Erhöhte Lebenserwartung und Resistenz gegenüber oxidativem Stress in Maus-Prion-Protein (PrP)-exprimierenden Drosophila melanogaster

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1 Erhöhte Lebenserwartung und Resistenz gegenüber oxidativem Stress in Maus-Prion-Protein (PrP)-exprimierenden Drosophila melanogaster Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg vorgelegt von Patrick Porps, Diplom-Biologe aus Berlin Würzburg 2008

2 Eingereicht am:... Mitglieder der Promotionskommission: Vorsitzender:... Gutachter: Prof. Dr. Michael A. Klein Gutachter: Prof. Dr. Erich Buchner Tag des Promotionskolloquiums:... Doktorurkunde ausgehändigt am:... ii

3 Ex vivo, scientia. iii

4 INHALT 1 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG Prionen und Prionenerkrankungen Übertragbare spongiforme Enzephalopathien Prionenerkrankungen bei Tieren Prionenerkrankungen beim Menschen Die protein only-hypothese Die Strukturen von PrP C und PrP Sc Die Konversion von PrP C zu PrP Sc Die physiologische Funktion von PrP C Die Prionpathogenese Drosophila melanogaster als Tiermodell Drosophila als Modell für neurodegenerative Erkrankungen Drosophila und Prionen Die Expression von Transgenen Ziel der Arbeit 25 2 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Tierzucht Verzeichnis benutzter und erzeugter Drosophila-Stämme Verpaarung transgener Linien Generierung eines doppelt transgenen Stammes Chemikalien, Verbrauchsmaterial und Laborgeräte Molekularbiologische Methoden Inverse Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Quantitative Real-Time PCR Microarray Proteinbiochemische Methoden Proteinnachweis Protein-Deglykosylierung Histologische Methoden whole mount-analyse Paraffin-Präparation Gefrier-Präparation Epoxidharz-Präparation Das Gehirn-Koordinatensystem Tierexperimentelle Methoden Expression von Transgenen im Fliegenauge Analyse der Lebenserwartung Applikation von Wasserstoffperoxid Haltung unter reiner Sauerstoffatmosphäre Applikation von Methylviologen (Paraquat) Software 61 iv

5 INHALT 3 ERGEBNISSE Funktionskontrolle und Expressionsmuster der GAL4-Treiberlinien Molekularbiologische Charakterisierung der transgenen Drosophila Kartierung der Transgen-Integrationsorte Messung der PrP-RNA in transgenen Fliegen Bestimmung der PrP-Expression in transgenen Fliegen Histologische Charakterisierung der transgenen Drosophila Gewebelokalisierung von transgenem PrP im Fliegengehirn Neuroanatomische Analyse PrP-transgener Fliegen Erhöhte Lebenserwartung bei Wildtyp-PrP-exprimierenden Drosophila Wildtyp-PrP vermittelt Resistenz gegenüber oxidativem Stress Resistenz gegenüber Wasserstoffperoxid-induziertem Stress Resistenz gegenüber Paraquat Resistenz gegenüber reinem Sauerstoff Neuropathogenese nach Induktion von oxidativem Stress Expression von Wildtyp-PrP schützt vor Gewebevakuolisierung Unterschiedlich stark ausgeprägte Apoptose in geschädigten Neuronen Differentielle Genexpression in Fliegen nach und ohne Induktion von oxidativem Stress 86 4 DISKUSSION Drosophila melanogaster als Modellorganismus zur Untersuchung der Neuropathogenese bei TSE und der physiologischen Funktion von PrP Charakterisierung der transgenen Fliegen PrP vermittelt erhöhte Lebenserwartung und neuroprotektive Eigenschaften in Drosophila PrP, die Octarepeat-Domäne und Kupfer-abhängige Fenton-ähnliche Reaktionen eine Spekulation 97 5 ZUSAMMENFASSUNG Deutsch English LITERATURVERZEICHNIS ANHANG Abkürzungs- und Symbolverzeichnis Einheiten nach dem Système international d unités (SI) Abbildungsverzeichnis 133 v

6 INHALT 7.4 Tabellenverzeichnis Statistische Berechnungen Curriculum Vitae Publikation DANKSAGUNG ERKLÄRUNG 143 vi

7 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG 1 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG 1.1 Prionen und Prionenerkrankungen Übertragbare spongiforme Enzephalopathien Prionenerkrankungen oder übertragbare spongiforme Enzephalopathien (transmissible spongiform encephalopathies, TSE) sind progressive neurodegenerative Erkrankungen beim Menschen und bei Tieren, die nach langer Inkubationszeit zum Tod des betroffenen Individuums führen. Charakteristische Symptome sind motorische Dysfunktionen (Myoklonien), Gang- und Gleichgewichtsstörungen (Ataxie) sowie im terminalen Stadium beim Menschen kognitive Störungen wie Demenz. Neuropathologische Befunde wie die namensgebenden schwammartigen Veränderungen (Spongiose), die Aktivierung von Astrozyten und Gliazellen (Astrogliose), neuronaler Zellverlust und extrazelluläre Ablagerung von amyloiden Aggregaten stellen typische Kennzeichen von Prionenerkrankungen dar. Bereits 1732 wurde in Großbritannien die Prionenerkrankung Scrapie (Traberkrankheit) beim Schaf bekannt und rund 200 Jahre später wissenschaftlich beschrieben (Cuillé et al., 1936). Kurz darauf folgende Infektionsstudien in Schottland (Wilson, D. et al., 1950) hatten im Jahre 1950 Exportverbote britischer Schafe als Konsequenz, was aufgrund der ökonomischen Verluste starke Forschungsbemühungen nach sich zog. Ein Jahrzehnt später gelang die erfolgreiche Übertragung des noch unbekannten Erregers auf die Maus, womit ein Tiermodell zur Verfügung stand (Chandler, 1961). Die außergewöhnlichen Eigenschaften des Erregers wie Hitze-, UVund Röntgenstrahlenbeständigkeit (Alper et al., 1966) deuteten auf ein nukleinsäurefreies Pathogen hin, woraufhin 1967 die Hypothese eines Proteins als Krankheitsauslöser aufkam (Griffith, 1967). Diese Annahme konnte zwei Jahrzehnte später durch weitere ermittelte Erregereigenschaften wie der Resistenz gegenüber konventioneller Sterilisationsverfahren, so zum Beispiel Formaldehydbehandlung (Pattison, 1965) oder Autoklavieren (Prusiner, 1982), als auch gegenüber Nukleinsäure zerstörenden Agenzien, wie DNase, Psoralen oder Hydroxylamin (Bellinger-Kawahara et al., 1987) bestätigt werden. Trotz dieser Erkenntnisse war ein Protein als alleiniger Erreger damals nicht 1

8 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG vorstellbar, so dass man an der bisherigen Theorie, die wegen der sehr langen Inkubationszeit nach einer experimentellen Übertragung auf Affen einen slow virus als Auslöser postulierte, festhielt (Gajdusek et al., 1966; Gajdusek, 1977) gelang es Stanley Prusiner bei Scrapie infizierten Hamstern ein infektiöses Extrakt zu isolieren, dass imstande war, amyloide Ablagerungen zu bilden (Prusiner, 1982). Da sich die Infektiosität nur durch denaturierende Prozesse verringern ließ, kam er wiederum zu dem Schluss, dass Proteine essentieller Bestandteil des Agens sein mussten und definierte diese proteinaceous infectious particles im Kontrast zu bisherigen Pathogenen als Prionen. Wenig später kam heraus, dass es sich nur um ein Protein handelte, und er bezeichnete dieses als Prion-Protein (PrP). Auch bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen des Nervensystems, wie zum Beispiel Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson, sind Proteine die Krankheitsauslöser, jedoch ist eine Übertragbarkeit nur bei Prionenerkrankungen bekannt Prionenerkrankungen bei Tieren Neben Scrapie bei Schafen und Ziegen (Parry, 1962) kommt BSE (bovine spongiform encephalopathy) bei Rindern eine große Bedeutung zu. Der erste Fall von BSE wurde 1986 in Großbritannien dokumentiert (Wells et al., 1987) und zog eine Epidemie nach sich, die für globales Aufsehen sorgte. Die Verfütterung von mit Prionen kontaminiertem Tiermehl (meat and bone meal, MBM) als Bestandteil des Rinderkraftfutters gilt als wahrscheinlicher Auslöser der Infektion ganzer Herden (Wilesmith, 1993) mit einer bisher geschätzten Zahl von einer Million erkrankter Rinder weltweit (Anderson et al., 1996). Aufgrund der ernormen wirtschaftlichen Einbußen und der Befürchtung einer weiteren Ausbreitung wurde die Tiermehlverfütterung bereits 1988 und der Export von Rindern aus dem Vereinigten Königreich 1989 per EU-Rechtsvorschrift untersagt, so dass die Anzahl infizierter Tiere seit 1992 wieder rückläufig ist. Eine Vielzahl weiterer animalischer Prionenerkrankungen sind seitdem beschrieben worden (Tabelle 1), denen Verhaltensauffälligkeiten wie Aggressivität, stereotypes Kratzen und ataktische Merkmale gemein sind. So beobachtet man seit einigen Jahren einen ähnlichen Krankheitsverlauf bei Nerzen (transmissible mink encephalopathy, TME) (Marsh, R. et al., 1992), Katzen (feline spongiform encephalopathy, FSE) (Lehmann et al., 1996) und verschiedenen Zootieren (Jeffrey et al., 1988; Kirkwood et al., 1990). Mit 2

9 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG Ausnahme der CWD (chronic wasting disease) bei frei lebenden nordamerikanischen und kanadischen Hirschen (Spraker et al., 1997) ist es wahrscheinlich, dass der Erreger der BSE die Speziesbarriere durchbrach und über infiziertes Futter übertragen wurde (Pearson et al., 1991). Bestätigend erscheint die Tatsache, dass sich diese Prionenerkrankungen im selben Zeitabschnitt entwickelten und bei Untersuchungen erkrankter Tiere tatsächlich BSE-Prionen entdeckt wurden (Bruce et al., 1994; Collinge et al., 1996a). Trotzdem sind nicht alle domestizierten Tierarten für eine Prioneninfektion gleichermaßen anfällig; bei Hunden und Vögeln konnte bislang keine TSE festgestellt werden, und bei Schweinen scheiterte sogar eine experimentelle orale Infektion (Dawson et al., 1990). Allerdings lieferten später zahlreiche Studien den Beweis, dass eine Übertragung von BSE auf den Menschen erfolgt war (Hill et al., 1997; Collinge, 2001; Weissmann et al., 2002) und dadurch eine neue Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (variant Creutzfeldt-Jakob disease, vcjd) schuf. Krankheit Spezies Ursache Scrapie Schafe, Ziegen sporadisch, orale Übertragung vertikale / horizontale Infektion BSE Rinder orale Übertragung bovine spongiform encephalopathy FSE Katzen orale Übertragung feline spongiform encephalopathy (Rindergewebe) TME Nerze orale Übertragung transmissible mink encephalopathy (Rindergewebe) CWD Hirsche unklar, evtl. ähnlich wie Scrapie chronic wasting disease Tabelle 1: Prionenerkrankungen bei Tieren und deren Ursachen Prionenerkrankungen beim Menschen Die sehr selten auftretenden humanen Prionenerkrankungen können auf drei unterschiedliche Arten initiiert werden, was unter allen Krankheiten einmalig ist. So sind sowohl sporadische als auch hereditäre (vererbbare) und infektiöse TSE beim Menschen bekannt (Tabelle 2) (Prusiner, 1989). 3

10 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG 1920 dokumentierte der Kieler Neurologe Hans Creutzfeldt den Fall einer 22-jährigen Frau, die an progressiver Demenz, Tremor und Lähmungen litt (Creutzfeldt, 1920). Sein Hamburger Kollege Alfons Jakob beschrieb anhand fünf ähnlicher Fälle die Neuropathologie dieser Erkrankung wenig später. Er stellte dabei amyloide Ablagerungen und schwammartig aufgelockertes Gehirngewebe fest (Jakob, 1921). Die sporadische Form der nach ihren Entdeckern benannten Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (scjd) tritt mit einer Wahrscheinlichkeit von etwa einem Patienten pro Jahr und Million Einwohner auf (Masters et al., 1979) und macht etwa 90% aller menschlichen Prionenerkrankungen aus. Typischerweise tritt sie beim Betroffenen im Alter von 60 Jahren auf und führt unter Begleitung der charakteristischen Symptome wie dem Verlust der Bewegungskoordination und geistiger Funktionen nach wenigen Monaten zum Tod. Wie Prionen in scjd-patienten spontan entstehen können, ist unbekannt. Weder eine genetische Prädisposition noch eine Infektion kann das Auftreten von scjd bisher erklären (Collinge, 2001). Fast 10% aller Prionenerkrankungen sind genetisch bedingt und treten familiär gehäuft auf. Dies hängt mit Fehlern des Gens PRNP zusammen, das die genetische Information für die Herstellung des humanen Prion-Proteins (PrP C ) enthält. Gegenwärtig sind mehr als 50 Punkt- oder Insertionsmutationen bekannt, die autosomal dominant vererbt werden und somit zu einer hereditären Prionenerkrankung führen (Kong, 2004). Diese manifestieren sich gewöhnlich im mittleren Alter der Patienten und haben leicht unterschiedliche Ausprägungen wurde in Wien das Gerstmann-Sträussler- Scheinker-Syndrom (GSS) als eine Erkrankung mit begleitender Ataxie und Kleinhirnschädigungen mit amyloiden Ablagerungen beschrieben (Gerstmann, 1936). Die familiäre Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (fcjd) hat hingegen einen wesentlich kürzeren Krankheitsverlauf (Haltia et al., 1979). Durch schwere Schlafstörungen, Neuronenverlust und Gliose im Thalamus ist die erst seit relativ kurzem bekannte tödliche familiäre Insomnie (fatal familial insomnia, FFI) gekennzeichnet (Medori et al., 1992; Gambetti et al., 1995; Reder et al., 1995). Kuru wurde 1957 als erste infektiöse menschliche Prionenerkrankung bekannt (Gajdusek et al., 1957). Sie trat epidemisch unter den Mitgliedern der Fore-Volksgruppe in Papua-Neuguinea auf und wurde dort als der lachende Tod bezeichnet. Systematisch wurden mögliche Ursachen und die neuropathologischen Veränderungen untersucht 4

11 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG (Klatzo et al., 1959) und bereits 1958 entdeckten die Forscher Gajdusek und Hadlow Ähnlichkeiten zwischen Kuru und Scrapie. Die Übertragung der Krankheit erfolgte offenbar durch kannibalistische Rituale nach dem Tod von Angehörigen über eine enterale Infektion oder manuell durch indirekten mukösen Kontakt (Alpers, 1975; Gajdusek, 1977). Offenbar war ein einzelner Fall von scjd der Auslöser. Nachdem 1959 der Verzehr des Gehirns Verstorbener verboten wurde, konnte Kuru nur noch selten nachgewiesen werden (Gajdusek, 1996). Die sorgfältige Überwachung der Kuru-Fälle ermöglichte einen Einblick in die langen Inkubationszeiten von bis zu 50 Jahren bei der Mensch-zu-Mensch-Übertragung von Prionen (Collinge et al., 2006). Krankheit Initiation Ursache scjd sporadisch vermutlich sporadische Konversion sporadic Creutzfeldt-Jakob disease von PrP C zu PrP Sc fcjd familial Creutzfeldt-Jakob disease GSS Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome FFI fatal familial insomnia hereditär hereditär hereditär PRNP Mutationen häufig: E200K oder D178N (Goldfarb et al., 1990; Kovanen, 1993) PRNP Mutationen häufig: P102L (Hsiao et al., 1989) PRNP Mutation D178N in Kombination mit M129 (Goldfarb et al., 1992) Kuru infektiös Endokannibalismus icjd iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease vcjd variant Creutzfeldt-Jakob disease PSPr protease-sensitive prionopathy infektiös infektiös unbekannt iatrogene Übertragung Übertragung durch kontaminierte Rindfleischprodukte unbekannt Tabelle 2: Humane Prionenerkrankungen und deren Ursachen. Prionenerkrankungen können auch durch eine unbeabsichtigte Infektion mit dem Erreger verursacht werden. So traten iatrogene CJD-Fälle (icjd) nach Transplantation 5

12 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG von infiziertem Gewebe (Hirnhaut und Hornhaut), Verwendung von ungenügend sterilisiertem Operationsbesteck und Hirnelektroden (Duffy, P. et al., 1974; Bernoulli et al., 1977) oder Verabreichung von kontaminierten Hormonpräparaten, die aus der Hirnanhangsdrüse (Hypophyse) gewonnen wurden, auf (Brown, P., 1988). Eine Übertragung durch mit vcjd kontaminierten Blutkomponenten konnte nachgewiesen werden, nachdem Empfänger die Krankheit nur kurze Zeit später ebenfalls entwickelten und starben (Llewelyn et al., 2004; Peden et al., 2004). Seit dem Auftreten der BSE-Epidemie bestand immer die Befürchtung, dass sich die Krankheit über infektiöses Rindfleisch auf den Menschen übertragen könnte. Aus diesem Grund wurde in Großbritannien ein nationales Überwachungsprogramm etabliert, und tatsächlich fielen im Jahr 1995 Patienten auf, die an einer neue Variante der CJD (vcjd) zu leiden schienen (Chazot et al., 1996; Will et al., 1996). Im Gegensatz zur klassischen CJD zeigten die vcjd-patienten mit 16 bis 53 Jahren ein deutlich früheres Erkrankungsalter, einen um bis zu 14 Monate verlängerten Krankheitsverlauf und ein stärker psychiatrisch geprägtes Krankheitsbild, das durch Depressionen und Wesensveränderungen geprägt war (Zeidler et al., 1997; Hill et al., 1999). Neben Kleinhirnsyndromen und Ataxie wurden in Gehirnen amyloide Ablagerungen sowie die für Kuru typische schwammartige Vakuolisierung (floride plaques) des Gewebes detektiert (Abbildung 1) (Will et al., 1996). Auffällig war auch das Auffinden von PrP Sc in lymphoreticulären Organen und die Tatsache, dass im Codon 129 des Gens PRNP alle Betroffenen homozygote Anlagen für die Aminosäure Methionin aufwiesen, was auf etwa 37% der Bevölkerung zutrifft (Collinge et al., 1996b). Abbildung 1: Pathologische Veränderungen bei vcjd-patienten. Floride plaques im cerebralen Cortex (links) und PrP Sc -Ablagerungen in follikulär-dendritischen Zellen (fdc) einer Tonsillen-Biopsie (rechts). (Bildquelle: Brandner, 2007) (Brandner, 2007) 6

13 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG Nicht nur die zeitliche und räumliche Korrelation (Abbildung 2) von vcjd- Erkrankten mit der BSE-Epidemie in Großbritannien sondern auch eine Reihe von Experimenten lieferten den Nachweis, dass über kontaminiertes Gehirngewebe, das damals als Bindemittel für verschiedene Rindfleischprodukte verwendet wurde, eine Übertragung von BSE-Prionen auf den Menschen stattgefunden hatte. So konnte einerseits eine mit vcjd-patienten vergleichbare Neurohistologie in mit BSE infizierten Primaten bestimmt werden (Lasmezas et al., 1996). Andererseits wurden sowohl ähnliche Läsionsprofile und Inkubationszeiten bei Mäusen, denen vcjd- oder BSE-Prionen injiziert wurden (Bruce et al., 1997; Hill et al., 1997), als auch übereinstimmende biochemische Charakteristika von PrP Sc beider Stämme entdeckt (Collinge et al., 1996b). Bislang konnten nur unzureichende Aussagen über eine wahrscheinliche vcjd-epidemie getroffen werden. Eine Therapie dieser tödlichen Erkrankung ist bis heute nicht möglich. Abbildung 2: BSE- und vcjd-fälle in Großbritannien bis Die BSE-Epidemie erreichte 1992 mit Fällen ihren Höhepunkt (blau). Aufgrund der sofortigen Gegenmaßnahmen sind die Zahlen seitdem rückläufig. Die meisten vcjd-neuinfektionen 28 Fälle im Jahr 2000 (rot) wurden mit acht Jahren Verschiebung zum Höhepunkt der BSE-Epidemie (blau) gezählt. (Datenquellen: OIE - World Organisation for Animal Health und The National Creutzfeldt-Jakob Disease Surveillance Unit, NCJDSU) In der Mitte dieses Jahres wurden einige Patientenfälle bekannt gegeben, bei denen eine abnormal gefaltete Form des Prion-Proteins in wesentlich geringeren Mengen als bei bisher beschriebenen Prionenerkrankungen nachgewiesen werden konnte. Es stellte sich ferner eine abweichende Histopathologie und Physikochemie heraus, die durch die Protease-Sensitivität der neuen PrP-Spezies bedingt wird (Gambetti et al., 2008). Die so bezeichneten Protease-sensitiven Prionopathien (protease-sensitive prionopathy, PSPr) 7

14 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG sind nach bisheriger Meinung der Autoren dieser Studie keine selten auftretenden Fälle unter den TSE. Viele könnten jedoch aufgrund der abweichenden Charakteristika dieser neuen Erscheinungsform fälschlicherweise als Nicht-Alzheimersche Demenzerkrankungen (non-alzheimer s dementia) klassifiziert worden sein Die protein only-hypothese Nachdem Stanley Prusiner das 33 bis 35 kda Prion-Protein als das infektiöse Agens von TSE identifiziert hatte, sollte nun die dazugehörige kodierende Sequenz im Erbgut bestimmt werden. Über eine Peptidsequenzierung (Edman, 1949) wurde die Aminosäuresequenz am N-Terminus von PrP entschlüsselt, so dass unter Verwendung des genetischen Codes eine molekulare Sonde erzeugt werden konnte, mit der es gelang, das Gen Prnp (Homolog des humanen PRNP) in einer DNA-Bibliothek aufzuspüren (Prusiner et al., 1984). Eine anschließende Studie hatte zum Ergebnis, dass die Menge an Prnp-messenger-RNA (mrna) in Scrapie infiziertem und gesundem Gewebe identisch war (Oesch et al., 1985). Die zusätzliche Beobachtung, dass ein in Mäusen gebildeter Antikörper gegen Hamster Prionen auch mit gesundem Gewebe reagierte (Meyer et al., 1986), ließ Zweifel an der Richtigkeit von PrP als Erreger aufkommen. Als Erklärung für dieses Phänomen wurde ein Modell erstellt, das zwei Formen, eine harmlose und eine krankheitserregende vorsah. Tatsächlich konnte bei aufgereinigten Extrakten aus krankem und gesundem Gewebe eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber einer proteolytischen Behandlung festgestellt werden. Bei infektiösem PrP blieb stets unter Abspaltung eines kleinen Teils ein Fragment bestehen, welches als PrPres bezeichnet wird (Bolton et al., 1982). Zur besseren Unterscheidung wurde fortan das unbehandelte infektiöse Protein als PrP Sc (scrapieförmiges Prion-Protein) und das Normale als PrP C (zelluläres Prion-Protein) bezeichnet. Später konnten weitere biochemische Unterschiede beider PrP-Formen bestimmt werden (Tabelle 3) (McKinley et al., 1991; Prusiner, 1991; Cohen et al., 1998). Ein Dogma der Biologie sagte damals aus, dass sich biologische Information nur in eine Richtung ausbreiten kann: von der DNA zum Protein. Es stellte sich also die Frage, wie sich ein Erreger ohne genetisches Material replizieren konnte. Da der wesentliche Unterschied zwischen PrP C und PrP Sc in der abgewandelten Sekundärstruktur besteht, lag es nahe, dass bei Kontakt beider Moleküle ein Umwandlungsprozess in Gang gesetzt 8

15 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG wurde. Die aufgrund dieser Überlegungen aufgestellte protein only-hypothese besagt, dass Prionen teilweise oder vollständig aus einer abnormal umgefalteten Isoform des endogenen zellulären Prion-Proteins bestehen und bei der Infektion eines Organismus die Konversion von PrP C zu pathologischem PrP Sc auslösen (Prusiner, 1982). Der endgültige Beweis für diese Theorie, die de novo-herstellung von infektiösem PrP Sc im Reagenzglas, steht noch aus. Allerdings gelang es, rekombinantes PrP C physikochemisch in Proteinase K-resistente PrP Sc -ähnliche Formen umzuwandeln (Kocisko et al., 1994; Mestel, 1996; Jackson et al., 1999). Infektiosität konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. In einer weiteren Studie wurde die Herstellung von amyloiden Fibrillen aus rekombinantem Prion-Protein beschrieben, welche nach Inokulation auf transgene Mäuse, die nur ein Teilstück des PrP C exprimieren, nach langer Inkubationszeit zu Scrapie-typischen Symptomen führte (Legname et al., 2004). Die Entwicklung einer Krankheit blieb bei wildtypischen Mäusen jedoch aus, so dass fraglich bleibt, ob die Erzeugung infektiösen Proteins gelang. Eigenschaften PrP C PrP Sc PrPres Infektiosität nein ja ja Proteasebehandlung sensitiv partiell resistent, resistent (sensitiv bei PSPr) Detergenslöslichkeit ja nein nein Molekulargewicht [kda] Halbwertszeit kurz (2-4h) lang (>24h) lang (>24h) Aggregationskonformationen Monomer, Dimer, Oligomer Monomer, Dimer, Oligomer amyloide Fibrillen Sekundärstruktur α-helices: 42% β-faltblätter: 3% α-helices: 30% β-faltblätter: 43% α-helices: 21% β-faltblätter: 54% Tabelle 3: Biochemische Eigenschaften von PrP C, PrP Sc und PrPres Die Strukturen von PrP C und PrP Sc Das murine Prion-Protein wird durch das Gen Prnp kodiert, welches auf Chromosom 2 vorliegt und in drei Exons unterteilt ist (Sparkes et al., 1986). Der offene Leserahmen (open reading frame, ORF) ist auf Exon 3 begrenzt (Basler et al., 1986), und das vollständige Translationsprodukt besteht aus 254 Aminosäuren (Abbildung 3). 9

16 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG Nach der Translation der mrna im rauen endoplasmatischen Retikulum (rer) wird das Protein einigen Modifikationen unterzogen. Am aminoterminalen Ende werden 22 Aminosäuren abgespalten, die als Leitsequenz für den Import in das rer benötigt werden. Im weiteren Verlauf werden die Asparagin-Reste 180 und 196 glykosyliert (Haraguchi et al., 1989) und eine stabilisierende Disulfidbrücke zwischen den Cystein- Resten 178 und 213 ausgebildet (Hope et al., 1986). Durch den Golgi-Apparat gelangt PrP C über den sekretorischen Weg zur Plasmamembran, wo die 24 hydrophoben carboxyterminalen Aminosäurereste entfernt werden (Borchelt et al., 1990; Taraboulos et al., 1990; Caughey, 1991) und das Protein über einen Glykosylphosphatidylinositol- Anker (GPI) mit der Zelloberfläche verknüpft wird (Caughey, 1991). Auf der Zelloberfläche liegt PrP C vermutlich als Monomer vor auch wenn Theorien über eine Dimer-Ausbildung vorliegen (Knaus et al., 2001) und reichert sich in speziellen Mikrodomänen an (lipid rafts), die durch einen hohen Gehalt an Cholesterolen und Sphingolipiden gekennzeichnet (Simons et al., 1997) oder mit Clathrin-coated pits assoziiert sind (Shyng et al., 1994). Von dort wird das Prion-Protein über Endocytose internalisiert (Shyng et al., 1993) und zum Teil wieder auf die Oberfläche zurück transportiert (Caughey et al., 1989). Die Bedeutung dieses Recyclings von PrP C ist unbekannt und wird gegenwärtig kontrovers diskutiert. Abbildung 3: Schematische Darstellung des murinen Prion-Proteins. Das ausgereifte Prion-Protein unterteilt sich in eine strukturlose und daher flexible aminoterminale (Hornemann et al., 1997) und eine globuläre carboxyterminale Domäne. Weitere bedeutende Regionen innerhalb der flexiblen Domäne sind zum einen die fünf hochkonservierten repetitiven Aminosäuresequenzen PQGGTWGQ (51 bis 91), die als Octarepeat-Region bezeichnet werden und imstande sind, Kupfer(II)- und andere Metallionen zu binden (Brown, D. et al., 1997a). Zum anderen sind die Stopp Transfer Effektor Sequenz (STE, 95 bis 111) sowie die anschließende hydrophobe transmembrane Region (TM, 112 bis 126) bekannt. 10

17 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG Der globuläre Teil von PrP C ist vorwiegend durch Sekundärstrukturen charakterisiert. Mithilfe des Kernresonanz-Spektroskopie-Verfahrens (nuclear magnetic resonance, NMR) konnte anhand rekombinanten Proteins ermittelt werden, dass bei PrP C etwa 42% der Aminosäureketten zu insgesamt drei α-helices aufgewunden ist: Helix 1 (144 bis 151), Helix 2 (179 bis 193) und Helix 3 (200 bis 217) (Riek et al., 1996; Riek et al., 1997; Eghiaian, 2005). Der Anteil an β-faltblattstrukturen ist mit 3% gering und bildet zwei antiparallele Stränge, die die Helix 1 flankieren (Abbildung 4). Abbildung 4: NMR-Struktur von rekombinantem PrP C und PrP Sc. Der globuläre Teil des PrP C (links) gliedert sich in drei α-helices (H1, H2 und H3) sowie zwei β-faltblätter (β1 und β2). Bei PrP Sc (rechts) ist der α-helicale Anteil geringer, es bildet sich eine β-helix aus. (Bildquelle: adaptiert von Eghiaian, 2005) Die zelluläre und die pathogene Form des Prion-Proteins sind in ihrer Primärstruktur identisch, Unterschiede lassen sich lediglich in der Sekundärstruktur feststellen. So weist die infektiöse Isoform PrP Sc einen größeren Anteil an β-faltblättern auf (43%), wobei der α-helicale Anteil auf 30% verringert ist (Pan et al., 1993). Dies lieferte sowohl die Erklärung für die ungewöhnlich hohe Stabilität als auch für die Protease-Resistenz des Proteins. Aufgrund computergestützter Modellanalysen (Cohen et al., 1994) geht man mittlerweile davon aus, dass bei PrP Sc die Helix 1 mit beiden angrenzenden β-faltblättern in eine linksdrehende β-helix umgewandelt wird und mit zwei weiteren fehlgefalteten PrP-Molekülen ein Trimer bildet (Wille et al., 2002). Polymerisieren mehrere dieser Trimere, so entstehen die charakteristischen amyloiden Fibrillen (prion rods), die sich im erkrankten Gewebe ablagern (Abbildung 5) (Govaerts et al., 2004). 11

18 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG Abbildung 5: Modellvorstellungen für PrP Sc -Aggregate. Drei fehlgefaltete PrP-Moleküle bilden ein Trimer (links). Polymerisieren mehrere dieser Trimere, so bildet sich ein amyloides Aggregat (rechts). (Bildquelle: Govaerts et al., 2004) Die Konversion von PrP C zu PrP Sc Eine Reihe von Experimenten, in denen PrP C -defiziente Mäuse, so genannte knock out- Mäuse (Prnp 0/0 ), mit hohen Mengen an infektiösem PrP Sc inokuliert wurden, hatten zum Ergebnis, dass die Tiere nicht erkrankten, sondern vollständig resistent gegenüber dem Pathogen waren (Bueler et al., 1993; Prusiner et al., 1993). Nach Einführung eines PrP- Transgens war die Anfälligkeit der Tiere jedoch wieder hergestellt (Whittington et al., 1995; Fischer et al., 1996). Dies war nicht nur ein weiterer Hinweis für die Richtigkeit der protein only-hypothese, sondern lieferte auch den Hinweis, dass PrP C eine essentielle Rolle bei der Replikation von Prionen spielen muss. So erscheint eine direkte Interaktion beider PrP-Spezies notwendig für die Entstehung von PrP Sc, bei der im Wesentlichen das Proteingerüst im Bereich der Aminosäuren 90 bis 112 umstrukturiert wird und dadurch die Konversion der Helix 1 und der beiden kurzen β-faltblätter in die stabile β-helix verursacht. Der Ort der Replikation konnte bislang nicht genau lokalisiert werden, vermutet werden endosomale/lysosomale Kompartimente oder die lipid rafts an der Zelloberfläche (Caughey et al., 1991; Borchelt et al., 1992; Mayer et al., 1992; Arnold et al., 1995; Baron et al., 2003). Bis heute werden zwei unterschiedliche Modelle diskutiert, die den Replikationsmechanismus von PrP Sc erklären. Das Faltungs- oder Heterodimermodell (Prusiner et al., 1990; Cohen et al., 1994) sieht vor, dass PrP C mitunter in einem teilentfalteten Stadium vorliegt und in der Gegenwart 12

19 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG von PrP Sc, möglicherweise mithilfe eines molekularen Chaperons, ein Heterodimer bildet und gänzlich umgefaltet wird (Abbildung 6a). Derart neu gebildetes PrP Sc kann nun entweder in zwei Monomere dissoziieren und in einem autokatalytischen Prozess die Restrukturierung weiterer zellulärer PrP-Moleküle vornehmen oder in Trimeren zu amyloiden Ablagerungen aggregieren. Die aufzubringende Aktivierungsenergie für die Konversion ist wahrscheinlich sehr hoch (Cohen et al., 1994), so dass eine spontane Entstehung sehr selten ist und eher im hohen Alter auftritt. Diese Annahme würde ebenfalls das Vorhandensein vererbbarer Prionenerkrankungen erklären, da bestimmte Mutationen in der Aminosäureabfolge des Prion-Proteins eine Verminderung der Aktivierungsenergie für die Umfaltung bedingen könnten. Um die Replikation zu initiieren, müsste nach Infektion mit PrP Sc der Transport in das Zentrale Nervensystem (ZNS) vorhergehen, ein Prozess der als Neuroinvasion bezeichnet wird. Dafür stellte man sich das körpereigene Immunsystem als Transportapparat vor, und in der Tat erkannte man anhand resistenter, immundefizienter Mäuse die Notwendigkeit eines intakten Abwehrsystems für die Entwicklung der Krankheit. Nach oraler Aufnahme des Erregers sind wahrscheinlich spezialisierte Darmepithelzellen, so genannte microfold cells (M- Zellen), für den Transport der infektiösen Prionen durch das Darmepithel verantwortlich (Heppner et al., 2001). Dendritische Zellen (DC) könnten an dem anschließenden Transport des Erregers in das ZNS beteiligt sein. Ein Hinweis dafür liefert die Beobachtung, dass sich PrP Sc -Akkumulation bereits in frühen Stadien im lymphatischen Gewebe wie den Peyerschen Plaques lokalisieren lässt (Prinz et al., 2003). Das Keimbildungsmodell (Abbildung 6b) hingegen postuliert ein thermodynamisch reguliertes Gleichgewicht zwischen beiden PrP Isoformen, das heißt die Konversion ist reversibel, wobei die PrP C -Form begünstigt wird (Brown, P. et al., 1990; Come et al., 1993; Caughey et al., 1995). Das Gleichgewicht wird hingegen gestört, wenn sich mehrere PrP Sc -Monomere zu einem kleinen Aggregat, dem Kristallisationskeim, formieren. Dies ist jedoch ein sehr seltenes und langsames Ereignis (Brown, P. et al., 1991), könnte aber auch durch eine Infektion initiiert werden. Weitere akkumulierende PrP Sc -Moleküle führen zu einem exponentiellen Anstieg der pathogenen PrP-Isoform, dabei wird eine regelmäßige Fragmentierung des Aggregats vorausgesetzt, damit weitere Anlagerungsflächen entstehen können (Jarrett et al., 1993; Orgel, 1996). Dieses Modell liefert eine Hypothese für das Vorhandensein mehrerer, biochemisch voneinander 13

20 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG abweichender PrP Sc -Stämme, die außerdem durch unterschiedliche Inkubationszeiten und neuropathologische Veränderungen charakterisiert sind (Bessen et al., 1992; Collinge et al., 1996b; Telling et al., 1996; Bruce, 2003). Die stammspezifischen Eigenschaften von PrP Sc könnten über die polymerisierten Aggregate übertragen und erhalten bleiben. Hereditäre TSE würden durch dieses Modell ebenfalls zu erklären sein, da auch hier mutierte PrP-Moleküle das vorhandene thermodynamische Gleichgewicht auflösen könnten. Abbildung 6: PrP Sc -Replikationsmodelle. Nach dem Umfaltungsmodell ist eine spontane Konversion sehr selten. Infektiöses PrP Sc könnte jedoch den Prozess katalysieren und beschleunigen (a). Das Keimbildungsmodell geht von einem Gleichgewicht beider PrP-Formen aus, welches in Anwesenheit eines Kristallisationskeimes gestört würde (b). (Bildquelle: adaptiert von Aguzzi et al., 2004) (Aguzzi et al., 2004) Es gibt es mehrere experimentelle Befunde, die das Keimbildungsmodell unterstützen. Zum einen ist es möglich, rekombinantes PrP in vitro zu konvertieren und dabei die stammspezifischen Charakteristika verschiedener Prionenstämme zu erhalten (Bessen et al., 1995; Kocisko et al., 1995; Vanik et al., 2004). Zum anderen liefert die protein misfolding cyclic amplification (PMCA) den Beweis für den im Keimbildungsmodell angenommenen Vermehrungsmechanismus (Saborio et al., 2001). Dabei wird ein Gehirnhomogenat eines gesunden Tieres mit einer kleinen Menge PrP Sc -infizierten Gewebes inkubiert, um die Konversion zu initiieren. Eine Ultraschallbehandlung 14

21 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG fragmentiert das wachsende Aggregat, so dass nach mehreren Zyklen eine exponentielle Vermehrung der pathogenen Isoform festgestellt werden kann. Es gibt jedoch Befunde, die darauf hinweisen, dass eine weitere Komponente, Faktor X genannt, für die Replikation notwendig sein könnte (Telling et al., 1995; Kaneko et al., 1997). So erkrankten transgene Mäuse nicht nach Inokulation mit CJD-Gehirnhomogenat, wenn diese ausschließlich humanes PrP C exprimierten, während Tiere, die ein chimäres Maus/Mensch-PrP erzeugten, anfällig waren (Telling et al., 1994). Man geht davon aus, dass Faktor X möglicherweise hochaffin für körpereigenes PrP ist und nicht imstande ist, körperfremde PrP Sc -Replikation zu katalysieren. Ob es sich bei Faktor X etwa um ein molekulares Chaperon handelt, konnte bisher nicht aufgeklärt werden Die physiologische Funktion von PrP C Das Prion-Protein ist unter Säugetierspezies hoch konserviert (Schatzl et al., 1995; Wopfner et al., 1999). Entsprechende Proteine mit homologer Funktion konnten auch in anderen Vertebratenklassen wie Vögeln (Harris et al., 1991) und Fischen (Gibbs et al., 1997) ausfindig gemacht werden. PrP C wird in nahezu allen Geweben exprimiert (Bendheim et al., 1992; Ford et al., 2002). Das hauptsächliche Vorkommen wurde jedoch in Neuronen (Kretzschmar, H. A. et al., 1986), und dort vorwiegend im synaptischen und präsynaptischen Bereich (Borchelt et al., 1994; Fournier et al., 1995; Herms et al., 1999), sowie in geringeren Mengen in anderen Zellen des ZNS, wie zum Beispiel Astrozyten, Oligodendrozyten und Schwann-Zellen bestimmt (Moser et al., 1995). In der Peripherie wurde das Prion-Protein in der Skelett-Muskulatur (Brown, D. et al., 1998b), in lymphoidem Gewebe (Dodelet et al., 1998; Brown, K. et al., 1999b; Burthem et al., 2001; Liu et al., 2001) sowie im Darmgewebe nachgewiesen (Morel et al., 2004). Aufgrund des Vorkommens von PrP C in neuronalem Gewebe so vieler Wirbeltier-Spezies kann eine wichtige physiologische Funktion des Proteins angenommen werden. Die Prnp-knock-out-Studien gaben jedoch auch diesbezüglich keinen Aufschluss, da bei betroffenen Tieren kein gravierender Phänotyp festzustellen war (Bueler et al., 1992), außer einer geringen Beeinträchtigung der GABAergen Inhibition, der Langzeit- Potenzierung (Collinge et al., 1994) und des zirkadianen Rhythmus (Tobler et al., 1996), der die Schlaf- und Wachphasen reguliert. Später wurde dokumentiert, dass Neuronen im Hippocampus PrP C -defizienter Tiere eine niedrigere Signaleingangsschwelle gegenüber 15

22 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG eingehenden Aktionspotentialen aufweisen (Colling et al., 1996). Da dieser Mechanismus Calcium-Ionen-abhängig ist, vermutete man zunächst die intrazelluläre Aufrechterhaltung der Calcium-Homöostase als Funktion für PrP C. Möglicherweise ist das Prion-Protein als GPI-verankertes Protein auf der Zelloberfläche als Rezeptor in verschiedenen Signaltransduktionspathways aktiv. Im Laufe der Zeit wurden etliche Interaktionspartner in vitro identifiziert, so konnte zum Beispiel über ein Hefe-Zwei-Hybrid-Assay (yeast two-hybrid, Y2H) eine direkte Bindung von PrP C mit einer Vorstufe des Laminin-Rezeptors (laminin receptor precursor, LRP) ermittelt werden (Rieger et al., 1997; Gauczynski et al., 2001). Weitere Bindungspartner sind unter anderem Caveolin-1 (Mouillet-Richard et al., 2000) und das Zelladhäsionsmolekül N-CAM (Schmitt-Ulms et al., 2001), die nach Interaktion mit PrP C eine erhöhte Aktivität der Fyn-Kinase zur Folge hatten. Dieses Zusammenspiel führte ebenso wie die Interaktion mit dem LRP zu einer Stimulation des axonalen Wachstums in Zellkulturen (Graner et al., 2000; Santuccione et al., 2005). Des Weiteren wurden neuroprotektive Eigenschaften des Prion-Proteins nach Identifikation der Heat shock Proteine STI-1 (Zanata et al., 2002) und Hsp60 (Edenhofer et al., 1996) und des antiapoptotischen Faktors Bcl-2 (Kurschner et al., 1995) als Bindungspartner diskutiert. In den meisten Fällen ist jedoch eine physiologische Relevanz gering, da diese Proteine nicht im selben Kompartiment wie PrP C agieren und daher eine Interaktion in vivo eher unwahrscheinlich ist (Westergard et al., 2007). Sehr ausführlich wird eine potentielle cytoprotektive Rolle des Prion-Proteins diskutiert, da sowohl in Zellkultur als auch im Modellsystem Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) Bax-vermittelte Apoptose durch PrP C -Expression inhibiert werden kann (Bounhar et al., 2001; Roucou et al., 2003; Li et al., 2005). Zwei unterschiedliche Mausmodelle belegen die Annahme einer cytoprotektiven Funktion des PrP C. Zum einen gelang es, eine aminoterminale Domäne zu identifizieren, die die Aminosäuren 106 bis 121 umfasst (Flechsig et al., 2004a) und essentiell für die normale Funktion des Prion- Proteins ist. Die Expression einer trunkierten PrP-Mutante (tr-prp), bei der die Aminosäuren 32 bis 134 deletiert sind (PrP ), führte zu einer progressiven Kleinhirndegeneration mit ataktischem Phänotyp in transgenen Prnp 0/0 -Mäusen, die durch die Ko-Expression eines wildtypischen PrP-Allels unterdrückt werden konnte (Shmerling et al., 1998; Flechsig et al., 2003; Weissmann et al., 2003). Zum anderen 16

23 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG wurde in bestimmten Prnp-knock-out-Mauslinien (Prnp -/- ) ein Protein aufgrund spezieller Spleißereignisse im Gehirn ektopisch exprimiert, was wiederum zu einem Verlust der Purkinje-Zellen im Kleinhirn führte (Sakaguchi et al., 1996; Moore et al., 1999; Rossi et al., 2001), aber in Anwesenheit von normalem PrP C aufgehoben werden konnte (Nishida et al., 1999). Dieses Protein wurde aufgrund der hohen Sequenzhomologie zu PrP C Doppel (Dpl) genannt und ähnelt wegen des Fehlens des Aminoterminus der trunkierten Form des Prion-Proteins. Die Beobachtungen, dass PrP C imstande ist, die neurotoxischen Auswirkungen von tr- PrP und Dpl zu unterbinden, führten zu einem Modell, in dem PrP C als Rezeptor für einen fiktiven Liganden dient (Abbildung 7) (Flechsig et al., 2004b). Dabei bindet der Ligand an die globuläre Region mit hoher Affinität, wobei die flexible aminoterminale Region die Signaltransduktion auslöst. Fehlt, wie im Falle der Präsenz von tr-prp oder Dpl, die aminoterminale Domäne, kommt es zwar zur Bindung, nicht aber zum Auslösen einer Signalkaskade. Der fehlende Phänotyp in PrP C -defizienten Mäusen kann dadurch erklärt werden, dass ein funktionelles Homolog π, welches von dem Liganden mit geringerer Bindungsstärke gebunden wird, die Signaltransduktion auslöst (Flechsig et al., 2003). Vor Kurzem wurde in der Tat ein Protein, Shadoo, identifiziert, dass PrP C -ähnliche Eigenschaften besitzt und ein Kandidat für π ist (Watts et al., 2007). Abbildung 7: Modellvorstellung für das Auslösen eines cerebellären Syndroms. PrP ohne die flexible aminoterminale Region (tr-prp) würde wie wildtypisches PrP C an einem fiktiven Liganden (L PrP ) binden, könnte jedoch kein Signal übertragen, wodurch ein Phänotyp hervorgerufen würde. Bei völliger Abwesenheit von PrP übernähme das fiktive Homolog π die normale Funktion. (Bildquelle: adaptiert von Flechsig et al., 2004b) 17

24 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG Obwohl der toxische Charakter aminoterminal trunkierter PrP-Spezies auf das Fehlen der Aminosäuren 106 bis 121 begrenzt werden kann, scheint die Octarepeat-Region ebenfalls von essentieller Wichtigkeit für die normale Funktionsweise des Prion-Proteins zu sein. Nach der Deletion dieser Repeats kann PrP zum Beispiel kortikale Neuronen nicht vor Bax-induzierter Apoptose (Bounhar et al., 2001) und granuläre Neuronen nicht vor Doppel schützen (Drisaldi et al., 2004). Es herrscht ein breiter Konsens dahingehend, dass PrP C ein Kupfer-bindendes Protein ist (Brown, D. et al., 1997a; Stockel et al., 1998; Jackson et al., 2001; Kramer et al., 2001; Vassallo et al., 2003) und dass die Histidinreichen Octarepeats sowie die Histidine 96 und 111 für die ph-abhängige Kupfer-Ionen- Bindung verantwortlich sind (Hornshaw et al., 1995; Walter et al., 2006). Spektroskopische Analysen unterstützen diese Ergebnisse ebenfalls (Viles et al., 1999; Whittal et al., 2000). Kupfer-Ionen sind ein wichtiger Ko-Faktor für viele enzymatische Funktionen und außerdem hochreaktiv, so dass Zellen einen spezialisierten Mechanismus für die Aufnahme und den Transport evolviert haben (Puig et al., 2002). Der Endocytosestimulierende Effekt von Kupfer auf PrP C legt nahe, dass PrP C eventuell eine regulierende Funktion beim Kupfer-Transport hat (Pauly et al., 1998). Defekte im Kupfer- Metabolismus wurden bereits im Zusammenhang mit vielen neurodegenerativen Störungen beschrieben (Waggoner et al., 1999) und könnten einen Hinweis auf den Pathomechanismus bei Prionenerkrankungen liefern. Oft wird beschrieben, dass neurodegenerative Erkrankungen die Folge von chronisch auf das Gewebe einwirkendem oxidativen Stress sind (Halliwell, 2006). Aus diesem Grund wurden mannigfaltige Experimente angestellt, um PrP C auf seine anti-oxidativen Eigenschaften zu testen. In der Tat konnte festgestellt werden, dass Neurone, die aus Prnp 0/0 -Mäusen kultiviert wurden, im Gegensatz zu Neuronen aus wildtypischen Tieren, anfälliger gegenüber verschiedenen Behandlungen sind, die oxidativen Stress provozieren (Brown, D. et al., 2002). Weiterhin wurden im Gehirngewebe von PrP C -defizienten Mäusen biochemische Stress-Marker wie erhöhte Mengen an peroxidierten Lipiden detektiert (Wong et al., 2001). Um diese Effekte zu erklären, wurden zwei Theorien aufgestellt. Einerseits könnte PrP C direkt als Antioxidant bei der Detoxifizierung reaktiver Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS), die für die Entstehung zellschädigender Sauerstoffradikale benötigt werden, mitwirken. Allerdings konnten Befunde, die PrP C Kupfer-abhängige Superoxid-Dismutase (SOD)-Eigenschaften 18

25 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG bescheinigen (Brown, D. et al., 1999a), nicht reproduziert werden (Jones, S. et al., 2005). Andererseits könnte PrP C indirekt über die Regulation anderer Proteinaktivitäten Einfluss auf den Schutz vor oxidativem Stress nehmen. Verschiedene Arbeitsgruppen veröffentlichten abnormale Aktivitäten von antioxidativ wirkenden Enzymen in der Gegenwart von PrP C (Brown, D. et al., 1997b; Brown, D. et al., 1998a; Klamt et al., 2001), dennoch wurden auch dazu kontroverse Ergebnisse publiziert (Waggoner et al., 2000; Hutter et al., 2003) Die Prionpathogenese Bislang konnte nicht aufgeklärt werden, wie Neuronen durch Prionen geschädigt und somit neurodegenerative Prozesse ausgelöst werden. Eine Möglichkeit wäre, dass PrP Sc durch die Umstrukturierung neue Eigenschaften erwirbt und somit neurotoxisch wirkt und apoptotische Ereignisse in Gang setzt, mit synaptischen Funktionen interferiert oder dass PrP Sc -Aggregate auf mechanische Weise den axonalen Transport stören. Gegen diese gain of function-theorie spricht allerdings, dass die Menge an PrP Sc im Gehirn nicht direkt mit den neuropathologischen Veränderungen korreliert. So sind für den Ausbruch der Erkrankung vermutlich auch geringe PrP Sc -Mengen ausreichend (Lasmezas et al., 1997; Flechsig et al., 2000). Andererseits kann PrP Sc offenbar auch im hohen Maße über mehrere Monate toleriert werden, ohne zu klinischen Symptomen zu führen (Bueler et al., 1994; Frigg et al., 1999). Alternativ könnte der Verlust des zellulären Prion-Proteins bei in Gang gesetzter Konversion zu einem loss of function-phänotyp führen. Prinzipiell ist es vorstellbar, dass der Verlust jeder der beschriebenen möglichen Funktionen des PrP C pathogene Konsequenzen hat. Verlorengegangene anti-apoptotische oder anti-oxidative Eigenschaften würden beispielsweise direkt zu neuronalem Zelltod führen (Hetz et al., 2003). Das Ausbleiben eines Phänotyps bei Prnp 0/0 -Mäusen (Bueler et al., 1992; Manson et al., 1994) unterstützt jedoch diese Annahme nicht und führt paradoxerweise wieder zu der gain of funtion-theorie. Zunächst nahm man ferner an, dass der Ausfall des Proteins bereits während der Embryonalentwicklung durch die Expression eines funktionellen Homologs kompensiert werden kann. Allerdings zeigten auch Mäuse, deren PrP C postnatal ablatiert wurde, keine Ausfallerscheinungen (Mallucci et al., 2002). Hinzu 19

26 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG kommt, dass spongiforme Veränderungen bei infizierten Tieren durch Depletion von PrP C sogar rückgängig gemacht werden konnten (Mallucci et al., 2003). Eine Erklärung für diese Kontroverse liefert die Annahme, dass die protektiven Eigenschaften von PrP C zunächst entbehrlich bleiben und bei Verlust zu keinerlei Ausfällen führen. Sie würden jedoch essentielle Wichtigkeit im akuten Krankheitszustand erlangen und bei Abwesenheit daher zu chronischen neurodegenerativen Veränderungen führen. Des Weiteren kam die Frage auf, ob ein hypothetisches Intermediat, das bei der PrP C -Konversion entsteht oder gebildet wird, neurotoxisch wirken könnte (Chiesa et al., 2001). In diesem Zusammenhang werden alternative Membrantopologien von PrP C als mögliche Krankheitsauslöser diskutiert (Stewart et al., 2003). Zum einen liegt PrP C neben der sekretorischen Variante (SecPrP) zu etwa 10% auch als Transmembranform vor. Je nach Ausrichtung in der Membran wird zwischen Ctm PrP (carboxyterminale Domäne im ER) oder Ntm PrP (aminoterminale Domäne im ER) unterschieden. Mutationen innerhalb der Transmembran-Region lassen den relativen Gehalt von Ctm PrP auf 40% ansteigen. Interessanterweise zeigen GSS-Patienten ebenfalls erhöhte Mengen von Ctm PrP im Gehirn, so dass ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Ctm PrP und der Neurodegeneration vermutet wird. Die Expression von PrP-Mutanten, die spezifisch die Bildung von Ctm PrP begünstigen, führt spontan zu einer Neurodegeneration in transgenen Mäusen, wobei weder PrP Sc noch Infektiosität nachgewiesen werde können und Ctm PrP somit unabhängig von PrP Sc neurotoxisch wirkt (Hegde et al., 1998). In einem zweiten Experiment konnte gezeigt werden, dass transgene Mauslinien, die vermehrt Ctm PrP produzieren, empfindlicher gegenüber Prionen sind und bereits bei einem geringeren Gehalt von PrP Sc erkranken. Ebenfalls korreliert die Menge von Ctm PrP mit dem Grad der neuropathologischen Veränderungen im Gehirn von Patienten mit GSS. Somit wurde vorgeschlagen, dass PrP Sc selbst nicht toxisch ist, sondern die Bildung von Ctm PrP stimuliert und die Menge von Ctm PrP für den Ausbruch der klinischen Erkrankung verantwortlich ist (Hegde et al., 1999). Zum anderen liegt PrP C auch in cytosolischer Form (cy-prp) vor und könnte eine wichtige Rolle bei der Prionen-induzierten Neurodegeneration spielen (Ma et al., 2001). Offenbar besitzt PrP C eine autokatalytische Fähigkeit zur Aggregation, wenn es in das Cytosol gelangt. Mit Proteosomen-Inhibitoren kann die Bildung von cytosolischen-prp- Aggregaten induziert werden, welche auch nach Entzug des Inhibitors weiterläuft (Ma et 20

27 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG al., 2002b). Infektiosität konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Die Expression einer artifiziellen PrP-Mutante (PrP23-230) in transgenen Mäusen führte zur Bildung von cy- PrP bei gleichzeitiger Körnerzelldegeneration im Kleinhirn (Ma et al., 2002a). Andere Studien hingegen belegen, dass cy-prp nicht generell toxisch ist und in einem Zellkulturmodell Apoptose inhibieren kann (Roucou et al., 2003). Außerdem wurde cytosolisches PrP in verschiedenen Neuronen des Hippocampus, des Neocortex und des Thalamus von nicht-infizierten Mäusen gefunden (Mironov et al., 2003). 1.2 Drosophila melanogaster als Tiermodell Drosophila als Modell für neurodegenerative Erkrankungen Die Taufliege Drosophila melanogaster, Ordnung Zweiflügler (Diptera), Klasse Hexapoden (Insecta), wurde 1830 von dem deutschen Entomologen Johann Wilhelm Meigen erstmals beschrieben (Meigen, 1830). Erste experimentelle Studien (Carpenter, 1905) erweckten das Interesse des amerikanischen Embryologen Thomas Hunt Morgan, der im Laufe seiner Forschungsarbeit Drosophila zum Versuchstier der klassischen Genetik entwickelte (Morgan, 1910). Dabei erwies sich als vorteilhaft, dass das Genom der Fliege auf lediglich vier Chromosomen organisiert ist und die Zucht der Tiere im Vergleich zu Vertebraten als Versuchstiere kostengünstig und einfach ist (Ashburner, M. et al., 1978; Greenspan, 2004). Für die genetische Forschung war außerdem die kurze Generationsabfolge mit je nach Zuchtbedingungen neun bis vierzehn Tagen und die große Anzahl der Nachkommen (bis zu 400) eines einzigen Elternpaares dienlich. Dass bei Drosophila viele Mutationen einen leicht zu erkennenden Phänotyp hervorriefen (Morgan, 1911), sollte später für die Identifizierung und Charakterisierung unbekannter Gene sehr nützlich werden. Im Laufe des letzten Jahrhunderts wurden die Embryonalentwicklung und die Anatomie des Tieres detailliert untersucht. Als man nach der Sequenzierung des Genoms (Adams et al., 2000) feststellte, dass die wichtigsten Elemente des Nervensystems wie synaptische Proteine, Ionenkanäle und Neurotransmitter zwischen Mensch und Fliege hochkonserviert sind (Bernards et al., 2001; Yoshihara et al., 2001), eröffneten sich neue Wege zur Erforschung und Modellierung humaner neurodegenerativer Erkrankungen (Driscoll et al., 2003). 21

28 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG Verschiedene Drosophila-Modelle wurden erstellt, die die spezifischen Symptome und Charakteristika menschlicher Krankheiten des ZNS reflektieren und in kleinen Schritten zur Aufklärung von grundlegenden Mechanismen beitragen (Muqit et al., 2002; Marsh, J. et al., 2006). Exemplarisch zeigen immunhistochemische Aufnahmen die Ähnlichkeit der typischen Befunde neurodegenerativer Erkrankungen beim Menschen und bei Drosophila (Abbildung 8). Die charakteristischen nukleären Einschlusskörperchen konnten in einem Chorea- Huntington-Modell durch Expression von Huntingtin beobachtet werden (8a) (Marsh, J. et al., 2000). Ähnliche Krankheitserscheinungen konnten auch durch die Expression anderer Proteine mit erhöhten Polyglutamin-Wiederholungen erzeugt werden (Warrick et al., 1998; Fernandez-Funez et al., 2000). Dopaminerger Neuronenverlust und cytoplasmatische Einschlusskörperchen, die so genannte Lewy body-pathologie, wurden in einem Morbus-Parkinson-Modell durch Expression von α-synuclein erzeugt (8b) (Feany et al., 2000). Durch die Expression des Tau-Proteins konnte die Alzheimersche Krankheit mit dem typischen Befund des cholinergen Neuronenverlusts modelliert werden (8c) (Wittmann et al., 2001). Abbildung 8: Drosophila-Modelle für neurodegenerative Erkrankungen des Menschen. Neuropathologische Veränderungen in Gehirnschnitten von Drosophila-Mutanten, spiegeln die typischen Charakteristika neurodegenerativer Erkrankungen des Menschen wider: Nukleäre Einschlusskörperchen bei Chorea Huntington (a), lewy bodies bei der Pakinsonschen Krankheit (b) und Tau-Patholgie bei der Alzheimerschen Krankheit (c). (Bildquelle: adaptiert von Muqit et al., 2002) Drosophila und Prionen In einem ersten Versuch, übertragbare spongiforme Enzephalopathien in Drosophila melanogaster zu etablieren, wurden transgene Linien hergestellt, die das Syrian Hamster Prion-Protein (SHaPrP) exprimierten. Im Kontrast zu transgenen Mäusen konnten aber 22

29 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG weder die Entwicklung charakteristischer Neuromyopathien noch Unterschiede in Bezug auf die Lebenserwartung festgestellt werden (Raeber et al., 1995). In einer anderen Studie sollte PG14 in der Fliege exprimiert werden. Hierbei handelt es sich um eine Insertionsmutante mit neun zusätzlichen Octarepeat-Sequenzen, die mit der familiären Creutzfeldt-Jakob-Krankheit assoziiert ist (Owen et al., 1992; Duchen et al., 1993; Krasemann et al., 1995) und in Mäusen neuronale Apoptose, Astrogliose und synaptische PrP-Aggregation hervorrief (Chiesa et al., 1998; Chiesa et al., 2000). Unerwarteterweise gelang es jedoch nicht, PG14-Akkumulation in transgenen Fliegen zu detektieren, so dass über einen posttranskriptionalen Suppressionsmechanismus spekuliert wurde, der die Aggregation der PrP-Mutanten inhibierte (Deleault et al., 2003). Erfolgreicher verlief ein Projekt, das die Expression der P101L PrP-Mutante, dem murinen Homolog der PrP- Mutation P102L, vorsah. Mit dieser Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom assoziierten Mutation gelang es, einige typische Charakteristika der Erkrankung nachzubilden, wie zum Beispiel die starke Akkumulation fehlgefalteten Prion-Proteins, spongiforme Veränderungen im Gehirn und daraus resultierende lokomotorische Dysfunktionen sowie eine kurze Lebenserwartung (Gavin et al., 2006) Die Expression von Transgenen Molekularbiologen steht ein hoch entwickeltes Repertoire an genetischen Werkzeugen zur Manipulation von Drosophila zur Verfügung, so etwa die ektopische Expression von heterologen Proteinen. Die Möglichkeit, durch mobile DNA-Abschnitte, wie dem so genannten P-Element, eine integrative Rekombination zu verursachen und so artfremde Gene in das Genom der Fliege einzuführen, ist vielleicht die Bedeutendste. Publiziert wurde dieses Verfahren der Keimbahntransformation erstmals vor 26 Jahren (Rubin et al., 1982; Spradling et al., 1982). Um transgene Fliegenstämme zu erzeugen, werden Plasmide, die ein P-Element mit integriertem Transgen tragen, zusammen mit einem Helferplasmid in Drosophila-Embryonen eines geeigneten Stammes injiziert. Enzymatische Prozesse, die durch das Helferplasmid initiiert werden, verursachen die Transposition des P-Elements in das Erbmaterial der Keimbahnzellen. Nachkommende Generationen tragen das Transgen ubiquitär. Um die Biosynthese solch inserierter Proteine zu aktivieren, adaptierte man das zweiteilige Expressionssystem UAS/GAL4 aus dem Organismus Saccharomyces cerevisiae. Das System basiert auf der Aktivierung des 23

30 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG Bindemotivs UAS (upstream activating sequence) durch den Transkriptionsaktivator GAL4 (Galaktosidase) und der daraus resultierenden Transkription UAS-abwärts gelegener Transgene (Abbildung 9) (Brand et al., 1993; Phelps et al., 1998; Duffy, J., 2002). Ein zusätzlicher Vorteil ergibt sich daraus, dass transgene Proteine in einem gewebeoder zellspezifischen Muster exprimiert werden können. Dazu verwendet man unterschiedliche GAL4-Linien (Treiberlinien), bei denen das GAL4-Gen unter der Kontrolle eines schwachen Promotors in der Nähe eines genomischen Enhancers inseriert wird und GAL4 nun im Wirkungsmuster dieses Enhancers exprimiert werden kann (enhancer trapping), ohne dass dabei Nachteile für den betroffenen Organismus entstehen (Bellen et al., 1989; Bier et al., 1989; Wilson, C. et al., 1989). Werden nun GAL4-Linie und Transgen-tragende Linie (Responderlinie) verpaart, so liegen bei Nachkommen beide Konstrukte im Genom vor. Diese Tiere zeigen eine Expression des Transgens in dem spezifischen GAL4-abhängigen Muster. Abbildung 9: Das GAL4-UAS-System zur Expression von Transgenen. Nachkommen von Treiber- und Responderlinien-Kreuzungen exprimieren in Anwesenheit des Transkriptionsaktivators GAL4 UAS-gekoppelte Transgene. 24

31 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG 1.3 Ziel der Arbeit Die Prionenerkrankungen zugrunde liegenden neurodegenerativen Mechanismen, die den Verlust von Neuronen nach einer Infektion mit Prionen (PrP Sc ) oder bei hereditären Fällen hervorrufen, sind bisher nur unzureichend erforscht. Ebenso enigmatisch stellt sich die physiologische Funktion des zellulären Prion-Proteins (PrP C ) dar, das als Substrat für die Prionenkonversion dient und möglicherweise neuroprotektiv wirkt. Dennoch konnte die Prionpathogenese bislang weder durch den Verlust des Prion-Proteins noch durch die Annahme einer toxischen Funktion der fehlgefalteten Isoform erklärt werden. Die zuvor beschriebenen Expressionsstudien mit aminoterminalen PrP C -Deletionen führten zu einem Modell zur Untersuchung der physiologischen Funktion, welches der vorliegenden Arbeit als Grundlage dienen soll. Im Rahmen vorangehender Forschungsarbeit wurden erfolgreich transgene Drosophila melanogaster-linien erzeugt, die murines Wildtyp-PrP (wt-prp) und die aminoterminale Deletionsmutante PrP (tr-prp) exprimieren (Porps, 2004). Durch diese Arbeit stehen außerdem Mutanten zur Verfügung, die cytosolisches PrP (cy-prp) und eine Ctm PrP-bildende Substitutions-Mutante (PrP-AV37) bilden, welche aufgrund bisheriger Erkenntnisse neurotoxisch wirken. Mithilfe dieses Tiermodells sollen die molekularen Prozesse, die bei der durch Prionenerkrankungen induzierten Neurodegeneration eine Rolle spielen, effizient und detailliert untersucht werden. Die Bestätigung einer protektiven Wirkungsweise von PrP C, würde einen erheblichen Beitrag zur Aufklärung der Funktion und des Krankheitsverlaufes leisten. Die Analyse der Überlebenszeit in Gegenwart von reaktiven Sauerstoffspezies, die oxidativen Stress provozieren, soll die Untersuchung des möglicherweise vorhandenen resistenzvemittelnden Potentials von wildtypischem PrP ermöglichen. Eine in diesem Zusammenhang relevante Notwendigkeit der Octarepeat- Domäne kann mithilfe die Deletionsmutante tr-prp studiert werden. Ob die trunkierte Form des Prion-Proteins dabei ein zusätzliches toxisches Attribut innehat, kann über die Messung der allgemeinen Lebensewartung bestimmt werden. Ferner soll ermittelt werden, ob etwaig auftretende Differenzen der Überlebenszeiten unterschiedlicher Linien mit neuropathologischen Veränderungen korrelieren. Eine anschließende Gewebeanalyse könnte Rückschlüsse auf die Mechanismen der degenerativen Ereignisse liefern und die Beteiligung apoptotischer oder nekrotischer Prozesse aufdecken. 25

32 EINFÜHRUNG UND PROBLEMSTELLUNG Sämtliche in Drosophila exprimierten PrP-Formen sind nicht infektiös. Ferner haben experimentelle Studien mit Mäusen gezeigt, dass die Überexpression von PrP C, PrP- AV37 und tr-prp nicht spontan zur Konversion in die infektiöse Form PrP Sc führen (Flechsig et al., 2003; Hegde et al., 2003; Hetz et al., 2003). Cytosolisches PrP stellt eine alternative Topologie des Proteins dar und ist bereits in Neuronen von nicht-infizierten Mäusen gefunden worden (Mironov et al., 2003), so dass ein Zusammenhang mit Infektiosität unwahrscheinlich ist. 26

33 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 2 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 2.1 Tierzucht Sämtliche Drosophila melanogaster-linien, die für diese Arbeit benutzt oder während dieser Arbeit erzeugt worden sind, wurden unter Standard-Laborbedingungen der Sicherheitsstufe S1 gehalten und gezüchtet. Die Tiere wurden in etwa 10 cm hohen Polystyrol-Röhrchen bei 18 oder 25 Celsius und 60% Luftfeuchtigkeit in einem Klimaraum inkubiert. Ein 16-h-hell/8-h-dunkel-Zyklus sollte dabei möglichst natürliche Verhältnisse imitieren. Zur Versorgung befand sich in den Röhrchen ungefähr zehn Gramm Standard-Futterbrei, etwas mit Wasser angerührte Hefe und ein eingestecktes, gefaltetes Filterpapier. Zur Erhaltung eines vitalen Stammes war es erforderlich, die Fliegenstämme in regelmäßigen Abständen auf frische Futterröhrchen zu transferieren. Der Zeitpunkt für diese Maßnahme variierte zwischen zwei und maximal 28 Tagen und war abhängig von der gewählten Temperatur, der Anzahl der Tiere in dem Futterbehälter, der Qualität und Menge des noch vorhandenen Futters, dem Trockenheitsgrad oder etwaigen Pilz-, Bakterien- oder Milbenbefall. Außer dem sofortigen Austausch des Futterbehälters konnte die Reduktion der Tieranzahl oder die Zugabe von einem wassergetränkten Stück Zellstoff über einen vorzeitigen Wechsel hinweghelfen. Die Anzahl an Nachkommen pro Futterbehälter konnte über die Inkubationstemperatur reguliert werden, da die Generationszeit und die damit verbundene Zunahme an Individuen temperaturabhängig war. Bei 25 Celsius erzeugte die Parentalgeneration adulte Nachkommen innerhalb von zehn Tagen, doppelt so lange dauerte es bei Reduktion der Temperatur auf 18 Celsius. Dieser Schritt war jedoch für Stämme mit geringer Fitness, wie zum Beispiel bei vielen Mutanten, nicht ratsam. Der Platzbedarf einer großen Anzahl an Fliegen konnte über die Größe der Futterbehälter kompensiert werden, wodurch der Austausch der Behälter bei optimalen Bedingungen erst nach vier Wochen nötig wurde. Im Falle einer Kontamination mit Bakterien, häufig der Gattung Lactobacillus, oder Milben half lediglich eine sorgfältige Säuberung mit dem Pinsel, bevor die ausgewählten Tiere transferiert werden konnten. Gegen die Invasion von Milben war die zusätzliche Benutzung von speziellen, sehr dichten Schaumstopfen zum Verschluss der Futterröhrchen auf Dauer die erfolgreichste Methode. Außerdem wurden die Futterröhrchen stets in einer Kammer mit einer Einlage, die zur mechanischen 27

34 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Abwehr von Milben mit Silikonöl umrandet werden konnte, gesammelt untergebracht. Schimmelbefall hingegen wurde von den Fliegen oft toleriert und stellte nur eine geringe kurzzeitige Bedrohung dar. Untersuchungen oder andere Arbeiten an Fliegen konnten unter einem Binokular durchgeführt werden. Dazu mussten die Tiere in ihren Behältern zuvor mit Kohlendioxid, das über eine Druckpistole zugeführt werden konnte, narkotisiert werden. Mit einem Pinsel wurden einzelne oder mehrere Tiere auf eine Gase-Unterlage gegeben, die dort weiterhin über ein Pedalsystem mit Kohlendioxid begast werden konnten. Fliegen, die nicht für weitere Experimente oder Verpaarungen benötigt wurden, konnten in einen Behälter, der mit technischem Alkohol gefüllt war, befördert werden, wo der Tod umgehend einsetzte. Futterbreizusammensetzung (adaptiert von Lewis, 1960) (Lewis, 1960) Maisgries...13,86% (w/v) 180 g Diamalt...3,08% (w/v) 40 g Zuckerrübensirup...3,08% (w/v) 40 g Bierhefe...1,42% (w/v) 18,5 g Sojamehl...0,77% (w/v) 10 g Agar-Agar...0,58% (w/v) 7,5 g Nipagin...0,19% (w/v) 2,5 g Wasser...auf 1000 ml auffüllen Material Polystyrol-Röhrchen, verschiedene Durchmesser..Lehrstuhl für Genetik Binokular...Carl Zeiss AG CO 2 -Narkoseanlage...Lehrstuhl für Genetik Hefe Filterpapier...Schleicher-Schuell Kisten mit Einlage...SSI Schäfer Silikonöl Pinsel, Größe 0 technischer Alkohol Verzeichnis benutzter und erzeugter Drosophila-Stämme Für die in dieser Arbeit getätigten experimentellen Untersuchungen wurden außer den bereits generierten Drosophila melanogaster-mutanten verschiedene GAL4-Treiberlinien und andere Fliegenstämme benötigt. Alle Linien sind im Folgenden mit den benutzten Abkürzungen aufgelistet und mit Quellen versehen, sofern sie fremden Ursprungs waren. 28

35 TIERE, MATERIAL UND METHODEN PrP-Mutanten Stammbezeichnung Abkürzung PrP-Transgen UAS-wt-PrP-5 wt-prp-5 murines Wildtyp PrP UAS-wt-PrP-8 wt-prp-8 murines Wildtyp PrP UAS-wt-PrP-9 wt-prp-9 murines Wildtyp PrP UAS-wt-PrP-11 wt-prp-11 murines Wildtyp PrP UAS-tr-PrP-2 tr-prp-2 PrP UAS-tr-PrP-3 tr-prp-3 PrP UAS-tr-PrP-2;UAS-wt-PrP-8 tr-prp-2;wt-prp-8 Wildtyp PrP und PrP UAS-tr-PrP-2;UAS-wt-PrP-11 tr-prp-2;wt-prp-11 Wildtyp PrP und PrP Treiberlinien Stammbezeichnung Abkürzung Quelle P{Act5c-GAL4.Hb} Actin-GAL4 (Ishikawa et al., 1999) P{Appl-GAL4.G1a} Appl-GAL4 (Torroja et al., 1999) P{w +Mc =GAL4-ninaE.GMR}12 GMR-GAL4 (Ellis et al., 1993) Responderlinien Stammbezeichnung Abkürzung Quelle P{w +mc =UAS-lacZ.B}4-1-2/CyO;y + UAS-LacZ (Brand et al., 1993) GAL4/P{UAS-eGFP} UAS-eGFP (Spana et al., 1999) P{UAS-cTNTe} UAS-TNT (Keller et al., 2002) Mutanten Stammbezeichnung Abkürzung Quelle methuselah mth 1 (Lin et al., 1998) white 1118 w 1118 (Safir, 1913) sine oculis so (Ransom, 1979) CyO/Sp;tm2/tm6 db Lehrstuhl für Genetik Verpaarung transgener Linien Um Drosophila-Linien mit unterschiedlichem Genotyp zu verpaaren, war es notwendig, adulte Zuchtpaare im Verhältnis von zehn jungfräulichen Weibchen zu fünf Männchen in einem kleinen Futterbehälter bei Standard-Bedingungen zu inkubieren. Weibliche Fliegen konnten ab dem Zeitpunkt ihres Schlüpfens bis zu einem Alter von etwa sechs Stunden, ab dem sie ihre Geschlechtsreife erlangten, gesammelt und für Kreuzungen verwendet werden. Bei männlichen Tieren war lediglich auf ein sauberes und vitales Erscheinungsbild zu achten. Die Geschlechter waren anhand der unterschiedlichen Größe und Pigmentierung (Abbildung 10), aber auch am Vorhandensein spezifischer Geschlechtsmerkmale zu unterscheiden. Eine Züchtung in dieser Größenordnung 29

36 TIERE, MATERIAL UND METHODEN erzeugte nach zehn Tagen bis zu 400 Nachkommen. Sofern die Nachkommen für Experimente benötigt wurden, mussten sie innerhalb der nächsten neun Tage abgesammelt und separiert werden, so dass sie sich nicht mit der zweiten Filialgeneration vermischten. Sollten die Nachkommen zur Generierung eines stabilen Stammes herangezogen werden, so musste eine Inzuchtkreuzung mit Tieren des gesuchten Genotyps angesetzt werden. Abbildung 10: Adulte Drosophila melanogaster. Männliche Tiere (links) sind etwa 2 mm lang und haben ein kürzeres, dunkleres Abdomen als die etwas größeren weiblichen Tiere (rechts). (Bildquelle: Ashburner, 1989) Generierung eines doppelt transgenen Stammes Für die Komplementationsstudien wurde aus den Linien wt-prp-8 und tr-prp-2 eine doppelt transgene Linie erzeugt. Die Auswahl geeigneter Nachkommen erfolgte über ein Sortierverfahren nach phänotypischen Markern. Hierfür eignete sich der Einsatz von so genannten Balancer-Chromosomen, die sich durch drei vorteilhafte Eigenschaften auszeichnen. Erstens sind Balancer-Chromosomen homozygot letal, das heißt, ihre Häufigkeit vergrößert sich nicht zu Ungunsten des Schwesterchromosoms, das die P- Element-Insertion enthält, und trägt somit zur Bildung eines stabilen Stammes bei. Zweitens ist durch die multiplen Inversionen die Vererbung eines rekombinanten Genoms ausgeschlossen, da homologe Chromosomenabschnitte, die an einem crossing over-ereignis teilgenommen hätten, zu infertilen Gameten führen würden. Drittens dient der phänotypische Marker zur einfachen Identifizierung der Balancer-Chromosomen. Die benutzten Balancer-Chromosomen und ihre phänotypischen Merkmale sind im Folgenden aufgeführt: 30

37 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Bezeichnung Chromosom Phänotyp Cyo 2 Flügel sind nach oben gewellt Sp 2 Anzahl der sternopleuralen Borsten ist erhöht tm2 3 Haltere deformiert und beborstet tm6 3 Anzahl der humeralen Borsten ist erhöht + Wildtyp Konfiguration Das Zuchtverfahren soll über die nachstehenden Kreuzungsschemata verdeutlicht werden. Angegeben werden jeweils die Parentalgeneration (P) und die gesuchten Genotypen der ersten Filialgeneration (F 1 ) mit der Wahrscheinlichkeit ihres Auftretens: Kreuzung 1a P: CyO/Sp ; tm2/tm6 ( ) x +/+ ; wt-prp-8/wt-prp-8 ( ) F 1 : CyO/+ ; wt-prp-8/tm2 (25%) Kreuzung 1b P: CyO/Sp ; tm2/tm6 ( ) x tr-prp-2/tr-prp-2 ; +/+ ( ) F 1 : tr-prp-2/sp ; +/tm6 (25%) Kreuzung 2 (aus den Filialgenerationen der Kreuzungen 1a und 1b) P: CyO/+ ; wt-prp-8/tm2 ( ) x tr-prp-2/sp ; +/tm6 ( ) F 1 : tr-prp-2/cyo ; wt-prp-8;tm6 (6,25%) Kreuzung 3 (Inzuchtkreuzung aus der Filialgeneration der Kreuzung 2) P: tr-prp-2/cyo ; wt-prp-8;tm6 ( ) x ( ) F 1 : tr-prp-2/cyo ; wt-prp-8;tm6 (100%) 2.2 Chemikalien, Verbrauchsmaterial und Laborgeräte Verwendete Chemikalien wurden über die Firmen Applichem GmbH, USB Corporation, Sigma, Serva, Carl Roth GmbH und Merck bezogen. Verbrauchsmaterialien wie Reaktionsgefäße oder Pipettenspitzen wurden bei der Firma Hartenstein Laborbedarf bestellt. Der benutzte Pipettensatz wurde von der Firma Gilson, Inc. hergestellt und umfasste vier Kolbenhubpipetten mit den maximalen Volumenkapazitäten 1 ml, 200 µl, 31

38 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 20 µl und 2 µl. Für Wiegearbeiten wurde eine Fein- und Laborwaage der Sartorius AG benutzt und ph-werte wurden mithilfe des ph-meters der Denver Instrument GmbH bestimmt. Oft benutzte Geräte im Labor waren Kühlschrank (Bosch GmbH), Tisch- Wippe, Vortexer (Heidolph GmbH & Co. KG), Magnetrührer (Ika Werke GmbH), Inkubator (Heraeus GmbH), Heizblock (Eppendorf AG), Eismaschine (Scotsman) und Wasserbad (GFL GmbH). Wieder verwendbare Gebrauchsgegenstände wie Bechergläser und Glaspipetten wurden vom Reinigungspersonal des Instituts autoklaviert und zur Verfügung gestellt. Destilliertes Wasser wurde über eine Millipore-Anlage gewonnen und durch Autoklavieren sterilisiert. Die vorgenannten Materialien und Instrumente werden wegen der Übersichtlichkeit im Folgenden nicht mehr aufgeführt. Bei der Verwendung von kanzerogenen, toxischen, fruchtschädigenden oder anderen Gefahrstoffen war die Benutzung von Handschuhen, Schutzkittel, Schutzbrille und Mundschutz ebenso selbstverständlich wie die Beachtung und Einhaltung der Risiko- und Sicherheits-Sätze. 2.3 Molekularbiologische Methoden Inverse Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Beobachtete Veränderungen der Verhaltensweise oder der Erscheinungsform transgener Fliegen können unter Umständen auf die Integration eines Transgens in einen kodierenden DNA-Abschnitt mit resultierender Inaktivierung endogener Funktionen zurückzuführen sein. Um den Status vorweg abzuklären, ist die Lokalisierung des Integrationsortes von entscheidender Wichtigkeit. Dazu eignet sich die Methode der inversen Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) (Kleppe et al., 1971; Mullis et al., 1986), mit welcher der unbekannte Genbereich, der das Transgen umgibt, amplifiziert und über eine anschließende Sequenzierung identifiziert werden kann (Rehm, 2003) DNA-Extraktion 20 Fliegen des Stammes, dessen Transgen-Integrationsort bestimmt werden sollte, wurden eingefroren und homogenisiert. Im Anschluss wurden zu dem Ansatz 500 µl 32

39 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Homogenisierungspuffer zugegeben und 30 Minuten bei 68 Celsius inkubiert. Der Ansatz wurde auf Eis heruntergekühlt, mit 65 µl 8-molarem Kaliumacetat vermischt und 30 Minuten abgestellt. Danach erfolgten zwei Zentrifugationsschritte zu je zehn Minuten bei Umdrehungen pro Minute (U/Min), wobei der Überstand jedes Mal in ein neues Gefäß übertragen wurde. Zur Präzipitation der DNA wurden zuerst 900 µl Ethanol dazugegeben, vermischt und für zehn Minuten auf Eis gestellt. Nach zehnminütiger Zentrifugation bei U/Min wurde das Ethanol mit einer Pipette abgezogen und mit 750 µl 70-prozentigem Ethanol ersetzt. Es folgte eine fünfminütige Zentrifugation bei U/Min und die Trocknung des Pellets nach Entsorgung des Ethanol-Überstandes. Im letzten Schritt wurde das DNA-Pellet in 60 µl sterilem Wasser resuspendiert. Die durchschnittliche DNA-Ausbeute betrug bei diesem Verfahren etwa 100 ng/µl. Material Homogenisierungspuffer (ph 8,0) Natriumchlorid mm Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) mm Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)...50 mm Natriumlaurylsulfat (SDS)...0,5% (w/v) Kaliumacetat...8 M Ethanol...100% Ethanol...70% (v/v) Tischzentrifuge...Eppendorf AG Verwahrung: RT Restriktionsverdau Um den Restriktionsverdau der genomischen DNA durchzuführen, wurden 30 µl des zuvor extrahierten Erbmaterials zusammen mit 2 µl des Restriktionsenzyms DraI, 5 µl zehnfach-konzentriertem Reaktionspuffer, 1 µl RNase A und 12 µl sterilisiertem Wasser für zwei Stunden bei 37 Celsius inkubiert. Der anschließende Reaktionsstopp erfolgte durch Zugabe von 30 µl 3-molarem Natriumacetat und 220 µl sterilem Wasser. Material genomische DNA DraI...MBI Fermentas GmbH 10x Reaktionspuffer...MBI Fermentas GmbH RNase A...MBI Fermentas GmbH Natriumacetat (ph 5,2)...3 M 33

40 TIERE, MATERIAL UND METHODEN DNA-Aufreinigung Durch die Phenolisierung wurde die DNA aufgereinigt und von Proteinen getrennt. Dazu wurde in einem ersten Schritt 200 µl Phenol und 100 µl Chloroform/Isopentanol imverhältnis 24:1 zu dem kompletten Restriktionsansatz gegeben und eine Minute mithilfe eines Vortexers durchgeschüttelt. Nach dreiminütiger Zentrifugation bei U/Min wurde die wässrige Phase in ein neues Gefäß überführt. Der zweite Schritt sah eine Zugabe von 100 µl Phenol und 200 µl Isopentanol/Chloroform vor. Nach erneutem einminütigen Schütteln erfolgte eine weitere Zentrifugation für zwei Minuten bei U/Min. Im Anschluss wurde die wässrige Phase wieder in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 750 µl Ethanol versehen. Nach kräftigem Durchschütteln bestand die Wahl zwischen einem Gefrierschritt bei -20 Celsius über Nacht oder bei -80 Celsius für 30 Minuten. Der Ansatz wurde fünf Minuten bei U/Min zentrifugiert, das Ethanol mit einer Pipette abgezogen und mit 500 µl 70-prozentigem Ethanol gewaschen. Es erfolgte ein abschließender Zentrifugationsschritt zu fünf Minuten bei U/Min, nach dem das überschüssige Ethanol abgegossen und das DNA-Pellet luftgetrocknet werden konnte. Zuletzt wurde die DNA in 30 µl sterilem Wasser resuspendiert. In diesem Volumen betrug die DNA-Konzentration durchschnittlich 100 ng/µl. Material restringierte DNA Phenol Isopentanol/Chloroform...4% (v/v) Ethanol...100% Ethanol...70% (v/v) Gefrierschränke...Bosch GmbH Ligation Über einen Ligationsschritt wurde die enzymatisch zerteilte DNA in viele zirkuläre Abschnitte überführt. Für diesen Zweck wurden 30 µl der aufgereinigten DNA mit 1 µl Ligase, 20 µl zehnfach-konzentriertem Ligationspuffer und 149 µl sterilem Wasser über Nacht bei 4 Celsius inkubiert. Im Anschluss musste die DNA präzipitiert werden, um sie von dem Enzym zu trennen. Dazu wurden 30 µl 3-molares Natriumacetat, 70 µl steriles Wasser und 750 µl Ethanol zugegeben und nach Durchschütteln im Vortexer für eine Stunde bei -80 Celsius gefroren. Das Ethanol wurde nach zehnminütiger Zentrifugation 34

41 TIERE, MATERIAL UND METHODEN bei U/Min mit einer Pipette abgezogen und durch 500 µl 70-prozentiges Ethanol ersetzt. Es schloss sich eine weitere Zentrifugation bei U/Min für zwei Minuten und die anschließende Lufttrocknung des DNA-Pellets an. Zum Schluss wurde die DNA in 30 µl sterilem Wasser gelöst. Im Durchschnitt betrug die DNA-Konzentration in diesem Volumen 50 ng/µl. Material aufgereinigte DNA Ligase...New England Biolabs, Inc. 10x Ligationspuffer...New England Biolabs, Inc. Natriumacetat (ph 5,2)...3 M Ethanol...100% Ethanol...70% (v/v) Gefrierschränke...Bosch GmbH Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die zirkulären DNA-Abschnitte, die einen Teil des Transgens enthalten, konnten nun durch die Wahl geeigneter DNA-Primer amplifiziert werden. Die besten Ergebnisse wurden unter Verwendung der Pfu-Polymerase, die über eine proof reading-funktion verfügt, erzielt. Die Primer-Basensequenzen für die P3 -PCR von pp[uast] lauteten wie folgt: Pry1 5 - CCT TAG CAT GTC CGT GGG GTT TGA AT -3 Pry4 5 - CAA TCA TAT CGC TGT CTC ACT CA -3 Bei mehreren Reaktionen war der Einsatz eines Mastermixes ratsam. Der PCR- Reaktionsansatz wird im Folgenden angegeben: PCR-Reaktionsansatz 6 µl ligierte DNA 300 ng 16 µl ddntps 400 nm 2 µl Primer Pry1 300 nm 2 µl Primer Pry4 300 nm 5 µl 10x Reaktionspuffer 0,5 µl Pfu-Polymerase 2,5 Einheiten 18,5 µl steriles Wasser 35

42 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Jeder PCR-Reaktionsansatz wurde in zweifacher Ausführung sowie einer Negativkontrolle mit Wasser anstelle der DNA in einen Thermocycler gestellt. Für die Amplifikation der DNA galten folgende Parameter: PCR-Programm (Standard-Hybridisierung) Denaturierung 5 min 95 C 1 Zyklus Denaturierung 60 s 95 C Hybridisierung 60 s 57 C Elongation 3 min 72 C 35 Zyklen Denaturierung 60 s 95 C Hybridisierung 60 s 57 C Elongation 5 min 72 C 5 Zyklen Für die Ermittlung der optimalen Hybridisierungstemperatur konnte es unter Umständen notwendig sein, eine Gradienten-PCR durchzuführen, bei der es möglich war, die Hybridisierungstemperatur während eines Durchganges intervallweise zu variieren. Die Rampentemperatur, also die Geschwindigkeit der Temperaturänderung betrug 3 C/s. Material Thermocycler...Eppendorf AG Gradienten-Thermocycler...Eppendorf AG Pfu-Polymerase mit 10x Reaktionspuffer...Stratagene GmbH Primer...Sigma-Aldrich Chemie GmbH ddntps...promega GmbH Agarosegel-Analyse Die Überprüfung der PCR-Reaktion nach spezifischen Amplifikaten wurde mithilfe einer DNA-Gelelektrophorese durchgeführt. Dazu wurden 160 ml TAE mit 2,4 g Agarose vermischt, aufgekocht und zum Polymerisieren lauwarm in den mit einem Probentaschenkamm vorbereiteten Gelschlitten gegossen. Das ausgehärtete Agarosegel wurde anschließend in die mit TAE gefüllte Elektrophoresekammer gelegt und der Kamm entfernt, so dass in die Probenkammern mit einer Pipette jeweils 20 µl einer PCR- Reaktion zusammen mit 4 µl sechsfach-konzentriertem Probenpuffer eingefüllt werden konnten. Die äußerste linke Kammer war für 6 µl DNA-Fragmentgrößenmarker und die äußerste rechte Kammer für die Wasser-Negativkontrolle vorgesehen. Im Anschluss wurde eine 100 Volt-Spannung an die Elektrophoresekammer angelegt, so dass die DNA 36

43 TIERE, MATERIAL UND METHODEN aufgrund ihrer negativen Ladung in Richtung Pluspol durch das Gel diffundierte und sich nach ihrer Größe aufteilte. Nach ungefähr einer Stunde Gellauf wurde das Gel 15 Minuten in einer TAE/Ethidiumbromid-Lösung zur Interkalation der DNA geschwenkt, zehn Minuten in TAE gewaschen und unter einer UV-Lampe mit einer Emission von 366 nm fotografiert. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden unter Verwendung eines UV-Schutzhelmes aus dem Gel mit einem Skalpell herausgetrennt und in ein Reaktionsgefäß überführt. Die Elution der DNA aus den Agarosefragmenten erfolgte entsprechend der Angaben des Herstellers mithilfe des Gel Extraction Kits. Material PCR-Reaktionsansatz TAE-Puffer (ph 8,0), 50x Verwahrung: RT Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)...2 M konzentrierte Essigsäure...5,7% (v/v) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)...50 mm Agarose Standard Elektrophoresekammer mit Gelschlitten...Hauswerkstatt 1 kb DNA-Marker...MBI Fermentas GmbH 6x Probenpuffer...MBI Fermentas GmbH Stromerzeuger...Hoeffer TAE/Ethidiumbromid-Lösung...0,0001% (v/v) UV-Lampe...Vilber Lourmat, Inc. s/w Monitor...Sony Corporation Thermodrucker...Mitsubishi Electric Corporation Gel Extraction Kit...Qiagen GmbH Sequenzierung Die Sequenzierung der amplifizierten DNA-Fragmente schloss die Lokalisierung des jeweiligen Transgens im Genom der Fliegen ab. Um den Sequenzier-Reaktionsansatz optimal zu bestimmen, musste die tatsächliche DNA-Konzentration zuvor photometrisch ermittelt und auf einen Standard eingestellt werden. Die Nukleinsäuren konnten über ihr optisches Absorptionsmaximum von 260 nm detektiert werden. Idealerweise wurden auch in der Probe enthaltene Reste von Phenol oder Proteinen bei einer Wellenlänge von 280 nm bestimmt, so dass man ebenfalls eine zuverlässige Angabe über den Reinheitsgrad der DNA-Probe erhielt. Die Sequenzieransätze wurden je Probe zweifach nach unten aufgeführtem Schema zusammengestellt: 37

44 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Sequenzier-Reaktionsansatz 2 µl DNA 100 ng 1 µl BigDye µl Sequenzierpuffer 1 µl Primer Pry4 5 µm Die Sequenzierreaktion erfolgte im Thermocycler nach folgendem Programm: Sequenzier-PCR-Programm Denaturierung 30 s 96 C Hybridisierung 15 s 50 C Elongation 4 min 60 C 25 Zyklen Nach der Amplifikation wurden die Ansätze zum Aufreinigen und Sequenzieren an die diagnostische Abteilung des Instituts übergegeben. Das verwendete System war ABI PRISM, Model 3100, Version 3.7. Der Sequenzabgleich und die damit verbundene Identifikation des Integrationsortes wurde mithilfe der Online-Genomdatenbank Flybase ( durchgeführt. Material eluierte DNA Spektralphotometer, Küvetten und Thermocycler..Eppendorf AG BigDye cycle Sequence Kit Applied Biosystems Sequenzierpuffer (ph 9,0) Verwahrung: -20 C Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) mm Magnesiumchlorid...5 mm Primer Pry4...Sigma-Aldrich Chemie GmbH Quantitative Real-Time PCR Die Real-Time-quantitative PCR (RT-RTQ-PCR) ist eine Methode zur quantitativen Messung der RNA in einem isolierten Extrakt. Dazu muss die genomische RNA zunächst mithilfe des retroviralen Enzyms Reverse Transkriptase in DNA umgeschrieben werden. Während der sich anschließenden Amplifikation wird die DNA-Menge über Fluoreszenz- Messungen bestimmt. Dabei nimmt die Fluoreszenz-Intensität proportional zur Menge der erzeugten PCR-Produkte zu, so dass am Ende des Vorgangs eine rückschließende Aussage auf den anfänglichen RNA-Gehalt und der damit verbundenen Aktivität korrespondierender Gene getroffen werden kann. Über den Vergleich zu Referenzgenen, 38

45 TIERE, MATERIAL UND METHODEN wie beispielsweise G6PDH (Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase), können Variationen in der Ausgangsmenge zu vergleichender Proben normalisiert werden RNA-Extraktion 50 männliche Drosophila eines Genotyps wurden im Alter von sieben Tagen in flüssigem Stickstoff eingefroren und homogenisiert. Die RNA wurde mithilfe des RNeasy-Mini Kits entsprechend der Angaben des Herstellers isoliert. Da RNA aufgrund seiner hohen Instabilität und Sensibilität gegenüber Nukleinsäure-zerstörenden Enzymen schnell degradiert, war steriles und zügiges Arbeiten unter gekühlten Bedingungen unerlässlich. Mit diesem Verfahren ließ sich durchschnittlich 50 ng RNA pro 1 µl Solvens erzielen (photometrische Messung). Im Anschluss musste eventuell verbliebene DNA im Isolat entfernt werden. Dazu wurden die extrahierten Nukleinsäuren (50 µl) mit 10 µl DNaseI sowie 10 µl zehnfachkonzentriertem Reaktionspuffer und 20 µl RNase-freiem Wasser für 30 Minuten bei 37 Celsius inkubiert. Der Reaktionsstopp erfolgte nach Zugabe von 10 µl EDTA bei 65 Celsius für zehn Minuten. Material Stickstoff, flüssig...tyczka Industrie-Gase GmbH RNeasy-Mini Kit...Qiagen GmbH DnaseI...MBI Fermentas GmbH 10x Reaktionspuffer...MBI Fermentas GmbH RNase-freies Wasser...Qiagen GmbH Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)...25 mm Spektralphotometer und Küvetten...Eppendorf AG RT-RTQ-PCR-Reaktion Die RNA-Produkte sollten für eine erfolgreiche Reaktion zwischen 100 und 150 Basenpaare groß sein. Für spätere Kontrolluntersuchungen wurde die nicht benötigte RNA aliquotiert und bei -80 Celsius eingefroren. Für die PCR-Reaktionen wurden je nach Matrize die Primerpaare sig1/del für wt-prp, sig1/mut217 für tr-prp und F2/R2 für G6PDH benutzt. Die Basensequenzen werden im Folgenden angegeben: 39

46 TIERE, MATERIAL UND METHODEN sig1 5 - TAT GTG GAC TGA TGT CGG CC -3 del 5 - TCC CCA GCA TGT AGC CAC CAA GG -3 mut CCT GGG ACT CCT TCT GGT ACC GGG TGA CGC-3 F2 5 - CGT CCC GTA GAC AAA ATG GT -3 R2 5 - GAA TTT GCC GTG AGT GGA GT -3 Die PCR-Reaktion wurde bei mehreren Reaktionen unter Verwendung eines Mastermixes nach folgendem Schema zusammengestellt, wobei ausschließlich sterile Gefäße und Filterpipettenspitzen benutzt wurden: RT-RTQ-PCR-Reaktionsansatz 2 µl isolierte RNA 100 ng 0,8 µl Primer, forward 10 pm 0,8 µl Primer, reverse 10 pm 10 µl 2x QuantiTect SYBR Green 0,2 µl QuantiTect RT Mix 6,2 µl RNase freies Wasser Die Ansätze wurden in gekühlte Reaktionskapillaren pipettiert, mindestens zehn Minuten abgestellt und mit Adaptern herunterzentrifugiert. Bei jedem Experiment wurde als Negativ-Kontrolle eine Probe mit sterilem Wasser anstelle der RNA sowie eine RNA- Probe aus einem PrP-defizienten Individuum (beispielsweise UAS-PrP Linie ohne GAL4 Präsenz) mitgeführt. Die G6PDH-Probe zur Normalisierung eignete sich gleichzeitig auch als Positiv-Kontrolle. Die Reaktion und Messung erfolgte in einem Light-Cycler bei folgenden Parametern: RT-RTQ-PCR-Programm rev. Transkription 20 min 50 C 20 C/s 1 Zyklus PCR Aktivierung 15 min 95 C 20 C/s 1 Zyklus Denaturierung 15 s 94 C 20 C/s Hybridisierung 30 s 55 C 20 C/s Elongation 30 s 72 C 2 C/s 35 Zyklen Nach Beendigung des Programms wurde zuerst eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Ein spezifisches PCR-Produkt ergab sich durch die Anzeige eines einzelnen Peaks in einer Probe. Die Spezifität konnte zusätzlich über eine Größenbestimmung mithilfe einer RNA-Agarosegel-Analyse ermittelt werden. Der anschließend analysierte CT-Wert (threshold cycle) gibt den Zyklus der PCR-Reaktion 40

47 TIERE, MATERIAL UND METHODEN an, in dem die Fluoreszenz erstmalig den Hintergrund-Bereich verlässt und in die exponentielle Phase übergeht. Je niedriger der CT-Wert ist, desto mehr PCR-Matrizen sind vorhanden, wodurch die damit verbundene Genexpression quantifiziert werden kann. Material isolierte RNA QuantiTect SYBR Green...Qiagen GmbH Primer...Sigma-Aldrich Chemie GmbH Reaktionskapillaren, 20 µl...roche GmbH Zentrifugen-Adapter, kühlbar...roche GmbH Light-Cycler mit Software...Roche GmbH Microarray Als Microarray wird eine molekularbiologische Methode bezeichnet, die über die Messung der mrna-menge bestimmter Gene Untersuchungen zur differentiellen Genexpression zulässt. Das Verfahren beruht auf der Hybridisierung extrahierter mrna- Moleküle mit auf so genannten Genchips aufgebrachten cdna-oligomeren. Die mit einem Fluoreszenzfarbstoff versehenen Hybride werden dann durch einen Laser detektiert. Die Signalintensitäten, die vor der Auswertung normiert werden müssen, korrelieren wiederum mit der Menge der aufgetragenen mrna. Der RNA-Isolation erfolgte wie unter beschrieben, jedoch mit Ausnahme der DNA-Restriktion. Die RNA wurde der Arbeitsgruppe Microarray-Analysen des Instituts übergeben, wo eine RNA-Qualitätsüberprüfung der Microarray-Analyse vorausging. Es wurden GeneChip Drosophila Genome 2.0 Arrays von Affymetrix verwendet, die die Untersuchung von verschiedenen Transkripten erlaubten. 2.4 Proteinbiochemische Methoden Proteinnachweis Mithilfe eines Immunblots lassen sich zuvor elektrophoretisch aufgetrennte Proteine auf eine Membran übertragen. Im Anschluss können durch unterschiedliche biochemische Reaktionen spezifische Proteine nachgewiesen und quantitativ gemessen werden. Des Weiteren ist eine Größenbestimmung über einen Vergleich mit bekannten Proteinen 41

48 TIERE, MATERIAL UND METHODEN möglich. Das Nachweisverfahren wurde 1979 entwickelt (Renart et al., 1979; Towbin et al., 1979) und ist als Western-Blot (Burnette, 1981) bekannt. Die Methode unterteilt sich in mehrere Schritte Herstellung von Gewebehomogenaten Je 20 Fliegen der zu untersuchenden Genotypen wurden in flüssigen Stickstoff eingetaucht. Die Köpfe der hartgefrorenen Tiere wurden mit einem Skalpell auf einem eisgekühlten Metallblock abgetrennt und in einem Reaktionsgefäß mit 25 µl Lysis-Puffer unter Verwendung eines Stößels homogenisiert. Im Anschluss wurde das Lysat mit 25 µl zweifach-konzentriertem SDS-Probenpuffer vermischt und bei 95 Celsius für fünf Minuten gekocht. Der Überstand konnte mit einer Pipette abgezogen und in ein neues Gefäß überführt werden. Material Stickstoff, flüssig...tyczka Industrie-Gase GmbH Metallblock...Hauswerkstatt Stößel...Eppendorf AG Lysis-Puffer (ph 7,5) Verwahrung: 4 C Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)...50 mm Natriumchlorid mm Nonidet P ,5% (v/v) Natriumdesoxycholat...0,5% (w/v) Complete Protease-Inhibitor, vor der Benutzung...4% (v/v) SDS-Probenpuffer Verwahrung: 4 C Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) mm Glycerol, 86%...10% (v/v) Natriumlaurylsulfat (SDS)...2% (w/v) Bromphenolblau...0,01% (w/v) beta-mercaptoethanol...5% (v/v) Dithiothreitol (DTT)...50 mm Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Nass-Blot Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese erlaubt die Auftrennung von Proteinen abhängig von ihrer relativen Molekülmasse unter denaturierenden Bedingungen (Laemmli, 1970). Die Methode basiert auf der Bindung des negativ geladenen Detergens Natriumlaurylsulfat (SDS) über hydrophobe Wechselwirkungen an denaturierte Proteine. 42

49 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Im ersten Schritt musste die Elektrophorese-Kammer mit SDS-Laufpuffer befüllt und ein Polyacrylamid-Gel in der dafür vorgesehenen Apparatur arretiert werden. Die Protein- Proben wurden mit einem maximalen Volumen von 35 µl in je eine Geltasche eingefüllt. Unbenötigte Taschen wurden mit einem äquivalenten Volumen an reinem SDS- Probenpuffer befüllt, wobei die äußerste linke Tasche für 6 µl Proteingrößenmarker reserviert wurde. Als Positiv- und Negativkontrolle wurden Gehirnhomogenate von wildtypischen und Prnp 0/0 -Mäusen mitgeführt. Im nächsten Schritt konnte eine Spannung mit einer Stromstärke von 35 ma für etwa eine Stunde angelegt werden. Über den sich anschließenden Nass-Blot erfolgte die Übertragung der Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran. Dazu wurde die Membran zuvor für fünf Minuten in Methanol aktiviert und mindestens zehn Minuten in Transfer- Puffer eingeweicht. Danach wurde die Elektrophorese-Kammer geleert und mit Transfer- Puffer sowie einem Eisakku beladen. Das Gel und die Membran konnten danach zusammen mit Puffer-getränktem Filterpapier vertikal in die Kammer eingesetzt werden (Gel auf der Seite der Kathode), woraufhin eine Spannung mit einer Stromstärke von 350 ma für 90 Minuten angelegt wurde. Nach dem Proteintransfer konnte die Membran bei Bedarf mit einer Ponceau-Lösung gefärbt werden, um die erfolgreiche Übertragung nachzuweisen. Die Entfärbung erfolgte durch mehrmaliges kurzes Schwenken in TBST und Wasser. Anschließend musste die Membran geglättet werden, um unspezifische Antikörperbindungen zu blockieren. Dafür wurden 20 ml SuperBlock-Lösung mit 0,5% (v/v) Tween 20 vermischt, auf die Membran pipettiert und über Nacht bei 4 Celsius abgestellt. Die Block-Lösung wurde durch sechsmaliges, fünfminütiges Schwenken in 20 ml TBST entfernt. Material Proteinproben Mausgehirnhomogenate, 10%...AG Klein Elektrophoresekammer...Biorad GmbH Polyacrylamidgel, 12% Tris-Glycin...Biozym GmbH SDS-Laufpuffer (ph 8,3) Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)...25 mm Glycin mm Natriumlaurylsulfat (SDS)...0,1% (w/v) MagicMark TM Standard...Invitrogen GmbH Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran und Filterpapier...Schleicher-Schuell Verwahrung: RT 43

50 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Material (Fortsetzung) Methanol Transfer-Puffer Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)...25 mm Glycin mm Natriumlaurylsulfat (SDS)...0,075% (w/v) Methanol...20% (v/v) Ponceau-Lösung SuperBlock-Lösung...Pierce Scientific Tween 20 TBST (ph 7,6) Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)...10 mm Natriumchlorid mm Tween 2...0,05% (v/w) Stromerzeuger...Hoeffer Scientific Verwahrung: RT Verwahrung: RT Antikörperinkubation Für die Immundetektion der Proteine wurde die Membran zunächst für eine Stunde mit einem Protein-spezifischen Antikörper (Primärantikörperlösung) bei Raumtemperatur auf einer Tisch-Wippe inkubiert. Es folgten sechs Waschschritte zu je fünf Minuten mit 20 ml TBST. Im Anschluss konnte die Membran mit der Sekundärantikörperlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert werden. Der Sekundärantikörper musste dabei so gewählt werden, dass er den Primärantikörper als Antigen erkennt. Außerdem waren die Immunglobuline mit dem Enzym Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HRP) konjugiert, was eine spätere Reaktion mit dem Substrat Luminol ermöglichte. Die Antikörper wurden danach wiederum durch sechsmaliges Schwenken für fünf Minuten in je 20 ml TBST entfernt. Primärantikörperlösung Bezeichnung Spezies Subtyp Verdünnung in TBST Quelle anti-prp (ICSM18) Maus, monoklonal IgG1 0,01% (v/v) D-Gen Ltd. (1 µg/µl) Sekundärantikörperlösung Bezeichnung Spezies Subtyp Verdünnung in TBST Quelle anti-maus-hrp Hase, monoklonal IgG1 0,0025% (v/v) Zymed GmbH 44

51 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Chemolumineszenz-Detektion Zur Visualisierung der Proteine auf der Membran wurden je 2 ml ECL (enhanced chemoluminescence)-lösung A und B zugegeben. Die Membran wurde drei Minuten in der Flüssigkeit geschwenkt und dann abgetupft. Durch die antikörpergebundene Peroxidase wurde die Oxidation des Luminol-Wasserstoffperoxid-Gemisches aus der ECL-Lösung katalysiert. Hierbei gehen Elektronen in einen energetisch niedrigeren Zustand über und emittieren Photonen. Das so erzeugte Licht kann mithilfe eines Röntgenfilms detektiert werden. Die Exposition mit dem Röntgenfilm dauerte im Durchschnitt 60 Sekunden. Der Film wurde in einer Dunkelkammer manuell entwickelt und fixiert und anschließend unter fließendem Wasser abgespült und luftgetrocknet. Zur Quantifizierung der Signalintensitäten wurde der entwickelte Röntgenfilm eingescannt und mit der AIDA Software Version densitometrisch analysiert. Material Proteinmembran ECL Detection-Kit SuperSignal West Pico...Pierce Scientific Röntgenfilm...Amersham Biosciences Autoradiographiekassette...Amersham Biosciences Filmrahmen Entwicklerlösung Fixierlösung Protein-Ladekontrolle Eine ausgewertete Membran konnte bis zu einer erneuten Antikörperinkubation in TBST bei 4 Celsius aufbewahrt werden. Für eine Protein-Ladekontrolle musste die Membran zuerst von den gebundenen Antikörpern befreit werden. Dazu erfolgte eine Behandlung mit 20 ml Stripping-Puffer für 15 Minuten und zwei sich anschließenden fünfminütigen Waschschritten mit je 20 ml Tris-Lösung. Nach zwei Stunden Lagerung in TBST konnte die Primärantikörperlösung zugegeben werden. Dieser Antikörper richtete sich gegen das Haushaltsprotein SAP47 (synaptic associated protein) von Drosophila (Reichmuth et al., 1995), das in allen Proben gleich stark vertreten sein sollte. Die weitere Behandlung der Membran sowie die Detektion erfolgten analog zu der zuvor beschriebenen Prozedur. Durch den Vergleich der Signalintensitäten beider Durchläufe erfolgte die Normierung aller Proben. 45

52 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Primärantikörperlösung Bezeichnung Spezies Subtyp Verdünnung in TBST Quelle anti-sap47 Maus, monoklonal IgG1 0,2% (v/v) AG Buchner Sekundärantikörperlösung Bezeichnung Spezies Subtyp Verdünnung in TBST Quelle anti-maus-hrp Hase, monoklonal IgG1 0,0025% (v/v) Zymed GmbH Material Proteinmembran Stripping-Puffer Restore WesternBlot...Pierce Scientific Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)...0,5 M Protein-Deglykosylierung Von 13 Fliegen eines Genotyps wurden mit 12 µl Lysis-Puffer analog zur beschriebenen Prozedur unter Kopfhomogenate hergestellt. Zur enzymatischen Deglykosylierung der Asparagin-Reste 180 und 196 wurde das Homogenat zunächst mit 12 µl Denaturierungspuffer vermischt und für zehn Minuten bei 100 Celsius erhitzt. Danach wurden 2,4 µl Reaktionspuffer, 2,4 µl Nonidet P-40 und 4 µl PNGase F dazu pipettiert. Die Reaktion erfolgte bei 37 Celsius für vier Stunden. Im Anschluss wurden 30 µl zweifach konzentrierten SDS-Probenpuffers zugegeben. Die Polyacrylamid- Gelelektrophorese und die Antikörperfärbung wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt. Material Lysis-Puffer (ph 7,5) Verwahrung: 4 C Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)...50 mm Natriumchlorid mm Nonidet P ,5% (v/v) Natriumdesoxycholat...0,5% (w/v) Complete Protease-Inhibitor, vor der Benutzung...4% (v/v) Denaturierungspuffer...New England Biolabs, Inc. G7 Reaktionspuffer...New England Biolabs, Inc. PNGase F...New England Biolabs, Inc. Nonidet P-40 46

53 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Material (Fortsetzung) SDS-Probenpuffer Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) mm Glycerol, 86%...10% (v/v) Natriumlaurylsulfat (SDS)...2% (w/v) Bromphenolblau...0,01% (w/v) beta-mercaptoethanol...5% (v/v) Dithiothreitol (DTT)...50 mm Verwahrung: 4 C 2.5 Histologische Methoden whole mount-analyse Die fluoreszenz-mikroskopische Untersuchung kompletter Drosophila-Larven (whole mounts) ermöglicht die Analyse der Funktionalität der UAS/GAL4-Methode sowie die genetische und biochemische Integrität der benutzten GAL4-Treiberlinien. Dazu wurden mithilfe der zu verifizierenden Treiberlinien und der UAS-eGFP-Mutante Nachkommen erzeugt, die das grün fluoreszierende Protein GFP (green fluorescent protein) im gewebetypischen Muster des jeweiligen Treibers exprimierten. Fünf Tage alte Larven (3 rd instar Stadium) wurden aus den Futtergläsern der Züchtung abgesammelt, in Glycerol unter einem Fluoreszenz-Mikroskop mit einem 10fach-Objektiv betrachtet und aufgenommen. Nach optischer Anregung bei einer Excitationswellenlänge von 488 nm konnte die Präsenz von GFP im Gewebe bei einer Emissionswellenlänge ab 505 nm (Langpass) gemessen werden. Zur Abhebung vom natürlichen Autofluoreszenz- Hintergrund wurden nicht-gfp-exprimierende Larven als Vergleich herangezogen. Material Glycerol Konfokal-Lasermikroskop...Leica Paraffin-Präparation Die Benutzung speziell angefertigter Fliegenkrägen ermöglicht die Paraffin-Einbettung mehrerer parallel fixierter Drosophila (Jäger et al., 1987; Ashburner, M., 1989). Die Methode ist daher sehr gut für die histologische Auswertung einer Vielzahl benötigter Gehirnschnitte verschiedener Genotypen geeignet. 47

54 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Carnoy-Fixierung Gleichaltrige weibliche Fliegen der zu untersuchenden Genotypen wurden in einer Etherbombe betäubt. Die Einwirkungsdauer durfte 60 Sekunden nicht überschreiten, da die Tiere sonst starben. Mithilfe von Uhrmacherpinzette und Pinsel wurden bis zu zwölf Tiere in einen Kragen eingefädelt, so dass die Köpfe auf der Oberseite herausragten. An geeigneter Stelle wurde zur späteren Identifizierung der Reihenfolge der aufgefädelten Genotypen eine sine oculis-mutante eingesetzt. Dieser Stamm ist aufgrund des Fehlens der Facettenaugen unter den Schnittpräparaten leicht zu erkennen. Bestückte Krägen wurden zur weiteren Betäubung der Tiere auf Eis gelegt, bis alle bearbeiteten Krägen für vier Stunden in Carnoy-Lösung bei Raumtemperatur fixiert werden konnten. Das fixierte Gewebe musste danach zweimal für 30 Minuten in 99-prozentigem Ethanol und einmal für eine Stunde in absolutem Ethanol entwässert werden. Über Nacht wurden die entwässerten Präparate in Methylbenzoat bei Raumtemperatur gelagert und am nächsten Morgen bei einer Temperatur von 58 Celsius für eine Stunde in ein Paraffin- Methylbenzoat-Gemisch gegeben. Anschließend wurden die Krägen achtmal für je 20 Minuten mit reinem Paraffin überschichtet, das nach jedem Schritt gewechselt wurde. Zum Schluss wurden die Präparate in Kammern gelegt, zügig mit Paraffin übergossen und nach dem Erkalten vom Paraffinblock abgebrochen. Der Paraffinblock mit den Fliegenköpfen wurde grob zurechtgetrimmt, beschriftet und bis zum Schneiden bei 18 Celsius aufbewahrt. Material Ether und Etherbombe...Hauswerkstatt Fliegenkrägen Hauswerkstatt Uhrmacherpinzette, No Dumont Carnoy-Fixans Ethanol, 99% (v/v)...30 ml Chloroform...15 ml Essigsäure...5 ml Ethanol, absolut (wasserfrei) Ethanol...99% (v/v) Methylbenzoat Methylbenzoat/Paraffin...50% (v/v) Paraffin, flüssig 48

55 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Herstellung von Frontal-Schnitten Die fixierten Paraffinpräparate wurden auf einer Platte zur besseren Weiterverarbeitung abgekühlt und in ein Mikrotom eingespannt. Das obere Ende der Blöcke wurde getrimmt, so dass sich eine gerade Schnittfläche ergab. Von jedem Block wurden danach frontale, 1 µm-starke Serienschnitte hergestellt und in einer mit Wasser gefüllten Glasküvette gesammelt. Zum Strecken der Paraffinschnitte wurden sie mit einem Objektträger aus der Küvette entnommen, kurz in ein 42 Celsius-Wasserbad getaucht und anschließend für mindestens einen Tag luftgetrocknet. Material Kühlplatte Mikrotom...Leica Mikrotomklingen, Typ R 35...pfm AG Neuropil-Färbung Zum Entparaffinieren wurden die Schnittpräparate zweimal für zehn Minuten mit Xylol, zweimal für fünf Minuten mit Ethanol, zweimal für fünf Minuten mit 96-prozentigem Ethanol, zweimal für fünf Minuten mit 70-prozentigem Ethanol behandelt und danach in destilliertem Wasser gespült. Nach zwei Waschschritten in TBST für je zehn Minuten musste die endogene Peroxidase durch Zugabe von Wasserstoffperoxid-Lösung für zehn Minuten inaktiviert werden. Es folgten vier fünfminütige Spülungen mit TBST und die anschließende Blockierung des fixierten Gewebes mit Pferdeserum für eine Stunde. Im Anschluss wurden die Schnitte mit der Primärantikörperlösung für eine Stunde bei 37 Celsius in einer feuchten Kammer inkubiert. Der verwendete Antikörper ab49 bindet selektiv an allen Neuropil-Regionen und Synapsen von Motoneuronen (Zinsmaier et al., 1990). Nach zweimaligem Waschen mit TBST für je zehn Minuten erfolgte unter gleichen Bedingungen die Inkubation mit der Sekundärantikörperlösung. Die Lösung wurde durch zwei TBST-Spülungen entfernt, so dass die Schnitte danach für 90 Minuten mit Peroxidase-enthaltendem ABC-Reagenz inkubiert werden konnten. Die Entwicklung mit dem Substrat Diaminobenzidin (DAB) erfolgte für vier Minuten und hinterließ einen braunen Niederschlag an den Stellen, wo die Primärantikörper an Antigenen gebunden hatten. Überschüssiges Substrat wurde mit TBST entfernt, woraufhin 30 Sekunden mit Hämalaun gegengefärbt wurde. Durch zweiminütiges fließendes Wässern ergab sich die 49

56 TIERE, MATERIAL UND METHODEN typische Blaufärbung. Abschließend konnten die Objektträger mit Aquatex eingedeckt werden. Primärantikörperlösung Bezeichnung Spezies Subtyp Verdünnung in TBS Quelle ab49 Maus, monoklonal IgG 1% (v/v) + 0,1% (w/v) BSA AG Buchner Sekundärantikörperlösung Bezeichnung Spezies Subtyp Verdünnung in TBS Quelle anti-mausbiotin Pferd, monoklonal IgG 0,5% (v/v) + 1,5% (v/v) Pferdeserum Vectastain ABC Kit Material Xylol Ethanol Ethanol...96% (v/v) Ethanol...70% (v/v) TBST (ph 7,6) Verwahrung: RT Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)...10 mm Natriumchlorid mm Tween 2...0,05% (v/w) Wasserstoffperoxid...0,72% (v/v) Pferdeserum, 1,5% (v/v)...vectastain ABC Kit, Vector/Linaris ABC Reagenz...Vectastain ABC Kit, Vector/Linaris Diaminobenzidin (DAB)...Sigma-Aldrich Chemie GmbH Hämalaun Aquatex Mikroskopische Analyse Die gefärbten Schnittpräparate wurden lichtmikroskopisch unter Verwendung eines 20fach-Objektives betrachtet und aufgenommen. Für die Analyse des Grades neuropathologischer Veränderungen, die sich als vakuolisierende Bereiche im angefärbten Gewebe darstellten, wurden je Genotyp zehn Individuen ausgewertet. Dabei wurde der vakuolisierte Bereich in den optischen Loben der Fliegengehirne von drei aufeinander folgenden Frontalschnitten elektronisch gemessen, so dass eine anschließende statistische Analyse möglich wurde (Botella et al., 2003). Material Lichtmikroskop...Leica 50

57 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Gefrier-Präparation Mithilfe der Gefrier- oder Kryo-Technik (Buchner et al. in Ashburner, 1989) lassen sich nur einzelne Präparate prozessieren. Der Vorteil dieser Methode liegt jedoch in der schonenden, paraffinfreien Fixierung des Gewebes, so dass empfindliche Antikörper einen besseren Zugang zum Gewebe finden als bei der vorhergehenden Technik Paraformaldehyd-Fixierung Weibliche Fliegen vom zu untersuchenden Genotyp wurden betäubt und mit Nagellack zwischen Kopf und Thorax auf einem Plastikstab fixiert. Nach kurzem Eintauchen in Ethanol wurden den Tieren in Ringer-Lösung mithilfe von Uhrmacherpinzetten und Binokular zügig der Proboscis-Komplex und die dahinter liegenden Luftsäcke entfernt. Durch diese Maßnahme erlangte das Paraformaldehyd besseren Zugang zum Gehirn. Das vierprozentige Fixans wurde hergestellt, indem 1 g Paraformaldehyd mit 9 ml Wasser vermischt und auf 60 Celsius erhitzt wurde. Danach wurden 50 µl 1-normale Natronlauge zugegeben und gerührt, bis die Lösung klar wurde. Nachdem die Lösung Raumtemperatur erreicht hatte, wurde 12,5 ml Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung zugegeben und der ph-wert von 7,4 mit Kaliumdihydrogenphosphat eingestellt. Die präparierten Fliegen wurden anschließend mit dem Fixans in einem geeigneten Gefäß für 90 Minuten bei 4 Celsius kaltgestellt. Als Gefrierschutz wurden die fixierten Fliegen über Nacht in Saccharose/Ringer-Lösung bei 4 Celsius gelagert. Material Uhrmacherpinzetten, No Dumont Nagellack, Plastikstäbchen Ethanol Ringer-Lösung (ph 7,0) Natriumchlorid mm Kaliumchlorid...4,7 mm Kaliumdihydrogenphosphat...0,74 mm Dinatriumhydrogenphosphat...0,35 mm Magnesiumchlorid...1,8 mm Formaldehyd Natronlauge...1 M Kaliumdihydrogenphosphat...85 mm Dinatriumhydrogenphosphat...85 mm Saccharose/Ringer-Lösung...25% (w/v) Verwahrung: RT 51

58 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Herstellung von Frontal-Schnitten Innerhalb der nächsten drei Tage mussten die Köpfe von dem Stab abgetrennt und einzeln in Carboxymethylcellulose auf einem Gefrierteller versenkt werden. Nach der Ausrichtung der Köpfe für Frontal-Schnitte wurde der Gefrierteller mit dem Stiel in flüssigen Stickstoff eingetaucht, bis die Carboxymethylcellulose durchgefroren war. Das Präparat wurde rechteckig getrimmt und zum Schneiden bei -20 Celsius in einem Kryostat befestigt. Die 10 µm-dicken Serienschnitte wurden auf Objektträger aufgenommen, kurz angetaut und wieder eingefroren. Abschließend wurden die Gefrierschnitte etwa 15 Minuten luftgetrocknet und bei -20 Celsius aufbewahrt. Material Carboxymethylcellulose...15% (w/v) Gefrierteller...Hauswerkstatt Stickstoff, flüssig...tyczka Industrie-Gase GmbH Kryostat...Leica Objektträger SuperFrost...Microm International Färbemethoden Nachweis von β-galaktosidase Eine Möglichkeit zur Überprüfung des Aktivitätsmusters der GAL4-Treiberlinien bot sich über die Kreuzung mit der Linie UAS-LacZ an. Die Aktivität des Enzyms β- Galaktosidase (LacZ) konnte nach Zugabe des Substrats 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta- D-galactopyranosid (X-Gal) visualisiert werden. Dazu wurden die Objektträger dreimal für je 15 Minuten in Waschpuffer gespült und danach mit Färbepuffer über Nacht bei 37 Celsius inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Färbelösung mit Waschpuffer gewechselt und die Objektträger mit Aquatex eingedeckt. Die Präparate konnten bei 4 Celsius aufbewahrt werden. Die Betrachtung und Aufnahme erfolgte mit einem Lichtmikroskop unter Verwendung eines 20fach-Objektives. Material Waschpuffer (ph 7,4) Natriumchlorid mm Kaliumchlorid...27 mm Verwahrung: RT 52

59 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Material (Fortsetzung) Dinatriumhydrogenphosphat...43 mm Kaliumdihydrogenphosphat...14 mm Ethylenglykol-bis(aminoethylether)- N,N,N'N'- Tetraessigsäure (EGTA)...5 mm Natriumdesoxycholat...0,01% (w/v) Nonidet P ,02% (v/v) Magnesiumchlorid...2 mm Färbepuffer (ph 7,4) auf Basis des Waschpuffers Kaliumeisen(III)-Cyanid...5 mm Kaliumeisen(IV)-Cyanid...5 mm X-Gal...0,002% (w/v) Aquatex Lichtmikroskop...Leica Nachweis von transgenem PrP Zum Nachweis von transgenem PrP in den Gehirnschnitten wurden die Präparate zuerst dreimal für je fünf Minuten mit Detergens-enthaltendem Waschpuffer gewaschen und für 30 Minuten mit Hasenserum geblockt. Nachdem das Serum ablaufen gelassen wurde, erfolgte die Inkubation mit der Primärantikörperlösung über Nacht bei 4 Celsius in einer feuchten Kammer. Es schlossen sich drei achtminütige Waschschritte an. Daraufhin konnten die Präparate mit der Sekundärantikörperlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert werden. Nach drei abschließenden Spülungen für je acht Minuten wurden die Gehirnschnitte mit fluorescence mounting medium eingedeckt. Nach optischer Anregung bei einer Excitationswellenlänge von 488 nm erfolgte die Fluoreszenzanalyse bei einer Emissionswellenlänge ab 505 nm (Langpass) mit einem Fluoreszenz-Mikroskop unter Verwendung eines 40fach-Objektives. Primärantikörperlösungen Bezeichnung Spezies Subtyp Verdünnung in TBS Quelle ICSM18 Maus, monoklonal IgG1 0,1% (v/v) + D-Gen Ltd. (1 µg/µl) 5% (v/v) Hasenserum B2-43 (0,27 µg/µl) Maus, monoklonal IgG1 0,1% (v/v) + 5% (v/v) Hasenserum (Hoffmann, 2008) 53

60 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Sekundärantikörperlösung Bezeichnung Spezies Subtyp Verdünnung in TBS Quelle anti-maus- Alexa fluor 488 (2 µg/µl) Hase, monoklonal IgG 0,1% (v/v) + 5% (v/v) Hasenserum Molecular Probes, Invitrogen GmbH Material Waschpuffer (ph 7,4) Natriumchlorid mm Kaliumchlorid...27 mm Dinatriumhydrogenphosphat...43 mm Kaliumdihydrogenphosphat...14 mm Triton X ,3% (v/v) Konfokal-Lasermikroskop...Leica Fluorescence mounting medium...dako GmbH Verwahrung: RT Nachweis von apoptotischen Neuronen Während des physiologischen Zelltods (Apoptose) wird die DNA durch Endonuklease- Aktivität fragmentiert. Die dadurch an den Bruchenden freiwerdenden Hydroxylgruppen können mithilfe der Terminalen deoxynucleotidyl Transferase (TdT) mit Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Nukleotiden versehen und mit einem Fluoreszenz- Mikroskop detektiert werden. Diese Methode wird als TdT-vermittelte desoxy- Uridintriphosphat-biotin nick end labeling (TUNEL) bezeichnet (Gavrieli et al., 1992). Die Zelllokalisation solch fragmentierter DNA kann durch eine Ko-Färbung mit einem TUNEL-Reaktionsgemisch und einem zellspezifischen Primärantikörper ermöglicht werden. Die vorgefertigten Gehirnschnitt-Präparate wurden aufgetaut und für zwei Minuten auf Eis permeabilisiert. Nach zweimaligem Spülen mit Waschpuffer erfolgte die Dunkelinkubation mit 100 µl TUNEL-Reaktionsgemisch für eine Stunde bei 37 Celsius in einer feuchten Kammer. Nach drei Waschschritten wurden die Objektträger mit je 100 µl der Primärantikörperlösung versehen und über Nacht bei 4 Celsius in einer feuchten Kammer gelagert. Am nächsten Tag erfolgte nach dreimaligem Waschen die Dunkelinkubation mit 100 µl der Sekundärantikörperlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach drei abschließenden Spülungen konnten die Präparate eingedeckt werden. Die Auswertung und Aufnahme erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines 40fach-Objektives. Nach optischer Anregung bei einer 54

61 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Excitationswellenlänge von 543 nm konnten TUNEL-positiv angefärbte Bereiche bei einer Emissionswellenlänge ab 560 nm (Langpass) detektiert werden. Positiv angefärbte Neuronen wurden bei 488 nm angeregt und zwischen 505 und 530 nm (Bandpass) detektiert. Primärantikörperlösung Bezeichnung Spezies Subtyp Verdünnung in TBS Quelle NeuN (1 µg/µl) Maus, monoklonal IgG 1% (v/v) + 5% (v/v) Hasenserum Chemicon Inc. Sekundärantikörperlösung Bezeichnung Spezies Subtyp Verdünnung in TBS Quelle anti-maus- Alexa fluor 488 (2 µg/µl) Hase, monoklonal IgG 0,1% (v/v) + 5% (v/v) Hasenserum Molecular Probes, Invitrogen GmbH Material Waschpuffer (ph 7,4) Natriumchlorid mm Kaliumchlorid...27 mm Dinatriumhydrogenphosphat...43 mm Kaliumdihydrogenphosphat...14 mm In situ Cell Death Detection Kit...Roche AG Konfokal-Lasermikroskop...Leica Fluorescence mounting medium...dako GmbH Verwahrung: RT Epoxidharz-Präparation Die Einbettung von fixierten Gewebepräparaten in Epoxidharz macht es möglich, äußerst dünne Schnitte von 2 µm bis wenigen Nanometern (Semi- und Ultradünn-Schnitte) herzustellen. Derart dünne Gewebeschnitte werden zum Beispiel für die Elektronenmikroskopie benötigt, bei der eine Auflösung von bis zu 100 pm erreicht werden kann Glutaraldehyd-Fixierung Die Fliegenköpfe wurden wie unter beschrieben präpariert und über Nacht mit dem Fixans bei 4 Celsius inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Präparate mit Waschpuffer gespült und mit Osmiumoxid-Lösung nachfixiert. Nach einem erneuten 55

62 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Waschgang wurde das Gewebe mit einer ansteigenden Ethanolreihe entwässert, woraufhin die frontal-gerichtete Einbettung in Epoxidharz erfolgte. Material Waschpuffer (ph 7,4) Natriumchlorid mm Kaliumchlorid...27 mm Dinatriumhydrogenphosphat...43 mm Kaliumdihydrogenphosphat...14 mm Glutaraldehyd-Fixans auf Basis des Waschpuffers Glutaraldehyd...5% (w/v) Osmiumoxid-Lösung auf Basis des Waschpuffers Osmiumoxid...1% (w/v) Ethanol Verwahrung: RT Schnittanfertigung, Färbungen und Mikroskopie Die Gewebepräparate wurden dem kooperierenden Institut für Anatomie der Universität übergeben. Dort wurden sowohl serielle 1 µm-dicke Toluidin-Blau-gefärbte Schnitte zur lichtmikroskopischen Auswertung als auch Ultradünnschnitte zur Analyse mit dem Elektronenmikroskop angefertigt (Kretzschmar, D. et al., 1997) Das Gehirn-Koordinatensystem Zur vereinheitlichten Beschreibung der untersuchten Gehirnkompartimente wurde das von Nicholas J. Strausfeld entwickelte Koordinatensystem verwendet (Strausfeld, 1976). Ursprünglich für Musca domestica (Stubenfliege) entwickelt, bezieht sich der Ursprung der X- und Z-Koordinate bei Frontal-Schnitten auf das Zentrum des Ellipsoid-Körpers (ellipsoid body, e b). Ganzzahlige positive X-Einheiten geben die dorsale Entfernung von X=0 in 10 µm-schritten an. Positive Z-Einheiten geben die Entfernung nach links von X=0 an. Die Y-Koordinate gibt die Entfernung von der X,Y=0-Fläche an. Positive Einheiten stehen für 10 µm-schritte in anteriore Richtung. 56

63 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 2.6 Tierexperimentelle Methoden Expression von Transgenen im Fliegenauge Transgene Proteine, die im Verdacht stehen, neurodegenerative Veränderungen hervorzurufen, können in einem Vorversuch im Augengewebe exprimiert werden. Dort führen krankheitsassoziierte Proteine schnell zu einer Retina-Degeneration, die makroskopisch zu erkennen ist (Franceschini, 1972; Feany et al., 2000; Gunawardena et al., 2003; Muhlig-Versen et al., 2005). Transgene Fliegen wurden mit der Treiberlinie GMR-GAL4 verpaart und deren Nachkommen etwa sieben Tage nach dem Schlüpfen abgesammelt. Nach Betäubung der Tiere konnte die Retina lichtmikroskopisch betrachtet und aufgenommen werden Analyse der Lebenserwartung Die Ermittlung der Lebenserwartung von Drosophila erfolgte bei Standard-Bedingungen, das heißt normales Futter und Haltung bei 25 Celsius im Klimaraum. Pro Genotyp wurden mindestens 100 Fliegen beider Geschlechter direkt nach dem Schlüpfen abgesammelt. Die Tiere wurden in Gruppengrößen zu je 25 auf mittelgroße Futterbehälter verteilt und durch eine Code-Vergabe anonymisiert. Auf die Beigabe von Hefe wurde verzichtet, da die klebrige Masse oft zur Falle für die Fliegen wurde und dadurch zu unnatürlichen Todesfällen führte. Ein wassergetränkter Filter wurde ebenfalls nicht eingesetzt, da die Futter-Oberfläche hierdurch geöffnet wurde, was für manche Fliegen ebenso zum Verhängnis geworden war. Des Weiteren wurden die Futtergläser in den Kisten nicht wie üblich senkrecht stehend, sondern waagerecht liegend gelagert. Dies hatte den Zweck, dass sich die Fliegen zur Erholung nicht auf dem Futterbrei, sondern auf der sauberen Behälterseite niederlassen konnten. Auch diese Maßnahme reduzierte die Anzahl unspezifischer Todesfälle drastisch. Damit es zu keinem Flüssigkeitsmangel innerhalb der Futtergläser kommen konnte und auch aufgrund der zunehmenden Zersetzung des Futterbreis durch sich entwickelnde Fliegenlarven, wurden die Versuchstiere regelmäßig alle zwei bis drei Tage auf frische Futterbehälter umgesetzt. Dabei war es wichtig, die Tiere möglichst wenig bis gar nicht zu narkotisieren, um 57

64 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Nervenschädigungen durch Kohlendioxid zu minimieren. Die Umsetzung wurde gleichzeitig zur Zählung und Entfernung der toten Individuen benutzt. Die dokumentierten Resultate wurden nach Abschluss des Experiments mithilfe einer Kaplan-Meyer-Funktion ausgewertet. Dabei wurden Subjekte, die durch Fremdeinwirkung starben oder dem Experiment entkamen, zensiert und gingen nicht in die Wertung mit ein. Ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der Lebenserwartung zweier Genotypen wurde nach Analyse der Überlebenskurven mit dem logrank-test bei einem Signifikanzniveau von 0,05 errechnet. Signifikanzniveau α Symbol P > 0,05 n.s. 0,05 P 0,01 * 0,01 > P 0,001 ** P 0,0009 *** Material Polystyrol-Röhrchen, mittlere Größe...Lehrstuhl für Genetik Binokular...Carl Zeiss AG CO 2 -Narkoseanlage...Lehrstuhl für Genetik Kisten mit Einlage...SSI Schäfer Silikonöl Pinsel, Größe 0 technischer Alkohol Applikation von Wasserstoffperoxid Zur Verfütterung eines Wasserstoffperoxid-enthaltenden Futtermittels mussten vor Versuchsbeginn entsprechende Futtergläser hergestellt werden. Dazu wurde eine Saccharose-Lösung mit Agarose vermischt und aufgekocht. Die Agarose musste einen sehr niedrigen Gelierpunkt aufweisen, denn es war notwendig, dass die Substanz bei einer Temperatur von 40 Celsius noch im flüssigen Aggregatzustand vorlag. Sobald die Lösung die 45 Celsius-Marke unterschritt, wurde Wasserstoffperoxid zugesetzt, vermischt und unmittelbar danach in Volumina zu je 10 ml zügig auf Polystyrol- Röhrchen verteilt. Wasserstoffperoxid konnte nicht bei einer höheren Temperatur zugesetzt werden, da sonst die oxidative Aktivität verloren gegangen wäre (Monnier et al., 2002). Nach Abkühlung auf Raumtemperatur und Polymerisation der Agarose- Lösung konnten die Futterbehälter mit einem Stopfen geschlossen und bei 4 Celsius 58

65 TIERE, MATERIAL UND METHODEN gelagert werden. Die Peroxidase-Aktivität blieb ab diesem Zeitpunkt für mindestens 14 Tage konstant bestehen (Kaneuchi et al., 2003). Wenigstens 100 Fliegen pro Genotyp und Geschlecht wurden nach dem Schlüpfen abgesammelt und nach fünf Tagen Standard-Haltung zu Gruppen von 20 Individuen auf die angefertigten Futterbehälter gesetzt. Die anonyme Inkubation erfolgte bei 25 Celsius und 60% Luftfeuchtigkeit. Alle acht Stunden wurden die toten Tiere gezählt und dokumentiert. Über eine Kaplan-Meyer-Funktion wurden Überlebenskurven errechnet und mit dem logrank-test auf signifikante Unterschiede überprüft. Material Polystyrol-Röhrchen, mittlere Größe...Lehrstuhl für Genetik Futtermittel Agarose, low melting...1,3% (w/v) Saccharose...1% (w/v) Wasserstoffperoxid...0,15% (v/v) Haltung unter reiner Sauerstoffatmosphäre Für die Haltung von Drosophila unter Hyperoxia-Bedingungen musste zunächst eine Vorrichtung zur Begasung der Tiere errichtet werden. Der Versuchsaufbau setzte sich aus mehreren Komponenten zusammen. Eine Gasflasche mit 20 Liter 99,5-prozentigem Sauerstoff diente als Sauerstoffquelle für bis zu zehn Tage. Die an 100 fehlenden 0,5% setzten sich aus geringen Mengen von Helium, Argon und anderen nicht-toxischen Gasen zusammen. Das Gas wurde über einen Druckverminderer mit feinregulierbarem Manometer mit einer Durchflussgeschwindigkeit von etwa 300 ml pro Minute in eine Gaswaschflasche geleitet. Dort wurde der Sauerstoff befeuchtet, so dass die Versuchstiere nicht an Austrocknung verendeten. Aus der Flasche wurde das Gas über ein Schlauchsystem in einen Exsikkator geleitet, in dem bis zu 24 mittelgroße Futterbehälter Platz hatten. Der Exsikkator wurde mit Schlifffett luftdicht verschlossen, die Abluft wurde über ein Deckelventil in einen Abzug geleitet, so dass sich kein Überdruck aufbauen konnte. Mindestens 100 Fliegen pro Genotyp und Geschlecht wurden nach dem Schlüpfen abgesammelt und nach fünf Tagen Standard-Haltung zu Gruppen von 20 Individuen auf die Futterbehälter mit Minimalmedium gesetzt. Das Futter setzte sich lediglich aus 59

66 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Saccharose und Agarose zum Gelieren zusammen. Auf die Verwendung von Standard- Futter musste verzichtet werden, da die enthaltenen Vitamine eine anti-oxidative Wirkung entfaltet und dem Experiment entgegen gewirkt hätten. Die anonyme Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur unter einem Abzug. Alle acht Stunden wurden die toten Tiere gezählt und dokumentiert. Über eine Kaplan-Meyer-Funktion wurden Überlebenskurven errechnet und mit dem logrank-test auf signifikante Unterschiede überprüft. Material Polystyrol-Röhrchen, mittlere Größe...Lehrstuhl für Genetik Futtermittel Agarose, low melting...1,3% (w/v) Saccharose...1% (w/v) Sauerstoffflasche, Typ 20...Tyczka Industrie-Gase GmbH Druckverminderer...Tyczka Industrie-Gase GmbH Gaswaschflasche Schlauch, 5 mm stark, Verbindungsklemmen Exsikkator, mit Deckel und Ventil Applikation von Methylviologen (Paraquat) Für dieses Experiment wurden analog zur Vorbereitung für die Wasserstoffperoxid- Applikation (2.6.3) Methylviologen enthaltende Futtermittelbehälter hergestellt. Aufgrund der hohen Toxizität des Pestizids, das auch als Paraquat bezeichnet wird, mussten sämtlich Arbeitsschritte unter dem Abzug und unter zusätzlicher Verwendung von Mundschutz durchgeführt werden. Das Methylviologen konnte wegen der erforderlichen Erhaltung der oxidativen Wirkung abermals nur unterhalb der 45 Celsius- Grenze mit der Zucker-Agarose-Lösung vermischt werden. Mindestens 100 Fliegen pro Genotyp und Geschlecht wurden nach dem Schlüpfen abgesammelt und nach fünf Tagen Standard-Haltung zu Gruppen von 20 Individuen auf Futterbehälter verteilt, die lediglich einen wassergetränkten Filter enthielten. Nach sechs Stunden derartiger Hungerung wurden die Versuchstiere auf die Methylviologen- Futterbehälter umgesetzt. Die anonyme Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur unter einem Abzug. Alle acht Stunden wurden die toten Tiere gezählt und dokumentiert. Über eine Kaplan-Meyer-Funktion wurden Überlebenskurven errechnet und mit dem logrank- Test auf signifikante Unterschiede überprüft. 60

67 TIERE, MATERIAL UND METHODEN Material Polystyrol-Röhrchen, mittlere Größe...Lehrstuhl für Genetik Futtermittel Agarose, low melting...1,3% (w/v) Saccharose...1% (w/v) Methylviologen...20 mm 2.7 Software Für die Erarbeitung dieser Dissertation sowie enthaltener Abbildungen und Tabellen und die Analyse, Verarbeitung und Darstellung der Resultate wurden unterschiedliche Computerprogramme verwendet, die im Folgenden aufgelistet werden. Software Windows Xp...Microsoft Word, Version 11...Microsoft Excel, Version 11...Microsoft Powerpoint, Version 11...Microsoft Access, Version 11...Microsoft Firefox, Version 2...open source Photoshop, Version 7...Adobe Illustrator, Version 10...Adobe Acrobat, Version 6...Adobe ScanSoft Omnipage, Version 4...Canon Prism, Version 4...GraphPad EndNote, Version X2...Thomson AIDA, Version 3...raytest 61

68 ERGEBNISSE 3 ERGEBNISSE 3.1 Funktionskontrolle und Expressionsmuster der GAL4-Treiberlinien Bevor mit der molekularbiologischen Charakterisierung der erzeugten transgenen Drosophila melanogaster-linien oder experimentellen Untersuchungen begonnen werden konnte, wurden die verwendeten Galaktosidase (GAL4)-Treiberlinien Actin- GAL4, Appl-GAL4 und GMR-GAL4 auf ihre Funktionalität überprüft. Durch die Verpaarung dieser Linien mit der UAS-TNT Reporter-Linie konnte die generelle Präsenz von GAL4 schnell nachgewiesen werden. Nachkommen dieser Züchtung exprimierten in der Gegenwart von GAL4 das Nervengift Tetanustoxin und waren nicht überlebensfähig. Da sich bei allen getesteten Linien keine vitalen Larven entwickelten, musste eine GAL4- Aktivität vorgelegen haben (Tabelle 4). Eine UAS-TNT-Kontrollkreuzung ohne GAL4- Treiberlinie führte hingegen zu keiner letalen Filialgeneration. Stamm Promotor GAL4-Expression Vitalität der F 1 bei UAS-TNT Präsenz Actin-GAL4 Actin ubiquitär letal Appl-GAL4 beta amyloid protein pan-neuronal letal precursor-like GMR-GAL4 Glass Multimer Reporter retinal letal keine vital Tabelle 4: Charakteristika der verwendeten GAL4-Treiberlinien. Angegeben sind die vorgeschalteten Promotoren, die gewebespezifischen Aktivität und die Vitalität der Filialgeneration (F 1 ) in Gegenwart von UAS-TNT. Für die Linien Actin-GAL4 und Appl-GAL4 sollten des Weiteren die gewebespezifische Expression und die detaillierten Verteilungsmuster im Fliegengehirn ermittelt werden. Zur Abklärung der Gewebespezifität wurde die Reporter-Linie UAS-eGFP mit den beiden Treiberlinien verpaart. Nachkommen dieser Züchtungen zeigten bei entsprechender optischer Anregung bereits im Larvenstadium eine deutliche, grünfarbene Fluoreszenz, die durch die egfp-präsenz in GAL4-exprimierenden Geweben hervorgerufen wurde. Zur Dokumentation wurden die anterioren Segmente von 3 rd instar-larven aufgenommen (Abbildung 11). Da Proteine unter UAS-Kontrolle von 62

69 ERGEBNISSE GAL4 abhängig sind, konnte bei Tieren von Kontrollgruppen aufgrund der Abwesenheit des Transkriptionsaktivators nur die natürliche Autofluoreszenz festgestellt werden. Abbildung 11: Die GAL4-Treiberlinien zeigen eine promotorabhängige, gewebespezifische Aktivität. Die fluoreszenzmikroskopische Analyse im anterioren Larvensegment zeigt Appl- GAL4-induzierte egfp-aktivität im Gehirn (a) und Actin-GAL4-induzierte ubiquitäre egfp- Aktivität (b) bei 3 rd instar Larven. Die relative Intensität (0 bis 255) ist jeweils unter den Aufnahmen der anterioren Larvensegmente angegeben. Natürliche Autofluoreszenz wurde in Abwesenheit eines GAL4-Konstruktes gemessen (c). Eine auflichtmikroskopische Darstellung (d) zeigt die anterioren (links) und posterioren Segmente (oben) einer 3 rd instar Larve im Maßstab 15:1. Die detaillierten Expressionsmuster wurden durch Verpaarung der GAL4-Treiberlinien mit dem Reporter-Konstrukt UAS-LacZ und einer anschließenden X-Gal Färbung von Gefrier-Gehirnschnitten ermittelt. Indiziert durch einen blauen Farbniederschlag zeigte 63

70 ERGEBNISSE sich bei den Präparaten eine diffuse Verteilung in allen Schnittebenen (Abbildung 12). Stark angefärbte Bereiche und damit die Gewebekompartimente mit der höchsten Expressionsaktivität ließen sich in den Strukturen der Pilzkörper (mushroom bodies), wie den α- und β-loben, den Pedunculi und den Calyces, aber auch in dem Fächerförmigen Körper des Zentralgehirns feststellen. Abbildung 12: GAL4 wird im gesamten Fliegengehirn exprimiert. Die auflichtmikroskopische Analyse zeigt die stärkste GAL4-Expressionsaktivität in den β-loben (β lob) auf der Schnittebene y +5,0 (a), den α-loben (α lob) auf y +1,0 (b), dem Fächerförmigen Körper (fanshaped body, fb) und den Pedunculi (ped) auf y -2,0 (c) sowie den Calyces (ca) auf y -7,0 (d). Der Nachweis erfolgte durch eine X-Gal-Färbung auf Frontalschnitten von 5-Tage-alten Weibchen des Genotyps Actin-GAL4/UAS-LacZ. Gezeigt ist die jeweils linke Gehirnhemisphäre im Maßstab 200: Molekularbiologische Charakterisierung der transgenen Drosophila Kartierung der Transgen-Integrationsorte Um schädliche Wirkungen auszuschließen, die durch Integration der Transgene in kodierende DNA-Bereiche hervorgerufen werden können, wurden die Transgenumgebenden Abschnitte sequenziert, um den jeweiligen Insertionsort im Wirtsgenom zu 64

71 ERGEBNISSE identifizieren. Nach Abgleich der Sequenzen mit der Drosophila-Genom-Datenbank flybase, konnten zusätzlich bekannte molekulare Funktionen der von der Insertion betroffenen Gene ermittelt werden (Tabelle 5). transgene Linie Chromosom Genlocus Gen intragen/ kodierend molekulare Funktion wt-prp-5 3R 98B6 CG5508 downstream Glycerol-3-Phosphat O-Acetyltransferase wt-prp-8 3L 70C5 Rgl Intron Ral Guanyl-Nukleotid exchange factor 2 wt-prp-9 3R 99C4 CG31032 Exon unbekannt wt-prp-11 2R 55B9 lolal Intron RNA Polymerase II Transkriptionsfaktor tr-prp-2 2L 35E2 beat-ia Intron unbekannt tr-prp-3 3 n.a. n.a. n.a. n.a. Tabelle 5: Integrationsdaten der transgenen Linien. Zu jeder Drosophila-Linie mit transgenem PrP-Konstrukt wird der genaue Integrationsort mit Angabe des betreffenden Chromosomen-Arms und des cytogenetischen Genlocus angegeben. Ferner wird aufgeführt, ob das Transgen in einem kodierenden (Exon), nicht-kodierenden intragenen (Intron) oder nichtkodierenden extragenen Bereich (downstream) inseriert wurde. Soweit bekannt, sind die molekularen Funktionen der betreffenden Gene aufgelistet. Da die Daten für die Linien wt-prp-8 und tr-prp-2 sehr schnell zu Beginn der Arbeit vorlagen und sich keine Konflikte mit endogenen Abschnitte ergaben, wurde entschieden, experimentelle Untersuchungen hauptsächlich mit diesen Linien durchzuführen. Als zweite Wildtyp-PrP-exprimierende Linie wurde trotz der Integration in einem kodierenden Bereich wt-prp-9 ausgewählt. Die Linien wt-prp-5 und wt-prp-11 mussten als homozygot letal eingestuft werden. Das heißt, dass sich das Transgen nicht auf beiden Schwesterchromosomen etablieren konnte, was sehr deutlich auf die Notwendigkeit des unberührten, wildtypischen Allels hinweist. Damit experimentelle Daten nicht vordergründig im Zusammenhang mit diesem Konflikt diskutiert werden müssen, wurde auf die Arbeit mit diesen Linien verzichtet. Um größere Sicherheit zu erhalten, wurde die Aktivität der betroffenen Gene Rgl, CG31032 und beat-ia über drei unabhängige Microarray-Experimente bestimmt. Es zeigte sich, dass der Gehalt an mrna zwischen den PrP-Mutanten und einer UAS-LacZ- Kontrolllinie nur minimal voneinander abwich (Tabelle 6). Somit lag bei den drei 65

72 ERGEBNISSE Mutanten zumindest keine Störung der Transkription durch die integrierten Transgene vor. Gen Experiment wt-prp-8 LacZ Verhältnis wt-prp-8/lacz Verhältnis (ln2) Rgl 1 6,8434 6,8283 1,0152 0,02 2 8,6005 8,8399 0,7871-0,35 3 8,7854 8,8673 0,9214-0,12 Gen Experiment wt-prp-9 LacZ Verhältnis wt-prp-9/lacz CG ,0365 5,9729 1,0657 0,09 2 7,4135 7,3741 1,0403 0,06 3 7,2058 7,3113 0,8998-0,15 Gen Experiment tr-prp-2 LacZ Verhältnis tr-prp-2/lacz beat-ia 1 5,7684 5,5837 1,2029 0,27 2 7,0077 6,8427 1,1794 0,24 3 7,0370 7,0995 0,9394-0,09 Verhältnis (ln2) Verhältnis (ln2) Tabelle 6: Die Gene Rgl, CG31032 und beat-ia verlieren durch die Integrate nicht an Transkriptions-Effizienz. Der Gehalt an mrna in den PrP-Mutanten und einer LacZexprimierenden Linie wird durch die logarithmierte Signalintensität wiedergegeben und in ein absolutes Verhältnis umgerechnet. Die Angabe des natürlichen Logarithmus zur Basis 2 (ln2) des Verhältnisses ermöglicht weitere Berechnungen mit normalverteilten, auch negativen Zahlenwerten Messung der PrP-RNA in transgenen Fliegen Als eine erste Kontrolle der transgenen Linien sollte festgestellt werden, ob die integrierten Transgene tatsächlich aktiv waren und somit nach Actin-GAL4-Induktion transkribiert wurden. Mithilfe der RTQ-PCR wurde der RNA-Gehalt der verschiedenen Transgene in den jeweiligen Genotypen ermittelt. Nach Vergleich der Werte mit dem Haushaltsgen G6PDH (Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase) aus denselben Nukleinsäure-Isolaten konnten die Daten normalisiert und in ein Verhältnis gesetzt werden (Tabelle 7). Somit ergab sich als Resultat nicht nur die Verifizierung einer intakten Transkription, es konnte außerdem bestimmt werden, dass Transgen-RNA in G6PDH-ähnlichen Mengen synthetisiert wurde. 66

73 ERGEBNISSE Linie CT-Wert G6PDH CT-Wert normalisiert Verhältnis G6PDH/Transgen wt-prp-8 20,34 20,78 20,34 1,02 wt-prp-9 19,08 21,13 18,76 1,11 tr-prp-2 17,46 21,57 16,82 1,23 UAS-LacZ > 31,00 23,64 Kontrolle (H 2 O) > 31,00 Tabelle 7: Die PrP-Transgene werden in Drosophila aktiv transkribiert. Die CT-Werte für die Transgene wurden mit den CT-Werten des Haushaltsgens G6PDH normalisiert und in Verhältnis gesetzt. Die verwendete Treiberlinie war Actin-GAL Bestimmung der PrP-Expression in transgenen Fliegen Der nächste Schritt in der Charakterisierung der transgenen Tiere war es, herauszufinden ob die PrP-Transkripte im weiteren Verlauf translatiert wurden, so dass ausgereifte Proteine entstanden. Der PrP-Proteinnachweis im Gehirn der transgenen Fliegen wurde mit Immunblots durchgeführt. Dazu wurden ganze Fliegenköpfe homogenisiert. Mithilfe der Treiberlinie Actin-GAL4 wurde PrP zunächst ubiquitär exprimiert und die Spezifität des benutzten PrP-Antikörpers anhand von Mausgehirnhomogenaten verifiziert. So zeigte sich keine Färbung bei der Protein-Probe aus der PrP-defizienten Mauslinie Prnp 0/0, jedoch das charakteristische dreiteilige Bandenmuster von PrP bei der Probe der wildtypischen Mauslinie Prnp +/+ (Abbildung 13). Dabei stand die unterste Bande mit einer Molekülmasse von etwa 27 kda für die unglykosylierte, die mittlere (30 kda) für die monoglykosylierte und die oberste (33 kda) für die diglykosylierte Form des Proteins. Für die Drosophila-Proteinproben ergab sich für wt-prp ebenfalls das dreiteilige Proteinmuster, wobei die unglykosylierte Form dieselbe Molekülmasse zeigte wie bei der Mausprobe. Die monoglykosylierte Form mit etwa 28 kda und die diglykosylierte Form mit 30 kda fielen jedoch kleiner aus. Diese Beobachtung spricht möglicherweise für unterschiedliche Glykosylierungsmechanismen in diesen beiden Spezies. Die Masse der trunkierten Form des transgenen Prion-Proteins fiel nochmals etwa 7 kda geringer aus, so dass die unglykosylierte Form bei 20 kda lag. Die erwartungsgemäße Differenz erklärt sich aus der um 102 Aminosäuren verkürzten Form von tr-prp. In der Probe der doppelttransgenen Linie wt-prp-8/tr-prp-2 wurde PrP sowohl in den Formen der wildtypischen Proben als auch der trunkierten Proben detektiert, was auf die intakte Ko-Expression 67

74 ERGEBNISSE beider Proteine in dieser Linie hinweist. In einer nicht-prp-exprimierenden Linie, hier durch die LacZ-exprimierende Linie repräsentiert, lies sich PrP nicht nachweisen. Um die Expressionsstärken in den jeweiligen Genotypen zu quantifizieren, wurden die PrP-Resultate mit den Expressionsdaten des Synapsen-assoziierten-Proteins-47 (SAP47) nach einer Ladekontroll-Färbung normalisiert. Dabei stellte sich heraus, dass stets etwa gleiche Mengen an Gesamt-Protein aufgetragen wurden und die Expression der Transgene vergleichbar stark war. Des Weiteren konnte auf diesem Weg festgestellt werden, dass es keine Expressionsunterschiede in männlichen oder weiblichen Tieren des getesteten Genotyps wt-prp-8 gab. Abbildung 13: PrP wird in Fliegenköpfen aller transgenen Linien etwa gleich stark exprimiert. Immunblots zeigen das charakteristische dreiteilige Bandenmuster von PrP. Durch die SAP47-Protein-Ladekontrolle wurden die Proteinmengen auf das wt-prp-8-level (100%) normalisiert. Im Vergleich dazu, zeigt wt-prp-9 einen etwas höheren (117%) und tr-prp-2 einen etwas niedrigeren PrP-Gehalt (71%) auf. Beide PrP-Größenformen sind bei der doppelt transgenen Linie zu erkennen. Kein signifikanter Expressionsunterschied kann bei Tieren weiblichen (96%) und männlichen Geschlechts (118%) festgestellt werden. Es wurden pro Genotyp 35 µl Homogenat (etwa 14 Köpfe) aufgetragen. Die verwendete Treiberlinie war Actin- GAL4, und PrP wurde mit ICSM18 detektiert. Um zu bestätigen, dass sich das dreiteilige PrP-Bandenmuster tatsächlich auf eine alternative Glykosylierung des Proteins begründet, wurde eine Proteinprobe des Genotyps wt-prp-8 mit dem Enzym PNGase F behandelt. Die enzymatische Reaktion löst die Zuckerreste an den beiden Asparagin-Resten des Prion-Proteins auf, so dass nach vierstündiger Inkubation nur noch eine unglykosylierte Form im Proteingemische auftreten sollte. Wie in Abbildung 14 zu sehen ist, fand sich die erwartete Auflösung der 68

75 ERGEBNISSE beiden oberen Banden, so dass lediglich die unglykosylierte Form auf dem Immunblot zu detektieren war (banding shift). Zur Kontrolle der enzymatischen Funktion wurde ein wildtypisches Mausgehirnhomogenat mitbehandelt. Auch hier zeigte sich die fast vollständige Reduktion der Protein-Banden auf eine Molekülmasse von etwa 27 kda. Abbildung 14: Das PrP-Bandenmuster als Resultat alternativer Glykosylierung. Immunblots zeigen die Auflösung der glykosylierten Formen des Prion-Proteins nach PNGase-Behandlung bei wt-prp-8 und Prnp +/+ Kopfhomogenaten. Aufgetragen wurden jeweils 35 µl, das entspricht etwa 14 Fliegen-Köpfen. Die verwendete Treiberlinie war Actin-GAL4. PrP wurde mit ICSM18 detektiert. Damit das Drosophila-Modell einen stärker physiologischen Charakter bekommt, wurden die Transgene in einem nächsten Schritt mithilfe der Treiberlinie Appl-GAL4 pan-neuronal exprimiert. Zur Kontrolle der Expressions-Effizienz wurde ein Immunblot mit Fliegenkopf-Homogenaten durchgeführt (Abbildung 15). Erneut zeigte sich das charakteristische Erscheinungsbild des Prion-Proteins für wt-prp und eine größenreduzierte Form bei tr-prp. Beide Formen konnten erwartungsgemäß in Protein- Proben der doppelt transgenen Linie detektiert werden. 69

76 ERGEBNISSE Abbildung 15: Prion-Protein wird in transgenen Fliegen pan-neuronal exprimiert. Nach Normalisierung der wt-prp-8-probe (100%) weist die trunkierte Form tr-prp-2 eine vergleichbare Expressionsstärke auf (97%). Wt-PrP-9 zeigt hingegen eine deutlich schwächere Expression (60%). Es wurden pro Genotyp 35 µl Homogenat (etwa 14 Köpfe) aufgetragen. Die verwendete Treiberlinie war Appl-GAL4, und PrP wurde mit ICSM18 detektiert. Über einen direkten Vergleich von Proteinproben aus Fliegen, deren Transgen ubiquitär oder pan-neuronal exprimiert wurde, sollte erkenntlich werden, ob es quantitative Unterschiede bezüglich der Expressionsstärke gibt. Dazu wurden in einem Kopfhomogenat-Immunblot Proben der Genotypen wt-prp-8 und wt-prp-9 unter der Verwendung beider Treiberlinien gegenüber gestellt (Abbildung 16). Es stellte sich heraus, dass pan-neuronal getriebenes Prion-Protein im Kopf in deutlich geringeren Mengen exprimiert wird. Abbildung 16: PrP wird pan-neuronal in geringeren Mengen exprimiert. Nach Normalisierung zeigt der Immunblot eine deutliche Reduktion der Proteinmenge bei pan-neuronal exprimiertem wt-prp-8 auf 38% des Actin-GAL4-Niveaus. Für wt-prp-9 ergab sich nach Verwendung der Appl-GAL4-Treiberlinie sogar eine Verminderung auf nur 7%. Von jeder Proteinprobe wurden etwa 35 µl, das entspricht 14 Fliegenköpfen, aufgetragen. PrP wurde mit ICSM18 detektiert. 70

77 ERGEBNISSE 3.3 Histologische Charakterisierung der transgenen Drosophila Gewebelokalisierung von transgenem PrP im Fliegengehirn Im Anschluss an die molekularbiologische Expressionsanalyse stellte sich die Frage, ob die transgenen PrP-Konstrukte gleichmäßig im Gehirn verteilt exprimiert werden, oder ob es bestimmte Areale mit verstärkter Expression gibt. Zur Klärung dieses Sachverhalts wurden Gehirn-Frontalschnitte mit einem PrP-spezifischen Antikörper angefärbt. Zuerst wurde die ubiquitäre Treiberlinie Actin-GAL4 verwendet. Dabei stellte sich heraus, dass die PrP-Transgene in allen Genotypen etwa gleich stark exprimiert wurden (Abbildung 17). Abbildung 17: Transgenes Prion-Protein ist im Fliegengehirn diffus verteilt. In Gehirn- Frontalschnitten verschiedener fünf Tage alter transgener Weibchen wurde PrP mit dem PrPspezifischen Antikörper ICSM18 detektiert. Besonders intensiv exprimierende Bereiche sind die Antennal-Loben (ant lob), die β-loben (β lob) und die α-loben (α lob) auf der Schnittebene y +4,0, der Fächerförmige Körper (fb) und die Pedunculi (ped) auf y -2,0 sowie die Calyces (ca) auf y -7,0. In der Lobula (lo), der Lobula-plate (lo p) und der Medulla (me) ist wie im übrigen Gewebe eine generelle PrP-Präsenz detektierbar. Zum Vergleich dient eine LacZ-exprimierende Linie. Die verwendete Treiberlinie war Actin-GAL4. Zur PrP-Detektion wurde der Antikörper B2-43 benutzt. Gezeigt sind jeweils das Zentralgehirn und die linken optischen Loben im Maßstab 100:1. 71

78 ERGEBNISSE Anhand der gemessenen Fluoreszenz lies sich eine diffuse Verteilung im ganzen Gehirn feststellen. Allerdings konnten einige Bereiche identifiziert werden, in denen eine besonders intensive Expression vorhanden war. Davon betroffen waren insbesondere alle Teile der Pilzkörper wie die α- und β-loben, die Pedunculi und die Calyces. Des Weiteren waren große PrP-Mengen im Fächerförmigen Körper und den Antennal-Loben auszumachen. In den optischen Loben war ebenfalls eine diffuse Verteilung zu erkennen. Die insgesamt stärkste Expression war in der doppelt transgenen Linie nachweisbar. Für die rein neuronale Expression der PrP-Konstrukte durch die Treiberlinie Appl- GAL4 ergab sich ein vergleichbares Verteilungsmuster im Fliegengehirn (Abbildung 18), mit Ausnahme der etwas schwächer exprimierenden Linie wt-prp-9. Auch bei der pan-neuronalen Verteilung der Transgene ließen sich wie im Falle der ubiquitären Verteilung Gehirnbereiche feststellen, in denen die Expression besonders intensiv war. Abbildung 18: Diffuse PrP-Präsenz auch bei pan-neuronaler Verteilung. In Gehirn- Frontalschnitten verschiedener fünf Tage alter transgener Weibchen wurde PrP mit ICSM18 detektiert. Neben der generellen Präsenz der transgenen Proteine, ließen sich auch intensiv exprimierenden Bereiche feststellen, die mit der ubiquitären Verteilung vergleichbar waren. Die verwendete Treiberlinie war Appl-GAL4. PrP wurde mit B2-43 detektiert. Gezeigt ist jeweils das Zentralgehirn im Maßstab 100:1. Zur besseren visuellen Darstellung wurde ein Verteilungsschema angefertigt, das die intensiven Expressionsbereiche (grün gefärbt) besonders herausstellt (Abbildung 19). 72

79 ERGEBNISSE Abbildung 19: Schematische Darstellung der Verteilung bei Actin-GAL4 getriebenem PrP. Neben einer diffusen Verteilung transgenem Prion-Proteins, lies sich eine besonders intensive Expression in den folgenden Gehirnarealen feststellen: den β-loben (β lob, y +5,0), den Antennal-Loben (ant lob, y +5,0), den α-loben (α lob, y +1,0), dem Fächerförmigen Körper (fb, y -2,0), den Pedunculi (ped, y -2,4) und den Calyces (ca, y -7,0). Das Schema wurde von der Internetdatenbank Flybrain ( neurobio.arizona.edu/) übernommen und bearbeitet Neuroanatomische Analyse PrP-transgener Fliegen Um abzuklären, ob durch die bloße Präsenz artfremder Proteine neuroanatomische Veränderungen auftreten, wurden Frontal-Ultradünnschnitte angefertigt und mit Toluidin-Blau angefärbt (Abbildung 20). Es zeigten sich keine auffälligen Unterschiede bezüglich der Morphologie oder der Entwicklung einzelner Gehirnregionen bei 7-Tagealten Weibchen. Aufgrund weniger tiefblau gefärbter Bereiche in den optischen Loben und dem lateralen Horn der untersuchten Gehirnschnitte, die in einer anderen Arbeit als Zeichen für apoptotische Zellen gewertet wurden (Botella et al., 2004), wurden elektronenmikroskopische Aufnahmen dieser Bereiche angefertigt. Die Untersuchung von Zellverbänden in den besagten Bereichen konnte die Annahme stattfindender Apoptose jedoch nicht bestätigen. 73

80 ERGEBNISSE Abbildung 20: Wildtypische Neuromorphologie in PrP-transgenen Drosophila. Es sind keine auffälligen morphologischen Abnormitäten oder entwicklungsbiologische Defizite in fünf Tage alten Weibchen festzustellen. Gezeigt sind Toluidin-Blau gefärbte Frontal-Gehirnschnitte im Maßstab 50:1 (Übersicht) und 200:1 sowie elektronenmikroskopische Aufnahmen von Zellverbänden des lateralen Horns im Maßstab 1.500:1. Actin-GAL4 wurde als Treiberlinie verwendet. In einem zweiten Experiment wurde die Expression von wt-prp-8 und tr-prp-2 im Augengewebe versucht, um eventuell auftretende neuropathologische Veränderungen über eine Retina-Degeneration zu bestimmen. Auch hier zeigten sich bei 30-Tage-alten Männchen keine morphologischen Auffälligkeiten oder Fehlentwicklungen (Abbildung 21). Abbildung 21: Wildtypische Retina-Morphologie bei PrP-exprimierenden Fliegen. Sowohl bei 30 Tage alten Männchen des Genotyps wt-prp-8 als auch tr-prp-2 zeigen sich im Vergleich zu einer LacZ-exprimierenden Linie keine Degeneration der Retinae oder eine abnorme Morphologie der Ommatidien. Dargestellt sind Aufnahmen des linken Auges im Maßstab 80:1 (oben) und 160:1 (unten). GMR-GAL4 wurde als Treiberlinie verwendet. 74

81 ERGEBNISSE 3.4 Erhöhte Lebenserwartung bei Wildtyp-PrP-exprimierenden Drosophila Da bereits bei der Zucht der transgenen Fliegenstämme eine unterschiedliche Fitness zwischen den verschiedenen Genotypen auffiel, sollte die Lebenserwartung der einzelnen Stämme unter optimalen Laborbedingungen bestimmt werden. Der parentale Stamm white 1118, der ursprünglich für die Keimbahntransformation verwendet wurde, ist aufgrund seines Phänotyps bezüglich der Lebenserwartung bereits benachteiligt und daher keine geeignete Referenz. Aufgrund der fehlenden Expression des Augenpigment- Transportproteins white, besitzen adulte Fliegen dieses Stammes keine wildtypisch roten sondern weiße Augen. Dadurch sind diese Mutanten nur zu einer verminderten Sehleistung befähigt, was in vielen Fällen zu einem vorzeitigen Tod führt. Daher wurde entschieden, die LacZ-exprimierende Linie als Referenz einzusetzen. Als Referenz für einen Stamm mit besonders hoher Lebenserwartung wurde die Mutante methuselah (mth 1 ) verwendet (Lin et al., 1998). Dieser Stamm wurde als die langlebigste Linie aus einem Set mit P-Element-Insertionen isoliert, die ihre parentale Linie überlebten. Offenbar wurde durch die Integration eines mobilen DNA-Abschnittes die endogene Sequenz für den G-Protein-gekoppelten-Rezeptor methuselah zerstört (Brody et al., 2000). Warum der Ausfall des Proteins zu einer erhöhten Lebenserwartung bei adulten Tieren führt, konnte bislang nicht aufgeklärt werden. Nach Abschluss des Experiments konnte für die LacZ-Referenzlinie eine mittlere Lebenserwartung von 53 Tagen festgestellt werden (Abbildung 22). Tiere des Kontrollstammes mth 1 zeigten einen signifikanten Anstieg der mittleren Lebenserwartung auf 63 Tage. Überraschenderweise präsentierte der Genotyp wt-prp-8 ebenfalls eine 20- prozentige Verlängerung der Lebenserwartung auf 63 Tage, wohingegen die Expression von tr-prp zu einer signifikanten Reduktion der mittleren Lebenserwartung auf nur noch 49 Tage führte. Eine Komplementation durch die Ko-Expression beider PrP-Formen führte jedoch zu keinerlei Vorteil gegenüber der alleinigen Präsenz des trunkierten Prion- Proteins. 75

82 ERGEBNISSE Abbildung 22: Expression von wt-prp führt zu einem signifikanten Anstieg der Lebenserwartung. Die LacZ-Referenz (blau) wies eine mittlere Lebenserwartung von 53 Tagen auf. Wt-PrP-8 (grün) zeigte im Vergleich dazu einen hochsignifikanten Anstieg um 20% und erreichte mit 63 Tagen dengleichen Wert wie die langlebige Linie mth 1 (gelb). Die Expression von tr-prp-2 (rot) führte hingegen mit 49 Tagen zu einer achtprozentigen, signifikanten Abnahme der Lebenserwartung und konnte nicht durch tr-prp-2;wt-prp-8 Ko-Expression (braun) komplementiert werden. Die Ergebnisse sind mit einer Kaplan-Meier-Funktion dargestellt, die P- Werte zur Bestimmung signifikanter Unterschiede wurden mit dem logrank-test ermittelt (Daten im Anhang). Actin-GAL4 wurde zur ubiquitären Expression in mindestens 100 Fliegen beider Geschlechter herangezogen. 3.5 Wildtyp-PrP vermittelt Resistenz gegenüber oxidativem Stress Die Lebenserwartung geht sehr eng mit einer erhöhten Stressresistenz einher (Lin et al., 1998). Im Modellsystem Caenorhabditis elegans (Fadenwurm) zeigte die langlebige Mutante age-1 verstärkte Resistenz gegenüber Hitzeeinwirkung (Lithgow et al., 1994) und oxidativem Stress (Larsen, 1993). Drosophila-Laborstämme, die durch hohes Alter auffielen, offenbarten auch erhöhte Abwehreigenschaften gegenüber Hitze, Futter- und Flüssigkeitsmangel sowie oxidativem Stress (Service, 1985; Rose et al., 1992). Um 76

83 ERGEBNISSE herauszufinden, ob wildtypisches Prion-Protein, das transgenen Drosophila eine erhöhte Lebenserwartung vermittelt, auch zu einer Resistenz gegenüber oxidativem Stress (OS) führt, wurden die Tiere durch weitere Experimente entsprechenden Bedingungen ausgesetzt. Insgesamt wurden drei Paradigmen publiziert, die auf unterschiedlichen Wegen oxidativen Stress induzieren. Durch die Verabreichung von Wasserstoffperoxid wurde erstmals der Alterungsprozess bei Mutanten getestet, die unterschiedlich starke Katalase-Aktivitäten aufwiesen (Orr et al., 1992). Die Resistenz gegenüber dem Herbizid Paraquat wurde als Methode zur Aufspürung von langlebigen Fliegen-Mutanten beschrieben (Arking et al., 1991). Unter reiner Sauerstoffatmosphäre gehaltene Tiere legten die Wichtigkeit von Harnsäure zur Bekämpfung von Sauerstoffradikalen offen (Hilliker et al., 1992). Diese drei Methoden wurden für die folgenden Experimente adaptiert Resistenz gegenüber Wasserstoffperoxid-induziertem Stress Die Beimengung einer Wasserstoffperoxid-Lösung (0,15% v/v) hatte drastische Auswirkungen auf die Überlebenszeit der Fliegen (Abbildung 23). So überlebten weibliche Tiere der LacZ-Referenzlinie nach Beginn der Verfütterung nur noch 204 weitere Stunden (Mittelwert). Die ubiquitäre Expression von PrP, hier repräsentiert durch die Linien wt-prp-8 und wt-prp-9, führte zu einer deutlichen Zunahme der Überlebenszeit um 24% auf 252 Stunden. Damit lagen die PrP-transgenen Linien gleichauf mit der besonders stressresistenten Linie mth 1. Die Expression der trunkierten Form von PrP ergab hingegen eine Reduktion der Fitness, die Überlebenszeit lag im Mittel bei 180 Stunden. In der Gegenwart von Wasserstoffperoxid war die Ko-Expression beider PrP-Formen interessanterweise für eine signifikante Komplementation dieses Phänotyps ausreichend (228 Stunden). Ein paralleles Experiment mit ausschließlich männlichen Tieren offenbarte eine weiter erhöhte Anfälligkeit gegenüber dem stressinduzierenden Agens. Die Überlebenszeiten aller Linien sanken im Mittel um 21%. Die signifikanten Unterschiede blieben jedoch qualitativ bestehen. Das gesamte Experiment wurde in mehreren unabhängigen Durchläufen mit geringen Unterschieden in den Resultaten durchgeführt. Hierfür waren wahrscheinlich geänderte Außentemperaturen und Luftdruckbedingungen verantwortlich. 77

84 ERGEBNISSE Abbildung 23: Ubiquitär exprimiertes PrP vermittelt Resistenz gegenüber Wasserstoffperoxid-induziertem oxidativen Stress. Die LacZ-Referenz (blau) zeigt in Gegenwart von 0,15% Wasserstoffperoxid bei weiblichen Tieren eine mittlere Überlebenszeit von 204 Stunden. Wt-PrP-8 (grün) und wt-prp-9 (hellgrün) vermittelten einen 24-prozentigen, signifikanten Anstieg und lagen mit 252 Stunden auf demgleichen Niveau wie die stressresistente Linie mth 1 (gelb). Die Expression von tr-prp-2 (rot) führte mit 180 Stunden zu einer signifikanten Abnahme der Überlebenszeit, konnte jedoch durch tr-prp-2;wt-prp-8 Ko-Expression (braun) signifikant komplementiert werden (228 Stunden) (links). Männliche Tiere zeigten eine im Mittel um 21% reduzierte Überlebenszeit bei größtenteils gleich bleibenden signifikanten Unterschieden untereinander (rechts). Die Ergebnisse sind mit einer Kaplan-Meier-Funktion dargestellt, die P- Werte zur Bestimmung signifikanter Unterschiede wurden mit dem logrank-test ermittelt (Daten im Anhang). Actin-GAL4 wurde zur ubiquitären Expression in mindestens 80 Fliegen beider Geschlechter herangezogen. In einem Folgeexperiment wurden die Transgene mit der Linie Appl-GAL4 panneuronal exprimiert (Abbildung 24). Dabei zeigten sich erneut signifikant erhöhte Überlebenszeiten für die Linien mth 1 (204 Stunden), wt-prp-8 (192 Stunden) und wt-prp- 9 (186 Stunden) im Vergleich zur LacZ-Kontrolle (156 Stunden). Die Expression von wildtypischem PrP brachte somit auch in seinem physiologischen Milieu des Nervensystems einen deutlichen Vorteil in Gegenwart eines Neurotoxins. Tr-PrP war nicht imstande diesen Effekt hervorzurufen sondern vermittelte eine obendrein reduzierte Überlebenszeit mit nur 120 Stunden. Die Anwesenheit eines wildtypischen Allels war jedoch wiederum ausreichend, die negativen Auswirkungen der trunkierten PrP-Form auszugleichen und resultierte in einer mittleren Überlebenszeit von 180 Stunden. Männliche Tiere schnitten in diesem Experiment abermals mit um 21% verkürzten Überlebenszeiten ab, zeigten jedoch die gleichen qualitativen Resultate. 78

85 ERGEBNISSE Abbildung 24: Pan-neuronale PrP-Expression ist ausreichend für die Ausbildung einer Resistenz gegenüber Wasserstoffperoxid-induziertem Stress. Weibliche Fliegen zeigen auch bei spezifischer Expression von wildtypischem PrP im Nervensystem signifikant erhöhte Überlebenszeiten (wt-prp-8 mit 192 Stunden und wt-prp-9 mit 186 Stunden) im Vergleich zu LacZ (156 Stunden). Zu einer signifikanten Reduktion kam es durch Expression von tr-prp-2 (120 Stunden), der Effekt konnte jedoch durch tr-prp-2;wt-prp-8 Ko-Expression umgekehrt werden (180 Stunden). Die Ergebnisse sind mit einer Kaplan-Meier-Funktion dargestellt, die P- Werte zur Bestimmung signifikanter Unterschiede wurden mit dem logrank-test ermittelt (Daten im Anhang). Appl-GAL4 wurde zur pan-neuronalen Expression in mindestens 100 Fliegen verwendet Resistenz gegenüber Paraquat Die Verfütterung des Herbizids Paraquat führte zu einem noch schnelleren Sterben der Versuchstiere (Abbildung 25). Die mittleren Überlebenszeiten von Weibchen sanken im Vergleich zur Wasserstoffperoxid-Applikation um weitere 75%, so dass bereits nach einem Tag die Hälfte der LacZ-exprimierenden Tiere tot waren (24 Stunden). Im Vergleich dazu zeigten die Linien mth 1 (44 Stunden), wt-prp-8 und wt-prp-9 (je 40 Stunden) eine enorme Steigerung der Resistenz um etwa 67%. Die Linie tr-prp-2 zeigte dieselbe Überlebenszeit wie die Referenz (24 Stunden), konnte jedoch bei Ko-Expression von wildtypischem PrP an Resistenzfähigkeit hinzugewinnen (32 Stunden). Männliche 79

86 ERGEBNISSE Tiere schnitten mit um 47% verkürzter mittlerer Überlebenszeit ab, zeigten jedoch die gleichen qualitativen Resultate. Abbildung 25: Starke Resistenz von PrP-transgenen Drosophila bei Verfütterung von Paraquat. Wildtypisches Prion-Protein vermittelte eine 67-prozentige Steigerung der Resistenz (wt-prp-8 und wt-prp-9 mit je 40 Stunden) im Vergleich zu LacZ- oder tr-prp-2-exprimierenden Tieren (je 24 Stunden). Tr-PrP-2;wt-PrP-8 Ko-Expression führte zu einem 50-prozentigen Anstieg der Resistenz (32 Stunden). Die Ergebnisse sind mit einer Kaplan-Meier-Funktion dargestellt, die P-Werte zur Bestimmung signifikanter Unterschiede wurden mit dem logrank- Test ermittelt (Daten im Anhang). Actin-GAL4 wurde zur ubiquitären Expression in mindestens 90 Fliegen herangezogen Resistenz gegenüber reinem Sauerstoff Knapp eine Woche überlebten Tiere der LacZ-Kontrolllinie unter reiner Sauerstoffatmosphäre (156 Stunden). Eine gewisse Resistenz gegenüber Sauerstoff, der in dieser hohen Konzentration als oxidativen Stress induzierendes Zellgift klassifiziert werden muss, zeigten Tiere der Linie mth 1 (180 Stunden) und die beiden Wildtyp-PrPexprimierenden Linien mit jeweils 168 Stunden (Abbildung 26). Bei ubiquitärer Expression zeigte tr-prp-2 die deutlich schwächste Abwehr mit einer Überlebenszeit von nur 132 Stunden im Mittel. Tr-PrP-2;wt-PrP-8 Ko-Expression vermittelte wiederum eine 80

87 ERGEBNISSE teilweise Komplementation auf den Status einer Linie mit irrelevantem Transgen (156 Stunden). Unter allen angewandten experimentellen Bedingungen, die oxidativen Stress auslösen, zeigten die männlichen Tiere hier die vergleichsweise besten Abwehrleistungen, die im Schnitt nur 8% unter denen der Weibchen lagen. Abbildung 26: Prion-Protein vermittelt Resistenz gegen hochkonzentrierten Sauerstoff (99,5%). Ubiquitär verteiltes wt-prp führte zu einem signifikanten Anstieg der Resistenz (168 Stunden). Tr-PrP-2 war dazu nicht imstande, sondern führte zu einer zusätzlichen Abnahme der mittleren Überlebenszeit (132 Stunden). Dieser Effekt wurde in der doppelt transgenen Linie komplementiert, wodurch eine unter diesen Bedingungen normale Lebenserwartung von 156 Stunden erzielt wurde. Die Ergebnisse sind mit einer Kaplan-Meier-Funktion dargestellt, die P- Werte zur Bestimmung signifikanter Unterschiede wurden mit dem logrank-test ermittelt (Daten im Anhang). Actin-GAL4 wurde zur ubiquitären Expression in mindestens 100 Fliegen herangezogen. Die pan-neuronale Expression der Transgene, zur physiologischen Darstellung der Verhältnisse, zeigte deutlichere Unterschiede (Abbildung 27). Die Expression von wt- PrP im Gehirn der Fliegen verhalf zu einer 21-prozentigen Zunahme der Sauerstofftoleranz und lag bei wt-prp-8 (180 Stunden) sogar noch über der Resistenzleistung der Linie mth 1 (168 Stunden). Die schlechteste Abwehrleistung zeigte 81

88 ERGEBNISSE wiederum die Linie tr-prp-2 (132 Stunden), wobei die Ko-Expression von tr-prp-2 und wt-prp-8 zu einer normalen Überlebenszeit innerhalb dieses experimentellen Rahmens von 144 Stunden führte. Abbildung 27: Deutlichere Abwehrleistungen bei pan-neuronaler Expression von wt-prp. Die Expression von wildtypischem PrP im Gehirn transgener Fliegen führte zu einem Zugewinn der Überlebenszeit von 24 (wt-prp-9) bis 36 Stunden (wt-prp-8). Abwehrschwächen zeigten die Linie tr-prp-2 mit 132 Stunden. Ko-Expression von tr-prp-2 und wt-prp-8 verhalf jedoch zu der gleichen Überlebenszeit wie bei der LacZ-exprimierender Linie (144 Stunden). Die Ergebnisse sind mit einer Kaplan-Meier-Funktion dargestellt, die P-Werte zur Bestimmung signifikanter Unterschiede wurden mit dem logrank-test ermittelt (Daten im Anhang). Appl-GAL4 wurde zur pan-neuronalen Expression in mindestens 100 Fliegen herangezogen. 3.6 Neuropathogenese nach Induktion von oxidativem Stress Expression von Wildtyp-PrP schützt vor Gewebevakuolisierung Da die unterschiedlichen Überlebenszeiten der einzelnen transgenen Linien, die oxidativem Stress ausgesetzt waren, höchstwahrscheinlich mit neuropathologischen Veränderungen einhergehen, wurden Gehirne von Tieren untersucht, die unter 99,5- prozentiger Sauerstoffatmosphäre gehalten wurden. Durch Sauerstoff verursachter 82

89 ERGEBNISSE oxidativer Stress macht sich bei Drosophila am ehesten in den optischen Loben bemerkbar, da diese Bereiche einer besonders intensiven Aktivität unterliegen. Tatsächlich konnten in den Gehirnen der Versuchstiere Vakuolen in der Medulla und der Lobula ausgemacht werden, die abhängig vom untersuchten Genotyp Unterschiede nach Größe und Anzahl aufwiesen (Abbildung 28). Abbildung 28: Unterschiedlich starke Vakuolisierung in PrP-transgenen Fliegen nach Induktion von oxidativem Stress. Die größte Fläche an Vakuolen in den Lobulae (lo) und Medullae (me) zeigt die parentale Linie w 1118 mit durchschnittlich 143 µm 2 pro Hemisphäre. Mth 1 (10 µm 2 ) und wt-prp-8-expression (19 µm 2 ) führen zu einer signifikant geringeren Vakuolisierung im Vergleich zur LacZ-exprimierenden Linie (81 µm 2 ). Diese Unterschiede korrelieren mit den Beobachtungen aus dem Überlebenszeit-Experiment unter 99,5% Sauerstoff- Atmosphäre. Der Grad an vakuolisiertem Gewebe bei den Linien wt-prp-9 (69 µm 2 ), tr-prp-2;wt- PrP-8 (52 µm 2 ) und tr-prp-2 (39 µm 2 ) spiegeln hingegen keine direkte Übereinstimmung mit vorhergehenden Beobachtungen wider. Die verwendete Treiberlinie war Actin-GAL4. Gezeigt sind repräsentative, frontale Gehirnschnitte im Maßstab 150:1. Zur Berechnung signifikanter Unterschiede wurde ein ungepaarter t-test verwendet (Daten im Anhang). 83

90 ERGEBNISSE In einem aufwändigen Verfahren wurde der Grad der Vakuolisierung pro Schnittebene und Hemisphäre der Individuen bestimmt, so dass sich eine teilweise Korrelation dieses Phänotyps mit den Resultaten der Überlebenszeit-Bestimmung ergab. So zeigte die LacZexprimierende Linie eine relativ starke Vakuolisierung mit im Mittel 81 µm 2. In Gehirnen des Genotyps mth 1 konnte hingegen ein signifikant geringerer Grad an vakuolisiertem Gewebe ausgemacht werden (10 µm 2 ). Die Expression von wt-prp-8 führte zu einer signifikanten, vierfachen Reduktion der Vakuolen (siebeneinhalbfache Reduktion im Vergleich zur parentalen Linie) mit durchschnittlich 19 µm 2. Tr-PrP-2 (39 µm 2 ) und die doppelt transgene Linie (52 µm 2 ) zeigten einen wesentlich höheren Anteil an Vakuolen, spiegelten jedoch die Resultate des Überlebenszeit-Experiments nicht direkt wider. Die Expression von wt-prp-9 führte zu einem fast ebenso hohen Grad an Vakuolisierungen wie die LacZ-Linie (69 µm 2 ). Am anfälligsten für diese Art Stress ist wie bereits erwähnt die benachteiligte parentale Linie white Hier zeigte sich das stärkste Ausmaß an löchrigem Gewebe mit durchschnittlich 143 µm Unterschiedlich stark ausgeprägte Apoptose in geschädigten Neuronen Um abzuklären, ob die in den Sauerstoff-geschädigten Gehirnen entstandenen Vakuolen tatsächlich auf neurodegenerative Prozesse und damit eventuell verbundener Apoptose zurückzuführen sind, wurden Gefriergehirnschnitte von entsprechenden Tieren sowohl mit einem Neuronenzellkern-spezifischen Antikörper als auch mit einer TUNEL-Färbung versehen. Eine große Anzahl an apoptotischen Neuronen konnten in den optischen Loben von Tieren der Linie w 1118 und wt-prp-8 detektiert werden, nachdem diese unter hochkonzentrierter Sauerstoffatmosphäre gehalten wurden (Abbildung 29). Eine moderate Verteilung solch absterbender Nervenzellen konnte in den Gehirnen der Linien LacZ, mth 1, tr-prp-2 und der doppelt transgenen Linie gefunden werden. Die Gehirnschnitte von wt-prp-9 waren hingegen nahezu frei von apoptotischen Prozessen. Insgesamt konnte somit keine Korrelation zwischen Apoptose und neurodegenerativen Prozessen in Form von Vakuolisierungen in den Sauerstoff-geschädigten Gehirnen von transgenen Fliegen festgestellt werden. 84

91 ERGEBNISSE Abbildung 29: Apoptose korreliert nicht mit Neurodegeneration. Eine große Anzahl an apoptotischen Neuronen fällt in den Linien w 1118 und wt-prp-8 auf. Wenig bis gar keine Apoptose lässt sich in Gehirnschnitten aller anderen Linien feststellen, nachdem diese unter 99,5- prozentiger Sauerstoffatmosphäre gehalten wurden. Für die Färbung der neuronalen Zellkerne wurde der Antikörper NeuN (grün) verwendet. TUNEL-positive Bereiche kennzeichnen apoptotische Prozesse (rot). Anhand von Frontalschnitten sind die optischen Loben der linken Gehirnhemisphäre im Maßstab 150:1 gezeigt. Die Transgene wurden mit der Linie Actin-GAL4 ubiquitär exprimiert. 85

92 ERGEBNISSE 3.7 Differentielle Genexpression in Fliegen nach und ohne Induktion von oxidativem Stress Ein wertvoller Befund wäre es herauszufinden, ob es möglicherweise gemeinsame Genaktivitäten in den transgenen Linien gibt, die spezifisch durch die Induktion von oxidativem Stress hervorgerufen werden. Mithilfe eines Microarray-Experiments wurden in einem ersten Ansatz mehrere Gene analysiert, die als Bestandteile verschiedener biochemischer Signalwege im Zusammenhang mit einer Stressantwort stehen. In den transgenen Linien mit tr-prp-2, wt-prp-8 und wt-prp-9 oder mth 1 konnten keine Unterschiede nach und ohne Induktion von oxidativem Stress durch Sauerstoff in der Genexpression von Mitgliedern des Insulin-Signalwegs (Tabelle 8), der foxo targets (Tabelle 9), des Jun-Kinase-Signalwegs (JNK) (Tabelle 10), des Insulin signaling Signalwegs (IIS) (Tabelle 11) oder des Janus-Kinase/STAT-Signalwegs (JAK/STAT) (Tabelle 12) festgestellt werden. Des Weiteren fanden sich keine Unterschiede in der Genexpression zwischen den transgenen Linien und der LacZ-exprimierenden Kontrolllinie nach Induktion von oxidativem Stress. Genotyp 1 LacZ wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 Genotyp 2 LacZ wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 LacZ LacZ LacZ Sauerstoff (99,5%) (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) (+/+) (+/+) (+/+) chico 0,14-0,17 0,30-0,06-0,07 0,25 0,35 InR 0,56 0,14 0,48 1,04-0,08 0,42 0,59 Pi3K92E 0,66 0,32 0,55 0,81 0,01 0,05 0,32 Pi3K21B - 0,10 0,10-0,12 0,11-0,35-0,17-0,40 Akt1(PKB) - 0,10 0,15 0,20 0,30-0,01 0,25 0,42 fak56d - 0,14-0,31-0,08-0,20-0,16 0,10-0,08 melted 0,02 0,03 0,15 0,13-0,01 0,17 0,24 Pten - 0,17-0,17-0,06-0,23-0,19-0,02-0,02 s6k - 0,09-0,04 0,05 0,10 0,16 0,27 0,22 scylla 0,52 0,25 0,45 0,70 0,10 0,39 0,57 charybde - 0,29 0,05-0,11 0,11 0,39 0,50 0,38 tor 0,06-0,12 0,04 0,27-0,12 0,09 0,16 TSC1 0,21 0,18-0,05 0,10-0,14-0,17-0,10 twins 0,31 0,13 0,26 0,02 0,08 0,29 0,29 diminutive 0,30 0,05 0,13 0,32-0,27 0,19 0,26 foxo 0,16 0,12 0,30 0,54-0,11 0,21 0,16 gigas - 0,11-0,14-0,18 0,12 0,11 0,24 0,25 rps6-0,09-0,04 0,05 0,10 0,16 0,27 0,22 thor 0,96 0,18 1,07 1,17 0,19 0,53 0,70 Tabelle 8: Keine differentielle Expression von Genen des Insulin Signalwegs. Dargestellt sind alle bekannten Gene des Signalwegs mit Angabe des ln2-wertes. Für signifikante Unterschiede war ein Grenzwert von 2 oder -2 maßgeblich. 86

93 ERGEBNISSE Genotyp 1 LacZ wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 Genotyp 2 LacZ wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 LacZ LacZ LacZ Sauerstoff (99,5%) (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) (+/+) (+/+) (+/+) l(2)efl 0,50 0,55 0,05 0,09 0,38 0,11 0,30 hsp68-0,08 0,31 0,21-0,39 0,72 0,43 0,22 fax - 0,26-0,18-0,10-0,23 0,02 0,12 0,19 fer1hch - 0,47-0,45-0,37-0,14 0,20 0,31 0,28 CG ,04-0,72-0,12 0,27-0,19 0,02 0,68 Tabelle 9: Keine differentielle Expression von Genen der foxo targets. Dargestellt sind alle bekannten Gene des Signalwegs mit Angabe des ln2-wertes. Für signifikante Unterschiede war ein Grenzwert von 2 oder -2 maßgeblich. Genotyp 1 LacZ wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 Genotyp 2 LacZ wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 LacZ LacZ LacZ Sauerstoff (99,5%) (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) (+/+) (+/+) (+/+) basket 0,08-0,14-0,17 0,00-0,09-0,12 0,00 chameau 0,00 0,25-0,06 0,02 0,16-0,18-0,25 eiger - 0,16-0,10-0,03-0,29 0,08 0,32-0,47 hemipterous 0,29 0,06-0,01 0,24-0,13-0,24 0,06 jra 0,11 0,17 0,34 0,40 0,03 0,23 0,43 kayak 0,09 0,07-0,06 0,11-0,01-0,11 0,03 ikb1-0,18 0,04 0,11 0,14 0,02-0,02 0,37 misshapen 0,11 0,29 0,24 0,12-0,21-0,05-0,02 puckered 0,34 0,21 0,27 0,28-0,38 0,08-0,02 src42a - 0,15 0,00-0,12-0,27-0,24-0,07-0,16 tak1-0,02-0,08 0,06-0,14-0,06 0,08-0,13 traf1-0,04-0,09-0,41-0,54 0,31-0,01 0,09 wengen - 0,34-0,31-0,31-0,78 0,14 0,33 0,57 decapentaplegic - 0,01-0,02-0,24-0,32 0,14-0,04-0,04 Tabelle 10: Keine differentielle Expression von Genen des Jun-Kinase-Signalwegs (JNK). Dargestellt sind alle bekannten Gene des Signalwegs mit Angabe des ln2-wertes. Für signifikante Unterschiede war ein Grenzwert von 2 oder -2 maßgeblich. Genotyp 1 LacZ wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 Genotyp 2 LacZ wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 LacZ LacZ LacZ Sauerstoff (99,5%) (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) (+/+) (+/+) (+/+) ilp1-0,05-0,22-0,09 0,07-0,20 0,03 0,05 ilp2 0,09 0,13 0,20-0,04 0,35 0,60 0,14 ilp3 0,05 0,44 0,28 0,13 0,12 0,35 0,19 ilp5-0,14 0,31 0,04-0,35 0,29 0,52 0,17 ilp6-0,14-0,44-0,18-0,46 0,03 0,02 0,26 ilp7 0,21 0,39-0,11 0,00 0,07-0,08-0,16 Tabelle 11: Keine differentielle Expression von Genen des Insulin signalling-signalwegs (IIS). Dargestellt sind alle bekannten Gene des Signalwegs mit Angabe des ln2-wertes. Für signifikante Unterschiede war ein Grenzwert von 2 oder -2 maßgeblich. 87

94 ERGEBNISSE Genotyp 1 LacZ wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 Genotyp 2 LacZ wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 LacZ LacZ LacZ Sauerstoff (99,5%) (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) (+/+) (+/+) (+/+) domeless 0,37 0,08 0,18 0,42-0,28-0,11-0,04 hopscotch 0,18 0,19-0,12 0,38-0,08-0,07 0,16 outstretched - 0,04-0,09-0,43 0,24 0,15 0,00 0,18 Stat92E - 0,32-0,07-0,16-0,39 0,00 0,09 0,27 even skipped - 0,06 0,29-0,08-0,07 0,30 0,06-0,01 sex lethal 0,26 0,37 0,15 0,32-0,12 0,02-0,01 Turandot C - 4,48-1,78-1,68-1,17-0,96-0,56 1,52 Turandot M - 4,29-2,29 0,12-1,00 0,83 1,72 1,38 Turandot A - 2,86-1,63-0,67-1,23-0,72-0,24-0,52 Turandot X - 2,92 0,51-1,58-1,78-0,78-1,07-1,12 takeout - 2,66 0,33-0,42-1,05-0,78-0,66-2,32 Tabelle 12: Keine differentielle Expression von Genen des Janus-Kinase/STAT-Signalwegs (JAK/STAT). Dargestellt sind alle bekannten Gene des Signalwegs mit Angabe des ln2-wertes. Für signifikante Unterschiede war ein Grenzwert von 2 oder -2 maßgeblich. In einer französischen Studie wurde nach Genen gesucht, die bei wildtypischen Drosophila nach Stressinduktion unterschiedlich reguliert wurden (Girardot et al., 2004). Dort fielen insbesondere die Cytochrome cyp9b2 und cyp18a1 sowie die Glutathion-S- Transferasen GstE10 und GstD5 auf. Eine Übereinstimmung ergab sich lediglich für GstD5, für die eine dreifache Herunterregulation festgestellt wurde (Tabelle 13, markiert). In einer anderen Studie derselben Arbeitsgruppe wurde dem Drosophila- Homolog des humanen Inositoltriphosphats IP3K1 eine besondere Rolle in der Abwehr von Wasserstoffperoxid, nicht jedoch von Paraquat zugeschrieben (Monnier et al., 2002). In Gegenwart von hochkonzentriertem Sauerstoff ist allerdings auch keine alternative Genregulation aufgefallen. Genotyp 1 LacZ wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 Genotyp 2 LacZ wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 LacZ LacZ LacZ Sauerstoff (99,5%) (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) (+/+) (+/+) (+/+) cyp9b2 1,33 0,87 0,70 0,80-0,43-0,30-0,72 cyp18a1 0,03-0,37 0,06-0,11-0,11-0,10 0,01 GstE10-0,44-0,85-0,06-0,17 0,04 0,18-0,11 GstD5 2,16 1,06 1,03 1,02-1,67-1,50-1,58 IP3K1 0,52 0,32 0,58 1,09-0,23 0,16 0,50 Tabelle 13: Keine differentielle Expression von Genen, die in anderen Publikationen im Zusammenhang mit oxidativem Stress auffielen. Dargestellt sind auffällige Gene aus der Studie Girardot et al., 2004 mit Angabe des ln2-wertes. Für signifikante Unterschiede war ein Grenzwert von 1,5 oder -1,5 maßgeblich. 88

95 ERGEBNISSE In einem zweiten Ansatz der Analyse wurde umgekehrt nach auffällig regulierten Genen gesucht, die keinem spezifischen Signalweg angehören müssen. Tatsächlich gab es einige Kandidaten, die teilweise stark heraufreguliert wurden (verglichen wurden wt- PrP-8, wt-prp-9 und LacZ-exprimierende Linien) wie zum Beispiel die Cytochrome cyp6a2 (4,7-fach) und cyp6a8 (3,5-fach), das Metallothionein MtnB (8,8-fach) und andere Gene mit noch unbekannter molekularer Funktion (Tabelle 14, markiert). Am auffälligsten war in diesem Zusammenhang das Gen CG11893, das rund 57-fach aktiver war als in Linien ohne wt-prp-präsenz. Stark herunterregulierte Gene waren neben der bereits erwähnten Glutathion-S-Transferase D5 das Serpin Spn2 (14-fach) und weitere Gene mit ebenfalls unbekannter Funktion. Genotyp 1 LacZ wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 Genotyp 2 LacZ wt-prp-8 wt-prp-9 mth 1 LacZ LacZ LacZ Sauerstoff (99,5%) (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) (+/+) (+/+) (+/+) CG ,72-0,56-0,33-0,82 1,89 1,92 0,57 quo vadis 0,02-1,36-0,07-0,09 2,30 2,53 0,27 CG ,55 0,29-0,26-0,48 1,65 1,23 0,82 CG6289-0,89 0,02-0,52-1,18 1,74 1,29 0,35 cyp6a2 0,22-0,89-0,06-0,04 2,22 1,36-0,10 CG4784-0,14 0,88-0,05-1,22 1,59 2,78-0,75 MtnB - 0,04 0,28 1,76 1,42 1,60 3,15 0,68 CG3408 0,04-0,47 0,50 0,38 1,62 1,47 2,57 CG ,15-0,87 0,19 0,18 2,31 1,97 0,09 CG ,06 0,27-0,06-0,14 5,71 5,84-0,21 CG ,31 1,04 0,38 0,20 1,91 1,39-0,40 cyp6a8 0,07-0,19-0,71-0,63 1,82 1,58 0,61 CG ,25-0,25-0,30-0,07-2,14-2,10-2,20 CG7203-0,61-4,43-1,46-2,70-2,02-3,01-4,72 CG ,43-0,53-0,49-0,32-1,61-1,65-1,21 nicht angegeben - 0,13-0,48-0,50-0,51-1,66-1,77-1,91 CG ,80 0,85 1,38 4,66-3,29-3,02 0,85 Acp76A - 0,39-1,01-1,49-1,49-3,14-4,34-6,88 Spn2-0,85-0,96-1,75-2,57-2,00-3,80-5,75 GstD5 2,16 1,06 1,03 1,02-1,67-1,50-1,58 CG7214 0,43-4,68-0,45-0,40-2,45-3,16-3,30 Drs 0,85-0,08-1,11 1,03-2,48-2,04-0,54 nicht angegeben 0,50-0,10 1,03 0,33-2,85-2,07-3,29 CG ,32-0,36-0,45 0,17-3,14-3,40-3,15 CG ,26-4,82-1,22-1,41-3,18-4,09-4,39 nicht angegeben - 0,36-0,17-0,12 0,25-4,01-4,12-3,84 Tabelle 14: Differentielle Expression von Genen nach Induktion von oxidativem Stress durch reinen Sauerstoff. Dargestellt sind auffällige Gene aus der Studie Girardot et al., 2004 mit Angabe des ln2-wertes. Für signifikante Unterschiede war ein Grenzwert von 1,5 oder -1,5 maßgeblich. 89

96 DISKUSSION 4 DISKUSSION 4.1 Drosophila melanogaster als Modellorganismus zur Untersuchung der Neuropathogenese bei TSE und der physiologischen Funktion von PrP Tiermodelle, die die Neuropathogenese und die Kardinalsymptome neurodegenerativer Erkrankungen widerspiegeln, sind bei der Aufklärung pathogener Mechanismen und biochemischer Zusammenhänge solcher Krankheiten von enormem Vorteil. Nicht nur die vergleichsweise einfache Tierzucht sondern vor allem die hohe Übereinstimmung der einzelnen Elemente des Nervensystems zwischen Tier und Mensch trugen dazu bei, dass zahlreiche Erkrankungen des menschlichen Nervensystems mithilfe der Taufliege Drosophila melanogaster erfolgreich modelliert werden konnten. In einem Modell der Parkinsonschen Erkrankung konnten sämtliche neuropathologischen Befunde, wie Neuronenverlust des dopaminergen Systems, Formierung von Lewy-Körperchen sowie motorischer Dysfunktion nachgewiesen werden (Feany et al., 2000; Chen et al., 2005). Gleichermaßen erfolgreich war die Erstellung eines Drosophila-Modells für die Alzheimersche Erkrankung (Wittmann et al., 2001). Die Beeinträchtigung des axonalen Transports konnte in einem Chorea Huntington- Modell beobachtet werden, indem pathogene polyglutaminhaltige Proteine ektopisch exprimiert wurden (Gunawardena et al., 2003). Zusätzlich fielen die typische Bildung von Proteinaggregaten und Verhaltensänderungen auf (Kretzschmar, D. et al., 2005). Auch zur Charakterisierung von weitgehend unbekannten Proteinen des Zentralen Nervensystems sind Experimente mit Drosophila geeignet. Es konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass die Expression der von dem Gen rutabaga kodierten Adenylyl- Cyclase in den Pilzkörpern von adulten rutabaga-defizienten Tieren ausreichte, um die Gedächtnisleistung bei betroffenen Tieren zu verbessern (McGuire et al., 2003). Ein anderes Beispiel liefern die Untersuchungen zur Balance des Apoptosefaktors Ras. Eine Hochregulierung dieses Faktors resultierte in neuronalem Zelltod, das Gegenteil, eine Herunterregulierung hervorgerufen durch das Ausschalten des Gens vacuolar peduncle (vap), welches für ein Ras GTPase-aktivierendes Protein kodiert hatte den gleichen Effekt (Botella et al., 2003). Als letztes Beispiel dienen die Gene wasted away (Gnerer et 90

97 DISKUSSION al., 2006) und swiss cheese (Kretzschmar, D. et al., 1997), deren Genprodukte eine so wichtige Funktion ausüben, dass Mutanten neurodegenerative Veränderungen und einen verfrühten Tod erleiden. Erste Versuche zur Erzeugung transgener Drosophila als TSE-Modell brachten jedoch nicht die gewünschten Resultate. Die Expression des Syrian Hamster Prion-Proteins scheiterte an der Entwicklung eines Phänotyps (Raeber et al., 1995), wohingegen die Expression der fcjd-assoziierten PrP-Mutante PG14 in der Fliege gänzlich misslang (Deleault et al., 2003). Drei Jahre später brachte dieser Arbeitsgruppe die Expression einer weiteren krankheitsassoziierten Mutante P101L den Erfolg, indem GSStypische Charakteristika wie spongiforme Veränderungen im Fliegengehirn nachgewiesen werden konnten (Gavin et al., 2006). Zur Aufklärung der physiologischen Funktion des Prion-Proteins oder der TSE zugrunde liegenden neuropathologischen, molekularen Prozesse konnten diese Studien nicht beitragen. Die Fragestellung dieser Arbeit bezog sich daher auf die Aufklärung der noch unbekannten physiologischen Funktion des hochkonservierten Prion-Proteins durch Expression der aminoterminalen PrP-Deletionsmutante PrP (tr-prp) mit und ohne komplementierender Ko-Expression von Wildtyp-PrP. Weiterhin sollte über die Monoexpression von tr-prp versucht werden, die potentielle Neurotoxizität dieser Mutante zu überprüfen. So konnte anschließend eine Aussage darüber getroffen werden, ob aufgrund des Verlustes der möglicherweise neuroprotektiven Wirkung des wt-prp eher die loss of function-theorie eine Grundlage für die Neuropathologie bietet oder die gain of function-theorie aufgrund des Auftretens einer neurotoxischen PrP-Form. 4.2 Charakterisierung der transgenen Fliegen Die Auswahl der transgenen Linien, mit denen in dieser Arbeit experimentiert wurde (Porps, 2004), erfolgte zunächst über die Beobachtung, ob Stämme, die das Transgen homozygot und damit je ein Allel pro betreffendem Chromosom tragen, vital sind. Dieser Fall traf nicht für die Linien wt-prp-5, wt-prp-11 und tr-prp-3 zu, so dass aufgrund des wahrscheinlich vorliegenden genetischen Konflikts entschieden wurde, diese Stämme in Experimenten nicht zu berücksichtigen. In zweiter Instanz wurde über die Ermittlung des genauen cytogenetischen Integrationsortes überprüft, ob die Transgene nicht in endogene 91

98 DISKUSSION DNA-Abschnitte inseriert wurden, die dadurch im ungünstigsten Fall ausgeschaltet und somit möglicherweise zu einem artifiziellen Phänotyp führen würden (Tabelle 5). Das Integrat wt-prp-8 wurde so in einem Intron des Gens Rgl das Genprodukt weist eine Nukleotid-Austauschfaktor Aktivität auf und tr-prp-2 in einem Intron des Gens beat-ia lokalisiert, dessen Genprodukt eine noch unbeschriebene Funktion ausübt. Da in beiden Fällen nicht-kodierende Bereiche betroffen waren, wurde der Integrationsort als unbedenklich eingestuft. Die neu über eine Kreuzung dieser beiden Stämme erzeugte doppelt transgene Linie tr-prp2;wt-prp-8 wurde über eine Polymerase-Kettenreaktion und einen Immunblot verifiziert. Um wenigstens zwei unabhängige wt-prpexprimierende Linien für die Experimente zur Verfügung zu haben, wurde zusätzlich die Linie wt-prp-9 ausgewählt, auch wenn das Integrat in einem Exon des Gens CG31032 lokalisiert wurde. Über die Funktion des Produkts dieses Gens liegen ebenfalls noch keine Erkenntnisse vor. Ein letzter Test sollte Gewissheit über die unveränderte Transkriptionseffizienz der in den jeweiligen Linien betroffenen Gene liefern. Hierfür ergaben sich in drei unabhängigen Microarray-Analysen keine signifikant alternierenden Daten (Tabelle 6), so dass von einer gleichwertigen Expression der Genprodukte in wildtypischen und transgenen Linien auszugehen ist. Zur Expression der Transgene wurden die Treiberlinien Actin-GAL4 für eine ubiquitäre und Appl-GAL4 für eine pan-neuronale Proteinverteilung ausgewählt. Die fehlerfreie, gewebespezifische Funktionsweise der Treiberlinien wurde vor den Experimenten über einen GFP- und einen Tetanustoxin-Nachweis überprüft (Abbildung 11, 12 und Tabelle 5). Auf der Ebene der RNA lag das Transkriptionsniveau der PrP-Transgene auf der gleichen Höhe wie das des Haushaltsgens G6PDH (Tabelle 7). Bei allen transgenen Linien konnte eine PrP-Expression im Gehirn der Fliegen mithilfe der Immunblot- Methode eindeutig nachgewiesen werden. Die ubiquitäre Expression der transgenen PrP- Formen zeigte keine signifikanten Mengenunterschiede zwischen den einzelnen Linien oder männlichen und weiblichen Tieren (Abbildung 13). Die Molekülmasse von unglykosyliertem wildtypischem PrP betrug 27 kda und war mit Proben aus Mäusen zu vergleichen. Die mono- und diglykosylierte Form des transgenen Prion-Proteins zeigten hingegen eine geringfügig niedrigere Masse als Maus-PrP, was vermutlich auf unterschiedliche Glykosylierungsmechanismen zurückzuführen ist. Eine frühere Studie 92

99 DISKUSSION stellte diesen Unterschied ebenfalls heraus und zeigte, dass die unglykosylierte Form von Maus- und Drosophila-PrP eine identische Masse aufwies (Raeber et al., 1995). Möglich wäre zum Beispiel eine unterschiedliche Zusammensetzung der Zuckerreste in den beiden Spezies, die somit zu verschieden schweren Glykoproteinen führen würde. Dass es sich bei den drei auftretenden Masseformen um alternative Glykosylierungsprodukte handelt, wurde über eine enzymatische Reaktion mit einer Amidase, die Kohlenwasserstoffreste von Glykoproteinen ablöst, ermittelt (Abbildung 14). Dieses Ergebnis widerlegt die Aussage aus einer Studie, in der das Auftreten des dreiteiligen PrP-Proteinmusters nicht als Resultat einer stattfindenden Glykosylierung festgehalten wurde (Deleault et al., 2003). Die pan-neuronale Expression der transgenen Proteine zeigte ebenfalls keine signifikanten Mengenunterschiede untereinander (Abbildung 15), war jedoch weniger stark als bei der ubiquitären Verteilung (Abbildung 16). Die Tatsache, dass Appl-GAL4 ausschließlich in Neuronen nicht aber in Glia oder anderen Zellen aktiv ist, mag die geringere Konzentration an transgenen Proteinen in den Kopfhomogenaten erklären. Das detaillierte Expressionsmuster der PrP-Formen wurde über eine indirekte Antikörperfärbung ermittelt. Neben einer diffusen Verteilung der transgenen Proteine, konnte eine starke Präsenz in allen Bereichen des Pilzkörpers ausgemacht werden (Abbildung 18). Dieses Muster trat unabhängig vom verwendeten GAL4-Treiber auf und wurde auch nicht durch die PrP-Expression selbst bedingt, da eine XGal-Färbung nach ubiquitärer LacZ-Expression dasselbe Muster aufwies (Abbildung 12). Die generell stärkste Expression zeigte sich erwartungsgemäß in Gehirnen von doppelt transgenen Fliegen, da hier zwei Allele vorliegen. Am schwächsten war die Expression in der Linie wt-prp-9 nach pan-neuronaler Verteilung (Abbildung 18). Dieses Ergebnis spiegelt die Expressionsdaten, die zuvor per Immunblot bestimmt wurden, wider. Die starke Aktivität der transgenen Proteine in den Pilzkörpern kann möglicherweise dadurch erklärt werden, dass die Neurone dieser Gehirnstrukturen besonders lang sind und Proteine in größeren Mengen benötigt und synthetisiert werden. In ersten histologischen Untersuchungen an frontalen Gehirnschnitten konnten auf mikroskopischer und elektronenmikroskopischer Ebene keine neuropathologischen Veränderungen bei fünf Tage alten weiblichen Fliegen der Genotypen wt-prp-8 oder tr- PrP-2 nachgewiesen werden (Abbildung 20). Da Neurodegeneration auch beim 93

100 DISKUSSION Menschen in der Regel erst im hohen Alter einsetzt, wurde in einem zweiten Versuch nach degenerativen Prozessen in der Retina 30 Tage alter transgener Fliegen gesucht. Auch hier konnten keine morphologischen Unterschiede zwischen PrP-transgenen Tieren und wildtypischen Kontrollen festgestellt werden (Abbildung 21). Festzuhalten bleibt, dass alle Stämme ihre Transgene in ausreichend großen Mengen synthetisieren und die Proteine in Homogenaten wie auch im exprimierenden Gewebe zu detektieren sind. Ein Phänotyp durch die bloße Präsenz dieser Transgene konnte auf anatomischer und molekularer Ebene weder bei Männchen noch bei Weibchen in unterschiedlichen Alterstufen festgestellt werden. 4.3 PrP vermittelt erhöhte Lebenserwartung und neuroprotektive Eigenschaften in Drosophila Das Ziel dieser Arbeit war es, durch die Expression von wildtypischem und trunkiertem Maus-PrP, Daten über die weitgehend unbekannte physiologische Funktion des hochkonservierten Proteins zu erheben. Nach dem Ausbleiben eines offensichtlichen neuroanatomischen Phänotyps, wurde nach subtileren Auffälligkeiten Ausschau gehalten. Die Beobachtung unterschiedlicher Fitnessniveaus der transgenen Stämme resultierte in einer detaillierten Analyse der allgemeinen Lebenserwartung der Linien unter optimalen Laborbedingungen (Abbildung 22). Im Vergleich zu einer LacZ-exprimierenden Linie, die als Normreferenz herangezogen wurde und eine mittlere Lebenserwartung von 53 Tagen erreichte, fiel die wt-prp-8-exprimierende Linie durch eine um 20% erhöhte Lebenserwartung mit im Mittel 63 Tagen auf. Derselbe Wert wurde für die besonders langlebige und stressresistente Mutante methuselah (mth 1 ) bestimmt. Somit hat wildtypisches PrP einen lebensverlängernden Charakter, was mit großer Wahrscheinlichkeit auf die neuroprotektive Funktion des Proteins und der damit assoziierten Octarepeat-Domäne zurückzuführen ist. Die Expression der trunkierten, Octarepeat-losen Form des Prion-Proteins hatte hingegen sogar eine achtprozentige Reduktion der mittleren Lebenserwartung auf nur 49 Tage zur Folge. Es erscheint folgerichtig, dass die nun ausbleibende lebensverlängernde, neuroprotektive Eigenschaft auf das Fehlen der Octarepeat-Domäne begrenzt werden kann und somit alle vorteilhaften Konsequenzen für den Organismus wegfallen. Obendrein scheint trunkiertes PrP wie 94

101 DISKUSSION auch in transgenen Mäusen beobachtet ein zweites, neurotoxisches Attribut innezuhaben, wodurch die zusätzliche Reduktion der Lebenserwartung erklärt würde. Diese Annahme ist mit der Beobachtung, dass es durch die Ko-Expression von trunkiertem und wildytpischem PrP zu keinem komplementierenden Effekt kommt, konsistent. Bei dem noch ungeklärten pathologischen Mechanismus der krankheitsassoziierten Mutante tr-prp könnte es sich um einen gain of function-komplex handeln, der eine chronische Toxizität beinhalten würde und nicht durch wildtypisches PrP kompensiert werden könnte. Lebenserwartung und Stressresistenz sind eng miteinander korreliert. In der Tat zeigte sich ein ebenso deutlicher Unterschied zwischen PrP- und nicht-prp-exprimierenden Linien nach Herausforderung der Stressabwehr durch Induktion von oxidativem Stress. Nach Verfütterung einer 0,15-prozentigen Wasserstoffperoxid-Zuckerlösung an weibliche Versuchstiere ergaben sich klare Vorteile für die Linien wt-prp-8 und wt-prp-9 (Abbildung 23). So erreichten diese Linien eine mittlere Überlebenszeit von 252 Stunden und lagen damit gleichauf mit mth 1. Dieser erreichte Wert stellt ein 25-prozentiges Plus zur mittleren Überlebenszeit der LacZ-Referenzlinie mit 204 Stunden dar. Eine erhöhte Stressanfälligkeit offenbarte die Linie tr-prp-2, wodurch erneut die Wichtigkeit der hier deletierten Octarepeat-Domäne herausgestellt wurde. Dieser Effekt konnte jedoch durch wt-prp-8-ko-expression teilweise komplementiert werden. Wahrscheinlich stellten in diesem Szenario die neuroprotektiven Eigenschaften des wt-prp einen der akuten tr-prp- Neurotoxizität übergeordneten Vorteil dar, so dass sich die Überlebenszeit der doppelt transgenen Linie hier zwischen beiden Extrema einpendelte. Männliche Tiere schnitten bei diesem Experiment mit durchschnittlich 21% verminderter Überlebenszeit ab. Die geringere Größe der Männchen und die damit einhergehende höhere Anfälligkeit gegenüber schädlichen Substanzen erklären diesen Sachverhalt. Das Stress-induzierende Agens wurde zunächst zusätzlich in drei anderen Konzentrationen (0,075%, 0,3% und 0,6%) angeboten. Dabei zeigte sich eine Dosis-Wirkungs-Korrelation. Die verabreichte Konzentration von 0,15% stellte sich jedoch als die Optimale in Bezug auf Dauer und Effizienz der Experimente heraus. Ferner konnte beobachtet werden, dass die Expression der Transgene in ihrem physiologischen Kompartiment, also des Zentralen Nervensystems, ausreichend für die Vermittlung der Stressresistenz war, die somit keine ubiquitäre Verteilung von PrP voraussetzte (Abbildung 24). Dies ist umso 95

102 DISKUSSION bemerkenswerter, als pan-neuronale PrP-Expression auf deutlich niedrigerem Niveau erfolgte (Abbildung 16). Im Rahmen eines zweiten Paradigmas zur Induktion von oxidativem Stress wurde weiblichen Fliegen das Herbizid Paraquat verfüttert (Abbildung 25). Hierdurch konnten die Vorteile, die sich den Fliegen durch PrP-Expression ergaben, bestätigt werden. Tiere mit wt-prp überlebten etwa doppelt so lang wie die LacZ-Kontrolle, deren Überlebenszeit sich in diesem Experiment auf nur 24 Stunden reduzierte. Die Tatsache, dass tr-prp dieselbe Überlebenszeit aufwies und durch wt-prp-ko-expression komplementierbar war, belegt die Annahme der der akuten Toxizität übergeordneten Protektion durch wildtypisches PrP. Auch in Gegenwart einer 99,5-prozentigen Sauerstoffatmosphäre zeichnete sich eine deutlich erhöhte Resistenz von wt-prp-exprimierenden Fliegen ab (Abbildung 26). Mit im Mittel 168 Stunden Überlebenszeit lebten die Tiere einen halben Tag länger als LacZexprimierende Individuen (156 Stunden). Fehlten wiederum die Octarepeat-enthaltenden Aminosäuren 32 bis 134, so wurde die erworbene Resistenz einerseits eliminiert und andererseits die Überlebenszeit zusätzlich durch die akute Toxizität des trunkierten PrP reduziert (132 Stunden). Bei gleichzeitiger Expression beider PrP-Formen pendelte sich auch in diesem Experiment die Überlebenszeit zwischen beiden Extrema ein. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass unabhängig von der gewählten Art der Stressinduktion wildtypisches PrP imstande ist, die allgemeine Lebenserwartung und die Überlebenszeit unter Stressbedingungen signifikant zu erhöhen. Die Deletion der Octarepeat-Domäne resultierte in dem Verlust der Resistenzeigenschaften und zeigte obendrein eine erhöhte Anfälligkeit gegenüber der LacZ-exprimierenden Referenzlinie. Es hat den Anschein, dass beide PrP-Formen entgegengesetzte Wirkungsweisen entfalten. Bei der allgemeinen Lebenserwartung, bei der eine Ko-Expression beider Formen zu keiner Komplementation der chronischen Toxizität des tr-prp führte, scheinen die positiven, neuroprotektiven Eigenschaften von wt-prp eine untergeordnete Rolle zu spielen. Unter andauernden Stressbedingungen hielten sich die entgegengesetzten Wirkungsweisen bei Ko-Expression offensichtlich die Waage. Der wt-prp-vermittelten Neuroprotektion wird unter akuter Stressinduktion eine höhere Relevanz zugeordnet, so dass die akute Toxizität des trunkierten Prion-Proteins teilweise unterminiert werden 96

103 DISKUSSION kann, was wiederum zu einer normalen Überlebenszeit der transgenen Tiere in allen Untersuchungen führte. Um die starken Unterschiede des Einflusses von wt-prp und tr-prp auf die Lebenserwartung und die Stressresistenz detaillierter zu bestimmen, wurde nach neuropathologischen Veränderungen in Gehirnen sauerstoffgeschädigter Fliegen gesucht (Abbildung 28). In der Tat zeigten LacZ- und tr-prp-exprimierende Tiere einen relativ hohen Grad an vakuolisiertem Gewebe in den optischen Loben. Die Expression von wt- PrP-8 resultierte ebenso wie bei mth 1 in einer drastischen Reduktion dieser anomalen Gewebeschädigungen. Diese Daten korrelieren mit den Ergebnissen aus dem Überlebenszeitexperiment. Inkonsistent waren jedoch die Resultate für die Linie wt-prp- 9, die einen höheren Anteil an vakuolisiertem Gewebe aufwies als wt-prp-8. Diese Tatsache kann nicht mit der diskutierten Arbeitshypothese, die eine erhöhte Neuroprotektion für wt-prp transgene Tiere formuliert, vereinbart werden. Möglicherweise spielt die Tatsache, dass das wt-prp-9-integrat in einem Exon des Wirtsorganismus inseriert wurde in diesem Zusammenhang eine unbekannte Rolle. In der Annahme, dass es sich bei den auftretenden Vakuolisierungen um eine Folge neurodegenerativer Prozesse handelt, wurde in Gehirnen der Tiere desselben Experiments nach apoptotischen Neuronen gesucht. Hier ergaben sich jedoch keine mit der Arbeitshypothese übereinstimmenden Resultate (Abbildung 29). Die kaum vorhandene neuronale Apoptose (physiologischer Zelltod) in LacZ- und tr-prp-exprimierenden Tieren muss allerdings kein Indiz für nicht stattfindende Neurodegeneration sein. Vielmehr wären auch nekrotische Prozesse (pathologischer Zelltod) oder neuronale Autophagozytose (Liberski et al., 2008; Oh et al., 2008) als Ursache für den Untergang sauerstoffgeschädigter Neuronen vorstellbar. 4.4 PrP, die Octarepeat-Domäne und Kupfer-abhängige Fenton-ähnliche Reaktionen eine Spekulation Es ist bekannt, dass reaktive Sauerstoffspezies wie Wasserstoffperoxid, das Paraquat- Kation oder molekularer Sauerstoff im Gewebe über biochemische Reaktionen in Sauerstoffradikale umgewandelt werden (Abbildung 30). Da keine enzymatischen Prozesse notwendig sind, wirkt das Paraquat-Kation besonders schnell. Es ist in der Lage, 97

104 DISKUSSION molekularen Sauerstoff über eine einfache Reduktion in das hochtoxische Hyperoxidradikal umzuwandeln. Diese Tatsache erklärt die beobachtete kürzeste Überlebenszeit der Versuchstiere in den Stressinduktions-Experimenten. Das Radikal kann ebenfalls mithilfe des Enzyms Dioxygenase aus Sauerstoff gebildet werden. Eine Oxidase-Reaktion hingegen überführt Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid, welches wiederum die Grundlage für die Entstehung des Hydroxylradikals bildet. Hydroxyl- und Hyperoxidradikale führen zu Lipidperoxidationen oder sind imstande, DNA und Proteine zu hydroxylieren. Diese Degradationen tragen zur Überlastung der erhaltenden Maßnahmen der Zelle bei. Übermäßiger DNA- und Proteinabbau führt meist zu dem Verlust der zellulären Integrität. Nekrotische Zellen werden dann über Phagozytose beseitigt. Nicht zu kompensierender Verlust der Lipidmembranen resultiert dahingegen unter anderem in einer Perforation der Mitochondrien mit einhergehendem Verlust des MMP (mitochondrial membrane potential). Anschließend freigesetztes Cytochrom c aktiviert mit der Kaspase den ersten Schritt der Apoptose-Kaskade, die zum programmierten Zelltod führt. Auf diesem Weg kann sich im Laufe eines Lebens ein enormes Ausmaß an neuronalem Zellverlust zu drastischen Gewebedegenerationen entwickeln, die vielfältige Ausfallerscheinungen im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen zur Folge haben können. Um dieser Bedrohung, die als oxidativer Stress zusammengefasst wird, zu begegnen, evolvierten Wirbeltierorganismen einige Abwehrmoleküle, die als Antioxidantien oder Oxidationshemmer bekannt sind und der Radikalsynthese aktiv oder passiv entgegenwirken. So wird zum Beispiel das Hyperoxidradikal spezifisch über eine katalysierte Reaktion durch das Enzym Superoxid-Dismutase (SOD) oder durch den Radikalfänger Ascorbinsäure (Vitamin C) in Wasserstoffperoxid umgewandelt und neutralisiert. Wasserstoffperoxid kann seinerseits durch das Enzym Katalase abgebaut werden. Ein Überangebot von Wasserstoffperoxid führt hingegen unweigerlich zur Bildung des hochtoxischen Hydroxylradikals. Die Umwandlung wird über eine chemische Reaktion vollzogen, die nach Ihrem Entdecker als Fenton-Reaktion bezeichnet wird (Fenton, 1894). Sie beschreibt eine durch Eisensalze katalysierte Oxidation organischer Substrate mit Wasserstoffperoxid und gilt als Hauptquelle von reaktiven Sauerstoffspezies in biologischen Systemen. Fenton-ähnliche Reaktionen wurden entdeckt, die dieselben Resultate unter Beteiligung anderer niedervalenter 98

105 DISKUSSION Metallkomplexe wie zum Beispiel Kuper(II)-Ionen als Katalysatoren erbrachten (Shinar et al., 1989). Diese Reaktion wird zum Beispiel von passiv wirkenden Antioxidantien gehemmt, die die benötigten Metallionen abfangen. Abbildung 30: Reaktionswege von reaktiven Sauerstoffspezies, deren Folgen und die spekulative Interaktion von PrP C und tr-prp. Ein Überangebot von Wasserstoffperoxid, Sauerstoff oder Paraquat begünstigt die Entstehung von hochtoxischen Sauerstoffradikalen. Diese führen zum Absterben betroffener Zellen durch Apoptose oder Nekrose. PrP C ist möglicherweise über die Kupfer-bindende Eigenschaft der Octarepeat-Domäne imstande, die Fenton-Reaktion zu inhibieren und der Bildung des Hydroxyl-Radikals entgegen zu wirken. Tr-PrP kann diese Funktion aufgrund der fehlenden Octarepeat-Domäne nicht ausüben und wirkt zudem möglicherweise zellschädigend. In diesem Zusammenhang muss die putativ neuroprotektive Rolle des Prion-Proteins neu betrachtet werden. Es wurde bereits eingangs beschrieben, dass PrP vermutlich weder eine der Superoxid-Dimutase ähnliche enzymatische Eigenschaft zur direkten Detoxifizierung beinhaltet (Jones, S. et al., 2005) noch regulatorische Prozesse zur indirekten Einflussnahme auf reaktive Sauerstoffspezies auszulösen vermag (Waggoner et al., 1999; Hutter et al., 2003). Dennoch könnte über die eindeutig nachgewiesene Kapazität der Octarepeat-Domäne des Prion-Proteins Kupfer-Ionen zu binden (Brown, D. 99

106 DISKUSSION et al., 1997a; Stockel et al., 1998; Jackson et al., 2001; Kramer et al., 2001; Vassallo et al., 2003), eine indirekte Inhibition Fenton-ähnlicher Reaktionen stattfinden. Diese Annahme wird durch die Ergebnisse dieser Arbeit, dass in transgenen Drosophila wildtypisches PrP neuroprotektiv wirkt, jedoch trunkiertes, Octarepeat-loses PrP keine vorteilhaften Eigenschaften vermittelt, bestätigt. Es wäre somit möglich, dass PrP freie Kupfer-Ionen an der Zelloberfläche abfängt und dem Gewebe entzieht. Einige Studien berichteten auch tatsächlich von einem Abfall der Kupfer-Ionen-Konzentration auf der Zelloberfläche in Prnp 0/0 -Mäusen (Brown, D. et al., 1997a; Herms et al., 1999), diese wurden allerdings von einer anderen Forschergruppe widerlegt (Waggoner et al., 2000). Die Octarepeat-Domäne des Prion-Proteins könnte auch eine den Kupfer-Haushalt regulierende Funktion ausüben. Analog zu einem DNA-Operon Modell würden die Octarepeats bei einem hohen Kupferniveau Kupfer-Ionen binden. Die dadurch hervorgerufene Strukturveränderung des flexiblen Aminoterminus würde die Konformation des Rezeptormoleküls PrP derart ändern, dass eine Signaltransduktion ermöglicht würde. Die nachfolgende Aktivierung eines Signalwegs könnte zum Beispiel Maßnahmen, die gegen ein erhöhtes Kupfer-Ionen-Niveau agieren, veranlassen und auf diesem Weg der Entstehung von Sauerstoffradikalen entgegenwirken. Da die klassischen Signalwege, die im Zusammenhang mit oxidativem Stress stehen, bei Präsenz von PrP nicht von wildtypischen Verhältnissen abweichend reguliert werden, müsste es sich um ein bislang unbekanntes Zusammenspiel von genetischen Faktoren handeln. Diese Regulator-Hypothese bestätigt nachfolgende Studienresultate und fügt sich nahtlos in bestehende Beobachtungen der Eigenschaften und Funktionen des Prion-Proteins ein: 1. die Kupfer-bindende Eigenschaft der Octarepeat-Domäne des Prion-Proteins. 2. die Beobachtung, dass der Aminoterminus nach Kupferbindung die Konformation des flexiblen Aminoterminus ändert (Jones, C. E. et al., 2004; Leclerc et al., 2006). 3. die pathogenen Eigenschaften der PG14-Mutante (Owen et al., 1992; Duchen et al., 1993; Krasemann et al., 1995). Neun zusätzliche Octarepeats würden vermutlich die Struktur der Octarepeats derart ändern, dass eine Signaltransduktion unmöglich würde. 100

107 DISKUSSION 4. die Tatsache, dass trunkiertes Prion-Protein keine Neuroprotektion vermittelt sondern obendrein aufgrund des kompletten Verlustes des signalübertragenden Aminoterminus indirekt toxisch wirkt (loss of function) (Shmerling et al., 1998; Flechsig et al., 2003; Weissmann et al., 2003). 5. die Beobachtung, das PrP keine Superoxid-Dismutase-ähnliche Aktivität aufweisen muss um antioxidativ zu wirken (Jones, S. et al., 2005). 6. die anti-apoptotischen Eigenschaften von PrP (Bounhar et al., 2001; Roucou et al., 2003; Li et al., 2005), die von einer direkten Einwirkung auf Sauerstoffradikale unabhängig sind. Zusammenfassend und frei von jeder Spekulation lässt sich festhalten, dass wildtypisches Prion-Protein selbst einer relativ kurzlebigen Spezies, die von der Natur nicht mit diesem in Vertebraten hochkonservierten Protein und dessen molekularer Infrastruktur ausgestattet wurde, signifikante Vorteile bezüglich der Lebenserwartung und der Abwehr von neurotoxischen Agentien einbringt. Die Wichtigkeit der Octarepeat- Domäne des Prion-Proteins konnte in diesem Zusammenhang zweifelsfrei herausgestellt werden. 101

108 ZUSAMMENFASSUNG 5 ZUSAMMENFASSUNG 5.1 Deutsch Übertragbare spongiforme Enzephalopathien (TSE) wie Scrapie beim Schaf, die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen sind fortschreitende neurodegenerative Erkrankungen, die nach langer Inkubationszeit zum Tod führen. Die protein only-hypothese besagt, dass das infektiöse Agens Prion teilweise oder vollständig aus dem zellulären Prion-Protein (PrP C ) besteht und nach Infektion des Organismus die Konversion von PrP C in die pathogene Isoform (PrP Sc ) verursacht. Die der Krankheit zugrunde liegenden neuropathologischen Mechanismen und die physiologische Funktion von PrP C sind bisher unbekannt. Es wurden jedoch eine neuroprotektive Funktion oder eine mögliche Rolle im Zusammenhang mit der oxidativen Stress Homöostase postuliert. In dieser Arbeit wurden transgene Drosophila melanogaster-linien als Modell zur Untersuchung der Funktion von PrP C etabliert. Unter Verwendung des Expressionssystems UAS/GAL4 exprimierten die Fliegen entweder wildtypisches PrP (wt-prp) oder eine trunkierte, krankheits-assoziierte Mutante PrP (tr-prp), der die potentielle neuroprotektive Octarepeat-Domäne entfernt wurde. Wt-PrP transgene Fliegen zeigten nach Vergleich mit Kontrolllinien eine signifikante, um 20% erhöhte allgemeine Lebenserwartung. Obwohl die Expression von tr-prp in Drosophila zu keinen nachweisbaren neuropathologischen Veränderungen führte, wurde die Lebensspanne um 8% reduziert. Ko-Expression von wt-prp und tr-prp konnte diesen Effekt nicht komplementieren, was eine chronische Toxizität der trunkierten Form nahelegt, die in diesem Zusammenhang der Neuroprotektion übergeordnet ist. Da Lebenserwartung und Stressresistenz eng miteinander korrelieren, wurden die Fliegen den reaktiven Sauerstoffspezies Wasserstoffperoxid, Sauerstoff und Paraquat ausgesetzt, um auf drei unabhängigen Wegen oxidativen Stress zu induzieren. In der Tat vermittelt wt-prp eine signifikante Stressresistenz, wohingegen tr-prp-exprimierende Tiere eine normale Anfälligkeit offenbarten, die jedoch teilweise durch Ko-Expression beider PrP-Formen komplementiert werden konnte. Hier erscheint die protektive Funktion von wt-prp der Toxizität der Deletionsmutante übergeordnet zu sein. 102

109 ZUSAMMENFASSUNG Diese Daten belegen eine wichtige Funktion des Prion-Proteins bezüglich der Abwehr von oxidativem Stress. Essentiell ist dabei die Kupfer-bindende Octarepeat-Domäne, durch die möglicherweise Fenton-ähnliche Reaktionen, die bei der Sauerstoff- Radikalsynthese eine wichtige Rolle spielen, inhibiert werden könnten. Konsistent damit ist die Beobachtung des Verlusts der erworbenen Stressresistenz nach Expression der Octarepeat-losen Mutante tr-prp und die signifikante Reduktion der Lebenserwartung über einen bislang unaufgeklärten Mechanismus. Das Drosophila PrP-Modell bietet die Möglichkeit, die physiologische Funktion von PrP detailliert zu untersuchen. Außerdem ist die Identifizierung unbekannter PrP-Interaktionspartner ermöglicht, um Signaltransduktionswege des PrP und die zugrunde liegenden neurodegenerativen Mechanismen aufzuklären. 5.2 English Transmissible spongiforme encephalopathies (TSE) such as scrapie in sheep, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle or Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans are fatal progressive neurodegenerative disorders. The protein only hypothesis proposes that the infectious agent designated prion consists partly or entirely of the host cellular prion protein (PrP C ) and, when the prion is introduced into the organism, causes the conversion of PrP C into the pathogenic isoform PrP Sc. However, the disease underlying neuropathogenic mechanisms and the physiological function of PrP C still remain unknown, although a neuroprotective function or a role in oxidative stress homeostasis has been postulated previously. In this work transgenic Drosophila melanogaster lines were evaluated as a model for studying the function of PrP C. By using the bipartite expression system UAS/GAL4 either wild-type PrP (wt-prp) or a truncated disease associated variant PrP (tr- PrP) lacking the putative neuroprotective octarepeat domain were utilized. Wt-PrP transgenic flies displayed an approximately 20% increase in average lifespan compared to controls. Although expression of tr-prp in Drosophila did not induce any obvious neuropathology, it significantly reduced the lifespan by 8%. Co-expression of wt-prp and tr-prp did not complement this phenotype, indicating a chronic toxicity of the truncated PrP that is overriding the neuroprotection. Since extended lifespan and stress resistance 103

110 ZUSAMMENFASSUNG are closely associated, flies were exposed to the reactive oxygen species (ROS) hydrogen peroxide, oxygen and Paraquat as three independent treatments to provoke oxidative stress. Interestingly, wt-prp confered resistance to ROS-induced stress, whereas tr-prp transgenic flies showed normal susceptibility, which was partly rescued by co-expression of wt-prp. In this regard PrP presence in its physiological compartment, the central nervous system, is sufficient to maintain the described beneficial effects. These findings suggest that PrP is involved in oxidative stress homeostasis by a mechanism that requires the copper binding octarepeat domain. This function might be responsible for the inhibition of Fenton-like reactions which are known to play an important role in oxygen radical synthesis. Consistent with this theory is the observation that ectopic expression of the octarepeat deletion mutant tr-prp reduces both acquired stress resistance and lifespan by an unrelated, yet unknown mechanism. The Drosophila PrP model provides the possibility to investigate the physiological function of PrP in more detail. It is likewise considerable to identify unknown ligands of PrP in order to uncover PrP signal transduction pathways or neuropathogenic mechanisms. 104

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132 ANHANG 7 ANHANG 7.1 Abkürzungs- und Symbolverzeichnis A ABC... Avidin-Biotin-Komplex AG... Arbeitsgruppe ant lob... antennal lobe Appl... amyloid protein precursor-like B B PrP-spezifischer Antikörper Bcl-2... B-cell lymphoma 2 beat-ia... Gen, kodiert für das Protein beaten BSA... bovine serum albumin BSE... bovine spongiforme encephalopathy C C-Terminus... Carboxyterminus ca... calyx cdna... copy-desoxyribonukleinsäure CG... cytogenetic map CJD... Creutzfeldt-Jakob-Krankheit CO 2... Kohlendioxid COOH... Carboxylgruppe CT... threshold cycle Ctm PrP... alternative Transmembranform des Prion-Proteins mit Carboxyterminus im ER Cu... Kupfer CWD... chronic wasting disease CyO... Curly of Oster, Balancerchromosom cyp18a1... Gen, kodiert für ein Cytochrom cyp6a2... Gen, kodiert für ein Cytochrom cyp6a8... Gen, kodiert für ein Cytochrom cyp9b2... Gen, kodiert für ein Cytochrom cy-prp... mutierte, cytosolische Form des Prion-Proteins der Maus (PrP23-230) D DAB... Diaminobenzidin db... double balancer DC... Dendritische Zellen ddh 2 O... doppelt destilliertes Wasser ddntp... Didesoxyribonukleintriphosphat del... reverse DNA-Primer für PrP DNA... Desoxyribonukleinsäure Dpl... Doppel DraI... Restriktionsendonuklease aus der Bakterienspezies Deinococcus radiodurans 126

133 ANHANG DTT... Dithiothreitol E e b... elipsoid body EDTA... Ethylendiamintetraessigsäure ECL... enhanced chemoluminescence egfp... enhanced green fluorescence protein EGTA... Ethylenglykol-bis(aminoethylether)- N,N,N'N'-Tetraessigsäure ER... Endoplasmatisches Retikulum et al.... et alii = und andere EU... Europäische Union F F 1... erste Filialgeneration F2/R2... DNA-Primerpaar für G6PDH fb... fan-shaped body fcjd... familiär auftretende Form der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit FFI... fatal familial insomnia FSE... feline spongiform encephalopathy G G6PDH... Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase GABA... gamma-aminobuttersäure GAL4... Galaktosidase 4 GMR... Glass Multimer Reporter GPI... Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol-Gruppe GSS... Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom GstD50... Gen, kodiert für eine Glutathion-S-Transferase GstE10... Gen, kodiert für eine Glutathion-S-Transferase H H... Helix H 2 O... Wasser HRP... horseradish peroxidase Hsp... heat shock protein http... hypertext transfer protocol I icjd... iatrogen auftretende Form der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit ICSM18... PrP-spezifischer Antikörper IgG... Isotypform der Immunglobuline IIS... Insulin signalling Signalweg IP3K1... Gen, kodiert für das Drosophila Inositoltriphosphat J JAK/STAT... Janus-Kinase/STAT Signalweg JNK... Jun-Kinase Signalweg K kda... kilo-dalton = 1x10 3 Dalton (Molekularmasse) L L PrP... fiktiver Ligand des Prion-Proteins LacZ... beta-galaktosidase ln2... Logarithmus zur Basis 2 127

134 ANHANG lo... lobula lo p... lobula plate lob... lobe lolal... Gen, kodiert RNA Polymerase II Transkriptionsfaktor LRP... laminin receptor precursor M M-Zellen... microfold Zellen MBM... meat and bone meal me... medulla MMP... mitochondrial membrane potential mrna... messenger Ribonukleinsäure mth... methuselah, Drosophila melanogaster-mutante MtnB... Gen, kodiert für das Drosophila Metallothionein mut reverse DNA-Primer für PrP N N-CAM... neural cell adhesion molecule n.a.... not available = nicht verfügbar n.s... nicht signifikant N-Terminus... Aminoterminus NCJDSU... The National CJD Surveillance Unit NeuN... Neuronen-spezifischer Antikörper NH 2... Aminogruppe NMR... nuclear magnetic resonance Ntm PrP... alternative Transmembranform des Prion-Proteins mit Aminoterminus im ER O OIE... Office International des Epizooties ORF... open reading frame OS... Oxidativer Stress P P... Parentalgeneration P3, P5... inverted repeats eines transposablen Elements P-Element... transposabler DNA-Abschnitt P-Wert... Irrtumswahrscheinlichkeitswert PAGE... Polyacrylamidgelelektrophorese PBS... phosphate buffered saline PCR... polymerase chain reaction ped... peduncle Pfu... DNA-Polymerase aus der Bakterienspezies Pyrococcus furiosus PG14... Form des Prion-Proteins mit neun zusätzlichen Octarepeats ph... Ionenprodukt des Wassers PMCA... protein missfolding cyclic amplification Prnp... Genbezeichnung für das humane Prion-Protein Prnp 0/0... PrP-defiziente Mauslinie (konservativer Knockout) Prnp -/-... PrP-defiziente Mauslinie (invasiver Knockout) PrP-AV37... mutierte Form des Prion-Proteins der Maus (Ala Val 112,114,117) 128

135 ANHANG PrP C... cellular Prion-Protein PrPres... resistentes Fragment des Prion-Proteins PrP Sc... scrapieförmiges Prion-Protein Pry1,Pry4... DNA-Primerpaar für das P-Element pp[uast] PSPr... protease-sensitive prionopathy PVDF... Polyvinylidenfluoride R rer... raues Endoplasmatisches Retikulum Rgl... Ral Guanyl-Nukleotid exchange factor 21 ROS... reaktive Sauerstoffspezies RT... reverse Transkriptase RTQ-PCR... Real-Time-quantitative PCR S S-S... Disulfidbrücke s/w... schwarz/weiß S1... Sicherheitsbereich 1 SAP47... synapse associated protein scjd... spontan auftretende Form der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit SDS... Natriumlaurylsulfat ShaPrP... Syrian hamster Prion-Protein sig1... forward DNA-Primer für PrP so... sine oculis SOD... Superoxid-Dismutase Sp... sternopleural, Balancerchromosom Spn2... Gen, kodiert für Serpin2 STE... Stopp Transfer Effektor-Domäne von PrP T t-test... statistischer Hypothesentest TAE... TRIS-Essigsäure-EDTA-Puffer TBST... tris buffered saline tween 20 TdT... Terminale deoxynucleotidyl Transferase TE... TRIS EDTA TM... transmembrane Domäne von PrP TME... transmissible mink encephalopathy tm2... third multiple 2, Balancerchromosom tm6... third multiple 6, Balancerchromosom TNT... Tetanustoxin tr-prp... mutierte, trunkierte Form des Prion-Proteins (PrP F32-134) TRIS... Tris(hydroxymethyl)-aminomethan TSE... transmissible spongiform encephalopathy TUNEL... TdT-vermitteltes desoxy-uridintriphosphat-biotin nick end labeling U U/min... Umdrehungen pro Minute UAS... upstream activating sequence UV... ultraviolette Strahlung V v/v... volume per volume 129

136 ANHANG vap... vacuolar peduncle, Drosophila melanogaster-mutante vcjd... variante Form der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit W w/v... weight per volume w white, Drosophila melanogaster-mutante wt-prp... natürliches, wildtypisches Prion-Protein der Maus X X-Gal... 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galactopyranosid Y Y2H... yeast two hybrid Z ZNS... Zentrales Nervensystem Symbole... männlich... weiblich... jungfräulich *... symbolisiert signifikanten Unterschied 3... Dritter Kohlenstoff in der Ribose von DNA und RNA, Bindestelle für den Phosphatrest des nächsten Nukleotids. Leserichtung von kodiereden Strängen ist entsprechend der Translationsrichtung von 5 zu Fünfter Kohlenstoff in der Ribose von DNA und RNA, Bindestelle für den Phosphatrest des vorhergehenden Nukleotids.... Deletion π... fiktives PrP-Homolog Purine Nukleobase Pentose Nukleosid A Adenin Ribose/Desoxyribose Adenosin/Desoxyadenosin G Guanin Ribose/Desoxyribose Guanosin/Desoxyguanosin Pyrimdine Nukleobase Pentose Nukleosid C Cytosin Ribose/Desoxyribose Cytidin/Desoxycytidin T Thymin Desoxyribose Desoxythymidin U Uracil Ribose Uridin 130

137 ANHANG Proteinogene Aminosäuren Code Abkürzung Eigenschaften essentiell Glycin G Gly aliphatisch nein Alanin A Ala aliphatisch nein Valin V Val aliphatisch ja Leucin L Leu aliphatisch ja Isoleucin I Ile aliphatisch ja Cystein C Cys schwefelhaltig nein Methionin M Met schwefelhaltig ja Phenylalanin F Phe aromatisch ja Tyrosin Y Tyr aromatisch nein Tryptophan W Trp aromatisch ja Prolin P Pro Iminosäure nein Serin S Ser neutral nein Threonin T Thr neutral ja Asparagin N Asn neutral nein Glutamin Q Gln neutral nein Aspartat D Asp sauer nein Glutamat E Glu sauer nein Histidin H His basisch nein Lysin K Lys basisch ja Arginin R Arg basisch nein Abbildung 31: Der genetische Code. Mit drei Nukleobasen können vom 5 -Ende (innen) zum 3 -Ende (außen) 64 verschiedene Codons gebildet werden, die für 20 unterschiedliche Aminosäuren, sowie drei Stoppcodons kodieren. 131