Hmmon, A. und. Greis (2007) itteilungsbltt der Fleischforschung Kulmbch 46, Nr. 176, 77-83 Immunochemische Detektion von ZN in Fleischerzeugnissen über den Nchweis von yelin Proteolipid Protein (PLP) Immunochemicl detection of CN in met products using yelin Proteolipid Protein (PLP) s mrker A. HAON und. GAREI Zusmmenfssung Als Huptinfektionsquelle von BE (Bovine pongiforme Encephlopthie) werden Gewebe des zentrlen Nervensystems (ZN) ngesehen. it hoher Whrscheinlichkeit besteht ein kusler Zusmmenhng zwischen dem Auftreten der neuen Vrinte der Creutzfeldt-Jkob- Krnkheit (vcjd) des enschen und dem Verzehr von Lebensmitteln, die von BE-infizierten Rindern stmmen. Der Ausschluss infektiöser Gewebe us der Nhrungskette gilt dher ls eine der wichtigsten ßnhmen zur Erhöhung des Verbrucherschutzes. yelin Proteolipid Protein (PLP) stellt ein geeignetes rkerprotein für den Nchweis von zentrlem Nervengewebe in Fleischerzeugnissen dr. ittels eines neu entwickelten Western Blot Assy, der uf dem Nchweis von PLP bsiert, wurden 152 Fleischerzeugnisse us loklen etzgereien und upermärkten uf ds Vorkommen von ZN-Gewebe nlysiert. Zu Vergleichszwecken wurden positiv getestete Proben zusätzlich mit einem kommerziell erhältlichen Enzymimmunossy untersucht. Der Nchweis von ZN-Gewebe erfolgt hierbei über die Detektion von surem Glifserprotein (GFAP). Unter Verwendung des PLP-Assy wr es möglich, in Referenzwurstsorten Gehlte von 0,1 % ZN Gewebe (Brüh-/Rohwurst) bzw. 0,2 (Kochwurst) nchzuweisen. Die Negtivkontrollen (Proben mit 0 % ZN-Zustz) wurden im PLP-Assy korrekt bestimmt. Zudem wurden keine flsch positiven Ergebnisse erzielt. In 9,9 % der Hndelsproben (15; n = 152) wurde ZN-Gewebe über den Nchweis von PLP detektiert. Die prllele Anlyse der positiv getesteten Proben im GFAP-ELIA bestätigte die Ergebnisse in 5 Fällen. Dies dokumentiert, dss ZN-Kontmintionen in Fleischerzeugnissen nicht usgeschlossen werden können. Die Ergebnisse der tudie zeigen drüber hinus, dss ds neue Testverfhren sehr gut für die empfindliche Anlyse von ZN-teril in Wurstwren geeignet ist. omit bietet der PLP-Assy eine geeignete dignostische ethode für die Lebensmittelkontrolle zur Überwchung der Einhltung einschlägiger Rechtsvorschriften sowie für den Hndel zur Durchführung von Qulitätssicherungsmßnhmen. chlüsselwörter Zentrles Nervensystem (ZN) yelin Proteolipidprotein (PLP) Western Blot Fleischerzeugnisse Key Words centrl nervous system (CN) myeline proteolipid protein (PLP) western blotting met products ummry The min infectivity of BE (bovine spongiform encephlopthy) is locted in centrl nervous tissues of infected nimls. Up to now, there is strong epidemiologicl evidence linking the trnsmission of BE nd the new vrint creutzfeldt jkob disese (vcjd) of humns to the ingestion of infectious mterils from BE-ffected cttle. As consequence, the removl nd destruction of CN tissues re considered s the most efficient mesure for preventing contmintion of the food chin with BE gents. yelin Proteolipid Protein (PLP) provides suitble mrkerprotein for the detection of centrl nervous tissues in met products. In this regrd, totl of 152 different met products (emulsion-type susges, cooked susges, fermented rw susges) originting from locl butchers shops nd supermrkets were nlysed for the presence of tissues from the centrl 77
Hmmon, A. und. Greis (2007) itteilungsbltt der Fleischforschung Kulmbch 46, Nr. 176 nervous system (CN) by newly developed Western blot ssy using PLP s specific mrker. mples tested positive were nlysed in prllel with commercilized ELIA kit bsed on the detection of glil fibrillry cidic protein (GFAP). The PLP Western blot ssy llowed the detection of CN in reference susges spiked with bovine spinl cord in concentrtions s low s 0.1 % (fermented rw nd emulsion-type susges) nd 0.2 % (cooked liver susges). The bsence of CN tissues in control smples ws correctly determined nd no flse-positives PLP-signls were observed. Anlysing retil met products by PLP-Assy, 9.9 % of the smples (15 out of 152) showed positive PLP responses. The positive findings were confirmed in five cses by ppliction of the GFAP- ELIA. This documents tht CN-contmintions of retil met products still occur. Overll, the PLP ssy ws confirmed to be highly sensitive method for the detection of CN in both het-treted nd rw fermented susges. Thus, it offers n dequte nlyticl tool for regultory gencies to cler up illegl prctices nd likewise for compnies controlling themselves to improve qulity criteri. Einleitung Als wichtigster Übertrgungsweg der neuen Vrinte der Creutzfeldt-Jkob- Krnkheit (vcjd) des enschen gilt die perorle Aufnhme infektiösen Gewebes von BE-Rindern. D Gewebe des zentrlen Nervensystems potentiell ds größte Risiko ufweisen den Infektionserreger zu trgen, stellt der Ausschluss dieser Gewebe us der Nhrungskette von ensch und Tier eine der wichtigsten ßnhmen zur Prophylxe von BE und der neuen Vrinte der CJD dr. Um ds humne Expositionsrisiko gegenüber dem BE-Erreger zu minimieren, ht die Europäische Union in der Verordnung EG Nr. 999/2001 vom 22. i 2001 ein Verbot der Verwendung von ZN us Rind, chf und Ziege ls Bestndteil spezifizierten Risikomterils (R) von Tieren über 12 onten erlssen. In Deutschlnd sehen die Leitsätze für Fleisch und Fleischerzeugnisse des Deutschen Lebensmittelbuches eine Verwendung von Hirn und Rückenmrk in Fleischerzeugnissen generell nicht mehr vor. Ds heißt, die Leitsätze differenzieren weder die pezies noch ds Alter des Tieres, von dem ds ZN-Gewebe stmmt. Als Konsequenz bedrf es geeigneter dignostischer Verfhren zum Nchweis zentrlen Nervengewebes in Lebensmitteln. Derrtige ethoden sind von großer Bedeutung für die Lebensmittelkontrolle zur Überwchung der Einhltung einschlägiger Rechtsvorschriften sowie für den Hndel zur Durchführung von Qulitätssicherungsmßnhmen. ehrere Nchweisverfhren wurden bislng in der Litertur beschrieben. Zu den derzeit bedeutendsten Verfhren zählen die immunchemischen Verfhren wie ELIA und Western Blot. Ein bereits ls Testkit kommerziell erhältlicher ELIA verwendet ds sure Glifserprotein (GFAP) ls ZN spezifisches rkerprotein (Ridscreen Risk mteril, R- Biophrm AG, Drmstdt, Deutschlnd). Ein nderer kommerzieller Test detektiert ZN-Gewebe über die Neuronenspezifische Enolse (NE) im Western Blot Verfhren (Brinostic, Giessen, Deutschlnd). Kürzlich wurde yelin Proteolipid Protein (PLP) ls neues rkerprotein zum Nchweis von zentrlem Nervengewebe identifiziert (3). PLP ist ls eines der Huptproteine des yelins im zentrlen Nervensystem mßgeblich m Aufbu der yelinscheide beteiligt. Es wird hoch spezifisch im Gehirn und Rückenmrk von enschen und äugetieren exprimiert. Zudem weist dieses Protein eine hohe Hitzestbilität uf. PLP, ds zur Gruppe der Proteolipide zählt, erinnert in seinen chemischen und physiklischen Eigenschften eher n ein Lipid. o ist PLP ufgrund seiner Hydrophobizität im Gegenstz zu nderen Proteinen sehr gut für eine Extrktion in orgnischen Lösungsmitteln geeignet. 78
Hmmon, A. und. Greis (2007) itteilungsbltt der Fleischforschung Kulmbch 46, Nr. 176 Im Rhmen eines Verbundprojekts der Institute für Lebensmittelchemie und Biochemie der Universität Erlngen sowie des Institutes für ikrobiologie und Toxikologie der BfEL Kulmbch wurde ein lterntives Verfhren zum Nchweis zentrlen Nervengewebes in Fleisch und Fleischerzeugnissen entwickelt, ds uf der Detektion von PLP bsiert (3). In der vorliegenden tudie sollte ds Testverfhren durch die Anlyse von Einzelhndelsproben uf seine Prxistuglichkeit untersucht werden. teril und ethodik Hndelsproben Insgesmt wurden 152 Fleischerzeugnisse us loklen etzgereien und upermärkten uf einen eventuellen ZN-Zustz nlysiert: 52 Kochwürste, 51 Brühwürste sowie 49 Rohwürste (Tb. 1). Referenzmteril Wurstproben mit definierten engen n bovinem Rückenmrk (0 %, 0,1 %, 0,2 % 0,5 % 2 % und 10 %) wurden ls tndrds zur Bestimmung der ensitivität des PLP-Assys verwendet und ls interne Kontrollen: Teewurst (Rohwurst), Lyoner (Brühwurst) und Leberwurst (Kochwurst). Die Würste wurden im Institut für Technologie (BfEL) gemäß den Leitsätzen für Fleisch und Fleischerzeugnisse des Deutschen Lebensmittelbuches hergestellt. Die Rezepturen sind detilliert in Tbelle 2 ngegeben. Ds verwendete Rinderrückenmrk wurde jeweils einen Tg vor der Herstellung der Referenzproben us dem tädtischen chlchthof Kulmbch bezogen. Nch der Homogenisierung des Gewebes mittels eines Ultr Turrx (IKA Werke GmbH und Co. KG, tufen, Deutschlnd) erfolgte die Zugbe zur Wurstgrundmsse. Je Wurstsorte wurden Chrgen/Referenzproben entsprechender ZN-Gehlte hergestellt. Probenufbereitung Jeweils 150 g-250 g der Proben wurden unter Verwendung eines Hushltsmixers (oulinette, Gießen, Deutschlnd) homogenisiert. Anschließend wurden 5 g-8 g der homogenisierten Probe in ein 50 ml Flcon Röhrchen (Becton Dickinson Lbwre Europe, Le Pont de Clix, Frnkreich) eingewogen für die folgende PLP- Extrktion. Ds restliche Homogent wurde Vkuum verpckt (uto vc, Krämer & Greber KG, Wllingen, Deutschlnd) und für weitere Anlysen bei 20 C ufbewhrt. Tb. 1: Übersicht über die nlysierten Fleischerzeugnisse in der vorliegenden tudie Produktnme Brühwürste Kochwürste Rohwürste n 1 n 2 b Produktnme n 1 n 2 b Produktnme Bierschinken 1 2 Blutwurst 3 2 Ktenruchwurst - 1 Bierwurst 1 3 Leberwurst, fein 7 12 ettenden - 2 Brtwurst 1 Leberwurst, grob 6 5 ettwurst, grob 4 6 Fleischkäse 2 2 Psteten 1 - ettwurst, fein 4 3 Fleischwurst 2 1 Presssck 5 1 Pfeffersäckchen 3 1 Gelbwurst 7 4 Rotwurst 2 4 Polnische Rohwurst 3 1 Göttinger 2 - Zungenwurst 4 - lmi 1 5 Jgdwurst - 3 Teewurst, fein 4 7 Kncker, gebrüht 1 - Teewurst, grob - 4 Krkuer - 1 Lyoner 5 3 chinkenwurst 3 4 Weißwurst 2 1 n 1, Anzhl der Proben, die in etzgereien erworben wurden; b n 2, Anzhl der Proben, die in upermärkten erworben wurden n 1 n 2 b 79
Hmmon, A. und. Greis (2007) itteilungsbltt der Fleischforschung Kulmbch 46, Nr. 176 Tb. 2: Herstellung von Referenzwursterzeugnissen mit definierten Zusätzen n ZN-Gewebe (bovines Rückenmrk) Wurstrt Rohwurst Rezept und Leitstznummer des Produkts 2.212.1 Teewurst ZN- Gewebe Rindfleisch, grob entsehnt, fettfrei chweinefleisch, sehnenfrei, mit geringem Fettnteil fett- und sehnenfreies Einlgefleisch vom chwein fette Wmmen Nitritpökelslz (NP) [g pro kg sse] Gewürzmischung [g pro kg sse] 0-10 % 18% 13,5% 13,5% 45-55% 26g 8g Brühwurst 2.222.1 Lyoner ZN- Gewebe sehnenhltiges Kutterfleisch vom chwein Kutterspeck Eis Nitritpökelslz (NP) [g pro kg sse] Gewürzmischung [g pro kg sse] Phospht 0-10% 40-50% 34% 16% 20g 4g 5g Kochwurst 2.2312.1 Feine Leberwurst ZN-Gewebe chweinefleisch, grob fettfrei durchwchsenes chweinefleisch, schwch durchgebrüht Wmmen, peck, Fettgewebe, schwch durchgebrüht chweineleber Heiße Kesselbrühe Eis Nitritpökelslz (NP) [g pro kg sse] Gewürzmischung [g pro kg sse] ZN-Gewebe wird in den Leitsätzen für Fleisch und Fleischerzeugnisse des Deutschen Lebensmittelbuches nicht gennnt 0-10% 10% 10% 35-45% 27% 4% 4% 18g 10g PLP-Extrktion Die PLP-Extrktion erfolgte nch dem von ndmeier et l. (3) beschriebenen Verfhren. Jeweils 5 g-8 g Homogent wurden dreiml in n-hexn unter wiederholtem uspensionieren mittels eines Ultr Turrx (IKA Werke GmbH und Co. KG, tufen, Deutschlnd) extrhiert. Nch jedem Extrktionsschritt wurde die uspension filtriert (Fltenfilter, N 615 ¼, cherey-ngel, Düren, Deutschlnd). Anschließend wurde ds Lösungsmittel us den Filtrten unter dem Rottionsverdmpfer (Rotvpor-EL, Büchi Lbortechnik GmbH, Essen, Deutschlnd) bei < 30 C bgezogen. Im nächsten chritt erfolgte eine Entfettung der Hexnextrkte durch eine Resuspension der Rückstände in 5 ml Diethyl-Ether und Zentrifugtion bei 2600 x g für 10 min bei 4 C. Nch Verwerfen des Überstndes wurde ds zurückbleibende Pellet in 1 ml Diethyl-Ether resuspendiert und bei 10 000 x g für 10 min bei Rumtempertur zentrifugiert. Der Überstnd wurde verworfen und ds Pellet nschließend luftgetrocknet. Immunochemische Detektion von PLP Der immunochemische Nchweis von PLP wurde nch ndmeier et l. (3) durchgeführt. Hierzu wurde ds luftgetrocknete Pellet in Lemmli-Probenpuffer (2) bis zu einer Endkonzentrtion von 5 µg/µl resuspendiert. Nch einem Denturierungs- 80
Hmmon, A. und. Greis (2007) itteilungsbltt der Fleischforschung Kulmbch 46, Nr. 176 schritt im Wsserbd bei 75 C für 25 min wurden die Proteine in einer D-Polycrylmid-Gelelektrophorese ufgetrennt (140 V; 75 min) und im Western Blot uf eine Nitrocellulosemembrn übertrgen. Anschließend erfolgte die Detektion von PLP mittels polyklonler Antikörper. Die gebundenen Antikörper wurden unter Verwendung von 4-Nitroblu-tetrzolium-chlorid 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphospht (NBIT-BCIP) ls chromogenes ubstrt nch Herstellerngben visulisiert (Roche Dignostics, nnheim, Deutschlnd). Enzyme-linked immunosorbent ssy Proben, die im oben beschrieben Verfhren (PLP-Assy) positiv getestet wurden, wurden prllel unter Verwendung des kommerziell erhältlichen ELIA Testkit Ridscreen Risk mteril (R-Biophrm AG, Drmstdt, Deutschlnd) untersucht. Die Aufbereitung und Anlyse der Proben wurden nch Angben des Herstellers durchgeführt. Für eine stndrdisierte Auswertung der Ergebnisse mittels linerer Regression wurde die oftwre RIDA OFT Win der Firm R-Biophrm AG (Drmstdt, Deutschlnd) verwendet. Ergebnisse ensitivität Die Empfindlichkeit des PLP-Assys wurde für drei Produktgruppen geprüft: Brüh-, Koch- und Rohwurst. Hierfür wurden Referenzwürste mit verschiedenen bovinen Rückenmrksgehlten (0 %, 0,1 %, 0,2 %, 0,5 %, 1 %, 2 % und 10 %) in Doppelbestimmung nlysiert. Die Negtivkontrollen (Proben mit 0 % ZN-Zustz) wurden im PLP-Assy korrekt bestimmt. Zudem wurden keine flsch positiven Ergebnisse erzielt. Über den Nchweis von PLP wurden in Brüh- und Rohwürsten ZN-Konzentrtionen 0,1 % und in Kochwürsten 0,2 % sicher detektiert (Abb. 1). Hndelsprobenstudie Insgesmt wurde in 15 (9,9 %) der 152 untersuchten Produkte ZN-Gewebe unter Verwendung des PLP-Assy nchgewiesen (Tb. 3). Hierbei hndelte es sich zum überwiegenden Teil um Brühwürste (60 %) und zu jeweils 20 % um Koch- und Rohwürste. Die prllele Anlyse der positiv getesteten Proben im GFAP-ELIA bestätigten diese Ergebnisse in 5 Fällen (Tb. 3). Zwei der positiv getesteten Feldproben (Gelbwurst, Lb. Nr. 63 und Weißwurst, Lb. Nr. 54) zeigten im PLP-Assy die stärksten ignle sowie im GFAP- ELIA die höchsten quntittiven Werte (Tb. 3; Abb. 2). D beide Proben in derselben etzgerei erworben wurden, wurden zusätzliche Proben dieser Wurstsorten im PLP-Assy und GFAP-EIA nlysiert. Wie Tbelle 4 zeigt, wurden die ersten Ergebnisse in beiden Fällen bestätigt. 1A 0 10 10 2 2 0.5 0.5 0.2 0.2 0.1 0.1 1B 1C 1 1 0.5 0.5 0.2 0.2 0.1 0.1 2 0 2 0 0.5 0.5 0.2 0.2 0.1 0.1 81 Abb. 1: PLP-Western Blot- Anlyse von Referenzwursterzeugnissen mit verschiedenen Gehlten n bovinem Rückenmrk. (A) Immunoblot von Teewurst mit ZN Gehlten von 0 bis 10 %; (B) Immunoblot von Lyoner verschiedener ZN Gehlte (0 % bis 2 %). (C) Immunoblot einer Leberwurst mit ZN-Gehlten von 0 % bis 2 %. Der Pfeil mrkiert die für PLP spezifische Proteinbnde bei einem däquten olekulrgewicht von 29 kd
Hmmon, A. und. Greis (2007) itteilungsbltt der Fleischforschung Kulmbch 46, Nr. 176 Tb. 3: Nchweis von zentrlem Nervengewebe in Wursterzeugnissen us dem Einzelhndel (positiv getestete Proben) Nchweis von ZN Gewebe über: Produktgruppe Wurstsorte Herkunft PLP- Assy b GFAP-ELIA c Brühwurst Kochwurst Rohwurst chinkenwurst Gelbwurst Bierschinken Gelbwurst Gelbwurst Bierwurst Lyoner Gelbwurst Weißwurst Fleischrotwurst Rotwurst Presssck, rot ettwurst lmi ettenden = etzgerei; = upermrkt; b Intensität der positiven PLP Immunontwort: strk, schwch; c Risikomteril-Gehlte in %; = tiv 0,953 0,149 0,154 0,166 1,028 Tb. 4: Wiederholter Nchweis von ZN-Gewebe in Brühwurstprodukten einer etzgerei Wurstprobe Zeitpunkt des wiederholten Erwerbs und der Anlyse Nchweis von ZN-Gewebe über: PLP-Assy GFAP-ELIA b Gelbwurst ärz 2005 1,62 August 2005 0,73 November 2005 > tndrd 2 % Dezember 2005 1,24 Jnur 2006 0,765 Weißwurst November 2005 1,57 Dezember 2005 0,69 Jnur 2006 1,64 Intensität der positiven PLP Immunontwort:, strk;, schwch; b Risikomteril Gehlte in % 1 2 3 4 5 6 7 8 Abb. 2: Detektion von zentrlem Nervengewebe in Wursterzeugnissen. Lne 1, Negtivkontrolle (TW); Lne 2, Positivkontrolle (TW 0,5 % ZN); Lnes 3 und 4, ettenden; Lnes 5 und 6, Gelbwurst; Lnes 7 und 8, Weißwurst. Der Pfeil zeigt die Position des olekulrgewichtsmrkers bei 29 kd n 82
Hmmon, A. und. Greis (2007) itteilungsbltt der Fleischforschung Kulmbch 46, Nr. 176 Diskussion Die Empfindlichkeit des PLP-Assy von 0,1 % ZN-Gewebe für Brüh- und Rohwürste sowie 0,2 % für Kochwürste stimmt sehr gut mit der von ndmeier et l. (3) ermittelten Nchweisgrenze von 0,1 % (lle Wursttypen) überein. Diese Ergebnisse bestätigen den PLP-Assy dher ls ein sehr sensitives Nchweisverfhren für ZN-Gewebe in Fleischerzeugnissen. In 15 (9,9 %) der 152 untersuchten Wurstprodukte wurde ZN-Gewebe nchgewiesen. Die prllele Anlyse dieser positiv getesteten Proben mittels GFAP-ELIA bestätigte die Ergebnisse in 5 Fällen. Dies dokumentiert deutlich, dss ZN-Kontmintionen in Fleischerzeugnissen nicht usgeschlossen werden können. Lücker et l. (2) detektierten ZN-Gewebe in 4 % untersuchter Hndelsproben. D 86,7 % der positiv getesteten Proben (PLP-Assy) weniger ls 0,2 % ZN ufwiesen, ist in diesen Produkten ls Ursche für den ZN-Nchweis eine unbewusste Kontmintion während des Herstellungsprozesses zu vermuten. Zwei der untersuchten Einzelhndelsproben, die in derselben etzgerei erworben wurden, zeigten sowohl im PLP-Verfhren ls uch im GFAP-EIA ein sehr strkes ignl. Durch wiederholten Erwerb und Anlyse dieser Wursterzeugnisse us der gleichen etzgerei über einen längeren Zeitrum wurden die ersten Ergebnisse bgesichert. Dies lässt uf eine systemtische ZN- Kontmintion dieser Produkte, vermutlich durch die Verwendung von chweinehirn, schließen. Während spezifizierte Risikomterilien durch die Europäische Union über die Tierspezies und ds Tierlter bestimmt werden, sieht ds Deutsche Lebensmittelbuch hingegen die Verwendung von ZN- teril in Fleischerzeugnissen in Deutschlnd generell nicht mehr vor. Vor diesem Hintergrund eignet sich der PLP- Assy sehr gut ls creening-ethode zum Nchweis von ZN-Gewebe in Fleischerzeugnissen, d er gemäß den Leitsätzen des Deutschen Lebensmittelbuches diese Gewebe unbhängig von Tierspezies und -lter detektiert. Litertur 1. Lemmli, U. K. 1970. Clevge of structurl proteins during the ssembly of the hed of bcteriophge T4. Nture 227: 680-685. 2. Lücker, E.,. Horlcher, nd E. Eigenbrodt. 2001. Brin in humn nutrition nd vrint Creutzfeldt-Jkob disese risk (vcjd): detection of brin in retil liver susges using cholesterol nd neuron specific enolse (NE) s mrkers. Br. J. Nutr. 86 (1): 115-119. 3. ndmeier, B., C. Villmnn, R. Bäuerlein, T. Düthorn,. Greis, C.. Becker, nd. Pischetsrieder. Detection of centrl nervous system tissue in met nd met products with newly developed immunossy selective for myelin proteolipid protein. Food Chem., in press. 83
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