosequenzierung 454 Sequenzierung Hybridisierung DNA- Mikroarrays 5

Reinigung von Nukleinsäuren: Methode abhängig von Art der Zelle und Art der aufzureinigenden Nukleinsäure. Zellaufschluss mit Detergenz-haltigen, gepufferten Lösungen Denaturieren der Proteine durch organische Lösungsmittel (z.b. Phenol / Chloroform / Isoamylakohol im Verhältnis 25/24/1) 6

7 Reinigung von Plasmid-DNA:

Reinigung von Nukleinsäuren: Gelfiltration: große DNA Moleküle eluieren im Ausschlussvolumen des Säulen- materials und werden so von niedermolekularen Verunreinigungen getrennt 8

Reinigung von Nukleinsäuren: Ethanolpräzipitation der Nucleinsäure: In Gegenwart monovalenter Kationen bildet die DNA bzw. RNA mit Ethanol (3-faches Volumen) einen unlöslichen Niederschlag. Natriumacetat, Ammoniumacetat oder Lithiumchlorid je nach Anwendung 9

Konzentrationsbestimung von Nukleinsäuren 1 OD 260 entspricht 50 µg/ml doppelsträngiger DNA 40 µg/ml einzelsträngiger DNA 33 µg /ml einzelsträngiger RNA Die Olegonucleotidkonzentration kann über Annäherungswerte oder -bei bekannter Sequenz- aus der Summe der molaren Absorptionskoeffizienten der Basen des Oligonucleotids berechnet werden. Ideal sind Nanodrop Photometer. Hier reichen 2 µl Probe aus 10

Gelelektrophorese o o o o Als analytisches Instrument, um den Erfolg von Reaktionen zu untersuchen, bei denen sich die Größe von Nuklein- säuren ändert, oder bei denen Nuklein- säuren synthetisiert werden. Als präparatives Mittel, um aus einem Gemisch von Nucleinsäuremolekülen ein bestimmtes Molekül zu isolieren Bei der DNA-Sequenzierung Dient zur Größenauftrennung als erster Schritt bei der Analyse von komplexen Nucleinsäuregemischen 11 Text aus Munk, Taschenlehrbuch Biologie Genetik Bild von http://www.uni-saarland.de/fak8/wenz/ausstattung/gelelektrophorese.jpg

Gelelektrophorese Färbung mit Ethidiumbromid, Nachweis von 10-20 ng DNA, Färbung mit Silber Nachweis von bis zu 0,03 ng pro mm 2 12 Bild von http://www.dfg.de/zentralablage/bildversionen/bildversionen_458x344/gelelektroph orese_380_gro 2.jpg

13 Gelelektrophorese

14 Gelelektrophorese

Formen der Gelelektrophorese o o o o o o Agarosegele in verschiedenen Konzentrationen 0,3 % bis 2,0 %(w/v) zur Auftrennung linearer doppelsträngiger DNA-Fagmente (kb) 5-60 kb bis 0,1-2 kb Polyacrylamidgele (PAGE) für eine bessere Auftrennung im Bereich unter 1 kb Nicht denaturierende PAGE zur Analyse von DNA-Protein-Komplexen (mobility shift) Native PAGE von Einzelstrang DNA zur Analyse von Sequenzunterschieden bei gleichen Fragmentlängen (SSCP) Denaturierende PAGE von einzelsträngiger DNA oder RNA. Trennung von Molekülen die sich in der Länge nur um ein Nucleotid unterscheiden ist möglich. Anwendung bei Sequenzierung und DNA-fingerprinting Analyse von RNA in denaturierenden Agarosegelen (z.b. Formaldehyd) wegen Sekundärstrukturen. 15

Formen der Gelelektrophorese o Pulsfeldgelelektrophorese: Hochmolekulare Nukleinsäuren können durch konventionelle Gelelektrophorese nicht mehr aufgetrennt werden. Sie besitzen alle die gleiche, so genannte limitierende Mobilität. 16

Restriktion Restriktionsendonucleasen o o o o Wurden in der Evolution von Mikroorganismen zur Abwehr von fremder DNA entwickelt. Spalten (hydrolisieren) doppelsträngige DNA an spezifischen Erkennungsstellen (sequenzspezifisch). Finden Anwendung in der Restriktionsanalyse Werden bei Klonierungen eingesetzt t 17 Bild: http://www.nibis.de/~niff/material/bild/schule/original/schere.jpg

Restriktion Typ II Restriktionsendonucleasen schneiden innerhalb der Erkennungssequenz 18

Ligation o o o Ligasen sind Enzyme die zwei DNA-Fragmente kovalent verbinden. Sie benötigen dazu ein 3`OH und ein 5`-Phosphat. Anwendung bei Klonierungen. Hier wird ein Vektor(ein aufgeschnittenes Plasmid) mit einem DNA-Fragment ligiert. Vorraussetzung ist, dass die DNA-Fragmente entweder mit dem gleichen Restriktionsenzym erzeugt wurden, oder dass sie glatte Enden haben. 19 Bild: http://www.baayaa.de/media/catalog/product/cache/1/image/9df78eab33525d08d6e5fb8d2713 6e95/p/v/pvc-kleber.jpg

Polymerasen und Reverse Transkriptasen Polymerasen : Enzyme, die anhand einer Matritze den Komplementärstrang synthetisieren. Es gibt DNA-abhängige DNA-Polymerasen, DNA-abhängige RNA-Polymerasen, RNA-abhängige DNA-Polymerasen (reverse Transkriptasen) und RNA-abhängige RNA-Polymerasen. 20 http://www.taz.de/uploads/images/684x342/abschreiber.jpg

Polymerasekettenreaktion PCR Methode zur spezifischen Amplifikation beliebiger DNA- Sequenzen. Exponentielle Vermehrung, daher sehr geringe Matritzenmenge nötig. Verschiedene Anwendungen 21

22 PCR

Real-Time PCR Variation der PCR, bei der die Produktmenge nach jedem Synthesezyklus quantifiziert i t wird. Grundlage ist die Integration einer Fluoreszenzanregungs- und Messeinheit in ein PCR Gerät. Es gibt verschiedene Methoden, wie die Zunahme der PCR-Produktmenge zu einer Zunahme der Fluoreszenz führt. In der einfachsten Form wird ein Fluoreszenzfarbstoff in die PCR gegeben, der doppelsträngige DNA bindet und in der gebundenen Form stärker fluoresziert als in der Lösung 23 http://www.roche-applied-science.com/publications/print_mat/lc_480_real_time_pcr_system.pdf

Real-Time PCR 24 http://www.roche-applied-science.com/publications/print_mat/lc_480_real_time_pcr_system.pdf

Reverse Transkriptions PCR (RT-PCR) Kombination von Reverser Transkription und PCR. 1. Schritt: RNA-Abhängige Abhängige DNA-Polymerase der Retroviren wird benutzt um in vitro RNA in DNA, sogenannte cdna umzuwandeln. Ansatz: RNA + ein Primer + dntps +Re Reverse ersetranskriptase cdna 2. Schritt: cdna wird als Template in der PCR benutzt Die Kombination von Reverser Transkription und Real-Time-PCR ermöglicht die Quantifizierung von Transkripten und damit die Anwendung der sogenannten qrt-pcr für Expressionsstudien 25

7b. Sequenzierung von DNA Kettenabbruchmethode nach Sanger Abbildung aus Brown S. 425 26

27 Wikipedia

28 Wikipedia DNA-Squenziergeräte

29 http://www.pyrosequencing.com/graphics/3019.pdf

30 http://www.pyrosequencing.com/graphics/3019.pdf

31 http://www.pyrosequencing.com/graphics/3019.pdf

32 http://www.pyrosequencing.com/graphics/3019.pdf

33 http://www.pyrosequencing.com/graphics/3019.pdf

34 http://www.pyrosequencing.com/graphics/3019.pdf

35 Wikipedia Chromatogramm einer Sequenzierung

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Roche Genome Sequencer FLX System Workflow http://www.youtube.com/watch?v=bfnjxkhp8jc Applied Biosystems http://www.youtube.com/watch?v=nlvyf8bfdwm 39 Screeening of Alternaria alternata strains and media for alternariol production in fluid submerse fermentation Katrin Brzonkalik 10.9.2009 KIT die Kooperation von Forschungszentrum Karlsruhe GmbH und Universität Karlsruhe (TH)

Blottingverfahren: Zur weiteren Untersuchung der durch Gelelektrophorese aufge- trennten Nukleinsäuren transferiert man die Nukleinsäuren auf eine feste Membran. Die fixierte Nukleinsäure wird durch Hybridisierung identifiziert und weiter analysiert. 40

41 Blottingverfahren

42 Hybridisierung

43 Hybridisierung

Hybridisierung Hybridisierung ist eine Nukleinsäurenachweistechnik zur gezielten Detektion und Analyse spezifischer DNA- oder RNA-Sequenzen. Sonden sind kurze Nukleinsäuren meist bekannter Sequenz, die mit einer Reihe unterschiedlicher Enzyme des Nukleinsäurestoffwechsels ( DNA-Polymerasen, RNA-Polymerase, Kinasen) markiert werden können. Die Markierung (früher Radioaktivität, heute meist Basenanaloga) muss sehr sensitiv nachzuweisen sein. Die Analyse liefert Information darüber, ob sich eine bestimmte Nucleinsäuresequenz (z.b. ein Gen) in dem untersuchten Material (z.b. dem Genom ) befindet. Basis für quantitative PCR (TaqMan und FRET) und FISH (fluorescens in situ hybridization). 44

DNA-Mikroarrays DNA-Mikroarray-Analysen haben zum Ziel, die Transkriptmenge aller Gene einer Art parallel zu bestimmen und damit das sogenannte Transkriptom zu analysieren (Transcriptional profiling). Auf einem DNA-Mikroarray sind typischer weise sämtliche Gene einer Art repräsentiert. Also für E. coli 4600 Punkte, Mensch 30 000 Punkte. Herstellung durch aufbringen von kleinsten Flüssigkeitsvolumina auf eine feste Oberfläche durch einen Roboter oder Synthese der Oligonukleotide direkt auf der Oberfläche. 45 Bild: From Wikipedia, the free encyclopedia

Transcriptional profiling of the developmental cycle of C. trachomatis serovar D in HeLa 229 cells with accompanying transmission electron microscopy of bacterial inclusions at 1, 3, 8, 16, 24, and 40 h PI. Results are shown in an array layout format that i... Belland R J et al. PNAS 2003;100:8478-8483 46 2003 by National Academy of Sciences

Analytik in der Molekularbiologie 1. In-vitro-Methoden Behandlung von DNA und RNA mit Enzymen PCR Sequenzierungsmethoden DNA- Mikroarrays 2. In-vivo-Methoden Transformation Heterologe Produktion von Proteinen Untersuchung der intrazellulären Lokalisation und der Wechselwirkung von Proteinen Analyse von Genfunktionen 3. In-silico-Methoden Datenbanken und Genbanken Werkzeuge 47

3. In-silico-Methoden Datenbanken Genomdaten Daten zur Expression von mrna Daten zur Expression von Proteinen Gehalt von Metaboliten in Zellen oder Geweben Gene Ontology will ein kontrolliertes und definiertes Vokabular zur konsistenten Beschreibung von Genen und Genprodukten entwickeln, das zu jedem Organismus s passt und in jeder Datenbank verwendet werden kann und soll. 48

3. In-silico-Methoden Datenbanken: Sammelstelle für Genfragmente aller Organismen. DDBJ (DNA Databank of Japan) www.ddbj.nig.ac.jp EMBL (The European Molecular Biology Laboratorium) http://www.embl.de/ / NCBI (National Center for Biotechnology Information USA) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 49

50 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

51 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery?te rm=lipase

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