2008 AGI-Information Management Consultants May be used for personal purporses only or by libraries associated to dandelon.com network. S. J. Morgan und D. C. Darling Kultur tierischer Zellen Aus dem Englischen übersetzt von Christof Hauck Spektrum Akademischer Verlag
Inhalt Vorwort Danksagung Abkürzungen 11 13 14 1. 1. 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2. 2.1 2.2 2.3 Grundlegende Methoden Einleitung 19 Wozu braucht man die Zellkultur? 19 Die verschiedenen Aspekte der Zellkultur 20 Sicherheitsratschläge 22 Grundlegende Vorsichtsmaßnahmen für die Arbeit mit Zellkulturen 23 24 Ausrüstung und normaler Laborbetrieb 25 Das Zellkulturlabor Autoklaven und Heißluftsterilisatoren 25 26 2.2.1 Arbeitsweise und Sicherheitsüberlegungen 26 2.2.2 2.2.3 Was läßt sich in einem Heißluftsterilisator/Autoklaven sterilisieren? Wie stellt man fest, ob der Autoklav ordnungsgemäß gearbeitet hat? 28 28 Sterile Arbeitsbänke 29 2.3.1 2.3.2 2.3.3 Die verschiedenen Bautypen und ihr Arbeitsprinzip Inbetriebnahme und Reinigung steriler Arbeitsbänke Sicherheitsaspekte, Wartung und technische 29 32 Überprüfung 32
6 Kultur tierischer Zellen 2.4 2.5 2.6 2.7 3. 3.1 3.2 3.3 3.4 4. 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 Brutschränke 2.4.1 Inkubationsbedingungen 2.4.2 Inbetriebnahme eines Gasbrutschranks 2.4.3 Tägliche Wartung und Kontrolle Zentrifugen 2.5.1 Tips zum Gebrauch der Zentrifuge Mikroskope Sterile Arbeits techniken Der sterile Bereich der Arbeitsbank Umgang mit Pipetten und Plastikpipettenspitzen Entnehmen von Medium aus einem sterilen Vorratsbehälter Sterilfilter für Einmalspritzen Ansetzen von Medien Anforderungen an Medien für die Zellkultur 4.1.1 Medienarten und Zusammensetzung 4.1.2 Serumfreie Medien 4.1.3 In welcher Form sollte man das Medium beziehen: als Pulver, Konzentrat oder gebrauchsfertige Lösung? Was benötigt man für das Ansetzen von Medien? Ansetzen von Medien aus Flüssigkonzentraten Ansetzen von Medien aus Pulver 4.4.1 Filtereinrichtungen 4.4.2 Filtermethode Autoklavierbare Medien Mediumzusätze 33 33 35 37 38 38 39 40 41 41 44 45 47 49 49 49 52 52 54 55 56 56 56 58 59 5. 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 Die Kultur permanenter Zellinien Verschiedene Arten etablierter Zellinien Vorbereitungen Beurteilung der Zellkulturen Zellzahlbestimmung 63 65 67 69 5.4.1 Vorbereitungen bei Suspensionskulturen 69 5.4.2 Vorbereiten von adhärenten Zellen 69 5.4.3 Einsatz des Haemocytometers 70 Die Subkultivierung von Zellen 73 Ermitteln einer Wachstumskurve 75 63
Inhalt 7 5.7 5.8 Produktion größerer Zellmengen 5.7.1 Rollerkulturflaschen 5.7.2 Spinnerkulturen 5.7.3 Mikrohäger 77 78 78 79 80 6. 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 7. 7.1 7.2 7.3 7.4 8. 8.1 8.2 8.3 8.4 Primärkulturen Warum eigentlich Primärzellen? Methoden der Zellisolierung Isolierung von Fibroblasten aus Hühnerembryonen Isolierung von Rattenhepatocyten Menschliche Primärzellen 6.5.1 Isolierung von Thyrocyten 6.5.2 Isolierung von Endothelzellen aus der Nabelschnur Besondere Voraussetzungen für die Kultur von Primärzellen Immortalisierung von Primärzellen Kontaminationen Verschiedene Kontaminanten in Zellkulturen Beseitigung von Kontaminationen Antimikrobielle Wirkstoffe Desinfektion mit Formaldehyd Kryokonservierung Gefrierschutzmittel Das Einfriermedium Das Einfrieren von Zellen Auftauen der Zellen 81 81 82 83 86 89 89 92 94 95 98 101 101 103 104 105 107 107 108 108 111 9. Zellkionierung 113 9.1 9.2 Klonierung durch Verdünnung 9.1.1 Mathematische Überlegungen 9.1.2 feeder-zellschicht 9.1.3 Ansetzen einer Klonierung durch 9.1.4 Klonierungseffizienz 9.1.5 Expandieren des Klons Klonierung in Weichagar 9.2.1 Hintergrund 9.2.2 Vorgehensweise Verd ünnung 113 115 115 116 118 119 119 119 120
8 Kultur tierischer Zellen 9.3 9.4 9.2.3 Expandieren des Klons 9.2.4 Alternativstrategien Ringklonierung - direktes Klonieren von Kolonien aus einer einzelnen Petrischale 125 126 127 129 11. 10. 10.1 10.2 10.3 10.4 11. 11.1 11.2 11.3 11.4 11.5 11.6 12. 12.1 12.2 Weiterführende Techniken und Anwendungen Isolierung von Lymphocyten und Richtlinien zur Etablierung von Lymphzellinien Isolierung von Lymphocyten 10.1.1 Isolierung aus menschlichem Blut 10.1.2 Lymphocyten aus Tonsillen des Menschen 10.1.3 Mauslymphocyten aus der Milz 10.1.4 Mauslymphocyten aus Thymus und Lymphknoten Anreicherung von T- und B-Zellen 10.2.1 Anreicherung von B-Zellen des Menschen 10.2.2 Anreicherung von T-Zellen 10.2.3 Andere Selektionsmethoden Kultivierung von Lymphzellinien 10.3.1 T-Zellinien 10.3.2 Test auf Spezifität 10.3.3 Klonierung der Lymphzellinien Zellfusion Ziele und Anwendungen Zellen, die sich als Fusionspartner eignen Fusion der Zellen 11.3.1 Vorbereiten der Fusion 11.3.2 Die Fusion 11.3.3 Kultur der Fusionsansätze Untersuchung des Wachstums der Hybride Expansion und Klonierung der Hybride Cytotoxizitätstests Killerzellen Voraussetzungen für Cytotoxizitätstests 133 134 134 137 137 138 138 139 140 143 143 144 147 149 15 1 153 153 156 157 157 159 161 162 163 164 167 167 168
Inhalt 9 12.3 12.4 12.5 12.6 12.7 13. 13.1 13.2 13.3 13.4 13.5 14. 14.1 14.2 14.3 14.4 14.5 Vorbereitung der Effektorzellen Vorbereitung der Zielzellinien Der Cytotoxizitätstest Interpretation der Ergebnisse Immortalisierung mit dem Epstein-Barr-Virus Vorbereitung des Virus Bestimmung des Virentiters Immortalisierung menschlicher Lymphocyten Klonierung Transfektion Grundlagen und Ziele 14.1.1 Die Herkunft der DNA 14.1.2 Wie kann sich Fremd-DNA in einer kultivierten Zelle replizieren? 14.1.3 Identifizierung transfizierter Zellen 14.1.4 Einsatz transfizierter Zellen Transfektion adhärenter Zellen 14.2.1 Auswahl der Methoden und Materialien 14.2.2 Calciumphosphat-Copräzipitation Transfektion von nichtadhärenten Zellen mit Retrovirusvektoren 14.3.1 Eigenschaften von Retroviren 14.3.2 Konstruktion von Vektoren 14.3.3 Auswahl der Methoden und Materialien 14.3.4 Abnehmen von Kulturüberstand der Produzentenzellen 14.3.5 Infektion der Zielzellen Alternative Transfektionsmethoden 169 172 174 175 176 177 178 1 ao iai 182 184 185 185 185 189 190 191 192 192 193 197 197 198 199 20 1 20 1 203 205 Anhang A: Glossar Anhang B: Nützliche Adressen Anhang C: Empfehlenswerte Index 207 211 213 215