Die Initiation der Transkription in den Mitochondrien höherer Pflanzen DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften am Fachbereich Chemie der Freien Universität Berlin vorgelegt von FRANK HATZACK aus Berlin 1996
INHALT 1. EINLEITUNG 1 1.1. Der evolutionäre Ursprung von Mitochondrien und Chloroplasten 1 1.2. Größe und Organisation mitochondrialer Genome 1 1.3. Grundzüge der Transkription in den Mitochondrien von Vertebraten 3 1.4. Mitochondriale Promotorstrukturen und Transkriptionsfaktoren in Vertebraten 4 1.5. Mehrere Promotoren im mitochondrialen Genom von Saccharomyces cerevisiae 7 1.6. Spezifische Initiation in Saccharomyces cerevisiae: sc-mttfb fungiert analog zu eubakteriellen o-faktoren 8 1.7. Sc-mtTFA hat eine histon-ähnliche" Funktion in Saccharomyces cerevisiae 8 1.8. Konservierte Sequenzmotive umgeben Transkriptionsstartpunkte in mitochondrialen Genomen höherer Pflanzen 9 1.9. Ziele der Arbeit 12 2. MATERIAL 13 2.1. Versuchspflanzen 13 2.2. Bakterienstamm 13 2.3. Feinchemikalien 13 2.4. Radiochemikalien 14 2.5. DNA-modifizierende Enzyme 14 2.6. Nukleinsäuren 14 2.7. Kits 16 2.8. Autoradiografie 16 2.9. Elektrophoresekammern 17 2.10. Chromatographie und Ultrafiltration 17 2.11. Geräte 17 2.12. Puffer und Lösungen 17
3. METHODEN 20 3.1. Standardmethoden 20 3.2. Erzeugung von Deletionsklonen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion 20 3.3. Präparation radioaktiv markierter DNA-Proben 20 3.4. Isolierung von Mitochondrien aus Erbsensprossen 23 3.5. Aufreinigung eines transkriptionsaktiven Proteinlysats aus Erbsenmitochondrien 24 3.5.1. Solubilisierung von Mitochondrien 24 3.5.2. Ammoniumsulfatfraktionierung 25 3.5.3. Anionen-Austauschchromatographie auf der MonoQ-Säule 26 3.6. In vitro Transkriptionstest 27 3.7. Isolierung radioaktiv markierter Nukleinsäuren aus Polyacrylamidgelen 28 3.8. Primer-Extension-Analyse 28 3.9. Aufreinigung DNA-bindender Proteine aus Erbsenmitochondrien unter denaturierenden Bedingungen 29 3.9.1. Denaturierende Lyse von Mitochondrien 29 3.9.2. Chromatographie an Hydroxylapatit 30 3.9.3. Renaturierung von Proteinen durch Triton X-100 30 3.9.4. Kationen-Austauschchromatographie auf Phosphocellulose 31 3.9.5. Reversed-Phase-HPLC 32 3.10. Methoden zum Nachweis von DNA-Protein-Interaktion 32 3.10.1. Mobiüty-Shift-Analyse 32 3.10.2. UV-Crosslink-Analyse 33 3.11. Bestimmung relativer Bindungsaffinitäten 34 3.12. Quantifizierung von DNA-Bindungsaktivität 36 3.13. Größenbestimmung DNA-bindender Proteine durch Geldissektion 36 3.14. Detektion radioaktiver Signale durch Phosphoimage-Analyse 37
4. ERGEBNISSE 39 4.1. Ein in vitro Transkriptionssystem für Mitochondrien dikotyledoner Pflanzen... 39 4.1.1. Auswahl der DNA-Templates und des geeigneten Pflanzenmaterials 39 4.1.2. Isolierung eines transkriptionsaktiven Proteinextrakts aus Erbsenmitochondrien 40 4.1.3. Detektion der spezifischen Transkriptionsaktivität 41 4.2. Die Transkription des atp9 Gens aus Erbse wird in vitro am Nonanukleotidmotiv initiiert 45 4.3. Spezifische Initiation der Transkription an heterologen Promotoren 46 4.3.1. Promotoren aus Sojabohne 47 4.3.2. Promotoren aus Oenothera berteriana 49 4.4. In vitro Transkription eines trna Promotors 51 4.5. Feinkartierung von in vitro Transkriptionsstartpunkten 52 4.6. Deletionsanalyse des atp9 Promotors aus Erbse 54 4.7. Entwicklung einer Aufreinigungsstrategie für DNA-bindende Proteine aus Erbsenmitochondrien 57 4.7.1. Option für ein Verfahren unter denaturierenden Bedingungen 58 4.7.2. Die Aufreinigungsmethode umfaßt drei chromatographische Schritte 59 4.7.3. Detektion von DNA-Bindungsaktivität 61 4.8. Identifizierung DNA-bindender Proteine 63 4.8.1. Das 44 kda Protein 64 4.8.2. Das 32 kda Protein 66 4.9. Die Aufreinigungseffizienz der entwickelten Methode 68 4.10. Promotorspezifische DNA-Bindung 69 4.11. Proteinbindung in verschiedenen Abschnitten zweier heterologer Promotorregionen 72 4.11.1 Diearp9 Promotorregion aus Erbse 72 4.11.2. Die afp 1 Promotorregion aus Oenothera 76
4.12. Konservierte Sequenzelemente sind entscheidend für die Bindung des 32 kda Proteins 79 4.13. Das 32 kda und das 44 kda Protein sind in transkriptionsaktiven Proteinfraktionen enthalten 81 4.14. Die Zugabe beider Proteine führt zu einer erhöhten Transkriptmenge in vitro... 84 5. DISKUSSION 87 5.1. Initiation der Transkription in vitro: Die Funktion des Nonanukleotidmotivs wird bestätigt 87 5.2. Andere Promotortypen in den mitochondrialen Genomen von Pflanzen? 87 5.3. Die minimalen Promotorregionen von atp9 aus Erbse und atp\ aus Mais haben einen ähnlichen Aufbau 89 5.4. Biochemische Eigenschaften von DNA-Bindungsproteinen aus Erbse im Vergleich zu denen von mttfa-proteinen 90 5.5. Zwei benachbarte Proteinbindungsstellen in den Promotorregionen von atp9 aus Erbse und atpl aus Oenothera 91 5.6. Erhöhte Transkriptmengen als Indiz für eine Stimulation der Transkriptionsinitiation 94 5.7. Unterschiedliche DNA-Bindungseigenschaften weisen auf verschiedene Funktionen der identifizierten Proteine hin 95 5.8. Ein mflhs-ähnliches Protein in Mitochondrien höherer Pflanzen? 96 5.9. Die Transkriptionsinitiation in den Mitochondrien von Pflanzen, Vertebraten und Saccharomyces cerevisiae: Gemeinsamkeiten und Unterschiede 97 6. ZUSAMMENFASSUNG. 7. LITERATUR 100