G E N A X X O N b i o s c i e n c e

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1 G:\products\productflyer\puri\ni_co_agarose\manu_s5373_ni_ida_en.docx Pre-Packed Ni-Cartridge Zur Aufreinigung von Histidin-tag Fusionsproteinen Produkt Katalog# Packungsgröße Pre-Packed Ni-Cartridge S x1mL (Kapazität Säule) Pre-Packed Ni-Cartridge S x5mL (Kapazität Säule) Alle Volumenangaben beziehen sich auf das sedimentierte Agarose-Harz. fon: +49 (0) fax: +49 (0) internet: Beschreibung Genaxxon bietet gebrauchsfertige Säulen für die His-tag Proteinaufreinigung im Gravity-Flow-Verfahren an. Damit ist ein schneller Aufreinigungsprozess mit hoher Ausbeute an Zielprotein verfügbar ohne lästiges Packen zur Verfügung stehender Leersäulen. Es werden beide Matrices, Ni2+- wie auch Co2+-IDA-Agarose, mit zwei verschiedenen Füllbettvolumina (1mL, 5mL) als 20% ethanolische Suspension angeboten. Die Genaxxon Pre-Packed Columns liefern eine einfache und effektive Methode, rekombinante 6 fach Histidin getaggte (Histag) Proteine aufzureinigen. Der His-tag beeinflusst normalerweise nicht die Bioaktivität des zu behandelnden Proteins und der Aufreinigungsprozess bei der Herstellung eines solchen Proteins ist zudem sehr einfach. Die Agarose enthält die chelatbildende, dreizähnige Verbindung Imino-di-essigsäure (IDA), welche kovalent am zu 6% quervernetzten Agarose-Polymer gebunden ist und mit Ni-Ionen komplexiert ist. Die durch IDA immobilisierten Nickel-Ionen vermögen selektiv an die Histidinreste der His-tag-Proteine zu binden, wodurch die Fusionsproteine sowohl im nativen wie auch im denaturierten Zustand direkt aus den bakteriellen Rohlysaten aufgereinigt werden können. Inhalt Beschreibung Inhalt 1. Allgemeine Hinweise Spezifikationen Erläuterungen Native oder denaturierende Bedingungen Probenpräparation Vorschlag: Probenpräparation unter nativen Bedingungen Vorschlag: Probenpräparation für denaturierende Bedingungen 3 Isolation der Inclusion Bodies 3 Solubilisierung der Inclusion Bodies 4 2. Arbeitsanweisung für native Bedingungen Eliminierung des Lagerungspuffers Äquilibierung der Genaxxon Pre-Packed Columns Auftragen der Probe Waschen Elution der Probe 5 3 Sonstiges Tipps Optimierung der Elution zur maximalen Proteinausbeute Empfohlene Pufferzusammensetzungen 6 Native Bedingungen 6 Denaturierende Bedingungen Übersicht an Optimierungsparametern zur Proteinaufreinigung 6 Native Bedinungungen 7 Denaturierende Bedingungen Kompatibilitätsliste Literatur Wichtige Information Gewährleistung 9 fax: info@genaxxon.com

2 1. Allgemeine Hinweise 1.1 Spezifikationen Anwendung Affinitätschromatographie von 6 Histidin-getaggten Fusionsproteinen im Gravity-Flow-Verfahren Säulenmaterial Polypropylen Frittenmaterial Polyethylen Frittenporengröße 20µm Agarose 6% quervernetzte Agarose Matrixstabilität In allen für die Proteinaufreinigung üblichen Agenzien Aktivierendes Agenz Epichlorhydrin Bettvolumen Agarose 1mL / 5mL Kapazität ca. 28 µmol Ni2+/mL Gel; ca. 25 µmol Co2+/mL Gel Autoklarvierbar 121 C, 30min. Lagerungspuffer 20% Ethanol Haltbarkeit 5 Jahre (nach Analysenzertifikatsdatum) Lagerung 2 C bis 8 C, nicht einfrieren! Versand: Bei Raumtemperatur Stabilität: Ungeöffnet haltbar bis: siehe Label Gebrauch: Nur für Forschungszwecke in vitro, nicht zur diagnostischen, therapeutischen oder anderer klinischen Anwendung an Mensch oder Tier. 1.2 Erläuterungen Die Elution des Proteins ist mittels zweier Techniken möglich. Zum einen durch eine Verringerung des ph-wertes, zum anderen über ein metall-komplexierendes Agens wie zum Beispiel Imidazol oder EDTA. Zu bemerken ist hierbei, dass ein Gleichgewicht besteht zwischen der Imidazolkonzentration, die benötigt wird, um das Histag-Protein zu eluieren, und der notwendigen Konzentration zur Verhinderung der unspezifischen Bindung von Kontaminationen. Grundsätzlich bedeutet eine höhere Imidazolkonzentration im Equilibrierungsspuffer eine höhere Reinheit des Proteins, gegenläufig verringert sich jedoch die Ausbeute. Die Säulenchromatographie kann zur exakten Ermittlung des Elutionsendpunktes mittels eines UV-Detektors bei 280nm überwacht werden. Es wird empfohlen, eine Probe eines jeden Aufreinigungsschrittes für eine SDS-PAGE-Analyse einzubehalten. Damit kann man die besten Voraussetzungen zur Optimierung der Aufreinigung gewährleisten. Zusätzlich wird die Möglichkeit gegeben, den Vorgang zur Sicherung eines positiven Ergebnisses zu überwachen. Unter der Voraussetzung, dass das Harz nicht zu lange aggressiven Puffern ausgesetzt war, kann das Harz anschließend wieder mit Ni2+ Ionen beladen und wiederbenutzt werden. 1.3 Native oder denaturierende Bedingungen Genaxxons Pre-Packed Ni-IDA Agarose kann sowohl unter denaturierenden als auch unter nativen Bedingungen angewendet werden. Zunächst muss ermittelt werden, ob sich das His-tag-Protein in gelöster Form oder als unlösliche sog. Inclusion Bodies im Zytoplasma vorliegt. Sollte Letzteres zutreffen, muss das Protein vor dem Aufreinigen mit denaturierenden Mitteln wie z.b. Harnstoff oder Guanidiniumchlorid aus den Inclusion Bodies befreit werden. Ganz generell bewirken denaturierende Mittel über die Konformationsänderung der Proteine zudem eine gute Freilegung des His-tags, damit eine wesentlich bessere Bindung an die Ni-IDA-Agarose und daher vorteilhafte Aufreinigungsergebnisse. Nachteilig ist, dass die denaturierten Proteine grundsätzlich ihre biologische und biochemische Aktivität einbüßen und daher sofern möglich in einem zusätzlichen Schritt wieder renaturiert werden müssen. Die Aufreinigung unter nativen Bedingungen dagegen erlaubt die Co-Aufreinigung von assoziierten Proteinkomplexen und ermöglicht damit unmittelbar weitere Studien bzgl. der biologischen oder biochemischen Aktivität (z.b. Enzymaktivität, Antikörperbindung oder Rezeptoraktivität). Soll die Aufreinigung unter nativen Bedingungen stattfinden, muss das His-tag-Protein im Zytosol bei angewandten Bedingungen löslich sein. Man sollte diesbezüglich aber in Betracht ziehen, dass immer noch eine ausreichende Menge an löslichen für die native Aufreinigung zur Verfügung stehenden His-tag-Proteinen vorhanden sein kann, obwohl die Hauptmenge in Form von Inclusion Bodies vorliegt. Die Aufreinigung unter nativen Bedingungen kann dazu führen, dass zum gewünschten Protein beziehungslose, nicht getaggte Proteine mit aufgereinigt werden. Solche unspezifische Bindungen an die Agarose können durch Hinzufügen einer niedrigen Imidazolkonzentration zum nativen Lysis- und Äquilibrierungsspuffer minimiert werden. fax: info@genaxxon.com

3 Beachten Sie: Rekombinante Proteine bilden häufig sog. Inclusion Bodies aus. In solchen Fällen sind denaturierende Bedingungen für eine erfolgreiche Aufreinigung notwendig. Beachten Sie: Puffer für native Bedingungen unterscheiden sich von Puffern für denaturierende Bedingungen! Beachten Sie: Folgendes Protokoll für die Aufreinigung von His-getaggten Proteinen behandelt nur die Anwendung nativer Bedingungen. Falls denaturierende Bedingungen Anwendung finden sollen, beachten Sie bitte die in diesem Manual angegebene chemische Stabilitätstabelle. 1.4 Probenpräparation Vorschlag: Probenpräparation unter nativen Bedingungen 1. Ernten Sie die Zellen der "Übernacht"-Kultur durch Zentrifugieren ( xg für 10 min oder 4.000xg für 15 min oder x g für 30 min bei 4 C). Das zu verwendende Kulturvolumen hängt vom Expressionslevel des gewünschten Proteins ab. Frieren Sie das Pellet bis zur weiteren Verwendung ein. 2. Lassen Sie das gefrorene Pellet ca. 15 min auf Eis auftauen. 3. Zelllysis-Methoden: Dies kann auf verschiedene Weisen ausgeführt werden: a) Mechanisch, wie Beschallung, Homogenisierung, Zermahlen oder Hochdruckaufschluss nach dem Frech-Press-Prinzip. Lösen Sie hierzu das Pellet in kaltem nativen Resuspensionspuffer. Verwenden Sie 5 Volumeneinheiten Resuspensionspufferlösung pro eine Volumeneinheit feuchtem Zellpellet. Falls Sie Beschallung oder Homogenisierung anwenden, minimieren Sie die Behandlungszeit so weit wie möglich, unter Eiskühlung und mit kurzen Impulsen. Typisch dafür sind 5 6 Impulse mit jeweils 10 Sekunden und dazwischen liegenden Pausen von 5 Sekunden. Exzessive Beschallung oder Homogenisierung kann die Funktionalität des Proteins zerstören. Vermeiden Sie das Einfrieren der Proben, da dies die Denaturierung des Fusionsproteins hervorrufen kann und daraus eine Co-Aufreinigung mit dem Ursprungsprotein resultiert. b) Vorzugsweise können die Zellen chemisch in nativem Lysispuffer lysiert werden. Suspendieren Sie dazu das Zellpellet (pro 1g feuchtes Pellet 2 5mL Lysispuffer) für ca. 30 Minuten auf Eis. Der Lysispuffer enthält 10mM Imidazol zur Minimierung der Bindung ungetaggter Proteine (Kontaminationen) und der Optimierung der Reinigungswirkung bei zugleich weniger Waschschritten. Falls aber unter diesen Bedingungen das Fusionsprotein nicht gebunden werden kann, verringern Sie die Imidazolkonzentration auf 1 5mM. Die maximal verträgliche Imidazolkonzentration (bei stark bindenden Proteinen) liegt bei 20mM! 4. Beschallen Sie die Suspension (ca. 10x bei W, jeweils 10s Kühlperiode dazwischen) 5. Falls die Lösung noch sehr viskos sein sollte, geben Sie 5mg/mL DNase I (oder wahlweise RNase I (5µg/mL) und RNase A (10µg/mL)) dazu und inkubieren Sie für min auf Eis. 6. Zentrifugieren Sie das Lysat ( xg für min bei 4 C). Entnehmen Sie den Überstand ohne jegliche Zelldebris. Behalten Sie eine Probe (ca. 5µl) des Lysats für eine SDS-PAGE- Analyse zurück. 7. Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins per SDS-PAGE Analyse Vorschlag: Probenpräparation für denaturierende Bedingungen Als denaturierender Lysis-Puffer kann zum einen 6M GuHCl-Lösung (Lysispuffer 1), zum anderen 8M Harnstoff-Lösung (Lysispuffer 2) eingesetzt werden. Harnstoff ist ein mildes denaturierendes Agens, wobei hier das Lysat direkt mit SDS-PAGE- Analyse untersucht werden kann. GuHCl besitzt stärker denaturierende Eigenschaften und kommt dann zum Einsatz, wenn Proteine anderweitig nur sehr schwer in Lösung gebracht werden können. Jedoch ist es unter Umständen dann für die SDS- PAGE-Analyse notwendig, mit Wasser im Verhältnis 1:6 zu verdünnen oder eine Dialyse vorzunehmen. Vorzugsweise sollte daher Harnstoff eingesetzt werden. Isolation der Inclusion Bodies 1. Tauen Sie das aus der E.coli Zellkultur erhaltene eingefrorene (für mind. 30 min) Zellpellet wieder auf. 2. Resuspendieren Sie 1g des feuchten Zellpellets in 5mL Resuspensionspufferlösung. 3. Homogenisieren Sie vollständig die Zellsuspension mittels Auf- und Abpipettieren oder Rühren (Beschallung meist nur notwendig im Falle eines frisch hergestellten, nicht eingefrorenen Zellpellets). 4. Fügen Sie Lysozym (1mg/mL Endkonzentration) hinzu. 5. Inkubieren Sie die Zellen unter ständigem Rühren 30 Minuten lang auf Eis. Die Lösung erscheint annähernd durchsichtig, wenn der Lysisprozess abgeschlossen ist. Falls dies nicht eintritt, kann eine kurze Beschallung zum gewünschten Erfolg führen. Falls die Lösung sehr viskos sein sollte, können Sie 5mg/mL DNase I hinzugeben und 15 min Rühren. 6. Zentrifugieren Sie das Lysat (10.000xg für 30 min bei 4 C). 7. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie das Pellet auf Eis. fax: info@genaxxon.com

4 Solubilisierung der Inclusion Bodies 1. Resuspendieren Sie das erhaltene Pellet in 10mL Resuspensionspuffer. 2. Zentrifugieren Sie bei 10,000xg (30 min bei 4 ºC) und entfernen Sie den Überstand. 3. Geben Sie 2mL pro g feuchtes Pellet des gewünschten Lysispuffers dazu. Unter Umständen ist Homogenisierung oder Beschallung zur vollständigen Resuspension notwendig. 4. Lösen Sie die Inclusion Bodies durch 60 min Rühren auf Eis. 5. Zentrifugieren Sie das Lysat ( x g für 30 min bei 20 C) zur Eliminierung des unlöslichen Materials und transferieren Sie den Überstand in ein sauberes neues Tube. 6. Zentrifugieren Sie nochmals bis zur vollständigen Klärung des Überstandes. 7. Behalten Sie eine Probe des Lysats für eine SDS-PAGE-Analyse zurück. Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins per SDS-PAGE Analyse. 2. Arbeitsanleitung für native Bedingungen 2.1 Eliminierung des Lagerungspuffers Entfernen Sie zunächst die obere, dann die untere Kappe der Säule und lassen Sie den Lagerungspuffer abfließen. 2.2 Äquilibrierung der Genaxxon Pre-Packed Columns Äquilibrieren Sie die Säule mit 5 10 Bettvolumina Bindungspuffer. Füllen Sie dazu den Bindungspuffer von oben in die Säule unter Beachtung, dass dabei keine Gasblasen eingeschlossen werden. Mischen Sie händisch durch mehrmaliges Umwenden der geschlossenen Säule. Ein typischer Bindungspuffer besteht aus einer 20mM Di-Natriumphosphat-, 500mM NaCl- und 10mM Imidazol-Lösung bei ph7,5. Sollte der vorgeschlagene Äquilibrierungspuffer nicht für Ihre Anwendung passend sein, können Sie auch Ihr eigenes Puffersystem benutzen, jedoch sollte dieser eine hohe Salzkonzentration aufweisen, um Ionen-Austausch-Effekte zu vermeiden. Wir empfehlen eine 0,1-0,5M NaCl-Pufferlösung (zur Pufferung werden allgemein 10mM Acetat- oder mM Phosphat-Pufferlösungen eingesetzt) mit moderat hohem ph-wert (wie zum Beispiel 50mM Tris/HCl, ph7,0 8,0), welcher zwischen 5,5 und 8,0 variieren kann. Beachten Sie: Die Bindungskapazität kann bei unterschiedlichen His-tag Fusionsproteinen stark variieren. Dies hängt von ganz unterschiedlichen Parametern ab, wie zum Beispiel von den besonderen Eigenschaften des Proteins, von der Expressionswirtszellart, von den Kulturbedingungen, usw.. Der Orientierungswert der Bindekapazität der Genaxxon Ni-IDA- Agarose liegt bei 10mg His-tag Protein/mL Gel. Entsprechend des Kapazitätswertes von 10mg His-tag-Protein pro ml Agarose können 5mL zentrifugiertes Lysat (0,2-2mg/mL Proteingehalt als Anfangsbereich) auf 1mL Harz aufgetragen werden. Je nach Bedarf kann in diesem Verhältnis ein Up- oder Downscale durchgeführt werden, um die optimale Beladungskapazität für das gewünschte Fusionsprotein zu bestimmen. Das Volumen der Agarose wird unabhängig vom Verfahren über die sedimentierte Menge an Agarose in einer graduierten Säule bestimmt.* Beachten Sie: Alle Lösungsmittel und Probenlösungen sollten vor der Säulenauftragung entgast werden. Beachten Sie: Äquilibrierungspuffer: Die Wahl der Pufferzusammensetzung hängt wesentlich von den spezifischen Eigenschaften des Fusionsproteins ab. Am häufigsten werden Acetat- (50mM) oder Phosphat-Puffer (10-150mM) im neutralen ph-bereich ( ) verwendet, kann aber für besondere Fälle im Bereich von 5,5-8,5 variiert werden. Zur Vermeidung von ionischen Interaktionen ist die Verwendung von 0,15-0,5M NaCl ratsam. Beachten Sie: In einigen Fällen kann zur Erhöhung der Bindungsselektivität des Fusionsproteins der Einsatz einer geringen Konzentration an Imidazol (10 40mM) im Äquilibrierungspuffer zu einem stark verbesserten Reinigungserfolg führen. Wichtig ist jedoch die Verwendung von nur hoch aufgereinigtem Imidazol, um unerwünschte Effekte für die O.D.-Wertbestimmung zu vermeiden. Außerdem dürfen weder EDTA noch Citrat oder ähnliche Agenzien vorhanden sein. 2.3 Auftragung der Probe Beachten Sie: Die Probe muss vollständig aufgelöst und komplett frei von Zelldebris sein, bevor die Säule beladen werden kann. 1. Tragen Sie das Lysat auf die vom Lagerungspuffer gereinigte und äquilibrierte Pre-Packed Ni-Cartridge auf. 2. Behalten Sie Harz und Probe für mindestens 15 min in Kontakt. Beachten Sie: Eine schon geringe Kontaktzeiterhöhung kann die Bindungseffizienz deutlich erhöhen! Beachten Sie: Die erreichbare Bindungskapazität hängt von vielen Parametern ab, wie z. B. von der Probenkonzentration. fax: info@genaxxon.com

5 2.4 Waschen Beachten Sie: Die SDS-PAGE- oder O.D. 280 nm Analyse liefert einen guten Anhaltspunkt, welcher Waschaufwand für Ihre Applikation notwendig ist. 1. Fügen Sie Bindungspuffer von oben zur Eliminierung der verunreinigenden Substanzen zu. 2. Mischen Sie händisch durch mehrmaliges Umwenden der geschlossenen Säule. 3. Waschen Sie das Säulenmaterial so oft, bis der O.D. 280nm-Wert des Eluenten den Basislevel erreicht. Behalten Sie sich Proben der Waschlösung für eine SDS-PAGE- oder O.D. 280nm Analyse zurück. 2.5 Elution der Probe Beachten Sie: Es können einige Versuche notwendig sein, bis die optimalen Elutions-Bedingungen bestimmt sind. Entsprechende Details dazu finden Sie in Kapitel Geben Sie den Elutionspuffer von oben in die Säule 2. Mischen Sie händisch durch mehrmaliges Umwenden der geschlossenen Säule. 3. Es wird empfohlen, eine Kontaktzeit von Elutionspuffer und Harz mindestens für 10 min. einzuhalten, bevor die untere Kappe entfernt wird. 4. Die empfohlene, maximal anzuwendende Elutionspuffer-Konzentration liegt bei 0.5M des Komplexierungsagenzes Imidazol. Es kann ein Konzentrationsgradient des Imidazols (0 0.5M) angewendet werden, die meisten Proteine werden aber bei einer Konzentration von 250mM eluiert. Zu beachten ist dabei immer die Prüfung des richtigen ph-wertes des Puffers. 5. Die andere häufig eingesetzte Elutionsmethode ist die Minderung des ph-werts des Elutionspuffers in 0,5 Einheiten- Schritten (in der Regel bis zu einem Endwert im Bereich von ph ).* Der Elutionspuffer besteht typischerweise aus 20mM Dinatriumphosphat-, 500mM NaCl und 500mM Imidazol-Lösung bei ph7,5 (oder 50mM Tris/HCl, 500mM NaCl und 500mM Imidazol ph8,0). Normalerweise ist diese Imidazolkonzentration ausreichend für die Elution der meisten Proteine. Es kann auch ein Konzentrationsgradient des Imidazols (0 0.5M) angewendet werden, viele Proteine werden sogar schon bei einer Konzentration von 250mM eluiert. In sehr seltenen Fällen muss die Konzentration noch weiter erhöht werden, was bis zu 2M noch durchführbar ist. Zu beachten ist immer die Prüfung des richtigen ph-wertes des Puffers * Es wird jedoch auch über die Verwendung anderer Komplexierungsmittel berichtet, wie zum Beispiel EDTA, EGTA (0.05M, verursacht jedoch die Elution von Protein und Metallion) oder NH4Cl (vgl. Hansen, P. & Lindeberg, G unter Kapitel 3.4 Punkt 1) Falls der empfohlene Elutionspuffer für ihre Anwendung nicht geeignet sein sollte, bedenken Sie bitte, dass einige Elutionsmethoden gelegentlich zur Kontamination des eluierten Proteins mit Metallionen führen können. Jene können über einen Pufferwechsel (im Regelfall genügt eine Anhebung des ph-wertes) und anschließende Aufreinigung über eine mit Phosphat-equilibrierte metallionenfreie IDA-Säule. Beachten Sie: Normalerweise ist eine anschließende komplette Entfernung von Imidazol unnötig. Falls dies jedoch gewünscht ist, kann eine Aufreinigung über Dialyse, Ammoniumsulfat-Präzipitation oder Ultrafiltration erfolgen. 3. Sonstiges 3.1 Tipps Wenn das Lysat sehr viskos ist, kann man eine 10µg/mL DNase-Lösung hinzugeben. Alternativ dazu können Sie die Lösung mit einer Injektionsspritze durch eine weite Kanüle drücken, bis die Viskosität ausreichend verringert ist. Bei nativen Bedingungen können Proteaseinhibitoren wie Pepstatin A, Bestatin, 4-(2-Aminoethyl)benzyl-Sulphonylfluorid (AEBSF), E-64 oder Phosphoramidon ebenso verwendet werden. Ausgiebige Behandlungen oder Kontaminationen des Harzes mit reduzierenden Reagenzien können zur Reduktion des Metallions führen und damit die Bindungskapazität des Harzes stark verringern. Vermeiden Sie daher unbedingt den Einsatz solcher Agenzien unter Berücksichtigung der in der Kompatibilitätsliste angegebenen Chemikalien. Das Harz ist bezüglich der darin angegebenen Chemikalien ausgiebig geprüft. 3.2 Optimierung der Elution zur maximalen Proteinausbeute Mittels Anlegen eines Imidazolgradienten zur Variation der Imidazolkonzentration im Äquilibrierungspuffer während der Säulenchromatographie lässt sich auf einfache Weise die optimale Imidazolkonzentration für ein spezielles Protein bestimmen. Vorgehen: Vorlage eines Gefäßes mit Äquilibrierungspuffer (ohne Imidazol) und eines weiteren Gefäßes mit 500mM Imidazol. Beide Gefäße sind mittels eines Schlauches oder dünnen Rohres verbunden. Das Gefäß mit Äquilibrierungspuffer ist mit der Ni-IDA-Agarose-Säule verbunden. Das Gefäß mit dem Äquilibrierungspuffer dient gleichzeitig als Mischkammer (rühren nicht vergessen). Beide Gefäße müssen dasselbe Flüssigkeitsvolumen aufweisen! Durch Abpumpen des Äqulibrierungspuffers aus dem ersten Gefäß, z.b. mittels einer Schlauchpumpe, wird aufgrund des notwendigen Ausgleichs beider Flüssigkeitssäulen (Füllhöhe der beiden Gefäße), die gleiche Flüssigkeitsmenge an Imidazollösung in das erste Gefäß überführt, wodurch ein linearer Konzentrationsgradient entsteht. fax: info@genaxxon.com

6 Über einen UV-Monitor kann man das Elutionsergebnis über die erhaltene Peakhöhe bestimmen und darüber das Optimum der Imidazolkonzentration im Puffer über den angelegten Gradienten berechnen. Alternativ könnte auch eine stufenweise Elution vorgenommen werden, bei der die Imidazollösung manuell in bestimmten Zeitabständen und in bestimmten Mengen vorgenommen wird. Beachten Sie: Für die Gradientenelution sollte die Eluentenmenge ungefähr 5-mal das Volumen der Agarose-Säule betragen. 3.3 Empfohlene Pufferzusammensetzungen Dekomplexierungspuffer 20mM NaH2PO4, ph7,0 50mM EDTA 0.5M NaCL Metallionen Lagerpuffer 100mM NiSO4 x 6 H2O 20% Ethanol Native Bedingungen Lysispuffer für die chemische Extraktion. Muss frisch hergestellt werden 50mM NaH2PO4, ph8,0 300mM NaCL 10mM Imidazol 1mg/mL Lysozym Resuspensionspuffer 50mM NaH2PO4, ph8,0 300mM NaCL 10mM Imidazol Äquilibrierungspuffer Elutionspuffer 50mM NaH2PO4, ph8,0 50mM NaH2PO4, ph8,0 300mM NaCl 300mM NaCl 10mM Imidazol 250mM Imidazol Denaturierende Bedingungen Lysispuffer 1 Lysispuffer 2 10mM Tris/HCl, ph8,0 10mM Tris/HCl, ph8,0 100mM NaH2PO4 100mM NaH2PO4 6M GuHCl 8M Harnstoff Äquilibrierungspuffer 10mM Tris/HCl, ph6,3 100mM NaH2PO4 8M Harnstoff Elutionspuffer Für Monomere Elutionspuffer Für große Moleküle 10mM Tris/HCl, ph5,9 10mM Tris/HCl, ph4,5 100mM NaH2PO4 100mM NaH2PO4 8M Harnstoff 8M Harnstoff Beachten Sie: Aufgrund der Dissoziationsfähigkeit des Harnstoffs sollte bei Verwendung entsprechender Pufferlösung der ph- Wert erst unmittelbar vor Verwendung eingestellt werden. Auf keinen Fall autoklavieren. 3.4 Übersicht an Optimierungsparametern zur Proteinaufreinigung Die generell in den Handbüchern für Co- und Ni-IDA-Agarosen angegebenen empfohlenen Pufferzusammensetzungen sind bei deren Anwendung in vielen Fällen ausreichend um einen Proteinaufreinigungserfolg erzielen zu können. Es kann aber nicht für jedes beliebige Protein der Erfolg garantiert werden. Die spezifischen Eigenschaften der Proteine sind hierfür zu vielfältig. Die Pufferzusammensetzungen für die optimale Aufreinigung eines Proteins können somit erheblich von den empfohlenen abweichen. Die über eine Optimierung ermittelten Parameter für ein spezifisches Protein garantieren schließlich erst den dauerhaften Aufreinigungserfolg bei Anwendung dergleichen Aufreinigungsmatrix. Falls über die Verwendung einer Matrix eines anderen Herstellers schon optimierte Pufferzusammensetzungen verwendet wurden, kann deren Verwendung für die entsprechende Genaxxon Agarosen durchaus erfolgreich sein, muss es aber nicht. Eventuell müssen trotzdem zumindest Optimierungswerte ermittelt werden. Folgende Tabelle gibt einen Überblick an Parametern über die eine Optimierung üblicherweise erfolgen kann. Diese Tabelle erhebt jedoch keinen Anspruch auf Vollständigkeit. fax: info@genaxxon.com

7 Native Bedingungen Äquilibrierungs- und Resuspensierungspuffer 10mM bis 150mM NaH2PO4 ph5,5 bis 8,5 Weitere Puffer in Anwendung, aber selten: 50mM Tris/Acetat ph7,0 bis 8,0 HEPES (bis 100mM), MOPS (bis 100mM), Tris-HCl (bis 100mM) Zur Vermeidung ionischer Wechselwirkungen (optional) 0,15 bis 0,5M NaCl Zur Erhöhung der Selektivität (optional) 10 bis 40mM Imidazol (hochgereinigt) Allgemeine Bemerkungen: 1. In jedem Fall Vermeidung von Agenzien wie EDTA oder Citrat gewährleisten. 2. Zur Probenauftragung: Bindungskapazität wird beeinflusst durch Faktoren wie Probenkonzentration, Bindungspufferzusammensetzung und bei Gravity-flow-Anwendungen von der Flussrate (langsamere Flussrate erhöht die Kontaktzeit und damit die Bindungskapazität) Elutionspuffer 1. Addition eines kompetitiven Liganden wie Imidazol (Standard) 0,0 bis 0,5M Imidazol Andere, mögliche Reagenzien: Histidin, Ammoniumchlorid (Standard: 0,25M) (hochgereinigt) 10mM bis 150mM NaH2PO4 ph5,5 bis 8,5 Weitere Puffer in Anwendung, aber selten: 50mM Tris/Acetat ph7,0 bis 8,0 HEPES (bis 100mM), MOPS (bis 100mM), Tris-HCl (bis 100mM) 0,15 bis 0,5M NaCl Zur Vermeidung ionischer Wechselwirkungen (optional) 2. Reduktion des ph-wertes (zur Optimierung Gradienten anwenden) ph3,0 4,0 10mM bis 150mM NaH2PO4 ph5,5 bis 8,5 Weitere Puffer in Anwendung, aber selten: 50mM Tris/Acetat ph7,0 bis 8,0 HEPES (bis 100mM), MOPS (bis 100mM), Tris-HCl (bis 100mM) 0,15 bis 0,5M NaCl Zur Vermeidung ionischer Wechselwirkungen (optional) 3. Anwendung drastischer Methoden 0,05M EDTA oder EGTA Verursacht Eliminierung von Protein und Metallionen! Denaturierende Bedingungen Lysis-, Äquilibrierungs- und Resuspendierungspuffer 0,0 bis 50mM Tris/HCl ph5,5 bis 8,5 Weitere Puffer in Anwendung, aber selten: 10mM bis 150mM NaH2PO4 Standard: ph7,0 bis 8,0 HEPES (bis 100mM), MOPS (bis 100mM), Tris/Acetat (bis 100mM) Bis zu 6M GuHCl oder Denaturierungsagenzien Bis zu 8M Harnstoff 0,15 bis 0,5M NaCl Zur Vermeidung ionischer Wechselwirkungen (optional) Zur Erhöhung der Selektivität (optional) 10 bis 40mM Imidazol (hochgereinigt) Allgemeine Bemerkungen: 1. In jedem Fall Vermeidung von Agenzien wie EDTA oder Citrat gewährleisten. 2. Zur Probenauftragung: Bindungskapazität wird beeinflusst durch Faktoren wie Probenkonzentration, Bindungspufferzusammensetzung und bei Gravity-flow-Anwendungen von der Flussrate (langsamere Flussrate erhöht die Kontaktzeit und damit die Bindungskapazität) Elutionspuffer 1. Addition eines kompetitiven Liganden wie Imidazol (Standard) 0,0 bis 0,5M Imidazol Andere, mögliche Reagenzien: Histidin, Ammoniumchlorid (Standard: 0,25M) (hochgereinigt) 10mM bis 150mM NaH2PO4 ph5,5 bis 8,5 Weitere Puffer in Anwendung, aber selten: 50mM Tris/HCl Standard: ph7,0 bis 8,0 HEPES (bis 100mM), MOPS (bis 100mM), Tris/Acetat (bis 100mM) 0,0 bis 0,5M NaCl Zur Vermeidung ionischer Wechselwirkungen (optional) Bis zu 6M GuHCl oder Denaturierungsagenzien Bis zu 8M Harnstoff 2. Reduktion des ph-wertes (zur Optimierung Gradienten anwenden) Monomere 0,0 bis 50mM Tris/HCl ph5,5 bis 6,5 Weitere Puffer in Anwendung, aber selten: 10mM bis 150mM NaH2PO4 ph5,5 bis 6,5 HEPES (bis 100mM), MOPS (bis 100mM), Tris/Acetat (bis 100mM) 0,0 bis 0,5M NaCl Zur Vermeidung ionischer Wechselwirkungen (optional) fax: info@genaxxon.com

8 Große Moleküle 0,0 bis 50mM Tris/HCl ph3,0 bis 4,5 Weitere Puffer in Anwendung, aber selten: 10mM bis 150mM NaH2PO4 ph3,0 bis 4,5 HEPES (bis 100mM), MOPS (bis 100mM), Tris/Acetat (bis 100mM) Bis zu 6M GuHCl oder Denaturierungsagenzien Bis zu 8M Harnstoff 0,0 bis 0,5M NaCl Zur Vermeidung ionischer Wechselwirkungen (optional) 3. Anwendung drastischer Methoden 0,05M EDTA oder EGTA Verursacht Eliminierung von Protein und Metallionen! 3.5 Kompatibilitätsliste Studie Reagenzien Chem. Stabilität HCl; 0,01M SDS; 2% NaOH; 0,1M 2-Propanol Ethanol; 20% NaOH; 1M Natriumacetat, ph4,0 HAc; 70% Denaturierende Agenzien Harnstoff; 8M Guanidinium/HCl; 6M Detergenzien Triton -100; 2% Chaps; 1% Tween20; 2% Additive Imidazol; 2M EDTA; 1mM Ethanol; 20% + Glycerin; 50% EDTA; 1mM + MgCl2; 10mM Na2SO4; 100mM Citrat; 60mM NaCl; 1,5M Citrat; 60mM + MgCl; 80mM Red. Agenzien Red. Glutathion; 1mM DTE; 5mM ß-Mercaptoethanol; 20mM DTT; 5mM Puffer Na2HPO4, ph7,5; 50mM Tris/Acetat, ph7,51; 100mM Tris/HCl, ph7,5; 100mM HEPES, ph7,5; 100mM MOPS, ph7,5; 100mM Beachten Sie: Die zeitlich ausgiebige Behandlung der Genaxxon Pre-packed Ni-Cartridge mit reduzierenden Agenzien oder die Anwendung einer sehr hohen Konzentration dieser Chemikalien kann zur Reduktion der Metallionen und daher zur Minderung der Bindungskapazität führen. Diese Agenzien sollten aus diesem Grunde nach Möglichkeit vermieden werden. Obige angegebene Bedingungen entsprechen den in Einzeltests ermittelten Maximalkonzentrationen, bei denen die Agarosen noch unbedenklich eingesetzt werden können. fax: info@genaxxon.com

9 4.1 Literatur 1. Hansen, P. & Lindeberg, G. (1995). Journal of Chromatography 690: Roe, S. (1993). Protein Purification Methods A Practical Approach. pp Edited by Harris, E. L. V. & Angal, S. Oxford University Press, New York. 3. Scopes, R.K. (1994). Protein Purification Principles and Practice. Springer Verlag, New York. 4. Bastida, A., Latorre, M. and García-Junceda, E. (2003) In Vivo Chaperone-Assisted Folding of - 1,6-Fucosyltransferase from Rhizobium sp. ChemBioChem, 4, Gasset-Rosa,F. et al. (2008). "Negative regulation of pps10 plasmid replication: origin pairing by zipping-up DNA-bound RepA monomers". Mol. Microbiol. 68: Giraldo,R. (2007). "Defined DNA sequences promote the assembly of a bacterial protein into distinct amyloid nanostructures". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: Hemdan, E.S. and Porath, J. (1985) Development of immobilized metal affinity chromatography. II: Interaction of amino acids with immobilized Nickel Iminodiacetate. Journal of Chromatography 323, Porath, J. (1992) Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification 3, Porath, J. and Hansen, P. (1991) Cascade mode multiaffinity chromatography. Fraction of human serum protein. Journal of chromatography 550, Porath, J., et al. (1975) Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature 258, Yip, T-T y Hutchens, W. (1994) Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography. Molecular Biotechnology, 1, Anspach, F.B. (1994). Silica-based metal chelate affinity sorbents. I. Preparation and characterization of iminodiacetic acid affinity sorbents prepared via different immobilization techniques. Journal of Chromatography, A 672, Wichtige Informationen Genaxxon Ni-IDA-Agarose wurde ausschließlich für die Forschung und für in vitro Anwendungen entwickelt und wird nur als solches verkauft. Dieses Produkt darf nicht für therapeutische oder diagnostische Anwendungen am Menschen angewendet werden. Angemessene Sorgfalt muss im Umgang mit vielen in diesem Manual beschriebenen Reagenzien angewendet werden. Sepharose, ÄKTA, FPLC sind registrierte Handelsnamen von Amersham Pharmacia Biotech AB. 3.6 Gewährleistung Genaxxon gewährleistet nur dann für die beschriebenen Eigenschaften der Ni-IDA-Agarose über einen Zeitraum von 5 Jahren (nach Analysenzertifikatsdatum), wenn dieses Produkt gemäß der in diesem Manual angegebenen Informationen angewendet wurde. Sollten Sie trotzdem mit diesem Produkt nicht vollkommen zufrieden sein, kontaktieren Sie bitte Genaxxon bioscience GmbH über die angegebenen Kontaktdaten oder einen der angegebenen autorisierten Vertriebsfirmen. fax: info@genaxxon.com