Translokation des Prion-Proteins ins endoplasmatische Retikulum: die Rolle intrinsischer und zellulärer Faktoren

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1 Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Ludwig-Maximilians-Universität München Translokation des Prion-Proteins ins endoplasmatische Retikulum: die Rolle intrinsischer und zellulärer Faktoren Margit Miesbauer aus Schärding 2009

2 Erklärung Diese Dissertation wurde im Sinne von 13 Abs. 4 der Promotionsordnung vom 29. Januar 1998 von Herrn Prof. Dr. Jörg Tatzelt betreut und von Frau PD Dr. Konstanze F. Winklhofer vor der Fakultät für Chemie und Pharmazie vertreten. Ehrenwörtliche Versicherung Diese Dissertation wurde selbständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet. München, am Dissertation eingereicht am Gutachter : Prof. Dr. Jörg Tatzelt 2. Gutachter: Prof. Dr. F.-Ulrich Hartl Mündliche Prüfung am

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4 Danksagung Zuerst möchte ich mich bei meinem Betreuer Prof. Dr. Jörg Tatzelt für die außerordentliche Unterstützung, die engagierte Betreuung sowie die vielen Diskussionen und Anregungen während der letzten Jahre herzlichst bedanken. Auch PD Dr. Konstanze F. Winklhofer möchte ich für die sehr gute Zusammenarbeit und Betreuung sowie die bereitwillige Übernahme der Fachvertretung danken. Ein großer Dank gilt Prof. Dr. F. Ulrich Hartl für die Übernahme des Zweitgutachtens dieser Dissertation. Prof. Dr. Christian Haass danke ich für die wissenschaftliche Unterstützung und seine anregenden Fragen und Ideen. Des Weiteren danke ich der gesamten Arbeitsgruppe der Abteilung Zelluläre Biochemie am Max Planck Institut und allen Kollegen am Adolf Butenandt Institut für ihre Hilfsbereitschaft und die gute Zusammenarbeit. Bedanken möchte ich mich natürlich auch bei der gesamten Arbeitsgruppe Tatzelt und Winklhofer und hierbei besonders bei Veronika für die tatkräftige Unterstützung im Labor sowie bei Julia, Lena, Kerstin, Uli, Vignesh, Natalie, Kathrin, Anna, Benjamin, Elisabeth und Vicky. Ganz besonderer Dank gilt Geli, Anita und Mareike, die abgesehen von ihren großartigen fachlichen Tipps und Tricks im Labor meine Dissertation zu einer ganz besonderen Zeit in meinem Leben gemacht haben und mir die besten Freunde geworden sind! An dieser Stelle möchte ich mich auch bei Markus für seine fortwährende Hilfsbereitschaft bedanken. Mein tiefster Dank gilt meiner Familie, die immer für mich da ist. Ihre Unterstützung und ihr Rückhalt in allen Lebenslagen haben mir meinen bisherigen Weg sehr geebnet und mir unendlich viel geholfen. Schließlich möchte ich von ganzem Herzen Jiri für seine Geduld und die manchmal notwendige Zerstreuung und Aufmunterung während der letzten Jahre danken. Es war sehr schön, es hat mich sehr gefreut! (Kaiser Franz Joseph et al., )

5 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG Prion-Erkrankungen Einführung Prion-Erkrankungen beim Tier Scrapie Bovine spongiforme Enzephalopathie Chronisch zehrende Hirschkrankheit Prion-Erkrankungen beim Mensch Pathologie und Symptomatik humaner Prion-Erkrankungen Das Prion-Protein Identifikation des infektiösen Agens Unterschiede zwischen PrP C und PrP Sc und Konversionsmodelle PrP- und PrP-ähnliche Gene Biogenese und zelluläre Lokalisierung von PrP Struktur von PrP PrP und verwandte Proteine im Zebrabärbling (Danio rerio) Funktion von PrP PrP knockout Mäuse Neuroprotektivität von PrP Rolle von PrP in der Signaltransduktion Kupferbindung von PrP Missfaltung von PrP und Neurodegeneration PrP Sc führt nur in Anwesenheit von neuronal exprimiertem PrP C zur Neurodegeneration PrP-Mutanten führen in Abwesenheit von PrP Sc zu Neurodegeneration Maturierung und Faltung sekretorischer Proteine Proteinsynthese am ER Prozessierung der Proteine im ER und Golgi-Apparat Proteinfaltung, Qualitätskontrollmechanismen und Proteinabbau Calnexin-Zyklus ER-assoziierte Degradierung UPR Kotranslokationale Qualitätskontrolle Zielsetzung 39

6 Inhaltsverzeichnis 2 ERGEBNISSE Teil 1 - Translokation von PrP ins ER: die Rolle intrinsischer und zellulärer Faktoren Teil 1A - Generierung eines Mausmodells für die GSS-Mutante Q160X Generierung einer PrP-Q159X überexprimierenden transgenen Mauslinie Analyse der Proteinexpression transgener Q159X-Mäuse Analyse der mrna-levels transgener Q159X-Mäuse Zusammenfassung Teil 1B - Analyse der intrinsischen und zellulären Faktoren, die für eine effiziente Translokation von PrP ins ER notwendig sind Die C-terminale GPI-Signalsequenz ist für den ER-Import entbehrlich, spielt aber eine Rolle bei der Umwandlung von mannosereichen Glykanen in komplexe Glykane α-helikale Bereiche sind wichtig für einen effizienten ER-Import Die Einführung einer zusätzlichen N-terminalen Konsensussequenz für N-Glykosylierung erleichtert die Analyse des ER-Imports Die Effizienz des ER-Imports korreliert mit der Ausdehnung der α-helikalen Bereiche α-helikale Bereiche sind für einen effizienten ER-Import ausreichend A115X/31 CHO wird offensichtlich kotranslokational degradiert α 2 α 3 wird unabhängig von einer N-verknüpften Glykosylierung und der Ausbildung einer Disulfidbrücke erfolgreich ins ER importiert Die Länge und möglicherweise die Lage der α-helikalen Domänen modulieren den ER- Import Eine unglykosylierte Fraktion von 115α 2 α 3 wird nicht in das ER importiert sondern kotranslokational degradiert α-helikale Bereiche heterologer Proteine fördern den ER-Import von PrP In vitro Analyse des ER-Imports Effiziente heterologe ER-Signalsequenzen können den ER-Import unstrukturierter Polypeptide nicht fördern p58 IPK fördert die kotranslokationale Degradierung von sekretorischen Proteinen mit ausgedehnten unstrukturierten Bereichen am N-Terminus α 2 α 3 wird unter ER-Stressbedingungen vermindert in das ER importiert Zusammenfassung Teil 2 - Biochemische Charakterisierung von PrP-Homologen aus dem Zebrabärbling (Danio rerio) Generierung von zeprp1 und zesho2 und Expression in murinen Neuroblastomzellen zeprp1 und zesho2 werden ins ER importiert und N-glykosyliert zeprp1 und zesho2 werden mit einem GPI-Anker modifiziert und sind an der Außenseite der Plasmamembran lokalisiert Zusammenfassung 84

7 Inhaltsverzeichnis 3 DISKUSSION Teil 1 - Translokation von PrP ins ER: die Rolle intrinsischer und zellulärer Faktoren ER-Import von PrP: Die Rolle der N-terminalen Signalsequenz und der HD Die Sekundärstruktur ist ein Signal für effizienten ER-Import Wie kann die Sekundärstruktur Einfluss auf die Translokation ausüben? Die Regulation der Translokation - ein früher Qualitätskontrollmechanismus? Die physiologische Bedeutung der kotranslokationalen Qualitätskontrolle Die kotranslokationale Qualitätskontrolle - Implikationen für neurodegenerative Erkrankungen Teil 2 - Biochemische Charakterisierung von PrP-Homologen aus dem Zebrabärbling (Danio rerio) zeprp1 und zesho2 zeigen konservierte ko- und posttranslationale Modifikationen sowie eine konservierte zelluläre Lokalisierung Sho-Proteine haben möglicherweise eine PrP-ähnliche, protektive Funktion 95 4 ZUSAMMENFASSUNG 96 5 MATERIAL Biologisches Material Bakterienstämme Vektoren Zelllinien Antikörper Enzyme und Proteine Standardgrößenmarker für Proteine und Nukleinsäuren Synthetische Oligonukleotide Chemikalien/Reagentien Lösungen und Puffer Medien Kits Geräte Sonstige Materialien METHODEN 106

8 Inhaltsverzeichnis 6.1 Molekularbiologische Methoden Rekombinante Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Klonierung der Konstrukte für die Analyse des ER-Imports Generierung der transgenen Mäuse PrP-Q159X, Parkin und Parkin-W453X Klonierung der Zebrabärbling PrP-Homologen Herstellung kompetenter Bakterien Transformation kompetenter Bakterien DNA-Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien DNA-Präparation aus Mäuseschwanzspitzen (zur Genotypisierung) RNA-Präparation Sequenzierungen Zellbiologische Methoden Zellkultur Kultivierung von Zellen Passagierung Ausplattieren Transfektion Zellernte Protein- und Nukleinsäureanalytik Gesamtzelllysat Nachweis der Löslichkeit (Trennung des Lysats) Lysat aus Mäusegehirnen Proteinkonzentration nach Bradford SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Proteintransfer auf Nitrozellulose (Western Blot) Ponceau S Färbung Immundetektion von Proteinen Immunpräzipitation (IP) Radioaktive Markierung von Proteinen mit [ 35 S]-Methionin Autoradiodiagramme Behandlung mit proteasomalem Inhibitor MG Behandlung mit Thapsigargin Nachweis der Sekretion Analyse der Glykosylierung Nachweis von Oberflächenproteinen Northern Blotting In vitro Transkription/Translation und in vitro Import in ER-Mikrosomen Indirekte Immunfluoreszenz BIBLIOGRAPHIE 121

9 Inhaltsverzeichnis 8 GLOSSAR LEBENSLAUF VERÖFFENTLICHUNGEN 143

10 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Prion-Erkrankungen Einführung Prion-Erkrankungen sind in jedem Fall tödlich verlaufende, neurodegenerative Erkrankungen, die sowohl beim Tier als auch beim Menschen auftreten (Prusiner et al., 1998; Belay, 1999; Collinge, 2001; Collins et al., 2001). Sie werden aufgrund ihrer Übertragbarkeit (Transmissibilität) und ihrer Pathologie, einer schwammartigen (spongiformen) Degeneration des Gehirns, auch transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE) genannt. Eine spongiforme Vakuolisierung des Hirngewebes, die Bildung von missgefaltetem Prion-Protein, das teilweise in Form sogenannter Plaques im Gehirn zu finden ist, und astrozytäre Gliose sind die wichtigsten pathologischen Charakteristika der Krankheiten (siehe Abschnitt ). TSE, die sich durch eine lange Inkubationszeit und einen äußerst progressiven Krankheitsverlauf auszeichnen, können nicht nur sporadischen oder hereditären, sondern auch infektiösen Ursprungs sein. Die Infektiösität von Prion-Erkrankungen ist eine einzigartige Eigenschaft und unterscheidet sie von allen anderen neurodegenerativen Erkrankungen wie beispielsweise der Alzheimer- Krankheit, Huntington-Krankheit und Parkinson-Krankheit Prion-Erkrankungen beim Tier Scrapie Die erste Prion-Erkrankung wurde von Hirten vor über 200 Jahren bei Schafen in Großbritannien beschrieben (McGowan, 1922). Die Krankheit wurde Scrapie genannt, da ein charakteristisches Merkmal das Kratzen des Fells ist (engl. scrape, kratzen). Daneben zeigen die Schafe auch Verhaltensänderungen und motorische Einschränkungen wie schwankender oder trabend wirkender Gang (deshalb auch Traberkrankheit ). Nach drei bis sechs Monaten kommt es zum Tod der Tiere. Scrapie hat sich in Großbritannien rasch ausgebreitet wurde erstmals dokumentiert, dass es sich um eine übertragbare Krankheit handelt (Leopoldt, 1759), und in den folgenden Jahren begannen sich erste wissenschaftliche Arbeiten mit der Krankheit auseinanderzusetzen. Besnoit und Morel beschrieben 1898 neuronale Vakuolisierungen als charakteristische pathologische Veränderungen im Gehirn kranker Schafe (Besnoit, 1898). Die ersten erfolgreichen epidemiologischen Studien, bei denen gezeigt wurde, dass Scrapie übertragbar ist und die Inkubationsdauer ungewöhnlich lang dauert, wurden 1936 von Cuille und Chelle 1

11 Einleitung durchgeführt (Cuillé und Chelle, 1939). Die Forschung der darauf folgenden Jahre befasste sich immer mehr mit der Suche nach dem Krankheitserreger, der damals jedoch noch nicht identifiziert werden konnte. Besonders von Scrapie betroffen waren im frühen 20. Jahrhundert englische Suffolk-Schafe, die intensivem internationalen Handel unterlagen, was vermutlich für die Verbreitung von Scrapie in viele andere Länder verantwortlich war (Hourrigan, 1979). Die Meldepflicht für Scrapie wurde in England schließlich erst 1993 eingeführt, was, wie im nächsten Abschnitt beschrieben, möglicherweise fatale Folgen für den Menschen hatte Bovine spongiforme Enzephalopathie Erste Fälle der sogenannten bovinen spongiformen Enzephalopathie (BSE), einer bis dahin unbekannten Rinderkrankheit, wurden 1986 in Großbritannien beschrieben (Wells et al., 1987). Die von der Krankheit betroffenen Tiere konnten, ähnlich wie Scrapie-infizierte Schafe, ihre Bewegungen nicht mehr kontrollieren, waren ungewöhnlich schreckhaft und starben schließlich innerhalb von sechs bis zwölf Monaten nach Ausbruch der Krankheit. In Hirngewebeschnitten BSE erkrankter Rinder wurden zur Scrapie-Erkrankung ähnliche, lichtmikroskopisch sichtbare Durchlöcherungen festgestellt. In den Jahren nach der Entdeckung weitete sich die Krankheit in Großbritannien relativ schnell zu einer massiven Epidemie aus, deren Höhepunkt 1992 mit mehr als Fällen erreicht wurde. Die mögliche Ursache der Epidemie wurde 1988 erstmals publik. Es wurde und wird noch immer vermutet, dass das verwendete Rinderfutter, welches aus ökonomischen Gründen damals seit geraumer Zeit nur mehr ungenügend sterilisiert wurde, die Ursache sein könnte. Dieses Rinderfutter enthielt unter anderem Tiermehl, welches zumindest teilweise vom Schaf stammte und deshalb möglicherweise mit Scrapie-Erregern kontaminiert war (Wilesmith, 1988; Wilesmith et al., 1992). In Folge des 1988 von der britischen Regierung aufgestellten Verbots der Tiermehl- Verfütterung an Wiederkäuer ist die Zahl der BSE-Neuerkrankungen rückläufig. Während 2003 weltweit noch circa Fälle beschrieben wurden, konnten 2005 nur noch 500 und 2008 nur mehr circa 60 Krankheitsfälle festgestellt werden ( Einen Grund für die lange Dauer zwischen Verbot und sinkenden Zahlen der an BSE erkrankten Rinder könnte die lange Inkubationszeit von vier bis fünf Jahren darstellen. Obwohl die Epidemie ihren Höhepunkt überschritten zu haben scheint, ist das Ausmaß für die Konsumenten von möglicherweise infiziertem Rindermaterial nicht abzusehen. Es wird davon ausgegangen, dass BSE auf den Menschen oral übertragbar ist und zu einer fatalen humanen Prion- Erkrankung (nvcjk) führt (siehe Abschnitt 1.1.3; Collinge et al., 1996, Aguzzi und Weissmann, 1996; Hill et al., 1997, Bruce et al., 1997). 2

12 Einleitung Chronisch zehrende Hirschkrankheit Eine weitere Art der Prion-Erkrankung im Tier ist die chronisch zehrende Hirschkrankheit (engl. chronic wasting disease, CWD), die unter anderem den Maultierhirsch (Odocoileus hemionus), den Virginiahirsch (Odocoileus virginianus) und den nordamerikanischen Rothirsch (Cervus elaphus nelsoni) befallen kann (Williams, 2005; Johnson, 2005; Watts et al., 2006; Conner et al., 2008). CWD wurde erstmals 1967 in Colorado (USA) beschrieben, aber erst 1978 nach histopathologischer Analyse der Hirngewebe erkrankter Tiere als spongiforme Enzephalopathie diagnostiziert (Williams und Young, 1980; Williams und Young, 1982; Williams und Young, 1992). Die betroffenen Tiere magern stark ab, zeigen Verhaltensveränderungen, wankenden Gang und übermäßigen Speichelfluss bis sie nach einigen Wochen oder Monaten sterben. Im Gegensatz zu BSE und Scrapie tritt CWD auch in nicht domestizierten, frei lebenden Herden in ganz Nordamerika auf (Williams und Miller, 2002). Ein besonderer Risikofaktor besteht darin, dass diese Krankheit durch direkten Kontakt der Tiere, möglicherweise durch Speichel und Exkremente, horizontal übertragen werden kann und sich entsprechend schnell ausbreitet (Miller und Williams, 2003; Miller et al., 2004; Mathiason et al., 2006). Obwohl CWD intrazerebral auf Rinder, Schafe und Ziegen übertragen werden kann, konnte eine orale Übertragbarkeit auf Rinder oder den Menschen (noch) nicht nachgewiesen werden (Williams und Miller, 2002; Belay et al., 2004; Hamir et al., 2005; Hamir et al., 2006; Hamir et al., 2007). Neben den bereits beschriebenen Krankheiten gibt es noch eine Reihe anderer Prion- Erkrankungen im Tier. Eine Übersicht der bisher identifizierten Erkrankungen ist in Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1. Überblick über die spongiformen Enzephalopathien der Tiere. Name der Prion-Erkrankung Jahr und Ort der ersten Beschreibung Referenz Ursache betroffene Tierarten Scrapie 1732, GB Leopoldt, 1759 nicht bekannt Schaf, Ziege Transmissible Nerz Enzephalopathie Transmissible mink encephalopathy (TME) 1974, USA Hartsough und Burger, 1965 Infektion Nerz Chronisch zehrende Hirschkrankheit Chronic wasting disease (CWD) 1980, USA Williams und Young, 1980 nicht bekannt Hirsch Bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) 1986, GB Wells et al., 1987 Infektion Rind Exotische Huftier Enzephalopathie Exotic ungulate encephalopathy (EUE) 1986, GB Kirkwood et al., 1990 Infektion rinderartige Wiederkäuer im Zoo (Antilope) Feline spongiforme Enzephalopathie (FSE) 1990, GB Leggett et al., 1990 Infektion Haus- und Wildkatze 3

13 Einleitung Prion-Erkrankungen beim Mensch Auch beim Menschen treten Prion-Erkrankungen auf. Diese lassen sich in drei verschiedene ätiologische Gruppen unterteilen: sporadisch (unbekannten Ursprungs), vererbbar (hereditär) und übertragbar (infektiös). In Tabelle 2 sind alle bisher beschriebenen Prion-Erkrankungen beim Menschen, deren Jahr und Ort des ersten Auftretens sowie ihre Ätiologie zusammengefasst. Tabelle 2. Übersicht über die humanen Prion-Erkrankungen. Name der Prion-Erkrankung Jahr und Ort der ersten Beschreibung Referenz Ätiologie Sporadische Creutzfeldt-Jakob- Krankheit (scjk) 1920, Deutschland Creutzfeldt, 1920 Jakob, 1921 unbekannt Familiäre Creutzfeldt-Jakob- Krankheit (fcjk) 1924, Deutschland Kirschbaum 1924 Mutation im PrP-Gen Gerstmann-Sträussler-Scheinker Syndrom (GSS) 1928/1936, Österreich Gerstmann et al., 1928, 1936 Mutation im PrP-Gen Kuru 1957, Papua-Neuguinea Gadjusek und Zigas, 1957 ritueller Kannibalismus Iatrogene Creutzfeldt-Jakob- Krankheit (icjk) 1974, USA Duffy et al., 1974 Infektion durch ärztliche Behandlung Fatale Familiäre Insomnie (FFI) 1986, Italien Lugaresi et al., 1986 Mutation im PrP-Gen Neue Variante der Creutzfeldt- Jakob-Krankheit (nvcjk) 1996, GB Will et al., 1996 Infektion 1957 wurde in den östlichen Hochländern von Papua-Neuguinea von einer bislang noch nie beschriebenen, tödlich verlaufenden Krankheit berichtet. Diese epidemisch auftretende neurologische Erkrankung unter den eingeborenen Stämmen wurde von den Einheimischen Kuru, was soviel heißt wie Zittern vor Fieber, genannt (Gajdusek und Zigas, 1957). Erkrankte litten an Tremor, starken emotionalen Veränderungen und erst später im Verlauf der Krankheit an Symptomen der Demenz. Eine Besonderheit war, dass hauptsächlich Frauen und Kinder aber kaum Männer von der Krankheit betroffen waren (Alpers und Gajdusek, 1965). Im Jahre 1965 konnte die Infektiösität der Krankheit durch Übertragungsexperimente an Schimpansen bewiesen werden (Gajdusek und Gibbs, 1964; Gajdusek et al., 1966; Beck und Daniel, 1976; Hainfellner et al., 1997). Es wird vermutet, dass Kuru durch Endo-Kannibalismus übertragen wurde (Klitzman, 1984). Aus rituellen Gründen verzehrten die Eingeborenen, unter ihnen vor allem Frauen und Kinder, die Hirne verstorbener Stammesmitglieder. Aufgrund der Rezyklierung des Erregers innerhalb einer isolierten kleinen Gruppe nahm Kuru zeitweise epidemische Ausmaße an. Insgesamt sind seit 1957 knapp Menschen an Kuru gestorben (Prusiner, 1995), doch nach Verbot des Kannibalismus 1959 sank die Zahl der Neuansteckungen kontinuierlich. Heute sind nur mehr 4

14 Einleitung sehr wenige Fälle bekannt, wobei alle Betroffenen vor dem Verbot des Kannibalismus geboren worden sind. Im Jahre 1959 wurde erstmals durch den Veterinärmediziner Hadlow eine Ähnlichkeit mit der Schafkrankheit Scrapie aufgezeigt (Hadlow, 1959). Der Wissenschaftler Igor Klatzo, der die Gehirne mehrerer Kuru-Patienten nach deren Tod analysierte, stellte darüber hinaus fest, dass Kuru einer anderen humanen Erkrankung - der sogenannten Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJK) - stark ähnelt und es einen Zusammenhang zwischen all diesen Erkrankungen geben muss (Klatzo et al., 1959). Die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit wurde 1920/21 unabhängig voneinander von den zwei deutschen Neurologen Hans-Gerhard Creutzfeldt und Alfons Jakob erstmals beschrieben (Creutzfeldt, 1920; Jakob, 1921). Sie nannten Symptome wie Depressionen, Bewegungsstörungen, Muskelstarre, Schluckstörungen und als Haupterkennungszeichen einen sehr raschen Persönlichkeitsverfall mit Demenz. Die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit ist eine äußerst selten vorkommende Erkrankung. Pro Jahr werden nur circa 0,4-1,8 Fälle pro einer Million Menschen registriert (Prince et al., 2006). Grundsätzlich können verschiedene CJK-Varianten, darunter die sporadische CJK (scjk), die familiäre CJK (fcjk), die iatrogene CJK (icjk) und die neue Variante der CJK (nvcjk), unterschieden werden. Die häufigste CJK-Form ist die sporadische Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (scjk), die circa 85% aller CJK-Fälle darstellt (Johnson, 2005; Prince et al., 2006). Die Ursache von scjk ist nicht bekannt. Bis jetzt konnten keine exo- oder endogenen Auslöser identifiziert werden. Es existieren jedoch Hypothesen über mögliche sporadisch auftretende somatische Mutationen im Prion-Protein-Gen (PRNP) (siehe Abschnitt 1.2.3), seltene spontane Umfaltungen des Prion-Proteins oder aber unerkannte Infektionen, die scjk verursachen könnten (Aguzzi et al., 2008). Die familiäre Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (fcjk) gehört zu den vererbbaren Prion- Erkrankungen, die circa 15% aller Fälle ausmachen. fcjk wird durch Keimbahnmutationen im PRNP hervorgerufen und autosomal dominant vererbt. In den von der Krankheit betroffenen Familien wurden eine Reihe verschiedener Punkt-, Deletions- oder Insertionsmutationen identifiziert (Abb. 1). Bemerkenswerterweise finden sich die meisten Mutationen im gut strukturierten C-Terminus von PrP (vgl. Abschnitt 1.2.5; Hsiao et al., 1989; Dlouhy et al., 1992; Petersen et al., 1992; Poulter et al., 1992; Gabizon et al., 1993). Das Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS) und die Fatale Familiäre Insomnie (FFI) werden ebenfalls durch Mutationen im PRNP ausgelöst (Hsiao et al., 1989; Medori et al., 1992). 5

15 Einleitung Abb. 1. Überblick über Mutationen im Prion-Protein-Gen (PRNP), die familiäre Creutzfeldt-Jakob-Krankheiten auslösen. Schematische Darstellung des PRNP mit oberhalb eingezeichneten pathogenen Mutationen sowie mit unterhalb eingezeichneten polymorphen Varianten. OPRI, Oktapeptidrepeat-Insertation, OPRD, Oktapeptidrepeat- Deletion. Abbildung modifiziert aus (Mead, 2006). Die dritte Gruppe der Prion-Erkrankungen ist die infektiöse Form, die weniger als 1% aller Fälle darstellt und die sogenannte iatrogene Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (icjk) sowie die neue Variante der Creutzfeldt-Jakob Krankheit umfasst. icjk, seit 1974 bekannt, wird durch medizinische Unfälle ausgelöst (Duffy et al., 1974). In den 1980er Jahren wurden Hormonpräparate wie das humane Wachstumshormon aus Hypophysen von Leichen extrahiert und therapeutisch eingesetzt. Da sich unter diesen Leichen auch ein CJK-Fall befunden hat, erkrankten in Folge mehr als 100 Patienten, die damals dieser Hormontherapie unterzogen wurden, innerhalb von ein bis zwei Jahren an icjk. Nach der Einführung der Produktion von rekombinantem Wachstumshormon nahm die Zahl der Neuinfektionen deutlich ab, doch noch immer tauchen vereinzelt icjk-fälle auf. Seltener gingen icjk-fälle auf die Verwendung kontaminierter chirurgischer Instrumente oder auf die Transplantation von infiziertem Gewebe wie der äußeren Hirnhaut oder der Cornea zurück (Duffy et al., 1974; Bernoulli et al., 1977; Kondo und Kuroiwa, 1982; Davanipour et al., 1984) tauchte eine neue Form humaner spongiformer Enzephalopathien in Großbritannien auf. Die sogenannte neue Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (nvcjk) wird ebenfalls durch Infektion erworben und geht höchstwahrscheinlich auf eine orale Übertragung mit BSE-infektiösem Material zurück (siehe Abschnitt ; Collinge et al., 1996; Aguzzi und Weissmann, 1996; Hill et al., 1997; Bruce et al., 1997). Bisher wurden über 160 Fälle der 6

16 Einleitung nvcjk in Großbritannien und einige wenige Fälle weltweit registriert ( Obwohl die befürchtete Epidemie bisher ausblieb, kann aufgrund der langen und variablen Inkubationszeiten von Prion-Erkrankungen nicht vorhergesagt werden, welche Auswirkungen die BSE-Epidemie in den folgenden Jahren noch auf den Menschen haben könnte. Es gibt Hinweise darauf, dass Prion-Erkrankungen über das Blut übertragen werden (Houston et al., 2000; Hunter und Houston, 2002) und einzelne Fälle von vcjk wurden bereits mit kontaminierten Bluttransfusionen in Zusammenhang gebracht (Llewelyn et al., 2004; Peden et al., 2004; Aguzzi und Glatzel, 2004; Wroe et al., 2006). Dementsprechend könnte die Kontamination von Blutprodukten mit infektiösem Material das Risiko für TSE-Infektionen beim Menschen maßgeblich erhöhen Pathologie und Symptomatik humaner Prion-Erkrankungen Prion-Erkrankungen sind durch lange Inkubationszeiten, einen äußerst progressiven Krankheitsverlauf und vor allem sehr komplexe Ätiologien charakterisiert. Unter den verschiedenen Formen der CJK bestehen Unterschiede in der Krankheitsdauer, der Symptomatik und dem neuropathologischen Bild. Während die sporadischen Formen der CJK im Durchschnittsalter von 60 Jahren und das zu fcjk zählende GSS mit durchschnittlich 45 Jahren ausbricht, wird nvcjk bei verhältnismäßig jungen Patienten im Durchschnittsalter von 29 Jahren festgestellt. Kuru tritt in einem Alter zwischen vier und 60 Jahren auf, was wahrscheinlich mit der Variabilität der Erregermenge, dem Zeitpunkt der Exposition und dem Infektionsweg zusammenhängt. Während die durchschnittliche Dauer zwischen dem Ausbruch der Krankheit und dem Tod bei scjk nur zwei bis drei Monate, bei nvcjk durchschnittlich 14 und bei Kuru ungefähr 12 Monate beträgt, ist die Krankheitsdauer bei GSS mit durchschnittlich fünf Jahren außergewöhnlich lang (Johnson und Gibbs, 1998; Collinge, 2001). Auch die Symptomatik ist sehr vielfältig. CJK ist vor allem durch Demenz und erst später durch Koordinationsstörungen charakterisiert, während dies bei Kuru zeitlich genau umgekehrt ist. Im Gegensatz dazu zeichnet sich FFI durch progressive Schlaflosigkeit und Störung des vegetativen Nervensystems aus. Vor allem Bewegungs- aber auch Sprachoder Sehstörungen zählen zu den anfänglichen Symptomen humaner Prion-Erkrankungen, während Persönlichkeitsveränderungen und Gedächtnisstörungen erst im weiteren Verlauf festzustellen sind (Wadsworth und Collinge, 2007). Letztendlich führt der totale Ausfall des Großhirns zum Tod der Patienten. Die neuropathologischen Veränderungen von Prion-Erkrankungen inkludieren unter anderem eine Vakuolisierung des Hirngewebes, astrozytäre Gliose und Ablagerungen von PrP, 7

17 Einleitung sogenannte Plaques, die sehr charakteristisch für die verschiedenen Krankheiten sein können (Abb. 2). Abb. 2. Neuropathologische Veränderungen bei Prion-Erkrankungen. Charakteristische histologische Merkmale eines CJK-Patienten umfassen unter anderem (A) spongiforme Veränderungen, (B) Astrogliose und (C) Prion-Protein-Ablagerungen. Gezeigt sind eine Hämatoxylin-Eosin Färbung (A) und immun-histochemische Färbungen unter Verwendung eines anti-gfap Antikörpers (B) und eines anti-prion-protein Antikörpers (C). Abbildung modifiziert aus (Glatzel und Aguzzi, 2001). So gibt es die sogenannten Kuru-Plaques, die sehr homogene Ablagerungen darstellen, und ihrem Namen nach sehr oft bei Kuru-Patienten zu finden sind, während sie bei scjk nur in 15% aller Fälle vorkommen (Klatzo et al., 1959). Des Weiteren finden sich multizentrische oder auch Korkarden-Plaques vor allem bei GSS-Patienten (Brown, 1992) und die ungewöhnlichen Florid-Plaques ausschließlich bei nvcjk-fällen (Will et al., 1996). Namensgebend für letztere Plaque-Art ist ein Ring von spongiformen Veränderungen der die Plaques umgibt und dessen Form an eine Blüte (lat. floridus, blühend) erinnern soll (Abb. 3). Abb. 3. Immunhistochemische und fluoreszenzmarkierte Färbung verschiedener Plaque-Formen humaner Prion-Erkrankungen. Gezeigt sind Gewebeschnitte des Kleinhirns eines scjk-patienten (Kuru-Plaques, a, b), eines GSS-Patienten (multizentrische Plaques, c, d) sowie eines nvcjk-patienten (Florid-Plaques, e, f). 8

18 Einleitung Immunhistochemische Färbung der Prion-Protein-Ablagerung mittels 3F4 Antikörper (a, c, e). Plaque-Färbung mit 2-(1-(6-[(2-Fluoroethyl)(Methyl)Amino]-2-Naphthyl) Ethyliden) Malononitril (FDDNP) (b, d, f). Abbildung aus (Bresjanac et al., 2003). 1.2 Das Prion-Protein Identifikation des infektiösen Agens Die Übertragbarkeit von Prion-Erkrankungen wurde schon früh vermutet und konnte im Laufe der Jahre experimentell bestätigt werden. Über den Erreger war man sich jedoch lange Zeit unklar. Ursprünglich hielt man Viren oder das sogenannte Slow Virus für den Auslöser von Prion-Erkrankungen (Sigurdsson, 1954). Die beobachtete Resistenz des übertragbaren Agens gegenüber ultravioletter und ionisierender Strahlung widersprach jedoch einem Virus als Erreger (Alper et al., 1967). Schließlich gelang es Stanley Prusiner und seinen Kollegen eine ausreichend reine, infektiöse Fraktion aus Hirnextrakten experimentell infizierter Hamster zu isolieren. Sie stellten fest, dass die Infektiösität dieser Extrakte zwar nicht durch die Behandlung mit Nukleinsäure-schädigenden Verfahren, jedoch mit Substanzen, die Proteine abbauen oder deren natürliche Faltung beeinflussen, verringert werden konnte (Prusiner et al., 1981; Prusiner, 1982). Diese Ergebnisse untermauerten eine schon früher aufgestellte Hypothese eines proteinartigen Krankheitserregers ohne Nukleinsäure (Griffith, 1967). Stanley Prusiner führte den Namen Prion [pri:on] als Abkürzung für proteinaceous infectious particle (engl. für proteinartiges, infektiöses Partikel) ein, um diesen neuartigen Erreger von Viren oder Bakterien abzugrenzen. Wegen der leichteren Aussprache wurde die Abkürzung Proin in Prion abgeändert. Die damals aufgestellte Hypothese besagt, dass das Prion-Krankheiten verursachende infektiöse Agens ein missgefaltetes Protein sei, das in Abwesenheit von Nukleinsäuren propagieren könne (Prusiner, 1982). Bis heute fehlt allerdings der endgültige Nachweis dieser Hypothese. Ein Protease-resistentes, Detergens-unlösliches kda großes Glykoprotein wurde im Jahre 1982 in Gehirnhomogenaten von Scrapie-infizierten Hamstern gefunden (Bolton et al., 1982) und als Protease-resistenter Kern des infektiösen Agens identifiziert. Es wurde Prion- Protein (PrP) und aufgrund seiner Größe PrP27-30 genannt (Prusiner et al., 1984). Schließlich gelang mit einer von diesem isolierten Protein abgeleiteten DNA-Sonde die Identifizierung des für PrP kodierenden Gens (PRNP) (Oesch et al., 1985). Erstaunlicherweise wurde die PrP-mRNA sowohl in Scrapie-infizierten als auch in uninfizierten, gesunden Geweben gefunden (Chesebro et al., 1985). In unifizierten Tieren wurde jedoch nur Protease-sensitives, Detergens-lösliches PrP entdeckt, welches daraufhin zelluläres Prion-Protein (engl. cellular PrP, PrP C ) genannt wurde (Oesch et al., 1985). 9

19 Einleitung Weitere Experimente zeigten, dass dieses Protein auch im Menschen exprimiert wird (Oesch et al., 1985; Chesebro et al., 1985; Basler et al., 1986; Stahl et al., 1993). Man kam zu dem Schluss, dass zwei verschiedene Formen des Proteins existieren. Neben dem unter physiologischen Umständen vorkommenden zellulären PrP musste eine aberrante, pathogene sogenannte Scrapie-Form (PrP Sc ) vorhanden sein. Viele Versuche die Prion-Hypothese zu widerlegen und Viren als Erreger zu etablieren scheiterten, doch die genaue Zusammensetzung des infektiösen Agens ist nach wie vor nicht geklärt. Nukleinsäuren, die länger als 25 Nukleotide lang sind, konnten zwar als essentielle Komponente infektiöser Einheiten (Prionen) ausgeschlossen werden (Safar et al., 2005), doch enthalten die heute reinsten, infektiösen Prionen-Präparationen neben ihrem Hauptbestandteil PrP Sc noch signifikante Mengen an spezifischen Lipiden und Kohlehydraten (Klein et al., 1998; Appel et al., 1999; Dumpitak et al., 2005) Unterschiede zwischen PrP C und PrP Sc und Konversionsmodelle PrP C und PrP Sc besitzen zwar die gleiche Aminosäure (AS)-Sequenz und gleiche posttranslationelle Modifikationen, unterscheiden sich aber grundlegend in biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften wie ihrer Löslichkeit, Stabilität und Struktur. Während PrP C hauptsächlich in α-helikaler Struktur vorliegt, Proteinase K (PK)-sensitiv und in nicht-ionischen Detergentien löslich ist, weist die krankheitsassoziierte, infektiöse Form PrP Sc einen hohen Anteil an β-faltblattstrukturen auf und zeigt die Tendenz unlösliche, PKresistente Aggregate zu bilden (Caughey und Raymond, 1991; Gasset et al., 1993; Pan et al., 1993). Die Unterschiede in ihrer Sekundärstruktur geben Anlass zur Annahme, dass die pathogene Isoform PrP Sc ein posttranslationell gebildetes Konformationsisomer von PrP C darstellt und durch Konversion aus der zellulären Isoform entsteht. Es wird vermutet, dass die Konversion von PrP Sc aus PrP C an der Zelloberfläche oder in endosomalen Kompartimenten stattfindet (Caughey und Raymond, 1991; Borchelt et al., 1992; Taraboulos et al., 1995). Der exakte Mechanismus dieser Umwandlung ist bisher noch nicht bekannt, es gibt jedoch verschiedene Erklärungsmodelle. Das Heterodimer-Modell, das von einer direkten Interaktion der beiden Konformationsisomere während der Umwandlung ausgeht (Prusiner et al., 1990), besagt, dass je ein PrP Sc -Molekül ein PrP C -Molekül bindet und umformt (Abb. 4). Eine Aggregation der pathologischen Isoform ist dafür unnötig (Prusiner, 1991). Dagegen wird beim Nukleationskeim-Modell (engl. seeding model) ein Kristallisationskeim benötigt und es wird vermutet, dass PrP Sc -Aggregate bestimmter Mindestgröße diesen Keim darstellen und es ohne sie zu keiner Konversion kommen kann (Jarrett und Lansbury, 1993). 10

20 Einleitung Abb. 4. Hetero-Dimermodell der Konversion. In einer autokatalytischen Reaktion mittels Bildung eines Heterodimers wird durch direkten Kontakt zwischen PrP C und PrP Sc jeweils ein PrP C -Molekül in ein PrP Sc -Molekül umgefaltet. Mehrere PrP Sc -Moleküle gemeinsam mit einem geringen Anteil an Lipiden und Polysacchariden bilden die infektiöse Einheit (Prion). Vor einigen Jahren konnten erstmals aus rekombinantem PrP in vitro infektiöse Prionen hergestellt werden, die nach intrazerebraler Inokulation zu histopathologischen und neurologischen Veränderungen, zur Propagierung von PK-resistentem PrP Sc im Gehirn und schließlich zum Tod der Tiere führten. Es konnten jedoch nur transgene Mäuse mit den synthetischen Prionen infiziert werden, die eine verkürzte PrP-Form (PrP89-231) stark überexprimieren (Legname et al., 2004). Auch mit der Methode der sogenannten PMCA (engl. protein misfolding cyclic amplification) konnten infektiöse Prionen in vitro generiert werden (Saborio et al., 2001). In mehreren Zyklen wurde hierbei aus einer geringen Menge an Hamster-PrP Sc, welches als Matrize diente, PrP C aus Gehirnhomogenat in PK-resistentes PrP Sc konvertiert. Der dabei amplifizierte Aggregationskeim wurde durch Ultraschallbehandlung immer wieder aufgelöst, um PrP Sc für eine erneute Umfaltung freizusetzen. Entstandene infektiöse Prionen konnten auf Mäuse übertragen und weiter propagiert werden. Bei der PMCA mit Gehirnhomogenaten kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass für die in vitro Konversion zelluläre Faktoren essentiell sind, die in dem Ausgangshomogenat vorhanden sind PrP- und PrP-ähnliche Gene Die Gene, die humanes, Maus- oder Hamster-PrP kodieren, wurden 1985/86 kloniert (Oesch et al., 1985; Locht et al., 1986; Liao et al., 1986; Kretzschmar et al., 1986; Basler et al., 1986). Das PrP-Gen wurde im Mensch auf dem Chromosom 20 (Sparkes et al., 1986) und in der Maus auf dem Chromosom 2 gefunden. Wie humanes PRNP besteht auch das Maus- Prnp aus drei Exons, wobei sich der gesamte offene Leserahmen im Exon 3 befindet. Es kodiert PrP mit 255 Aminosäuren (AS) (Abb. 5; Oesch et al., 1985; Westaway et al., 1994), das ab dem frühen Embryonalstadium in fast allen Geweben exprimiert wird. Die höchste Expression findet sich in den Neuronen des Zentralnervensystems (ZNS) (Kretzschmar et 11

21 Einleitung al., 1986), aber auch im lymphatischen Gewebe und im Muskel wird PrP in größeren Mengen exprimiert (Bendheim et al., 1992). Neben PrP wurden noch zwei Paraloge gefunden. Das erste wurde eher indirekt entdeckt, als einige Stämme der PrP knockout Mäuse phänotypische Anomalitäten wie späten Ausbruch von Ataxie oder Verlust der Purkinjen Zellen im Zerebellum aufwiesen, während andere dies nicht taten (Sakaguchi et al., 1996; Moore et al., 1999; Rossi et al., 2001). Nach genauer Analyse zeigte sich, dass in einigen transgenen Vektoren der Prnp-Lokus zufällig derart deletiert wurde, dass ein anderes Gen 16 Kilobasen abwärts von Prnp unter die Kontrolle des Prnp-Promoters gestellt und somit im ZNS exprimiert wurde, was zu dem oben genannten neurodegenerativen Phänotyp führte. Das zu diesem Gen (Prnd) gehörige Protein wurde Doppel (Dpl) genannt. Der offene Leserahmen liegt wie PrP auf einem Exon und kodiert ein Protein mit 179 AS (Abb. 5). Dpl wird im Gegensatz zu PrP nur in geringem Maße und hauptsächlich während der Embryonalentwicklung im ZNS exprimiert (Moore et al., 1999). Vorwiegend kommt es im Hoden vor, weshalb seine Funktion eng mit der Reproduktivität zusammenzuhängen scheint. Um die physiologische Funktion von Dpl zu untersuchen, wurden homozygote Dpl knockout Mäuse generiert. Das Fehlen des Proteins verursachte männliche Sterilität. Als Ursachen konnte eine verminderte Anzahl und Immobilität sowie Missbildung der Spermatiden festgestellt werden (Behrens und Aguzzi, 2002, Paisley et al., 2004). Über welche Mechanismen die Überexpression von Dpl im ZNS Neurodegeneration induziert, ist bisher allerdings noch nicht geklärt. Das dritte PrP-ähnliche Gen wurde erst kürzlich durch Datenbank-Analysen über eine kurze, aber stark homologe DNA-Sequenz zu PrP entdeckt. Es handelt sich hierbei um das Sprn- Gen, welches auf dem Maus-Chromosom 7 lokalisiert liegt und das 148 AS lange Protein Shadoo (japanisch für Schatten) kodiert. Wie Prnp und Prnd liegt der offene Leserahmen auf einem Exon (Abb. 5) und wie PrP wird Shadoo (Sho) hauptsächlich im ZNS exprimiert (Premzl et al., 2003). Da es sich um ein erst kürzlich gefundenes Protein handelt, ist über seine physiologische Funktion noch relativ wenig bekannt. Es wird aber vermutet, dass es, ähnlich zu PrP, eine neuroprotektive Funktion in der Zelle haben könnte (vgl. Abschnitt 1.3.2). Die Expression der beiden Proteine überlappt sich, doch interessanterweise ist Sho im Gehirn genau dort am höchsten exprimiert, wo PrP die geringste oder keine Expression zeigt, in Purkinjen Zellen im Zerebellum und in den dendritischen Ausläufern der hippocampalen pyramidalen Zellen (Watts und Westaway, 2007, Watts et al., 2007). 12

22 Einleitung Abb. 5. Schematische Darstellung der murinen Gene, die die Proteine PrP, Dpl und Sho kodieren. Prnp und Prnd sind auf Chromosom 2 der Maus lokalisiert während Sprn auf Chromosom 7 zu finden ist. Der offene Leserahmen aller drei Gene liegt auf einem Exon. Abbildung modifiziert aus (Watts und Westaway, 2007) Biogenese und zelluläre Lokalisierung von PrP PrP zählt zu den sekretorischen Proteinen (allgemeine Beschreibung der Biogenese sekretorischer Proteine vgl. Abschnitt 1.5). Die Biogenese beginnt mit der Synthese eines 255 AS langen Vorläuferproteins, das eine hydrophobe, N-terminale Erkennungssequenz aufweist. Diese 22 AS lange ER-Signalsequenz (ER-SS) wird während des kotranslationalen Imports in das endoplasmatische Retikulum (ER) von der sogenannten Signalpeptidase (SPase) abgespalten. An den Positionen N180 und N196 werden unterdessen Kernglykane mit dem Protein verknüpft (Endo et al., 1989; Haraguchi et al., 1989; Rudd et al., 1999; Stimson et al., 1999). Nachdem PrP vollständig ins ER transloziert ist, wird die C-terminale, hydrophobe, 23 AS lange Erkennungssequenz abgespalten und durch einen Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-Anker ersetzt (Stahl et al., 1987; Stimson et al., 1999). Bei dem auf diese Weise modifizierten Protein bildet sich zwischen den AS C178 und C213 eine Disulfidbrücke. In Folge wird PrP weiter in den Golgi-Apparat transportiert, wo die Kernglykane zu komplexen Glykanen umgewandelt werden. Schließlich wird PrP in Vesikeln zur Zelloberfläche transportiert, wo es, bedingt durch den GPI-Anker, in Detergensresistenten Membranen (DRM, lipid rafts) zu finden ist (Harmey et al., 1995). An der Außenseite der Plasmamembran lokalisiertes PrP wird über Clathrin-vermittelte Endozytose oder über kaveoläre Strukturen internalisiert und kann dann entweder lysosomal abgebaut oder wieder an die Zelloberfläche rezykliert werden (Abb. 6; Shyng et al., 1994; Peters et al., 2003; Sunyach et al., 2003). 13

23 Einleitung Abb 6. Biogenese von PrP. (1) PrP wird an freien Ribosomen im Zytosol gebildet. Das Signalerkennungspartikel (SRP) bindet an die N-terminale Signalsequenz (SS) und führt die naszierende Polypeptidkette zum Sec61-Komplex (Translokon). (2) PrP wird kotranslational in das endoplasmatische Retikulum (ER) importiert. Während des Imports wird die SS durch die Signalpeptidase (SPase) abgespalten. (3) Die Oligosaccharyltransferase (OST) verknüpft zwei Kernglykane mit der naszierenden Peptidkette. (4) Im ER erfolgt die Faltung von PrP unter Ausbildung einer Disulfidbrücke. Des Weiteren wird die C-terminale Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-Ankersequenz durch einen GPI-Anker ersetzt und PrP damit in der Membran verankert. (5) Im Golgi-Apparat werden die Kernglykane in komplexe Glykane umgewandelt und über vesikulären Transport gelangt PrP zur Zelloberfläche, wo es in Detergens-resistenten Membranen an der Außenseite der Plasmamembran lokalisiert ist. (6) PrP kann internalisiert und entweder im Lysosom abgebaut oder wieder zurück zur Zelloberfläche transportiert werden Struktur von PrP Die dreidimensionale Struktur von rekombinant in E.coli hergestelltem und aufgereinigtem PrP (AS ) wurde von der Gruppe um Kurt Wüthrich mittels NMR aufgeklärt (Riek et al., 1996; Riek et al., 1997). Es wurde gezeigt, dass PrP eine selbstständig faltende, globuläre C-terminale Domäne (AS , Abb. 7) und eine unter den für die NMR- Analyse bestehenden Bedingungen unstrukturierte, nicht faltende N-terminale Domäne (AS ) besitzt. Die globuläre Domäne umfasst zwei antiparallele β-stränge, die ein kurzes β-faltblatt ausbilden und drei α-helices. Helix 1 wird durch die beiden β-stränge eingeschlossen, während Helix 2 und 3 durch die Disulfidbrücke miteinander verbunden sind. Die AS-Ketten der α-helices 2 und 3 und die des β-faltblatts bilden zusammen den stabilen hydrophoben Kern von PrP (Riek et al., 1998). Im Gegensatz zu PrP C konnte bis 14

24 Einleitung heute die Struktur von PrP Sc, unter anderem wegen seiner hohen Unlöslichkeit, nicht geklärt werden. Abb 7. NMR-Struktur von murinem PrP. Gezeigt ist die globulär gefaltete C-terminale Domäne (AS ) mit zwei antiparallelen β-strängen (grün) und drei α-helices (violett). Abbildung aus (Riek et al., 1996). Ein weiteres strukturelles Charakteristikum ist die Oktarepeat (OR)-Region (engl. repeat, Wiederholung) am N-Terminus von PrP, welche die AS-Sequenz PHGGGWGQ fünfmalig wiederholt umfasst. Diese Domäne kann an den Histidin-Aminosäureresten Kupfer-Ionen binden (siehe Abschnitt 1.3.4). Daneben weist PrP noch eine hydrophobe Domäne (HD), die die AS miteinschließt, auf (Abb. 8). Abb. 8. Schematische Darstellung des Vorläuferproteins und der maturen Form von PrP. Gezeigt sind die strukturellen Domänen und posttranslationale Modifikationen von PrP. (A) Vorläuferprotein mit N- und C-terminaler Signalsequenzen für ER-Import (grau) und GPI- Verankerung (schwarz) sowie die Oktarepeat-Region (OR, blau) und die hydrophobe Domäne (HD, grün). (B) In der maturen Form von PrP findet sich ein N-terminaler ungefalteter Bereich (AS ) und ein C-terminaler, globulär gefalteter Bereich (AS ), der zwei β-stränge (β1 und β2) und drei α-helices (α1-3) besitzt. PrP wird außerdem durch komplexe Glykane (CHO), eine Disulfidbrücke (S-S) und einen GPI-Anker modifiziert. 15

25 Einleitung Eine Analyse des paralogen Proteins Dpl, dem verglichen mit PrP fast der gesamte N- terminale Bereich und somit die Repeat-Region und die HD fehlt, ergab, dass die allgemeine Sequenzhomologie ziemlich gering ist. Interessanterweise ist jedoch die NMR-Struktur der globulär gefalteten C-terminalen Domäne nahezu identisch mit PrP (Abb. 9) (Luhrs et al., 2003; Colacino et al., 2006). Abb. 9. Vergleich der Domänen und Strukturen zwischen PrP und Dpl. (A) Schematische Darstellung der Protein-Domänen in PrP und Dpl. Gezeigt sind die strukturellen Domänen und posttranslationale Modifikationen (Beschriftungen und Abkürzungen siehe Abb. 8) (B) Dreidimensionales Modell der Strukturen von PrP (rot) und Dpl (blau). Abbildung aus (Colacino et al., 2006) PrP und verwandte Proteine im Zebrabärbling (Danio rerio) PrP ist ein hoch konserviertes Protein. Es wurde in verschiedenen Spezies, von höheren Säugetieren über Vögel und Reptilien bis hin zu Amphibien, gefunden. Ein Vergleich der AS- Sequenzen zeigt eine Homologie von über 90% zwischen Mensch (Homo sapiens), Maus (Mus musculus) und Rind (Bos taurus). Huhn (Gallus gallus), Schildkröte (Trachemys scripta) und Frosch (Xenopus laevis) teilen sich immerhin noch circa 30% ihrer AS mit humanem PrP (Schatzl et al., 1995; Wopfner et al., 1999, Gabriel et al., 1992; Harris et al., 1991; Simonic et al., 2000; Strumbo et al., 2001). Die grundsätzliche Anordnung der strukturellen Domänen und posttranslationalen Modifikationen wie der Disulfidbrücke und der N-verknüpften Glykosylierungsseiten, ist in diesen Organismen in etwa gleich. Die HD ist die am stärksten konservierte Domäne, während die N-terminale Repeat-Region bezüglich ihrer Länge und Wiederholungssequenz von Spezies zu Spezies stark variieren kann. Auch die dreidimensionale Struktur von PrP ist vom Menschen bis hin zu den Amphibien hoch konserviert (Lopez Garcia et al., 2000; Wuthrich und Riek, 2001; Lysek et al., 2005). So weist PrP aus Xenopus laevis zwar nur mehr eine geringe Sequenzhomologie zum 16

26 Einleitung Säugetier-PrP auf, die NMR-Struktur ist dennoch außergewöhnlich ähnlich (Calzolai et al., 2005). Vor einigen Jahren wurden auch in verschiedenen Fischarten homologe Proteine zu PrP gefunden (Gibbs und Bolis, 1997; Suzuki et al., 2002; Oidtmann et al., 2003; Rivera-Milla et al., 2003; Favre-Krey et al., 2007). Die Identifikation der neu entdeckten Proteine erfolgte über die hoch konservierte Sequenz der HD, die nahezu identisch zu der von humanem PrP ist. Im Zebrabärbling (Danio rerio, engl. zebrafish), der zu den Knochenfischen zählt, wurde die cdna zweier, möglicherweise duplizierter, langer Isoformen gefunden. Im Folgenden werden diese beiden Formen Zebrabärbling PrP 1 und 2 (zeprp1 und zeprp2) genannt. Die AS-Sequenzhomologie zu humanem PrP beträgt weniger als 25%. Dennoch scheint eine gewisse Ähnlichkeit im Aufbau der Proteinmotive vorhanden zu sein. ZePrP1 und zeprp2 beinhalten laut Sequenzanalysen eine N-terminale Repeat-Region und eine HD. Eine putative ER- und GPI-SS, eine Disulfidbrücke und Glykosylierungsmotive wurden ebenfalls anhand bioinformatischer Programme vorhergesagt. Verglichen mit Säugetier-PrP fällt jedoch ihre Länge mit 606 beziehungsweise 567 AS auf, die unter anderem auf die deutlich längere Repeat-Region zurückzuführen ist. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass zeprp1 und zeprp2 während des Embryonalstadiums des Zebrabärblings im ZNS exprimiert werden (Cotto et al., 2005, Abb. 10). Zusätzlich wurden auch hoch konservierte Homologe zu Säugetier-Sho in verschiedenen Fischarten gefunden. Analog zu PrP ist auch bei dem Protein Sho eine Sequenzhomologie von circa 90% zwischen den Säugetier-Spezies zu finden (Uboldi et al., 2006). Wie auch bei anderen Fischarten hat der Zebrabärbling durch Gen-Duplikation zwei Isoformen dieses Proteins, die im Folgenden zesho1 und zesho2 genannt werden. Sie haben, verglichen mit humanem PrP, eine nur sehr geringe Sequenzhomologie, sind viel kürzer (132 und 135 AS) und die Repeat-Region beinhaltet nur wenige, kurze, basische Repeats. Trotzdem wurde mittels bioinformatischer Programme eine ER- und GPI-SS und eine mögliche Glykosylierungsstelle vorhergesagt (Premzl et al., 2003; Premzl et al., 2004; Abb. 10). Schließlich wurde noch ein drittes Protein in Fischen identifiziert, welches im Bereich der HD eine starke Sequenzhomologie zu PrP aufweist. Demzufolge wurde es PrP3 genannt, doch abgesehen von dieser Homologie und der vorhergesagten putativen ER- und GPI-SS zeigt dieses Protein keine weiteren Ähnlichkeiten zu PrP oder Sho. Im Gegensatz zu den anderen PrP- und Sho-Isoformen in Fischen, konnte überdies keine Expression im ZNS detektiert werden (Cotto et al., 2005). 17

27 Einleitung Abb. 10. Schematische Darstellung der im Zebrabärbling gefundenen PrP-Formen im Vergleich zu Maus-PrP. Eingezeichnet sind die OR-Region in Maus-PrP beziehungsweise die längeren Repeat-Regionen (R) in zeprp1 und zeprp2 (blau) sowie die davon abweichenden sehr kurzen basischen Repeat-Regionen in den Sho-Proteinen (türkis). Allen Proteinen gemeinsam ist die stark konservierte HD (grün), die ER-SS (grau), die GPI-SS (schwarz) und zumindest eine mögliche Glykosylierungsstelle (CHO). Interessanterweise konnten für die lange PrP-Isoform aus dem Kugelfisch (Fugu rubripes), die große Sequenzhomologie mit den Zebrabärbling-Isoformen zeprp1 und zeprp2 aufweist, keine NMR-Daten generiert werden. Obwohl das untersuchte Fisch-PrP exprimiert werden konnte, wurde keine dreidimensionale Struktur gefunden. Da analoge Faltungsbedingungen zu den bisher aufgeklärten PrP-Strukturen verwendet wurden, kann vermutet werden, dass die langen Fisch-PrP Isoformen trotz der ähnlichen Proteinmotive keine oder eine von den anderen Spezies stark abweichende C-terminale Struktur aufweisen (Christen et al., 2008). 1.3 Funktion von PrP PrP knockout Mäuse Wie im vorigen Abschnitt erwähnt, zeigt PrP von Säugetieren bis hin zu Amphibien große Ähnlichkeiten in der Anordnung der Proteindomänen, der posttranslationalen Modifikationen 18

28 Einleitung und in der dreidimensionalen Struktur. Aufgrund dieser Tatsache lässt sich eine konservierte physiologische Funktion von PrP vermuten. Bislang ist diese Funktion jedoch noch weitgehend unbekannt. Die Analyse von PrP-defizienten Mäusen (Prnp 0/0 - oder knockout Mäusen) ergab, dass sich diese normal entwickeln und keine signifikanten Verhaltensanomalitäten zeigen (Büeler et al., 1992; Manson et al., 1994). Als phänotypische Erscheinungsbilder konnten lediglich eine geringe Veränderung im Schlaf-Wach-Rhythmus, Anomalitäten in der synaptischen Physiologie und bei elektrophysiologischen Parametern sowie leichte Störungen in der Myelinisierung festgestellt werden (Collinge et al., 1994; Tobler et al., 1996; Vassallo und Herms, 2003). Eine erst kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass PrP-defiziente Mäuse etwas weniger mobil sind, aber ein größeres Angstverhalten aufweisen als PrP-exprimierende Kontrollmäuse. Die beobachteten Phänotypen sind aber als sehr mild anzusehen (Lobao-Soares et al., 2007; Lobao-Soares et al., 2008) Das Fehlen eines klaren Phänotyps in PrP-defizienten Mäusen könnte bedeuten, dass die Funktion von PrP entweder nicht essentiell ist oder aber von so großer Wichtigkeit, dass die Zelle kompensatorische Mechanismen entwickelt hat, um den Verlust auszugleichen. Um auszuschließen, dass Prnp 0/0 -Mäuse bereits in der Embryogenese Kompensationsmechanismen entwickeln, um dem Mangel an PrP entgegenzuwirken, wurden sogenannte konditionale PrP knockout Mäuse generiert, in denen die PrP- Expression erst im postnatalen Stadium ausgeschaltet wurde. Lediglich eine Reduktion der Nachhyperpolarisationsströme in hippocampalen Zellen, die auf eine Rolle in der Regulation neuronaler Signalübertragungen hinweisen könnte, wurde gefunden. Dieses Mausmodell zeigte jedoch, dass PrP auch im adulten Tier nicht essentiell zu sein scheint, denn abgesehen von dem erwähnten Phänotyp entwickelten und verhielten sich die Mäuse normal (Mallucci et al., 2002; Mallucci et al., 2003) Neuroprotektivität von PrP Nachdem PrP-defiziente Mäuse unter physiologischen Bedingungen keinen oder nur einen milden Phänotyp erkennen ließen, versuchte man die äußeren Bedingungen zu verändern und setzte die Mäuse unter Stress. Überraschenderweise konnte in Ischämie-Modellen eine erhöhte Vulnerabilität von PrP knockout Mäusen festgestellt werden (Shyu et al., 2002; McLennan et al., 2004; Weise et al., 2004; Shyu et al., 2005; Spudich et al., 2005; Mitteregger et al., 2007). Einerseits konnten erhöhte PrP C -Levels in geschädigten Hirnarealen detektiert werden (Weise et al., 2004; Shyu et al., 2005). Andererseits war die nach Ischämie beobachtete Infarkt-Größe in den Gehirnen PrP-defizienter Mäuse signifikant größer als in Kontrollmäusen (McLennan et al., 2004; Weise et al., 2006). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Infarkt-Größe durch Überexpression von PrP reduziert werden 19

29 Einleitung konnte und dass dabei die OR-Region von PrP für die Vermittlung der Neuroprotektivität notwendig ist (Shyu et al., 2005; Mitteregger et al., 2007). Schließlich konnte auch unter anderen Stressbedingungen, beispielsweise unter exzitatorischem Stress, eine erhöhte Vulnerabilität PrP-defizienter Neuronen beobachtet werden, die durch die Überexpression von PrP wieder gesenkt werden konnte (Milhavet und Lehmann, 2002; Haigh und Brown, 2006; Rangel et al., 2007). Gemeinsam lassen diese Ergebnisse auf eine neuroprotektive Funktion von PrP schließen. Einen weiteren Hinweis auf eine zytoprotektive Aktivität von PrP lieferten transgene Mäuse, in denen N-terminal deletierte Formen von PrP auf Prnp 0/0 -Hintergrund exprimiert wurden (Shmerling et al., 1998). Die Überexpression von PrPΔ und PrPΔ führte in diesen Mäusen zu einer progressiven Neurodegeneration, die jedoch durch Expression bereits einer Kopie des Wildtyp PrP-Gens wieder verhindert werden konnte. In zwei erst kürzlich publizierten Studien konnte der toxische Bereich auf die AS beziehungsweise eingeschränkt werden. Die Expression der Mutanten PrPΔ und PrPΔ führte ebenfalls zu einem starken neurodegenerativen Phänotyp. Doch auch in diesen Studien war die Expression bereits einer der beiden Kopien des Wildtyp PrP- Gens ausreichend, um den Phänotyp zu verhindern (Baumann et al., 2007; Li et al., 2007). Interessanterweise konnte auch gezeigt werden, dass die Expression von PrP die bereits erwähnte Dpl-induzierte Neurodegeneration hemmen kann (vgl. Abschnitt 1.2.3; Moore et al., 1999) Rolle von PrP in der Signaltransduktion Da PrP ein GPI-verankertes Zelloberflächenprotein und in Detergens-resistenten Membrandomänen (DRM) zu finden ist, wurde weiter vermutet, dass es eine Rolle in der Signaltransduktion spielt. So konnte eine Aktivierung der Tyrosin-Kinase Fyn und in Folge eine Phosphorylierung der Kinase Erk1/2 nach induzierter Dimerisierung von PrP beobachtet werden (Mouillet-Richard et al., 2000; Schneider et al., 2003; Toni et al., 2006). Um Signale ins Zellinnere zu leiten, würde extrazellulär lokalisiertes PrP einen transmembranären Interaktionspartner benötigen. Nach diesem Partner wird noch immer intensiv gesucht. Bisher wurden unter anderem der 37 kda/67 kda Laminin-Rezeptor (Rieger et al., 1997; Graner et al., 2000; Gauczynski et al., 2001), ein unbekanntes 66 kda Membranprotein (Martins et al., 1997) und das transmembran vorliegende Stress-induzierbare Protein 1 (STI 1) als Interaktionspartner von PrP vorgeschlagen (Zanata et al., 2002). Für STI 1 konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass eine Wechselwirkung mit PrP Neuronen vor Anisomycin-induziertem Zelltod schützt. Die physiologische Relevanz der hier genannten Interaktionen sowie vieler weiterer gefundenen Wechselbeziehungen muss in Zukunft jedoch noch geklärt werden. In erst kürzlich publizierten Studien konnte gezeigt werden, dass PrP 20

30 Einleitung seine neuroprotektive Funktion über die Modulation des N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)- Rezeptors (NMDAR), einem ionotropen Glutamatrezeptor (Villmann und Becker, 2007) ausübt. Die erhöhte Anfälligkeit gegenüber neuronaler Schädigung durch exzitatorischen Stress in PrP-defizienten Mäusen konnte durch die Verwendung von NMDAR-Blockern reduziert werden (Rangel et al., 2007). In PrP 0/0 -Neuronen wurden darüber hinaus eine gesteigerte Aktivität der NMDAR sowie erhöhte Apoptoseraten nach transienter Inkubation mit NMDA beobachtet, die durch Überexpression von PrP verhindert werden konnten (Khosravani et al., 2008) Kupferbindung von PrP PrP besitzt in der N-terminalen OR-Region mehrere Histidin-Reste. Sowohl in vitro als auch in vivo konnte gezeigt werden, dass diese Histidin-Reste selektiv und kooperativ vier Kupferionen komplexieren können (Brown et al., 1997a; Stöckel et al., 1998; Viles et al., 1999). Des Weiteren ergaben Studien, dass eine Bindung von Kupfer eine Konformationsänderung in der OR-Region auslöst und dadurch Endozytose von PrP induzieren kann (Pauly und Harris, 1998; Quaglio et al., 2001; Sumudhu et al., 2001). Diese Daten führten zu der Vermutung, dass PrP eine Funktion in der Kupferhomöostase spielen könnte. Es wurde gezeigt, dass PrP an präsynaptischen Membranen lokalisiert ist (Fournier et al., 1995, Herms et al., 1999) und dass in PrP-defizienten Mäusen eine signifikante Reduktion der synaptosomalen Kupferkonzentration auftritt (Collinge et al., 1994; Manson et al., 1995). Dies könnte darauf hindeuten, dass PrP eine Funktion in der Wiederaufnahme der freigesetzten Kupferionen in die präsynaptische Zelle hat und damit die Kupferkonzentration des synaptischen Spalts reguliert. Kupfer wurde auch als Kofaktor für eine putative enzymatische Aktivität von PrP, möglicherweise als Superoxid-Dismutase (SOD), diskutiert (Brown et al., 1999; Hutter et al., 2003). In Prnp 0/0 -Mäusen wurde eine verminderte SOD- Aktivität gefunden (Brown et al., 1997b). Ebenfalls wird vermutet, dass PrP eine Rolle in der Kupferbeladung der SOD spielen könnte (Brown et al., 1997b; Waggoner et al., 2000; Hutter et al., 2003). Gegen diese Annahmen spricht jedoch, dass PrP im Vergleich zu anderen kupferabhängigen Enzymen eine relativ geringe Affinität zu Kupfer aufweist (Garnett und Viles, 2003). 21

31 Einleitung 1.4 Missfaltung von PrP und Neurodegeneration Anhand verschiedener Mausmodelle konnte gezeigt werden, dass die Expression von zellulärem PrP (PrP C ) notwendig für die Entstehung von Prion-Erkrankungen ist. PrPdefiziente Mäuse können keine infektiösen Prionen replizieren und zeigen keine Neurodegeneration (Büeler et al., 1993). Der genaue Mechanismus, der zur Neurodegeneration führt, ist noch weitgehend unbekannt. Wie bereits erwähnt wurde, gibt es sporadische, infektiöse und vererbbare Prion-Erkrankungen. Ein gemeinsames Charakteristikum dieser verschiedenen Krankheiten ist das Auftreten einer aberrant gefalteten Form von PrP, weshalb vermutet wird, dass die Missfaltung von PrP eine zentrale Rolle in der Pathogenese einnimmt (Abb. 11). Abb. 11. Prion-Erkrankungen zeichnen sich durch missgefaltete PrP-Konformere aus. Den drei Formen von Prion-Erkrankungen (sporadisch, vererbbar und infektiös) liegt eine fehlgefaltete PrP-Konformation zugrunde. Diese kann entweder spontan, durch Mutation im Prnp oder durch Infektion mit PrP Sc entstehen. In Folge führt die Missfaltung von PrP zu Infektiösität und/oder Neurodegeneration. Die Mehrheit der Prion-Erkrankungen zeichnet sich neben einer äußerst progressiven Neurodegeneration durch die Bildung von PK-resistentem PrP Sc, das sich in Form von Plaques im Gehirn ablagert, und durch infektiöse Prionen aus (vgl. Abschnitt 1.2.1). Über einen langen Zeitraum wurde angenommen, dass das missgefaltete Konformer PrP Sc sowohl für die Infektiösität als auch die Neurodegeneration verantwortlich ist. Mittlerweile geht man aber davon aus, dass es sich bei PrP Sc zwar um das infektiöse Agens, nicht aber um das toxische handelt. Diese Annahme beruht auf den im folgenden Abschnitt näher beschriebenen Beobachtungen, dass einerseits PrP Sc in Abwesenheit von neuronalem PrP C nicht toxisch ist und andererseits neben PrP Sc andere aberrant gefaltete PrP-Formen, die zu Neurodegeneration in Abwesenheit infektiöser Prionen führen, exisitieren (Abb. 12). 22

32 Einleitung Abb. 12. Neurodegeneration und Infektiösität sind voneinander trennbare Prozesse. PrP Sc, das durch Konversion von PrP C entsteht, führt zur Neurodegeneration und Infektiösität. Durch Mutation entstehen aus PrP C verschiedene fehlgefaltete PrP-Mutanten, die ebenfalls Neurodegeneration auslösen, ohne jedoch dabei infektiöse Prionen zu bilden. Abbildung modifiziert aus (Winklhofer et al., 2008) PrP Sc führt nur in Anwesenheit von neuronal exprimiertem PrP C zur Neurodegeneration Im Konsens mit der Prion-Theorie zeigen PrP knockout Mäuse vollständige Resistenz gegenüber Prion-Erkrankungen und können keine infektiösen Prionen replizieren (Büeler et al., 1993; Sailer et al., 1994). Dies konnte von zwei eleganten Studien gestützt werden. Brander und Kollegen transplantierten Gehirnbereiche aus Wildtyp-Mäusen in die Gehirne PrP-defizienter Mäuse. Nach Infektion dieser Mäuse mit Prionen konnte eine deutliche räumliche Restriktion der neuropathologischen Veränderungen auf die transplantierten, PrP C -exprimierenden Regionen beobachtet werden (Brandner et al., 1996). Interessanterweise wurde die Viabilität PrP-defizienter Neuronen durch eine voranschreitende PrP Sc -Akkumulation nicht beeinträchtigt. Die zweite Studie zeigte, dass die Neurotoxizität nach Inokulation mit infektiösen Prionen von der neuronalen Expression von PrP C abhängig ist. Die Expression von PrP C in Gliazellen führte zu fortlaufender Replikation von PrP Sc und zur Bildung von infektiösen Prionen. Trotzdem konnte die Replikation von PrP Sc in Gliazellen keine Degeneration von PrP-defizienten Neuronen induzieren (Mallucci et al., 2003). Schließlich konnte demonstriert werden, dass transgene Mäuse, die PrP mit deletierter GPI-SS (PrPΔGPI) überexprimieren, zwar infektiöse Prionen propagieren, wenn sie mit Prionen infiziert wurden, dies aber keine pathogenen Auswirkungen zu haben scheint (Chesebro et al., 2005). Gemeinsam deuten diese Studien darauf hin, dass PrP Sc per se nicht toxisch ist. 23

33 Einleitung PrP-Mutanten führen in Abwesenheit von PrP Sc zu Neurodegeneration Interessanterweise fand man bei einigen vererbbaren Prion-Erkrankungen zwar Neurodegeneration, aber keine infektiösen Prionen (Hsiao und Prusiner, 1990; Hsiao et al., 1990; Medori et al., 1992; Budka, 1997). Verschiedene Arbeiten zeigten, dass neben PrP Sc noch andere fehlgefaltete PrP-Spezies existieren, die in Abwesenheit von PrP Sc zu Neurodegeneration führen (Muramoto et al., 1997; Chiesa et al., 1998; Hegde et al., 1998a; Shmerling et al., 1998; Ma et al., 2002; Flechsig et al., 2003; Baumann et al., 2007; Li et al., 2007). Daraus lässt sich schließen, dass fehlgefaltete PrP-Konformere vorkommen können, die zwar neurotoxisch, aber nicht infektiös sind (Abb. 12). Eines dieser Konformere stellt die pathogene Mutante PG14 dar, welche durch eine neunfache OR-Insertion gekennzeichnet ist. Die Überexpression dieser PrP-Mutante in Mäusen führte zu fataler Neurodegeneration. Versuche, Wildtyp-Mäuse mittels intrazerebraler Inokulation von Hirnhomogenat aus transgenen PG14-Mäusen zu infizieren, schlugen jedoch fehl (Chiesa et al., 1998; Chiesa et al., 2003). Anhand von Mausmodellen und in Zellkulturstudien konnte beobachtet werden, dass PrP auch neurotoxisches Potential gewinnt, wenn die hydrophobe Domäne (HD) im N-Terminus des Proteins deletiert wird (Shmerling et al., 1998; Baumann et al., 2007; Li et al., 2007; Rambold et al., 2008). Transgene Mäuse, die diese PrP-Mutanten auf Prnp 0/0 -Hintergrund überexprimieren, zeigten schwere Ataxie und neuronalen Zelltod, aber keine Infektiösität (Shmerling et al., 1998; Baumann et al., 2007; Li et al., 2007). Des Weiteren ergaben mehrere Studien, dass PrP toxisches Potential erwerben kann, wenn der Import ins ER teilweise oder vollständig verhindert wird. Wie bereits in Abschnitt beschrieben wurde, besitzt PrP eine hochkonservierte, hydrophobe Domäne (AS ). In in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass PrP aufgrund dieser Domäne neben seiner GPI-verankerten, vollständig ins ER importierten Form auch zwei unterschiedliche transmembranäre Topologien annehmen kann (Abb. 13). Während sich bei der als Ntm PrP bezeichneten Form der N-Terminus im ER-Lumen befindet, ist bei der Ctm PrP-Form der C- Terminus im ER-Lumen (Lopez et al., 1990; Yost et al., 1990). Tatsächlich können verschiedene Mutationen in der HD und in der N-terminalen Signalsequenz die relativen Anteile dieser drei PrP-Topologien modulieren (Hegde et al., 1998b; Kim et al., 2001). Eine Studie mit transgenen Mäusen ergab, dass die Dreifach-Mutation AV3 (A112V/A114V/A117V) in der HD, die zur vermehrten Biosynthese von Ctm PrP führt, progressive Neurodegeneration zur Folge hat. Beachtenswerterweise konnte auch bei GSS- Patienten mit der Mutation A117V ein erhöhter Anteil an Ctm PrP gefunden werden (Hegde et al., 1998a; Hegde et al., 1999; Stewart et al., 2005). 24

34 Einleitung Abb. 13. Schematische Darstellung der Lokalisierungsmöglichkeiten und Topologien von PrP in der Zelle. Neben der physiologisch vorwiegend auftretenden GPI-verankerten Form von PrP liegen in geringerem Ausmaß auch transmembrane Formen ( Ctm PrP und Ntm PrP) sowie zytosolisch lokalisiertes PrP vor. Ein weiteres Mausmodell zeigte schließlich, dass die vollständige Hemmung des ER-Imports von PrP ebenfalls zur Bildung einer neurotoxischen Spezies führt. Die Expression von PrP mit deletierter ER-Signalsequenz (zytoprp) führt zur ausschließlichen Lokalisierung des Proteins im Zytosol. Transgene Mäuse, die diese PrP-Mutante überexprimierten, zeigten schwere Ataxie, zerebrale Degeneration und Gliose, was ein Indiz dafür war, dass PrP im Zytosol toxisch ist (Ma et al., 2002). Das neurotoxische Potential von zytosolischem PrP konnte auch in mehreren Zellkulturstudien beobachtet werden (Ma und Lindquist, 2001; Ma et al., 2002, Yedidia et al., 2001; Drisaldi et al., 2003; Rane et al., 2004; Orsi et al., 2006; Rambold et al., 2006). In einem erst kürzlich publizierten Zellkulturmodell aus unserer Arbeitsgruppe wurde PrP in verschiedene zelluläre Kompartimente geleitet und der Einfluss auf die Viabilität der neuronalen Zellen untersucht. Obwohl PrP in allen analysierten Kompartimenten (ER, Zytosol, Mitochondrien und Nukleus) eine Detergens-unlösliche, partiell PK-resistente Konformation einnahm, induzierte nur zytosolisch lokalisiertes PrP Apoptose. Das apoptotische Potential von zytoprp konnte mit der HD und Helix1 (AS ) assoziiert werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Toxizität von zytoprp mit der Bindung an den anti-apoptotischen Faktor Bcl-2 korreliert (Rambold et al., 2006). Interessanterweise konnte im Gegensatz zu den eben dargestellten Ergebnissen in anderen Studien keine Beeinträchtigung der zellulären Lebensfähigkeit durch Expression von zytoprp 25

35 Einleitung beobachtet werden (Roucou et al., 2003; Fioriti et al., 2005). Eine Analyse ergab sogar, dass die Expression von zytoprp in primären Neuronen protektiv ist und gegen BAX-vermittelten Zelltod schützen kann (Roucou et al., 2003). Eine mögliche Erklärung für diese kontroversen Befunde liefert die Annahme, dass die Toxizität von zytoprp durch zelluläre Faktoren moduliert werden kann. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass das toxische Potential von zytoprp durch die Überexpression von Hsp70 und Hsp40 oder Bcl-2 reduziert, jedoch durch die Inhibition des Proteasoms verstärkt wird (Ma und Lindquist, 2001; Ma et al., 2002; Yedidia et al., 2001; Drisaldi et al., 2003; Rane et al., 2004; Orsi et al., 2006; Rambold et al., 2006;). Dies deutet darauf hin, dass die Toxizität, abhängig von der zellulären Homöostase, durch die Bildung und den Abbau von zytoprp beeinflusst werden kann. Bis jetzt wurden in Patienten keine pathogenen Mutationen in der N-terminalen Signalsequenz von PrP gefunden, die die Effizienz des ER Imports beeinträchtigen und zu einer zytosolischen Lokalisierung führen würden. Die Analyse der pathogenen Stop-Mutante W145X ( X bezeichnet ein Stopcodon), die in einem GSS-Patienten gefunden wurde, ergab aber überraschenderweise eine zytosolische und nukleäre Lokalisation dieses Proteins (Kitamoto et al., 1993; Zanusso et al., 1999). Die in unserer Arbeitsgruppe durchgeführten Studien in neuronalen Zellen konnten zeigen, dass neben W145X auch eine zweite pathogene Stop-Mutante Q160X teilweise im Zytosol lokalisiert ist (Heske et al., 2004) und Apoptose induziert (Rambold et al., 2006). Mechanistische Analysen ergaben schließlich, dass der deletierte C-Terminus von PrP Informationen beinhaltet, die notwendig für den Import in das ER sind. Ohne diese Information ist die Translokation ins ER beeinträchtigt und die Mutanten liegen mit ungeschnittener Signalsequenz im Zytosol vor (Heske et al., 2004). In einer anderen Studie wurde vermutet, dass PrP aufgrund seiner ineffizienten ER-SS nicht vollständig ins ER transportiert wird, sondern eine kleine Fraktion im Zytosol lokalisiert vorliegt, wo sie toxisch wirken kann (Rane et al., 2004). Im Gegensatz zu der gerade dargestellten Vermutung, dass der ER-Import von PrP beziehungsweise der PrP-Mutanten beeinträchtigt sein könnte, wurde in vorangegangenen Arbeiten angenommen, dass PrP im ER-Lumen missfaltet und mittels ER-assoziierter Degradierung (siehe Abschnitt ) wieder zurück ins Zytosol transportiert werden kann (Ma und Lindquist, 2001; Yedidia et al., 2001). 1.5 Maturierung und Faltung sekretorischer Proteine PrP ist ein sekretorisches Protein. Dennoch konnten sowohl PrP als auch zwei pathogene Stop-Mutanten (Q160X und W145X) teilweise im Zytosol beobachtet werden, wo sie Apoptose auslösen. Die Untersuchung der genauen Vorgänge, weshalb und auf welchem Weg PrP ins Zytosol gelangt, ist ein wesentlicher Bestandteil dieser Arbeit. Für ein besseres 26

36 Einleitung Verständnis wird deshalb im folgenden Abschnitt genauer auf die allgemeine Biosynthese sekretorischer Proteine eingegangen. Außerdem werden verschiedene Qualitätskontroll- und Abbaumechanismen der Zelle vorgestellt, welche dazu dienen, die Akkumulation missgefalteter Proteine zu verhindern Proteinsynthese am ER Die Synthese sekretorischer Proteine beginnt an freien Ribosomen im Zytosol. Die naszierende Polypeptidkette wird im Peptidyl-Transferase-Zentrum in der Spalte zwischen der kleinen und großen Untereinheit des Ribosoms gebildet. Während die Kette elongiert wird, erstreckt sie sich entlang der circa 100 Å langen und etwa 20 Å breiten ribosomalen Austrittpore (engl. exit tunnel) (Ban et al., 2000; Menetret et al., 2000; Beckmann et al., 2001). Die aus dem Ribosom austretende naszierende Polypeptidkette enthält eine N-terminale SS, welche das entstehende Protein an die ER-Membran dirigiert (Blobel und Dobberstein, 1975a). Signalpeptide variieren sehr stark in ihrer Länge und AS-Sequenz. Grundsätzlich können sie aber in drei Regionen, bestehend aus einer kurzen, positiv geladenen N-terminalen, einer zentralen hydrophoben und einer C-terminalen polaren Region, die die Schnittstelle für die Signalpeptidase enthält, eingeteilt werden (von Heijne, 1985). Lange Zeit wurde vermutet, dass ER-SS frei austauschbar sind. Einzig und allein ihre Hydrophobizität schien von Bedeutung zu sein. So muss ein bestimmtes Maß an Hydrophobizität vorhanden sein, um einen kotranslationalen Import ins ER zu ermöglichen (Valent et al., 1995). Mehrere kürzlich durchgeführte Studien ergaben jedoch, dass Signalpeptide Informationen beinhalten, die eine Rolle für die Wahl des Translokationsweges, die Effizienz der Translokation, die zeitliche Regulierung der Abspaltung durch die Signalpeptidase und interessanterweise auch für spätere Funktionen der abgespaltenen ER-SS spielen (Hegde und Bernstein, 2006). In einer Studie konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Diversität der ER-SS wichtig für die Substratspezifische Modulation der Proteintranslokation sein kann (siehe Abschnitt ; Kang et al., 2006). In Säugetierzellen werden sekretorische Proteine in der Regel kotranslational in das ER importiert (Abb. 14). An die ER-SS der naszierenden Polypeptidkette bindet das sogenannte Signalerkennungspartikel (engl. signal recognition particle, SRP) (Walter und Blobel, 1980; Walter und Blobel, 1982). Die Elongation der Polypeptidkette wird daraufhin verlangsamt und der Ribosom-Peptid-Komplex zum ER geleitet. Dort bindet das SRP in einer GTPanhängigen Reaktion an den SRP-Rezeptor (SR), der wiederum mit der Translokationsmaschinerie interagiert (Meyer und Dobberstein, 1980; Gilmore et al., 1982a; Gilmore et al., 1982b). Der SRP-SR-Komplex wird von dem Ribosomen-Polypeptidketten- Komplex gelöst (Connolly und Gilmore, 1989) womit die Elongation am Ribosom fortgesetzt 27

37 Einleitung werden kann (Pohlschroder et al., 1997; Matlack et al., 1998; Johnson und van Waes, 1999). Schließlich dissoziiert der SRP-SR-Komplex durch GTP-Hydrolyse (Miller und Walter, 1993) und der SRP-Zyklus kann von neuem beginnen. Abb. 14. Modell der kotranslationalen Proteintranslokation eines sekretorischen Proteins. Das Schema zeigt die Schritte des SRP-Zyklus. Das Signalerkennungspartikel (SRP) bindet an die hydrophobe ER-SS (rot) der wachsenden Polypeptidkette. Die Translation wird verlangsamt und der Ribosom-Peptid-Komplex zur ER Membran geleitet. Dort bindet SRP an seinen Rezeptor. Sobald SRP wieder freigesetzt wird, bindet das Ribosom an den Translokationskanal (Sec61-Komplex) und die Translation wird fortgesetzt. Die Signalsequenz wird geschnitten während das naszierende Polypeptid in die Translokationspore inseriert. Abbildung aus (Rapoport, 2007). Der Translokationstunnel (Sec61-Komplex in Eukaryonten, SecY in Bakterien und Archaeen) besteht aus den drei transmembranen Untereinheiten α, β und γ, wobei die α-untereinheit die Pore ausbildet (Gorlich et al., 1992, Mothes et al., 1994). Das eukaryontische Translokon beinhaltet mehrere Kopien des heterotrimeren Sec61-Komplexes und verschiedene assoziierte Komponenten wie den TRAP (translocon-associated protein)-komplex, das TRAM (translocating chain associating membrane)-protein, die Oligosaccharyltransferase (OST) und den Signalpeptidase-Komplex (Hanein et al., 1996, Van den Berg et al., 2004, Menetret et al., 2005). Da die Aufklärung der Kristallstruktur von SecY aus dem Archaebakterium Methanococcus jannaschii eine statische Porengröße von nur 8 Å ergab, wurde angenommen, dass die Pore dynamisch während der Translokation geweitet wird. Interessanterweise konnte beobachtet werden, dass die Pore groß genug ist, um einer Polypeptidkette in α-helikaler Konformation Platz zu bieten (Van den Berg et al., 2004; Cannon et al., 2005; Gumbart und Schulten, 2006; Tian und Andricioaei, 2006; Haider et al., 2006; Saparov et al., 2007). Inwieweit das SecY-Modell mit dem eukaryontischen 28

38 Einleitung übereinstimmt, ist bisher noch unklar. Obwohl man vermutet, dass die Pore in Eukaryonten nur von einem Sec61-Komplex geformt wird, konnte mittels Elektronenmikroskopie gezeigt werden, dass vier Sec61-Komplexe assoziiert vorliegen (Menetret et al., 2005). Des Weiteren bleibt herauszufinden, wie während der Translokation eine Permeabilitätsbarriere für Ionen aufrecht erhalten wird. Anhand des SecY-Modells wird vermutet, dass neben einer kurzen helikalen Domäne des Translokons auf der lumenalen Seite, die als Pfropfen die Pore verschließt, ein zentraler Ring hydrophober AS in der Pore (engl. pore ring) die Ionen- Barriere aufrechterhält (Van den Berg et al., 2004). Alternative Modelle schlagen hingegen vor, dass der Verschluss der Pore im ER-Lumen durch das Chaperon BiP und auf der zytosolischen Seite durch das Ribosom gebildet wird (Crowley et al., 1994; Hamman et al., 1998). Nachdem der Ribosom-Peptid-Komplex mit dem Sec61-Komplex in Kontakt getreten ist, wird unter Kontrolle des Signalpeptids der Kanal geöffnet und die ER-SS assoziiert zuerst mit dem integralen TRAM-Protein (Görlich et al., 1992; Voigt et al., 1996). Die wachsende Polypeptidkette wird Richtung ER-Lumen vorwärtsgeschoben. Schließlich schneidet die Signalpeptidase, welche an der lumenalen Seite der ER-Membran lokalisiert ist, die N- terminale SS ab (Johnson und van Waes, 1999) und die Synthese des Proteins kann vollendet werden. In vitro Experimente haben gezeigt, dass für die Translokation der meisten Proteine nur die drei Komponenten Sec61-Komplex, TRAM und SRP-Rezeptor ausreichend sind (Görlich und Rapoport, 1993; Voigt et al., 1996). Für einen erfolgreichen ER-Import von PrP und einiger anderer Proteine wird allerdings ein weiterer Faktor, der sogenannte TRAP- Komplex, benötigt (Fons et al., 2003). Die genaue Funktion dieses Proteinkomplexes ist jedoch noch nicht geklärt Prozessierung der Proteine im ER und Golgi-Apparat Eine wichtige Proteinmodifikation sekretorischer Proteine ist die Glykosylierung. Man unterscheidet zwischen der N- und der O-Glykosylierung. Die N-Glykosylierung erfolgt auch bei PrP und ist die meistverbreitete Glykosylierungsart. Sie findet an Asparaginresten (N), die durch das Motiv N-X-S/T (X beliebige AS außer Prolin) charakterisiert sind, statt. In vitro- Analysen ergaben, dass das Motiv N-X-T eine vierzigmal effizientere Glykosylierung der Proteine ermöglicht als N-X-S (Bause, 1983). Die N-Glykosylierung beginnt kotranslational im ER mit dem Transfer der Kernglykane auf die naszierende Polypeptidkette. Die Synthese der Kernglykane ist äußerst komplex. Sie beginnt auf der zytosolischen Seite des ERs. Oligosaccharide bestehend aus fünf Mannose- und zwei N-Acetyl-Glucosaminresten (Man5GlucNAc2) werden dort mit dem lipophilen Polyprenol Dolichol-Phosphat verknüpft. Dieses hydrophobe Polyprenol transferiert anschließend die Zuckereinheit durch Umklappen auf die lumenale Seite der Membran. Dort wird die Glykankette durch 29

39 Einleitung aufeinanderfolgende Additionen von Monosacchariden verlängert (Kornfeld und Kornfeld, 1985, Gahmberg und Tolvanen, 1996; Burda und Aebi, 1999). Sobald dieses Grundgerüst bestehend aus drei Glucose-, neun Mannose- und zwei N-Acetyl-Glucosaminresten (Glc3Man9GlucNAc2) fertiggestellt ist, wird es als Ganzes mit Hilfe der OST auf einen Asparaginrest der wachsenden Polypeptidkette übertragen (Silberstein und Gilmore, 1996) (Abb. 15). Abb. 15. Schematische Darstellung des Kernglykangerüsts, welches im ER kotranslational an die naszierende Polypeptidkette mit dem Erkennungsmotiv N-X-S/T geknüpft wird. Das Kernglykangerüst besteht insgesamt zwei N-Acetyl-Glucosamin-, neun Mannose- und drei Glucoseresten. Die drei Glucosereste und ein Mannoserest werden im ER mit Hilfe der Glucosidase I und II und der α-1,2-mannosidase wieder entfernt. Im ER werden mit Hilfe der Glucosidase I und II und der α-1,2-mannosidase die drei Glucose- und einer der Mannosereste wieder entfernt (Kornfeld und Kornfeld, 1985; Moremen et al., 1994). Die Abspaltung des Mannoserestes ist von Bedeutung, da es das Signal für den Export des richtig gefalteten Proteins in den Golgi-Apparat darstellt. Missgefaltete oder ungefaltete Proteine werden hingegen mittels der Glucosyl-Transferase reglucosiliert und somit erneut in den sogenannten Calnexin-Zyklus (vgl. Abschnitt ) überführt. Nativ gefaltete Proteine gelangen letztendlich vom ER über vesikulären Transport in den Golgi-Apparat, wo die Prozessierung der Kernglykane fortgesetzt werden kann. Zuerst werden im cis-golgi weitere drei Mannosereste entfernt woraufhin im mittleren Golgi ein N- Acetyl-Glucosaminrest addiert und danach weitere zwei Mannoseeinheiten abgespalten werden. Danach erfolgt im trans-golgi die Addition der terminalen Zuckerreste bestehend aus N-Acetyl-Glucosamin-, Galactose-, Sialylsäure- und Fucoseresten was zur komplexen Glykosylierung des Proteins führt (Abb. 16). Während die Kernglykane aller Proteine eine einheitliche Struktur und Zusammensetzung besitzen und unter anderem eine Rolle in der Proteinfaltung und Qualitätskontrolle einnehmen, haben die Glykane im Golgi-Apparat 30

40 Einleitung komplexe Strukturen mit heterogener Oligosaccharid-Zusammensetzung. Diese Diversität der terminalen Glykosylierung ist Zelltyp- und Spezies-spezifisch und vermittelt verschiedene Funktionen wie Zellerkennung oder Signalwirkung (Kornfeld und Kornfeld, 1985; Paulson und Colley, 1989; Varki, 1993). Abb. 16. Modell der Prozessierung von Kernglykanen in komplexe Strukturen. Folgende Enzyme sind an der Prozessierung beteiligt: (1) Glucosidase I, (2) Glucosidase II, (3) α-1,2-mannosidase des ERs, (4) Mannosidase I des Golgi-Apparats, (5) GlcNAc- Transferase I, (6) Mannosidase II des Golgi-Apparats, (7) GlcNAc-Transferase II und IV, (8) Fucosyl-Transferase, (9) Galactosyl-Transferase, (10) Sialyl-Transferase. Der rückwärtige Pfeil im Schritt (2) symbolisiert die Reglucosilierung, welche den erneuten Eintritt in den Calnexin-Zyklus ermöglicht. Für die Untersuchung des Glykosylierungsstatus eines Proteins stehen verschiedene Enzyme und Inhibitoren zur Verfügung. Ein wichtiger antibiotischer Inhibitor der N- Glykosylierung ist Tunicamycin (TM). Es hemmt die Addition von N-Acetyl-Glucosamin an Dolicholphosphat, also den ersten Schritt der Bildung des Kernglykans. Durch den Einsatz von des Alkaloides Swainsonin wird die Mannosidase II im Golgi-Apparat gehemmt. Hierdurch wird die Prozessierung der Zucker im ER gestoppt wodurch keine Umwandlung in komplexe Glykane erfolgen kann. Komplexe Glykane können durch Verwendung der N- Glykosidase F (PNGase F) abgespalten werden, während das Enzym Endoglykosidase H 31

41 Einleitung (EndoH) spezifisch zwischen zwei N-Acetyl-Glucosamin-Resten, an denen mindestens fünf Mannoseeinheiten hängen, schneidet (Abb. 16). Der Einsatz dieses Enzyms ermöglicht daher eine Unterscheidung zwischen dem mannosereichen Glykan-Typ (EndoH-sensitiv) oder komplex glykosylierten Strukturen (EndoH-resistent) (Robbins et al., 1984; Maley et al., 1989). Neben der Glykosylierung stellt die Membranverankerung über den GPI-Anker eine weitere mögliche Modifizierung sekretorischer Proteine dar. Der GPI-Anker wird im ER separat synthetisiert und besteht aus einem Distearat, das über eine Oligosaccharid-Einheit mit Ethanolaminphosphat verknüpft wird. Proteine, die GPI-verankert werden sollen, benötigen eine C-terminale, hydrophobe GPI-Anker-Präsequenz, welche im ER durch den kompletten, vorgefertigten GPI-Anker ersetzt wird. Dabei wird der GPI-Anker über die NH 2 -Gruppe des endständigen Ethanolaminphosphats mittels einer Transamidase-Reaktion an die carboxyterminale Akzeptor-AS des Proteins, die sogenannte ω-site, übertragen (Englund, 1993). Ähnlich wie die N-terminalen ER-SS weisen die C-terminalen GPI-SS keine konservierten Sequenzhomologien auf. Die GPI-Signalpeptide sind charakterisiert durch die ω-site sowie die Positionen ω+1 und ω+2, an denen sich nur einfache AS mit kurzen Seitenketten befinden dürfen, gefolgt von einer durch einen Linker getrennten AS langen hydrophoben Domäne (Ferguson und Williams, 1988; Moran et al., 1991; Kodukula et al., 1993) Proteinfaltung, Qualitätskontrollmechanismen und Proteinabbau Wie in Abschnitt 1.4 bereits erläutert, kann die Missfaltung von PrP zu Neurodegeneration führen. Da die Zelle verschiedene Mechanismen hat, um die Fehlfaltung von Proteinen zu vermeiden oder bereits missgefaltete Proteine zu erkennen und gegebenenfalls zu eliminieren, ist es von Interesse, diese hier genauer zu beleuchten. Die sogenannte Qualitätskontrolle der Zelle besteht aus einem komplexen Netzwerk molekularer Mechanismen, die für die Balance von Protein-Biosynthese, Translokation, Faltung und Abbau sorgen (Morimoto, 2008). Zu den wichtigsten Mechanismen der Qualitätskontrolle von ER-Proteinen gehören der Calnexin-Zyklus, die Antwort auf ungefaltete Proteine (engl. unfolded protein response, UPR) und die ER-assoziierte Degradierung (engl. ER-associated degradation, ERAD). In den letzten Jahren fand man schließlich Hinweise auf einen weiteren Qualitätskontrollmechanismus, die sogenannte präventive (engl. pre-emptive quality control, pqc) oder kotranslokationale (engl. cotranslocational quality control, cqc) Qualitätskontrolle. Um die Proteinfaltung, die ein äußerst komplexer und oft ineffizienter Vorgang ist, zu erleichtern, besitzt die Zelle eine hohe Zahl an zusätzlichen Faktoren. Dazu gehören unter 32

42 Einleitung anderem die Chaperone (französisch für Anstandsdamen) und andere Faltungsenzyme. Chaperone assistieren bei der Faltung, indem sie un- oder fehlgefaltete Proteine an exponierten hydrophoben Bereichen reversibel binden und somit entweder passiv einer Proteinaggregation vorbeugen oder aktiv eine korrekte Faltung vermitteln (Hartl, 1996; Netzer und Hartl, 1998; Ellis und Hartl, 1999; Agashe und Hartl, 2000; Hartl und Hayer-Hartl, 2002; Walter und Buchner, 2002). Zu den wichtigsten Chaperonen gehören die Mitglieder der sogenannten Hitzeschockproteine (Hsp), die ubiquitär vorkommen und hoch konserviert sind. Während Hsp70-Mitglieder, wie das konstitutiv exprimierte Hsc70 oder das stressinduzierte Hsp70 im Zytosol vorliegen, ist das 78kDa große BiP (Immunglobulin schwere Kette-bindendes Protein) der Hauptvertreter dieser Proteine im ER-Lumen. Weitere wichtige Chaperone sind Grp94 (Glucose-reguliertes Protein 94), ein Hsp90-Mitglied im ER, die zytosolisch und lumenal vorkommenden Kochaperone der Hsp40-Familie sowie die Lektine Calretikulin und Calnexin. Zusätzlich findet man im ER-Lumen unter anderem die Protein-Disulfid-Isomerase, die die Faltung beschleunigt, indem sie die Ausbildung korrekter Disulfidbrücken katalysiert, und Peptidyl-Prolyl-Isomerasen, die wichtig für die cis/trans- Isomerisierung nicht frei drehbarer Peptidyl-Prolyl-Bindungen in Proteinen sind (Anelli und Sitia, 2008) Calnexin-Zyklus Sollten Proteine im ER trotz eines ausgeklügelten Systems an Helferproteinen nicht korrekt falten oder missfalten, so besitzt die Zelle Mechanismen um diese Proteine zu erkennen und gegebenenfalls zu eliminieren. Bei Eukaryonten findet man im ER den sogenannten Calnexin-Zyklus (Helenius, 1994; Zapun et al., 1999; Parodi, 2000), dessen Hauptaufgabe darin besteht, Proteine zu falten und zu verhindern, dass missgefaltete Glykoproteine aus dem ER exportiert und weiter durch den sekretorischen Weg transportiert werden. Nachdem die Glucosidase I und II im ER zunächst zwei der drei Glucosereste der Kernglykane von neu synthetisierten Proteinen abspaltet (Abb. 16, Schritt 1), werden die Proteine, die nur noch einen Glucoserest besitzen (Glc1Man9GlucNAc2), von den ER-Chaperonen Calnexin und Calretikulin erkannt und gebunden (Ou et al., 1993; Hammond und Helenius, 1994). Membrangebundenes Calnexin und lumenales Calretikulin bilden jeweils einen Komplex mit ERp57, einer Thiooxidoreduktase, die den faltenden Proteinen bei der Ausbildung von Disulfidbrücken assistiert (Oliver et al., 1997; Molinari und Helenius, 1999). Die Interaktion mit den beiden Lektinen und ERp57 verlangsamt die Faltung vieler Proteine und erhöht damit deren Effizienz. Die Abspaltung des letzten Glucoserestes des neu synthetisierten Proteins durch die Glucosidase II (Abb. 16, Schritt 2) führt zur Dissoziation der Komplexe und zur Entlassung des Proteins aus dem Calnexin-Zyklus. Korrekt gefaltete Proteine können das ER verlassen und Richtung Golgi transportiert werden. Im Gegensatz dazu sind 33

43 Einleitung nicht korrekt gefaltete Glykoproteine Substrate für die UDP-Glucose-Glucosyl-Transferase und werden durch sie reglucosiliert. Dies hat eine erneute Bindung an die ER-Chaperone zur Folge (Suh et al., 1989; Sousa et al., 1992; Trombetta et al., 1996). Der Zyklus wird so oft durchlaufen bis das Protein entweder richtig gefaltet oder zur ER-assoziierten Degradierung freigegeben wird (Hebert et al., 1996) ER-assoziierte Degradierung Die ER-assoziierte Degradierung (ERAD) ist ein Mechanismus zur selektiven Entfernung missgefalteter Proteine aus dem ER für die anschließende Degradierung durch das 26S- Proteasom im Zytosol (Finley et al., 1984; Jentsch et al., 1987; Hurtley und Helenius, 1989; Klausner und Sitia, 1990; Sommer und Jentsch, 1993; Jensen et al., 1995). Wie bereits erläutert wurde, unterliegen ER-Proteine der Qualitätskontrolle durch den Calnexin-Zyklus. Permanent missgefaltete Proteine werden schließlich mit Hilfe von Chaperonen sowie der Glykosylierungsmaschinerie erkannt (McCracken und Brodsky, 1996; Plemper et al., 1997; Jakob et al., 1998) und retrograd ins Zytosol zurücktransportiert (Wiertz et al., 1996; Plemper et al., 1997; Zhou und Schekman, 1999). Ein wichtiges Signal für Fehlfaltung ist der Mannose-Status der Glykoproteine. Während die Abspaltung der terminalen Glucosereste als Zeichen für korrekte Faltung und Weitertransport in den Golgi dient, ist das Abspalten von Mannoseresten durch ER-Mannosidasen ein Signal für ERAD (Cabral et al., 2001). Die so modifizierten, terminal fehlgefalteten Proteine sind Substrate für die sogenannte ER degradation-enhancing-1,2-mannosidase-like (EDEM)-Familie (Hosokawa et al., 2001, Mast et al., 2005, Olivari et al., 2005). Die Identität der Oligosaccharid-Zusammensetzung, die zur Erkennung der fehlgefalteten Glykoproteine durch EDEM-Proteine führt, wird momentan noch kontrovers diskutiert. Es wird jedoch vermutet, dass in Säugetieren fünf bis sechs Mannosereste dafür nötig sind (Frenkel et al., 2003). An EDEM gebundene missgefaltete, lumenal lokalisierte Proteine werden retrograd durch eine bisher noch nicht identifizierte Translokationspore ins Zytosol transloziert. Möglicherweise handelt es sich dabei um Sec61, das auch am Import beteiligt ist (Wiertz et al., 1996; Plemper et al., 1997; Zhou und Schekman, 1999). Alternativ oder zusätzlich könnte auch das Transmembranprotein Derlin-1 an der Retrotranslokation beteiligt sein (Lilley und Ploegh, 2004, Ye et al., 2004). Obwohl der genaue Mechanismus des Rücktransports noch nicht geklärt ist, wird davon ausgegangen, dass die ERAD-Substrate im Zytosol schließlich deglykosyliert und polyubiquitiniert werden, was als Signal für den Abbau durch das 26S-Proteasom dient (Schlesinger et al., 1975; Chau et al., 1989). Das sogenannte Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist der Hauptmechanismus des regulierten Proteinabbaus im Zytosol und gekoppelt mit der ERAD- Maschinerie auch für die kontrollierte Degradierung terminal fehlgefalteter ER-Proteine zuständig (Ciechanover und Brundin, 2003). 34

44 Einleitung UPR Sollten missgefaltete Proteine im ER akkumulieren und die Faltungs- und Prozessierungsmaschinerie überlasten, wird eine Stressantwort, die sogenannte Antwort auf ungefaltete Proteine (engl. unfolded protein response, UPR), ausgelöst (Kozutsumi et al., 1988; Gething und Sambrook, 1992; Malhotra und Kaufman, 2007). Die UPR verfolgt verschiedene Ziele. Erstens wird versucht, die normale zelluläre Funktionalität aufrecht zu erhalten, indem die Proteintranslation gestoppt und eine komplexe Signaltransduktionskaskade aktiviert wird, um die Produktion verschiedener Chaperone zu induzieren (Mori et al., 1992). So bewirkt die UPR unter anderem die gesteigerte Transkription der ER-Chaperone BiP und Grp94 sowie der Protein-Disulfid-Isomerase (Dorner et al., 1990; Little und Lee, 1995). Des Weiteren wird die Bildung der Proteasomuntereinheiten hochreguliert, was einen verstärkten proteasomalen Abbau der missgefalteten Proteine im Zytosol ermöglicht (Ng et al., 2000). Sollte dieses Ziel von der Zelle nicht erreicht werden und die Überlastung Überhand nehmen, so wird über die UPR als letzter Ausweg Apoptose induziert (Breckenridge et al., 2003). Mehrere Studien haben gezeigt, dass BiP in der UPR als Stresssensor dienen kann. Unter physiologischen Bedingungen (Abb. 17, A) liegt genügend BiP im ER-Lumen vor, um einerseits seine Funktion als Chaperon auszuüben, andererseits aber auch als Stresssensor an die Rezeptoren PERK (protein kinase RNA (PKR)-like ER kinase), IRE1 (Inositol-requiring protein-1) und ATF6 (activating transcription factor-6) zu binden. Unter Stressbedingungen (Abb 17, B) steigt die Anzahl fehlgefalteter Proteine im Lumen. In seiner Funktion als Chaperon bindet BiP vermehrt an nicht-native ER-Proteine und folglich vermindert an die Stressrezeptoren. Diese unterliegen dadurch einer Konformationsänderung oder Relokalisierung innerhalb der Zelle und induzieren daraufhin verschiedene UPR-Signalwege (Shamu und Walter, 1996; Harding et al., 1999; Haze et al., 1999; Urano et al., 2000; Bertolotti et al., 2000; Okamura et al., 2000; Yoneda et al., 2001). Alternativ zu diesem BiPvermittelten Mechanismus, besteht auch die Vermutung, dass fehlgefaltete Proteine selbst lumenal an die Rezeptoren binden und sie so aktivieren (Credle et al., 2005). 35

45 Einleitung Abb. 17. Vereinfachte schematische Darstellung der Induktion der UPR. Ob BiP und/oder fehlgefaltete Proteine als Stresssensoren der UPR agieren, ist noch nicht geklärt. Vereinfacht ist hier nur BiP dargestellt, welches unter physiologischen Zuständen an die Rezeptoren PERK, IRE und ATF bindet (A). Unter ER-Stressbedingungen wird BiP vermehrt für die Faltung sekretorischer Proteine benötigt (B). In Folge der verminderten Bindung an BiP oligomerisieren die Rezeptoren PERK und IRE, werden autophosphoryliert und induzieren verschiedene Wege, um die Zelle vor der Überlastung durch missgefaltete Proteine zu schützen. ATF6 wird nach Aktivierung auf bisher noch nicht geklärte Weise in den Golgi-Apparat transportiert wo es proteolytisch prozessiert wird und so zur UPR-Antwort beiträgt. Die verschiedenen Arme der UPR umfassen die Induktion der Chaperonsynthese, vermehrten Proteinabbau im Zytosol und gegebenenfalls auch Apoptose. Abbildung modifiziert aus (Ma und Hendershot, 2004) Kotranslokationale Qualitätskontrolle Erst kürzlich wurde ein alternativer Mechanismus zur ER-assoziierten Degradierung von sekretorischen Proteinen beschrieben (Abb. 18). Die sogenannte kotranslokationale Qualitätskontrolle (cqc) stellt einen Mechanismus zur Regulation der Translokation von Polypeptiden ins ER dar (Kang et al., 2006; Oyadomari et al., 2006; Hegde und Kang, 2008). Die Beobachtung, dass sekretorische Proteine teilweise nicht von der Signalpeptidase prozessiert wurden und daher noch eine ungeschnittene ER-SS aufweisen, diente als Hinweis dafür, dass sie nicht vollständig ins ER importiert wurden (Rutkowski et al., 2007, Oyadomari et al., 2006). So wurde vermutet, dass die cqc bereits vor oder während der Proteintranslokation stattfindet, um das ER frühestmöglich vor einer Überlastung durch fehlgefaltete Proteine zu schützen. Substrate der cqc werden nicht in das ER importiert, sondern kotranslokational ins Zytosol geleitet, wo sie proteasomal degradiert werden. 36

46 Einleitung Abb. 18. Ko- und posttranslokationale Qualitätskontrolle von ER-Proteinen. Während die ER-assoziierte Degradierung (ERAD) einen posttranslokationalen QC-Mechanismus darstellt, um fehlgefaltete Proteine zu erkennen, aus dem ER zu translozieren und im Zytosol über das Proteasom abzubauen, greift der alternative Mechanismus der sogenannten präventiven oder kotranslokationalen Qualitätskontrolle (cqc) bereits ein, bevor die Proteintranslokation abgeschlossen ist und verhindert somit einen Import der Proteine in das ER. Stattdessen werden die Proteine direkt ins Zytosol geleitet, wo sie vom Proteasom abgebaut werden. Vor allem unter ER-Stressbedingungen kann es für die Zelle von Vorteil sein, sekretorische Proteine nicht konstitutiv ins ER zu importieren, da dies die Faltungs-Maschinerie überlasten würde und in Folge zur zellulären Dysfunktion führen könnte. Eine Studie zeigte, dass verschiedene sekretorische Proteine, darunter PrP, unter ER-Stress vermindert ins ER transloziert wurden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Regulation der Translokation abhängig von den Eigenschaften des Signalpeptids ist (Kang et al., 2006). Auch für das Kochaperon p58 IPK, das bisher allein für seine Funktion als UPR-induzierter Inhibitor der eif2α-kinase PERK bekannt war (Lee et al., 2003, Yan et al., 20022, van Huizen et al., 2003), wurde eine Funktion in der kotranslokationalen Degradierung von Proteinen vermutet. Einer Studie zufolge liegt p58 IPK mit dem Sec61-Komplex assoziiert vor und vermittelt durch Rekrutierung von Hsp70 an die zytosolische Seite des Translokons die kotranslokationale Degradierung von Proteinen unter ER-Stressbedingungen (Oyadomari et al., 2006). Alternativ wurde in einer darauf folgenden Studie postuliert, dass p58 IPK mit BiP assoziiert im ER-Lumen lokalisiert ist und dort indirekt Einfluss auf die Translokation und Maturierung der naszierenden Polypeptidkette ausübt. Da die Translokation ins ER unter anderem von lumenalen Chaperonen gefördert wird, könnte diesem Modell zufolge die 37

47 Einleitung reduzierte Menge an frei vorliegendem BiP aufgrund verstärkter Assoziation mit p58 IPK dafür verantwortlich sein, dass die Translokationseffizienz vermindert wird (Rutkowski et al., 2007). Die cqc beruht wahrscheinlich auf dem Zusammenspiel zwischen intrinsischen Eigenschaften der Polypeptide und extrinsischen Faktoren wie p58 IPK, die die Modulation der Translokation ermöglichen und somit versuchen, die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Die genauen molekularen Mechanismen der Substrat-spezifischen Regulation der Translokation sind bisher aber unbekannt. 38

48 Einleitung 1.6 Zielsetzung Die vorliegende Doktorarbeit umfasst zwei verschiedene Themenbereiche: Teil 1 - Translokation von PrP ins ER: die Rolle intrinsischer und zellulärer Faktoren Für einige Prion-Erkrankungen konnte gezeigt werden, dass die Missfaltung und Fehllokalisation von PrP Neurodegeneration in Abwesenheit von PrP Sc induzieren kann. Zwei pathogene, mit dem GSS-Syndrom in Zusammenhang stehende, Mutanten sind partiell im Zytosol lokalisiert und induzieren dort Apoptose. Der erste Teil der Doktorarbeit sollte sich daher mit der Entstehung toxischer, zytosolischer PrP-Mutanten und allgemeiner mit der Regulation des kotranslationalen Imports in das ER befassen. Es sollte ein Mausmodell für die GSS-Mutante Q160X generiert werden, um die Biogenese und die toxischen Mechanismen dieser Mutante im Tiermodell zu studieren. Des Weiteren sollten im Zellkulturmodell generell die intrinsischen und zellulären Faktoren, die für eine effiziente Translokation von PrP ins ER notwendig sind, analysiert werden. Teil 2 - Biochemische Charakterisierung von PrP-Homologen aus dem Zebrabärbling (Danio rerio) PrP ist ein hoch konserviertes Protein, das in vielen verschiedenen Spezies gefunden werden konnte. Dennoch ist über die evolutionäre Entstehung und Funktion von PrP noch sehr wenig bekannt. Um festzustellen, ob PrP-Homologe aus dem Zebrabärbling (Danio rerio), wie mittels bioinformatischer Programme vorhergesagt, in das ER importiert, ko- und posttranslational modifiziert und ähnlich zu Säugetier-PrP an der Außenseite der Zellmembran GPI-verankert werden, sollte im Zellkulturmodell eine biochemische Analyse von zwei verschiedenen mit PrP verwandten Proteinen aus dem Zebrabärbling durchgeführt werden. Dies sollte zeigen, ob die vorhergesagte evolutionäre Konservierung der Biogenese der Proteine zwischen Fisch und Säugetieren zutrifft und Aufschluss über die funktionellen Verhältnisse der einzelnen konservierten Domänen und Proteinmodifikationen geben. 39

49 Ergebnisse 2 Ergebnisse 2.1 Teil 1 - Translokation von PrP ins ER: die Rolle intrinsischer und zellulärer Faktoren Wie bereits in Abschnitt erwähnt, kann PrP - auch in Abwesenheit von PrP Sc - toxisches Potential erwerben, wenn es nicht oder nicht vollständig ins ER importiert wird. Die Expression von PrP mit deletierter ER-Signalsequenz führt zur Lokalisierung des Proteins im Zytosol. Transgene Mäuse, die diese zytosolische Form von PrP überexprimierten, wiesen einen schweren neurodegenerativen Phänotyp auf (Ma et al., 2002). Des Weiteren konnte auch Wildtyp PrP in Neuronen teilweise im Zytosol lokalisiert gefunden werden (Mironov et al., 2003). Die zwei humanpathogenen, C-terminalen Deletionsmutanten Q160X und W145X ( X bezeichnet ein Stop-Codon) führen im Menschen zum Gerstmann-Sträussler-Scheinker Syndrom (GSS), einer familiären Form von Prion-Erkrankungen (Kitamoto et al., 1993; Finckh et al., 2000). Interessanterweise konnte im Zellkulturmodell gezeigt werden, dass Q160X und Q145X nur partiell ins ER importiert wurden (Heske et al., 2004, Zanusso et al., 1999) und Apoptose induzierten (Rambold et al., 2006). Diese Daten zeigen, dass eine Veränderung des ER-Imports zur Generierung einer neurotoxischen PrP-Spezies führen kann. Im ersten Teil der Arbeit wurden deshalb zwei Aspekte bearbeitet: A) Generierung eines Mausmodells für die GSS-Mutante Q160X B) Analyse der intrinsischen und zellulären Faktoren, die für eine effiziente Translokation von PrP ins ER notwendig sind 40

50 Ergebnisse Teil 1A - Generierung eines Mausmodells für die GSS-Mutante Q160X Im Zellkulturmodell durchgeführte Studien zeigten, dass die pathogene, mit GSS assoziierte C-terminale Deletionsmutante Q160X nur partiell ins ER importiert wird, während eine Fraktion des Proteins im Zytosol vorliegt und Apoptose induziert (Heske et al., 2004, Rambold et al., 2006). Um diese Daten anhand eines Mausmodells in vivo zu verifizieren, sollte die PrP-Mutante Q160X transgen in Mäusen überexprimiert werden. Darüber hinaus sollte mit diesem Tiermodell der Mechanismus, der zur Neurodegeneration von zytosolisch lokalisierten Formen von PrP führen könnte, genauer geklärt werden. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass Q160X im Mensch einen dominanten Erbgang aufweist, was bedeutet, dass die Expression von Q160X offensichtlich einen toxischen Effekt hat. Für die Generierung des GSS-Mausmodells wurde das der murinen AS-Sequenz von PrP entsprechende Äquivalent Q159X verwendet. Parallel zur PrP-Q159X Maus wurden auch zwei transgene Mauslinien generiert, die humanes Parkin (hp) und eine Stop-Mutante von Parkin (W453X) überexprimieren sollten Generierung einer PrP-Q159X überexprimierenden transgenen Mauslinie Für die Expression in transgenen Mäusen musste das DNA-Konstrukt für murines PrP- Q159X zuerst in den sogenannten halb genomischen phgmmprp Vektor kloniert werden (Fischer et al., 1996, siehe Abschnitt 6.1.3, Abb. 49). Dieser enthält mit Ausnahme des Introns 2 nahezu das komplette murine Prnp mit dem endogenen murinen PrP-Promoter, der zu einer hohen Expression im Gehirn führt. Nach erfolgter Mikroinjektion des aufgereinigten phgmm-q159x Konstrukts in Zygoten aus FVB Mäusen (durchgeführt von Michael Bösl vom Max-Planck-Institut für Biochemie) konnten 62 Foundertiere (27 Weibchen und 35 Männchen) der F0-Generation erhalten werden. Diese mussten einer Genotypisierung unterzogen werden, um jene Mäuse zu identifizieren, die das Transgen per Injektion ins Genom integriert haben. Die Analyse mittels sequenzspezifischer PCR ergab 13 positive Mäuse (8 Weibchen und 5 Männchen) (Abb.19A). 41

51 Ergebnisse Abb. 19. Mäuse haben die transgene DNA per Mikroinjektion aufgenommen und in die Keimbahn integriert. Agarosegelfoto der Genotypisierung ausgewählter Mäuse der F0 Generation (A) sowie der Genotypisierung der Nachkommen (F1) der positiv getesteten Linie 48 (B). Nach Entnahme einer Schwanzbiopsie und Präparation genomischer DNA wurde mittels sequenzspezifischer PCR das Transgen (Tg) amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden auf ein Agarosegel geladen und analysiert. Als Positivkontrolle wurden direkt 10 fg und 100 fg des phgmm-q159x Plasmids im Gemisch mit genomischer DNA aus Wildtyp FVB-Mäusen aufgetragen. Als Negativkontrolle diente H 2 O beziehungsweise genomische DNA von Wildtyp FVB-Mäusen (FVB). M, 100-Basenpaar (bp)-marker. Ausgehend von den positiv für das Transgen Q159X getesteten Tieren der F0 Generation wurden mehrere Mauslinien gezüchtet. Bei den daraus entstandenen positiv getesteten Mäusen der F1-Generation (Abb. 19B) geht man davon aus, dass die DNA in die Keimbahn integriert wurde, da das Transgen auf die Nachkommen weitervererbt werden konnte. Schließlich fanden mit diesen F1-Mäusen die ersten Untersuchungen zur Expression von Q159X statt Analyse der Proteinexpression transgener Q159X-Mäuse Für die Expressionsanalyse auf Proteinebene wurde Hirngewebe analysiert. Nach Lyse in 0,5% Triton X-100/0,5% Deoxycholat (DOC) wurden die daraus gewonnenen Proteinextrakte mittels Western Blot unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers (mab) 3F4 analysiert. Als Positivkontrolle diente eine Hamster-PrP überexprimierende Maus (HaPrP), die 42

52 Ergebnisse freundlicherweise von Herrn Prof. Kretzschmar zur Verfügung gestellt wurde. Hamster-PrP weist das gleiche Epitop auf, das auch im transgenen Konstrukt artifiziell vorhanden ist und welches mittels mab 3F4 detektiert werden kann (Kascsak et al., 1987). Im Gegensatz dazu kann endogen vorhandenes Maus-PrP von diesem Antikörper nicht erkannt werden. Als Negativkontrolle wurde ein Proteinextrakt aus Parkin überexprimierenden Mäusen inkludiert (hp). Die Western Blot Analyse ergab, dass nur HaPrP detektiert werden konnte, während bei der Q159X-Maus Tg377 keine Expression von Q159X beobachtet werden konnte (Abb. 20). Alle weiteren getesteten transgenen Linien zeigten ebenfalls keine Proteinexpression (Daten nicht gezeigt). Abb. 20. Q159X-Mäuse zeigen keine Überexpression des Transgens. Hirngewebe aus Mäusen wurde in 0,5% Triton X-100/0,5% DOC lysiert und die gewonnenen Proteinextrakte mittels Immunblotting analysiert. Repräsentativ für die analysierten transgenen Q159X Mäuse der F1 Generation ist die Maus Tg377, ein Nachkomme der Maus Tg48, im Western Blot gezeigt (Q159X). Als Positivkontrolle wurde eine Hamster-PrP überexprimierende Maus analysiert (HaPrP). Als Negativkontrolle diente Hirngewebe aus transgenen Mäusen, die humanes Parkin überexprimieren (hp). Sowohl die Detergens-lösliche (S) als auch die Detergens-unlösliche (P) Fraktion der Proben wurde in zwei unterschiedlichen Mengen (60 und 80 µl) aufgetragen. PrP wurde unter Verwendung des mab 3F4 detektiert Analyse der mrna-levels transgener Q159X-Mäuse Zellkulturstudien zeigten, dass Q159X nur teilweise ins ER importiert wird und eine Fraktion des Proteins im Zytosol vorliegt, wo sie proteasomal abgebaut wird (Heske et al., 2004). Das Transgen Q159X konnte zwar auf DNA- nicht aber auf Proteinebene detektiert werden. Eine Erklärung dafür könnte die schnelle Degradierung des Proteins oder die verhinderte Transkription der DNA sein. Um dies zu analysieren, wurde die Q159X-mRNA mittels Northern Blotting untersucht. 43

53 Ergebnisse Die für die Northern Blot Analyse benötigte RNA wurde aus Hirngewebe isoliert und auf einem Agarosegel aufgetrennt. Nach erfolgtem Transfer auf eine Nitrozellulosemembran wurde sie mit einer radioaktiv markierten, sequenzspezifischen Sonde, die neben der Stop- Mutante Q159X auch endogenes PrP erkennt, detektiert. Als Positivkontrollen wurden eine PrP überexprimierende Maus (Tg20) sowie eine transgene PrPΔ32-94-Maus verwendet (C4). Letztere zeigt eine Überexpression von PrP, bei dem die Repeat-Region (AS 32-94) deletiert wurde. Als Negativkontrolle diente eine PrP knockout Maus (-/-). Diese drei Mäuse wurden freundlicherweise von Herrn Prof. Kretzschmar zur Verfügung gestellt. Des Weiteren wurde das Plasmid phgmm-q159x direkt auf das RNA-Gel aufgetragen. Abbildung 21 zeigt einen repräsentativen Northern Blot. Die mrna von PrP konnte bei der PrP überexprimierenden Maus (Tg20) und den analysierten transgenen Mäuse detektiert werden. Wie erwartet wies die PrP knockout Maus (-/-) keine endogene PrP-mRNA auf. Die Analyse der transgenen PrPΔ32-94-Maus (C4) ergab eine mrna-bande, die eine leicht erhöhte Mobilität auf dem Agarosegel zeigte, was darauf zurückzuführen ist, dass in diesem Konstrukt die Oktarepeat-Region fehlt. Das Plasmid phgmm-q159x wurde erwartungsgemäß ebenfalls von der radioaktiv markierten Sonde erkannt. Im Gegensatz dazu konnte bei allen getesteten transgenen Mäusen der F1-Generation jedoch zusätzlich zur endogenen PrP-mRNA keine mrna des Transgens gefunden werden. Diese Resultate deuten darauf hin, dass in den generierten Mäusen aus der integrierten Q159X-DNA keine mrna gebildet wurde und die fehlende Proteinexpression darauf zurückzuführen ist. 44

54 Ergebnisse Abb. 21. Transgene Mäuse bilden keine Q159X-mRNA. Repräsentative Northern Blot Analyse verschiedener Mauslinien der F1-Generation. Die benötigte RNA wurde aus Hirngewebe isoliert und auf ein Agarosegel geladen. Nach erfolgreichem Transfer auf eine Nitrozellulosemembran wurde die RNA mit einer radioaktiv markierten, sequenzspezifischen Sonde inkubiert, die neben der Stop-Mutante Q159X auch PrP detektieren kann. Als Kontrollen dienten eine PrP knockout Maus (-/-), sowie eine PrP überexprimierende Maus (Tg20) und eine Maus, die PrP ohne die Oktarepeat-Region (AS 32-94) überexprimiert (C4). Zusätzlich wurde als Positivkontrolle das für die Mikroinjektion der Mäuse verwendete Plasmid phgmm-q159x direkt auf das RNA-Gel aufgetragen Zusammenfassung Zusammenfassend ergaben die gezeigten Daten, dass die generierten Mäuse das Transgen Q159X auf DNA-Ebene in ihre Keimbahn integrieren und auf ihre Nachkommen weitergeben konnten. Es konnte jedoch weder mrna noch überexprimiertes Protein detektiert werden. Eine Erklärung hierfür könnte die zufällige Integration der DNA ins Heterochromatin, einem transkriptionell inaktiven Bereich des Chromatins, in dem die DNA dicht gepackt vorliegt, sein. Dies hätte zur Folge, dass die DNA zwar ins Genom integriert, dort aber nicht transkribiert wird. Des Weiteren könnte die Toxizität des Transgens ein Problem dargestellt haben. Wie bereits in Zellkulturstudien gezeigt werden konnte, führt die Expression des Proteins Q159X zu Apoptose neuronaler Zellen (Rambold et al., 2006). Es könnte also auch 45

55 Ergebnisse eine negative Selektion stattgefunden haben, sodass nur jene transgene Mausembryonen überlebt haben, die das Protein nicht exprimieren. Dass die fehlende Expression von Q159X vermutlich nicht auf technische Probleme zurückzuführen ist, zeigen die Ergebnisse der parallel generierten transgenen Parkin-Mäuse. Die Mäuse, die humanes Parkin (hp) und eine Stop-Mutante (W453X) überexprimieren, wurden analog zu den PrP-Q159X Mäusen unter Verwendung des gleichen Expressionsvektors und identischer Bedingungen generiert. Der in Abbildung 22 dargestellte Western Blot zeigt deutlich, dass diese Mäuse das Transgen im Gehirn exprimieren. Darüberhinaus konnten erfolgreich jeweils mehrere Mauslinien mit unterschiedlichen Expressionslevels erhalten werden (Abb. 22, hp1 und hp2, W453X 1 und W453X 2). Diese Resultate sollen veranschaulichen, dass die verwendete Strategie zur Generierung transgener Mäuse richtig gewählt wurde und die Durchführung grundsätzlich funktioniert hat. Die fehlende Expression von Q159X ist daher wahrscheinlich auf intrinsische Faktoren des Transgens zurückzuführen. Abb. 22. Transgene Parkin-Mäuse exprimieren Parkin (hp) und die Stop-Mutante W453X in unterschiedlichen Mengen. Hirngewebe aus Mäusen wurde in 0,5% Triton X- 100/0,5% DOC lysiert und die gewonnenen Proteinextrakte mittels Immunblotting analysiert. Als Negativkontrolle diente Hirngewebe von Wildtyp FVB-Mäusen (FVB). Die Detektion von humanem Parkin (hp) und der Stop-Mutante W453X erfolgte unter Verwendung des pab anti-hp. Jeweils zwei unterschiedliche Mauslinien (1 und 2) wurden analysiert. Aktin wurde mittels mab anti-aktin nachgewiesen und diente als Ladekontrolle für gleiche Proteinmengen. Die gezeigten Western Blot Analysen wurden von Frau Anita Schlierf durchgeführt und freundlicherweise zur Verfügung gestellt. 46

56 Ergebnisse Teil 1B - Analyse der intrinsischen und zellulären Faktoren, die für eine effiziente Translokation von PrP ins ER notwendig sind Eine ineffiziente Translokation von PrP oder PrP-Mutanten ins ER und damit verbundene Fehllokalisierung im Zytosol können zu neurotoxischen PrP-Spezies führen (vgl. Abschnitt 1.4.2). Zusätzlich konnte vor kurzem gezeigt werden, dass die Regulation der Translokation einen generellen Qualitätskontroll-Mechanismus der Zelle darstellt, um nicht-native Proteine frühestmöglich dem proteasomalen Abbau zuzuführen (vgl. Abschnitt ). Diese sogenannte kotranslokationale Qualitätskontrolle (cqc) scheint ein alternativer Mechanismus zur ER-assoziierten Degradierung (ERAD) zu sein, bei der Proteine erst ins ER importiert und, falls fehlgefaltet, ins Zytosol zurücktransportiert werden, um dort proteasomal abgebaut zu werden. Noch ist sehr wenig über die cqc und die Faktoren, die sie beeinflussen, bekannt. Bisherige Studien haben ergeben, dass das Signalpeptid der naszierenden Polypeptide vor allem unter ER-Stressbedingungen wichtig für eine effiziente Translokation ist (Kang et al., 2006). Neben der Signalsequenz könnte aber auch der Faltungszustand der naszierenden Polypeptidkette ein möglicher Modulator des ER-Imports sein. Die Ausbildung von Sekundärstrukturen konnte bereits im ribosomalen Exit-Tunnel beobachtet werden (Lu und Deutsch, 2005b; Woolhead et al., 2004; Mingarro et al., 2000; Whitley et al., 1996). Des Weiteren ergab eine Studie, dass die Translokation durch die Sekundärstruktur von sich noch im Ribosom befindlichen Bereichen der naszierenden Kette moduliert werden kann. Es wurde gezeigt, dass die Sekundärstruktur im ribosomalen Exit- Tunnel die zeitliche Steuerung beeinflusst, mit der zuvor gebildete Domänen des untersuchten Transmembranproteins Kontakt zum Translokon herstellen und durch die Pore transloziert werden (Daniel et al., 2008). PrP ist ein interessantes Modellprotein, um zu untersuchen, ob die Sekundärstruktur die Translokationseffizienz modulieren kann, da es eine außergewöhnliche, modulare Struktur besitzt. Der N-terminale, 120 AS lange Bereich von PrP ist flexibel und unstrukturiert während die 110 AS umfassende C-terminale Domäne globulär gefaltet ist und drei α- Helices sowie ein kurzes β-faltblatt beinhaltet (Riek et al., 1996; Riek et al., 1997, siehe Abschnitt 1.2.5). Im Zellkulturmodell sollte anhand des Modellproteins PrP und verschiedener, neu generierter Konstrukte geklärt werden, ob die Sekundärstruktur der naszierenden Polypeptidkette den ER-Import modulieren kann. Darüber hinaus sollte die Rolle zellulärer Faktoren für die Translokation analysiert werden. 47

57 Ergebnisse Die C-terminale GPI-Signalsequenz ist für den ER-Import entbehrlich, spielt aber eine Rolle bei der Umwandlung von mannosereichen Glykanen in komplexe Glykane PrP besitzt eine N-terminale ER-SS (AS 1-22), die den kotranslationalen Import ins ER vermittelt, sowie zwei Konsensussequenzen für N-Glykosylierung (N180 und N196) und eine GPI-SS (AS ) am C-Terminus (Stahl et al., 1987; Haraguchi et al., 1989). Im Golgi- Apparat werden die Kernglykane in komplexe Glykane umgewandelt und PrP wird an die Plasmamembran transportiert, wo es an der Außenseite GPI-verankert lokalisiert ist (vgl. Abschnitt 1.2.4). Studien zeigten, dass PrP mit deletierter GPI-SS (S230X) von der Zelle effizient sekretiert, das heißt effizient ins ER importiert wird (Rogers et al., 1993, Kocisko et al., 1994, Winklhofer et al., 2003). Dies konnte durch die hier durchgeführte Analyse ebenfalls demonstriert werden. Die Expression von S230X in N2a Zellen ergab eine effiziente Sekretion ins Zellkulturmedium (M), während PrP als GPI-verankertes Protein nur im Lysat (L) detektiert werden konnte (Abb. 23). Dieses Ergebnis bestätigt den Befund, dass die Deletion der GPI-SS zwar die Verankerung des Proteins in der Membran verhindert, aber weder den Import in das ER noch den weiteren Transport durch den sekretorischen Biogeneseweg beeinträchtigt. Abb. 23. PrP mit deletierter GPI-SS (S230X) wird effizient ins ER importiert und sekretiert. Links: schematische Darstellung der Konstrukte. ER-SS, ER-Signalsequenz; α 1-3, α-helices 1-3; β1 und 2, β-faltblatt; gerade Linie, unstrukturierter Bereich; CHO, N- verknüpfte Glykosylierungsstelle; GPI-SS, GPI-Signalsequenz. Rechts: N2a Zellen wurden transient mit den gezeigten Konstrukten transfiziert. Proteine im Zelllysat (L) und im Zellkulturmedium (M) wurden mittels Western Blot unter Verwendung des mab 3F4 detektiert. Bei dieser Analyse konnten hinsichtlich der Maturierung von S230X zwei bereits beschriebene Phänomene verifiziert werden (Winklhofer et al., 2003). Einerseits ist im Gegensatz zu PrP das Ausmaß der Glykosylierung bei fehlendem GPI-Anker stark 48

58 Ergebnisse vermindert. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte die Tatsache sein, dass die Konsensussequenzen für N-Glykosylierung durch Deletion der GPI-SS relativ nah am C- terminalen Ende des Proteins lokalisiert sind, sodass sie nicht mehr so effizient von der Oligosaccharyltransferase modifiziert werden können (Whitley et al., 1996). Darüber hinaus konnten bei S230X im Gegensatz zu PrP keine komplex modifizierten Glykane detektiert werden. Um der Frage nachzugehen, ob die Deletion der GPI-SS generell bei Glykoproteinen dazu führt, dass keine komplexe Glykosylierung erfolgt, wurden die GPI-verankerten Proteine Doppel (Dpl) und GDNF-Rezeptor α (GFR) in die Analyse miteinbezogen. Zur Unterscheidung zwischen komplexen und mannosereichen Glykanen wurde ein Endoglykosidase H (EndoH)-Verdau der Zelllysate durchgeführt. Das Enzym EndoH aus Streptomyces plicatus spaltet spezifisch zwischen zwei N-Acetyl-Glucosamin-Resten, mit denen mindestens fünf Mannoseeinheiten verknüpft sind. Somit können mittels EndoH nur die Glykane, die in einer mannosereichen Form vorliegen abgespalten werden, während komplex glykosylierte Strukturen nicht verdaut werden können (vgl. Abschnitt 1.5.2, Robbins et al., 1984; Maley et al., 1989). Wie in Abbildung 24 ersichtlich, ändert bei beiden Volllängen-Proteinen (Dpl, GFR) die oberste Bande ihr elektrophoretisches Laufverhalten nach EndoH-Behandlung nicht, was ein Indiz dafür ist, dass diese Proteine EndoH-resistent und daher komplex glykosyliert werden (doppelte Pfeilspitze). Abb. 24. Die GPI-Verankerung ist für die Ausbildung von Glykanen mit komplexer Struktur notwendig. N2a Zellen wurden transient mit den darüber gezeigten Konstrukten transfiziert und das Zelllysat mit EndoH behandelt oder unbehandelt analysiert (±EndoH). 49

59 Ergebnisse Die Proteinexpression wurde unter Verwendung des anti-dpl Antiserums (Dpl, DplΔGPI) sowie des pab anti-gfrα (GFR, GFRΔGPI) untersucht. Doppelte Pfeilspitzen markieren die komplex glykosylierte Proteinfraktion, geschlossene Pfeilspitzen die mannosereiche Spezies und offene Pfeilspitzen unglykosylierte Proteine. Bei den korrespondierenden Mutanten mit deletierter GPI-SS (DplΔGPI, GFRΔGPI) liegt jedoch ausschließlich eine EndoH-sensitive, also mannosereiche Fraktion der Proteine vor (geschlossene Pfeilspitze). Die N-verknüpften Glykane von DplΔGPI und GFRΔGPI werden also offensichtlich nicht in komplexe Strukturen umgewandelt. Dass eine fehlende Membranverankerung mit der komplexen Glykosylierung interferiert, scheint demzufolge nicht nur für PrP, sondern auch für andere GPI-verankerte Proteine wie Dpl oder GFR zuzutreffen. Interessanterweise wurden trotz der fehlenden komplexen Glykosylierung sowohl DplΔGPI als auch GFRΔGPI von den Zellen effizient ins Zellkulturmedium sekretiert (Abb. 25, M). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die fehlende GPI-Verankerung von Dpl und GFR wie bei PrP mit der komplexen Glykosylierung, nicht aber mit effizientem ER-Import und dem weiteren Transport durch den sekretorischen Biogeneseweg interferiert. Abb. 25. Proteine mit deletierter GPI-SS werden effizient ins ER importiert. N2a Zellen wurden transient mit den angegebenen Konstrukten transfiziert. Proteine im Zelllysat (L) und im Zellkulturmedium (M) wurden mittels Western Blot unter Verwendung des anti-dpl Antiserums (Dpl, DplΔGPI) beziehungsweise des pab anti-gfrα (GFR, GFRΔGPI) untersucht. Die Tatsache, dass Proteine mit deletierter GPI-SS effizient ins ER transloziert werden, ist für die folgende Analyse der Regulation der Translokation wichtig, da alle weiteren in dieser Studie verwendeten Konstrukte ebenfalls ohne GPI-SS untersucht wurden. Studien zeigten 50

60 Ergebnisse außerdem, dass die GPI-SS ein Signal für ER-Import sein kann (Gu et al., 2008, Holscher et al., 2001) weshalb dieses Signal für die weitere Analyse deletiert werden sollte α-helikale Bereiche sind wichtig für einen effizienten ER-Import Wie bereits erläutert, wird S230X erfolgreich in das ER importiert und sekretiert (Abb. 23, S230X, M). Interessanterweise führte jedoch die Deletion eines Teils der α-helikalen Bereiche im C-Terminus von PrP zu einem verminderten ER-Import. In einer bereits früher durchgeführten Studie konnte gezeigt werden, dass die pathogene, mit GSS in Zusammenhang stehende, PrP-Mutante Q159X, der die α-helices 2 und 3 fehlen, nicht effizient in das ER importiert wird sondern partiell im Zytosol vorliegt (Heske et al., 2004; Zanusso et al., 1999). Diese Daten konnten in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Die Western Blot Analyse von Q159X zeigte, dass im Vergleich zu S230X kaum Sekretion ins Zellkulturmedium erfolgt (Abb. 26, Q159X, M). Es konnte nur eine schwache Bande im Zelllysat detektiert werden. Um zu klären, ob Q159X im Zytosol vorliegt und proteasomal abgebaut werden kann, wurde das Proteasom transient mit dem Inhibitor MG132 gehemmt. Die Inkubation für 3 h mit MG132 führte tatsächlich dazu, dass die relative Menge von Q159X im Lysat zunahm (Abb. 26, Q159X, L ± MG132). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass Q159X nicht vollständig in das ER importiert wird, sondern partiell im Zytosol auftritt, wo es proteasomaler Degradierung unterliegt. Um herauszufinden, ob die verkürzte Länge von Q159X für den verminderten ER-Import und den vermehrten proteasomalen Abbau verantwortlich ist, wurde eine weitere PrP-Mutante in die Analyse inkludiert. In Δ27-89/S230X wurde der N-terminale, unstrukturierte Teil von PrP (AS 27-89) deletiert. Dies führt dazu, dass diese Mutante zwar eine ähnliche Länge verglichen mit Q159X hat, jedoch noch den gesamten α-helikalen Bereich beinhaltet. Die Western Blot Analyse ergab, dass Δ27-89/S230X effizient in den Zellkulturüberstand sekretiert und nicht proteasomal abgebaut wird (Abb. 26, Δ27-89/S230X). Das Vorhandensein des α-helikalen, C-terminalen Bereichs von PrP scheint somit den Import in das ER stark zu verbessern. Fehlt dieser Bereich, wie im Fall der untersuchten Mutante Q159X, kann diese nicht mehr effizient ins ER importiert werden und unterliegt einem proteasomalen Abbau im Zytosol. 51

61 Ergebnisse Abb. 26. Das Vorhandensein α-helikaler Bereiche ist für einen effizienten ER-Import wichtig. Links: Schematische Darstellung der transfizierten Konstrukte. Rechts: N2a Zellen wurden transient mit den links gezeigten Konstrukten transfiziert und PrP im Zelllysat (L) und im Zellkulturmedium (M) mittels Western Blot unter Verwendung des mab 3F4 untersucht. Für die Analyse des Lysats wurden die Zellen vor der Lyse in An- oder Abwesenheit des proteasomalen Inhibitors MG132 für 3 h bei 37 C inkubiert (±MG132) Die Einführung einer zusätzlichen N-terminalen Konsensussequenz für N-Glykosylierung erleichtert die Analyse des ER-Imports Um die weitere Analyse des ER-Imports zu erleichtern, wurde N-terminal direkt nach der ER- SS eine zusätzliche Akzeptorstelle für N-verknüpfte Glykosylierung eingefügt. Mittels PCR wurden die Aminosäuren W31 und N32 gegen die Aminosäuren N und F ausgetauscht, wodurch das Glykosylierungsmotiv N-F-T generiert wurde. Um festzustellen, ob dieses zusätzliche Motiv von der Oligosaccharyltransferase (siehe Abschnitt 1.5.2) erkannt und genutzt wird, wurden PrP sowie PrP mit dem zusätzlichen Glykosylierungsmotiv (PrP/31 CHO ) parallel in N2a Zellen transfiziert und nach EndoH-Verdau des Lysats mittels Western Blotting analysiert. PrP/31 CHO weist im Vergleich zu PrP ein reduziertes Laufverhalten auf dem SDS-Gel auf, was darauf hindeutet, dass eine zusätzliche Glykosylierung vorliegt. Ein Verdau mit EndoH hatte kein verändertes Laufverhalten der Banden während der SDS- Elektrophorese zur Folge, was ein Indiz dafür ist, dass die Glykane an der Position N31 analog zu N180 und N196 EndoH-resistent und daher komplex glykosyliert sind (Abb. 27). Diese Daten lassen erkennen, dass die neu eingefügte Akzeptorstelle funktionell ist und komplex glykosyliert werden kann. Die zusätzliche Glykosylierung scheint außerdem nicht mit dem zellulären Transport von PrP an die Plasmamembran zu interferieren. 52

62 Ergebnisse Abb. 27. Die zusätzlich eingefügte Akzeptorstelle für N-verknüpfte Glykosylierung ist funktionell und wird komplex glykosyliert. Links: schematische Darstellung der transfizierten Konstrukte. Die zusätzliche Glykosylierungsstelle (CHO) an der AS-Position 31 ist rot markiert. Rechts: N2a Zellen wurden transient mit PrP oder PrP/31 CHO transfiziert. Die Gesamtzelllysate wurden anschließend entweder mit EndoH behandelt oder unbehandelt gelassen (±EndoH). PrP wurde unter Verwendung des mab 3F4 mittels Immunblotting detektiert. In Folge wurde diese zusätzliche Akzeptorstelle für Glykosylierung auch in verschiedene C-terminale Deletionsmutanten, darunter Q159X, eingefügt. Dies erleichterte die Analyse des ER-Imports der Mutanten, denen aufgrund der Deletion die endogenen Glykosylierungsstellen fehlen. Die transient transfizierten Zellen wurden mittels 35 S-Methionin radioaktiv markiert und direkt (pulse, p) oder nach einstündiger Inkubation mit frischem Medium (chase, c) analysiert. Parallel wurden Zellen während der pulse- und chase-phase mit 50 μm MG132 versetzt (+MG132). PrP im Lysat wurde mit dem mab 3F4 immunpräzipitiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Für Q159X/31 CHO wurden zwei Fraktionen beobachtet: eine elektrophoretisch langsamer laufende Bande, die nach Inkubation mit dem proteasomalen Inhibitor MG132 nicht stabilisiert werden konnte, was ein Indiz dafür ist, dass dies die glykosylierte Bande darstellt (Abb. 28, geschlossene Pfeilspitze), und eine elektrophoretisch schneller laufende Bande. Die relative Menge dieser Bande nahm nach Behandlung mit dem proteasomalen Inhibitor MG132 zu, was darauf hindeutet, dass diese Fraktion im Zytosol vorliegt und vom Proteasom abgebaut wird (Abb. 28, offene Pfeilspitze, ±MG132). Dieses Ergebnis zeigte, dass Q159X/31 CHO teilweise glykosyliert, also in das ER importiert werden kann, eine Fraktion des Proteins jedoch unglykosyliert im Zytosol vorliegt. Außerdem muss angemerkt werden, dass zwei distinkte unglykosylierte Banden beobachtet werden konnten. Wie später (Abschnitt ) noch genauer erklärt wird, stellt dabei vermutlich die Bande mit dem höheren elektrophoretischen Laufverhalten jene Fraktion von Q159X/31 CHO dar, die eine geschnittene Signalsequenz hat. Die unglykosylierte Proteinfraktion, bei der das Signalpeptid nicht prozessiert wurde, ist etwas größer und läuft daher etwas langsamer auf dem SDS-Gel. 53

63 Ergebnisse Die Effizienz des ER-Imports korreliert mit der Ausdehnung der α-helikalen Bereiche Um weitere Hinweise zu erhalten, dass die C-terminalen, α-helikalen Bereiche von PrP wichtig für einen effizienten ER-Import sind, wurden zusätzlich zu Q159X/31 CHO die Mutanten W144X/31 CHO und M133X/31 CHO, denen größere Teile des C-Terminus fehlen, generiert (Abb. 28A). Nach transienter Transfektion der Konstrukte wurden die Zellen mittels 35 S- Methionin radioaktiv markiert und direkt (pulse, p) oder nach Inkubation mit frischem Medium (chase, c) analysiert. Parallel wurden Zellen während der pulse- und chase-phase mit 50 μm MG132 versetzt (+MG132). PrP wurde mit dem mab 3F4 immunpräzipitiert und mittels SDS- PAGE analysiert. Die Analyse ergab, dass bei Q159X/31 CHO noch deutlich eine glykosylierte Fraktion detektiert werden konnte, wohingegen dies für W144X/31 CHO nur mehr in geringerem Maße und für M133X/31 CHO kaum mehr der Fall war (Abb. 28B, geschlossene Pfeilspitzen). Nach Hemmung des Proteasoms konnte bei den analysierten Proteinen die unglykosylierte Fraktion (Abb. 28B, offene Pfeilspitze, +MG132) stabilisiert und deutlich auf dem SDS-Gel nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass die verminderte beziehungsweise fehlende glykosylierte Fraktion nicht aufgrund verminderter Proteinsynthese zustande kam. Der Vergleich der untersuchten Mutanten ergab, dass mit der Abnahme der Menge an α-helikalen Bereichen das Ausmaß der Glykosylierung, und damit auch die Effizienz des ER-Imports abnimmt. Die Quantifizierung der Ergebnisse verdeutlicht, dass die Glykosylierungseffizienz invers mit der Größe der C-terminalen Deletion korreliert (Abb. 28C). Abb. 28. Die Effizienz des ER-Imports korreliert mit der Länge der α-helikalen Bereiche. (A) Schematische Darstellung der C-terminalen Deletionsmutanten. (B) N2a 54

64 Ergebnisse Zellen wurden transient mit den gezeigten Konstrukten transfiziert. Am nächsten Tag wurden die Zellen 1 h mit [ 35 S]-Methionin radioaktiv markiert und direkt (pulse, p) oder nach einstündiger Inkubation mit frischem Medium (chase, c) analysiert. Parallel wurden Zellen während der pulse- und chase-phase mit 50 μm MG132 versetzt (+MG132). PrP wurde mit dem mab 3F4 immunpräzipitiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Der hier gezeigte repräsentative Versuch wurde von Frau Dr. Sophia Kiachopoulos durchgeführt. Offene Pfeilspitzen markieren die unglykosylierte, geschlossene Pfeilspitzen die glykosylierte Fraktion. (C) Drei unabhängige Versuche wurden quantifiziert und das Verhältnis der glykosylierten zur unglykosylierten Proteinfraktion des chase + MG132 aufgetragen. Mittels studentischen t-tests wurden die p-werte ermittelt α-helikale Bereiche sind für einen effizienten ER-Import ausreichend Um zusätzliche Evidenzen zu erhalten, dass der verminderte ER-Import der C-terminalen Deletionsmutanten auf das Fehlen α-helikaler Strukturen im C-Terminus und nicht auf die verkürzte Länge der Mutanten zurückzuführen ist, wurden die Konstrukte A115X/31 CHO und Δ27-156/S230X generiert. Diese Mutanten sind 114 beziehungsweise 100 AS lang. Während A115X/31 CHO jedoch den N-terminalen Bereich von PrP umfasst und somit völlig unstrukturiert vorliegt, ist Δ27-156/S230X von α-helikalen Bereichen dominiert (Abb. 29) Eine Expression in N2a Zellen und die anschließende Immunpräzipitation der radioaktiv markierten Proteine zeigte, dass A115X/31 CHO kaum detektiert werden konnte (Abb. 29). Erst nach Inhibition des Proteasoms konnte eine Bande nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass A115X/31 CHO einem raschen proteasomalem Abbau unterliegt (offene Pfeilspitze). Dahingegen konnte Δ27-156/S230X bereits in den unbehandelten Zellen nachgewiesen werden (-MG132). Es konnten zwei Banden detektiert werden, die nach Hemmung des Proteasoms nicht stabilisiert werden konnten, was ein Indiz dafür ist, dass es sich dabei um die mono- und diglykosylierten Banden der Mutante handeln könnte (geschlossene Pfeilspitzen). Während also Δ27-156/S230X offensichtlich effizient glykosyliert und damit in das ER importiert wird, zeigt die annähernd gleich lange, aber unstrukturierte Mutante A115X/31 CHO keinen produktiven Import in das ER sondern liegt im Zytosol vor und wird proteasomal abgebaut. Der markante Unterschied in der Translokationseffizienz zwischen den beiden Mutanten deutet darauf hin, dass die Länge des Polypeptids in Bezug auf die Translokation nicht ausschlaggebend ist. Da angenommen werden kann, dass der α-helikale Bereich (α 2 α 3 ) von PrP den ER-Import fördert, wurde diese α-helikale Domäne an A115X fusioniert. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass in in vitro Experimenten gezeigt werden konnte, dass sich isolierte Peptidfragmente, die die Domäne α 2 α 3 von PrP beinhalten, strukturell autonom falten, das 55

65 Ergebnisse heißt, dass sie unabhängig von der Umgebung des Gesamtproteins eine α-helikale Konformation annehmen (Eberl und Glockshuber, 2002; Gallo et al., 2005). In der Tat stellte die Fusion der Helices an den unstrukturierten Teil von PrP den ER-Import wieder her. 115α 2 α 3 wird ebenso effizient glykosyliert wie Δ27-156/S230X (Abb. 29, 115α 2 α 3 ). Abb. 29. α-helikale Domänen sind für die Translokation in das ER notwendig. Neuroblastomzellen wurden transient mit den dargestellten Konstrukten transfiziert und 24 h später für 1 h radioaktiv markiert. Nach einstündiger Inkubation im frischen Medium in Anoder Abwesenheit des proteasomalen Inhibitors MG132 (±MG132) wurden die Zellen geerntet, lysiert und PrP im Zelllysat unter Verwendung des mab 3F4 immunpräzipitiert sowie anschließend mittels SDS-PAGE analysiert. Offene Pfeilspitzen markieren die unglykosylierte, geschlossene Pfeilspitzen die mono- und diglykosylierte PrP-Fraktion. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Effizienz des ER-Imports mit dem Ausmaß an α-helikalen Bereichen korreliert. Für eine erfolgreiche Translokation ist das Vorhandensein von α-helices, nicht aber die Länge des Polypeptids ausschlaggebend A115X/31 CHO wird offensichtlich kotranslokational degradiert Wie bereits erklärt wurde, gibt es zwei Mechanismen der Qualitätskontrolle von ER- Proteinen. Die während oder noch vor der Translokation stattfindende kotranslokationale Qualitätskontrolle (cqc) scheint ein alternativer Mechanismus zu ERAD zu sein, bei der nicht-native Proteine erst im ER erkannt und von dort aus zurück ins Zytosol transportiert werden müssen, wo sie proteasomaler Degradierung unterliegen. Wie gezeigt wurde, konnte nur eine unglykosylierte Fraktion von A115X/31 CHO nach Inhibition des Proteasoms gefunden werden. Es stellte sich die Frage, ob diese Mutante in das ER importiert und anschließend wieder exportiert wird oder ob sie noch vor einer vollständigen Translokation in das ER ins Zytosol geleitet und dort proteasomal abgebaut wird. 56

66 Ergebnisse Um eine mögliche transiente Glykosylierung der Mutante zu analysieren, wurde eine sehr kurze radioaktive Markierung der Proteine durchgeführt. Transfizierte N2a Zellen wurden nur 15 min radioaktiv markiert (pulse) und anschließend für weitere 15 beziehungsweise 30 min in frischem Medium inkubiert (chase). Bei PrP, das hier als Kontrolle für ein effizient importiertes Protein diente, wurde bereits im pulse eine glykosylierte Fraktion beobachtet. Im chase wurden zusätzlich zu den mono- und diglykosylierten Fraktionen komplexe Glykane detektiert (Abb. 30, PrP, geschlossene, doppelte Pfeilspitzen). PrP wurde demnach in dem analysierten Zeitraum in das ER importiert, glykosyliert und weiter in den Golgi-Apparat transportiert, wo die Kernglykane in komplexe Glykane umgewandelt wurden. Hingegen kann bei A115X/31 CHO in demselben Zeitraum nur eine unglykosylierte und keine glykosylierte Bande beobachtet werden (Abb. 30, offene Pfeilspitze). Dies deutet darauf hin, dass bei A115X/31 CHO auch in einer sehr kurzen Zeitspanne keine Glykosylierung im ER stattgefunden hat, was vermuten lässt, dass diese Mutante nicht ins ER importiert wurde. Abb. 30. A115X/31 CHO wird offensichtlich kotranslokational degradiert. Transient transfizierte N2a Zellen wurden für 15 min radioaktiv mit [ 35 S]-Methionin markiert und anschließend entweder direkt analysiert (pulse, p) oder für weitere 15 oder 30 min in unmarkiertem, frischem Medium inkubiert (chase, c). Die mit A115X/31 CHO transfizierten Zellen wurden in Anwesenheit von 50 µm MG132 inkubiert. Proteine wurden mit dem mab 3F4 immunpräzipitiert und mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Offene Pfeilspitze markiert die unglykosylierte PrP Spezies, geschlossene Pfeilspitzen die mono- und diglykosylierten und die doppelte Pfeilspitze die komplex glykosyliert auftretende Form von PrP α 2 α 3 wird unabhängig von einer N-verknüpften Glykosylierung und der Ausbildung einer Disulfidbrücke erfolgreich ins ER importiert Um herauszufinden, ob N-verknüpfte Glykosylierungen oder die Ausbildung einer Disulfidbrücke eine Funktion im ER-Import von 115α 2 α 3 haben, wurden verschiedene 57

67 Ergebnisse Mutanten, die in Abbildung 31 schematisch dargestellt sind, generiert. Zunächst wurden die C-terminalen Akzeptorstellen für N-Glykosylierung (N180, N196) mittels PCR-Techniken mutiert und stattdessen eine N-terminale Akzeptorstelle (N31) zur Detektion der Glykosylierung eingeführt. Die Western Blot Analyse der generierten Konstrukte ergab, dass die Deletion der C-terminalen Akzeptorstellen für N-Glykosylierung zu keinem verminderten ER-Import von 115α 2 α 3 führte. 115α 2 α 3 N196Q als auch 115α 2 α 3 N196Q/N180Q wurden effizient glykosyliert, was durch EndoH-Verdau sichtbar gemacht wurde (Abb. 31). Anschließend wurde ein Cystein-Rest, der zur Ausbildung der Disulfidbrücke von PrP notwendig ist (C178), mittels PCR-Techniken mutiert, sodass keine Disulfidbrückenbildung mehr möglich ist. Wie in Abbildung 31 ersichtlich, konnte auch bei 115α 2 α 3 C178A eine Glykosylierung beobachtet werden, was darauf schließen lässt, dass die Ausbildung einer Disulfidbrücke, genau wie die C-terminalen N-Glykosylierungen nicht für einen effizienten ER-Import notwendig sind. Abb. 31. ER-Import vom 115α 2 α 3 ist unabhängig von der N-verknüpften Glykosylierung sowie der Ausbildung einer Disulfidbrücke. Murine Neuroblastomzellen wurden transient mit den gezeigten Mutanten transfiziert. Das Zelllysat wurde in zwei Teile aufgeteilt, wobei ein Aliquot mit EndoH inkubiert wurde während das andere nicht behandelt wurde (±EndoH). Die PrP-Expression wurde mittels Western Blot unter Verwendung des mab 3F4 analysiert. 58

68 Ergebnisse Die Länge und möglicherweise die Lage der α-helikalen Domänen modulieren den ER-Import Im nächsten Schritt wurde untersucht, wie groß der α-helikale Bereich sein muss, um noch einen effizienten ER-Import von 115α 2 α 3 zu gewährleisten. In vitro Experimente zeigten, dass isolierte Peptidfragmente der Helix 3 von PrP (α 3 ) unabhängig von der Gesamtstruktur des Proteins eine stabile α-helikale Konformation einnehmen können, während die Stabilität der isolierten Helix 2 (α 2 ) reduziert ist (Gallo et al., 2005). Interessanterweise zeigten die hier durchgeführten Zellkulturexperimente, dass die isolierte Domäne α 2 nicht ausreichte, um eine effiziente Translokation zu ermöglichen. Die Western Blot Analyse von 115α 2 ergab, dass diese Mutante kaum glykosyliert wurde, was für einen verminderten ER-Import spricht, und stattdessen im Zytosol proteasomalem Abbau unterlag. Im Gegensatz dazu wurde die Mutante 115α 3, die die Helix 3 von PrP (α 3 ) umfasst, teilweise glykosyliert, was indiziert, dass die isolierte Domäne α 3 in der Lage ist, die Translokation ins ER zu fördern (Abb. 32). Darüber hinaus scheint auch die Lage der α-helikalen Bereiche innerhalb des Proteins den ER-Import zu beeinflussen. 115α 2 α 3 wird etwas schwächer glykosyliert als die umgekehrt angeordnete Mutante α 2 α 3 115, bei der die α-helices direkt nach der ER-SS liegen (Abb. 32). Abb. 32. Das Ausmaß der α-helikalen Bereiche und möglicherweise die Lage der α- Helices sind Faktoren für einen produktiven Import in das ER. N2a Zellen wurden 59

69 Ergebnisse transient mit den gezeigten Konstrukten transfiziert und in An- oder Abwesenheit des proteasomalen Inhibitors MG132 (30 µm, 3 h) inkubiert (±MG132). Die Gesamtzelllysate wurden mit EndoH inkubiert oder unbehandelt analysiert (±EndoH). PrP wurde mittels mab 3F4 und Western Blotting detektiert. Im 115α 3 -Blot wurde die EndoH+ Bande direkt neben die EndoH- Bande positioniert. Die Banden stammen jedoch von einem Gel. Diese Experimente bestätigen die Annahme, dass α-helikale Domänen ein Signal für effizienten ER-Import sind. Die Ausdehnung und möglicherweise die Lokalisierung der α-helices innerhalb des Proteins beeinflussen die Produktivität der Translokation Eine unglykosylierte Fraktion von 115α 2 α 3 wird nicht in das ER importiert sondern kotranslokational degradiert Wie bereits im Abschnitt erläutert, erfolgt die Abspaltung der N-terminalen ER-SS durch die Signalpeptidase während der Translokation des naszierenden Polypeptids in das ER. Die Degradierung nicht-nativer ER-Proteine über ERAD ist ein posttranslationaler Vorgang, bei dem Proteine erst im ER als fehlgefaltet erkannt und anschließend retrotransloziert werden, um im Zytosol abgebaut zu werden. Im Gegensatz dazu findet der alternative Mechanismus der cqc noch vor oder während der Translokation des Polypeptids statt. Wie in mehreren Studien demonstriert werden konnte, wird bei Proteinen, die der cqc unterliegen und die daher nicht vollständig in das ER-Lumen gelangen, das Signalpeptid nicht abgespalten. Die Proteine mit ungeschnittener ER-SS werden indessen direkt ins Zytosol geleitet und dort proteasomal abgebaut (Oyadomari et al., 2006, Kang et al., 2006, Rutkowski et al., 2007). Bei der Western Blot Analyse des Konstrukts 115α 2 α 3 konnte neben der glykosylierten, und daher in das ER importierten Fraktion, auch eine unglykosylierte Fraktion beobachtet werden. Bei genauerer Betrachtung der unglykosylierten Spezies konnten zwei distinkte Banden detektiert werden (Abb. 33). In Folge sollten diese unglykosylierten Spezies genauer untersucht werden. Nach Deglykosylierung des Zelllysats mit EndoH zeigte sich, dass die Menge der unteren, auf dem SDS-Gel schneller laufenden unglykosylierten Bande zunahm. Dies ist ein Indiz dafür, dass diese Bande, die von der glykosylierten Spezies stammt, vermutlich die Fraktion mit geschnittener Signalsequenz darstellt (Abb. 33, -ER-SS). Um diese Vermutung zu stützen, wurde die Mutante zyto115α 2 α 3 generiert, bei der die N-terminale ER-SS (AS 2-22) deletiert wurde. Ein Vergleich von 115α 2 α 3 und zyto115α 2 α 3 in der Western Blot Analyse zeigt, dass die untere der beiden unglykosylierten Banden von 115α 2 α 3 das gleiche Laufverhalten wie zyto115α 2 α 3 aufweist, was ein zusätzlicher Hinweis 60

70 Ergebnisse dafür ist, dass diese Fraktion mit geschnittener ER-SS vorliegt. Außerdem ergab die Analyse, dass diese Fraktion durch Inhibition des Proteasoms nicht stabilisierbar ist. Die relative Menge der zweiten unglykosylierten Bande von 115α 2 α 3 nahm jedoch nach Hemmung des Proteasoms deutlich zu und weist zusätzlich eine geringere elektrophoretische Mobilität als zyto115α 2 α 3 auf. Dies deutet darauf hin, dass diese Fraktion eine ungeschnittene SS hat (Abb. 33, +ER-SS). Eine quantitative Analyse der Resultate ergab, dass nach Hemmung des Proteasoms spezifisch die Menge an 115α 2 α 3 mit ungeschnittener SS ansteigt. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die glykosylierte und somit ins ER importierte Fraktion von 115α 2 α 3 eine geschnittene SS aufweist. Die Ergebnisse deuten des Weiteren darauf hin, dass eine unglykosylierte Spezies mit ungeschnittenem Signalpeptid vorliegt. Diese Fraktion könnte ein Substrat für die cqc sein, die Polypeptide noch vor dem vollständigen Import ins ER dem proteasomalen Abbau im Zytosol zuführt. Abb. 33. Polypeptide, die proteasomalem Abbau unterliegen, haben eine ungeschnittene Signalsequenz. N2a Zellen wurden transient mit den Konstrukten 115α 2 α 3 und zyto115α 2 α 3, bei dem die ER-SS (AS 2-22) deletiert worden ist, transfiziert und in Anoder Abwesenheit des proteasomalen Inhibitors MG132 für 3 h bei 37 C inkubiert (±MG132). Zelllysate wurden, wenn angezeigt, mit EndoH behandelt (±EndoH). Die Detektion von PrP erfolgte unter Verwendung des mab 3F4. Die unglykosylierte Fraktion mit und ohne dem ER- Signalpeptid ist mit einer Pfeilspitze markiert (±ER-SS). Eine Quantifizierung von mindestens drei unabhängigen Versuchen ist rechts dargestellt. Aufgetragen wurde das Verhältnis von 115α 2 α 3 mit ungeschnittener SS zu dem mit geschnittener SS mit und ohne Behandlung mit MG132. Der über studentischen t-test ermittelte p-wert ist angezeigt. 61

71 Ergebnisse α-helikale Bereiche heterologer Proteine fördern den ER-Import von PrP Wie bereits gezeigt worden ist, sind α-helikale Bereiche für die effiziente Translokation des unstrukturierten Teils von PrP wichtig. In Folge sollte geklärt werden, ob auch heterologe α-helikale Domänen die Fähigkeit besitzen den unstrukturierten Bereich von PrP ins ER zu translozieren. Für diese Analyse wurde das paraloge Protein Doppel (Dpl) in die Untersuchung miteinbezogen (vgl. Abschnitt 1.2.3). Dieses Protein weist in der C-terminalen Domäne α-helikale Bereiche auf, die jedoch keine signifikante Sequenzhomologie zu PrP zeigen (< 16%). Die beiden α-helices von Dpl wurden an A115X fusioniert und das dadurch generierte Konstrukt 115Dpl nach Expression in N2a Zellen mittels Western Blotting untersucht. Die Analyse ergab, dass 115Dpl effizient glykosyliert wurde, was für einen produktiven Import in das ER spricht (Abb. 34, 115Dpl). Um weitere, nicht homologe α-helikale Domänen zu testen, wurde außerdem der GDNF-Rezeptor α (GFR), ein überwiegend von α-helices dominiertes Protein, in die Analyse einbezogen (siehe Abschnitt , Abb. 24 und Leppanen et al., 2004). Die ersten beiden α-helices dieses heterologen Proteins wurden an den unstrukturierten Teil von PrP fusioniert. 115/31 CHO GFR wies in der Western Blot Analyse ebenfalls eine Glykosylierung auf, was einen erfolgreichen ER-Import indiziert (Abb. 34, 115/31 CHO GFR). Um auszuschließen, dass der ineffiziente ER-Import auf die Primärsequenz des unstrukturierten Bereichs von PrP zurückzuführen ist, wurde der Effekt von heterologen unstrukturierten Domänen analysiert (Abb. 34). Die Fusion von A115X/31 CHO mit der unstrukturierten Domäne von PrP (115/31 CHO +115) sowie mit einem unstrukturierten Bereich des humanen Proteins Tau (115/31 CHO +Tau) zeigte in der Western Blot Analyse keine Glykosylierung (±EndoH). Zusätzlich wurde bei beiden Konstrukten ein Anstieg der relativen Proteinmenge im Lysat nach Behandlung der Zellen mit MG132 detektiert (±MG132), was ein Indiz dafür ist, dass sie nicht in das ER importiert werden, sondern sich im Zytosol befinden und proteasomalem Abbau unterliegen (Abb. 34, 115/31 CHO +115, 115/31 CHO +Tau). Dieses Ergebnis zeigte, dass zusätzliche unstrukturierte Domänen die Translokation ins ER nicht fördern können. 62

72 Ergebnisse Abb. 34. Translokation in das ER wird durch heterologe α-helikale Domänen gefördert. N2a Zellen wurden mit den gezeigten chimären Konstrukten transfiziert und, wenn angezeigt, vor der Zellernte mit dem proteasomalen Inhibitor MG132 für 3 h bei 37 C inkubiert (±MG132). Gesamtzelllysate wurden, sofern angegeben, mit EndoH behandelt (±EndoH). PrP wurde mittels Western Blot unter Verwendung des mab 3F4 analysiert. Um der Vermutung nachzugehen, dass 115/31 CHO +115 und 115/31 CHO +Tau nicht in das ER transloziert werden, wurde zusätzlich eine Version der Konstrukte ohne Signalsequenz generiert und in N2a Zellen transient transfiziert. Ein Vergleich des Laufverhaltens der Proteine mit und ohne Signalpeptid (±ER-SS) ergab, dass 115/31 CHO +115 und 115/31 CHO +Tau verglichen mit den zugehörigen zyto-formen eine geringere elektrophoretische Mobilität aufweisen, was auf eine ungeschnittene Signalsequenz hindeutet (Abb. 35). Da Proteine, sobald sie ins ER importiert werden, von der Signalpeptidase prozessiert werden, kann man davon ausgehen, dass 115/31 CHO +115 und 115/31 CHO +Tau nicht vollständig ins ER transloziert werden. 63

73 Ergebnisse Abb /31 CHO +115 und 115/31 CHO +Tau haben offenbar ein ungeschnittenes Signalpeptid. Von den Konstrukten 115/31 CHO +115 und 115/31 CHO +Tau wurden je eine Version mit und ohne SS (±ER-SS) generiert und in N2a Zellen transfiziert. Proteine im Zelllysat wurden mittels Immunblotting und dem mab 3F4 analysiert In vitro Analyse des ER-Imports Die bisherigen Ergebnisse demonstrierten, dass das Vorhandensein α-helikaler Bereiche notwendig und ausreichend für einen effizienten ER-Import von PrP ist. Es konnte gezeigt werden, dass 115α 2 α 3, nicht aber 115/31 CHO +115 ins ER transloziert wird. Um diese Daten zu stützen, wurde eine in vitro Analyse des ER-Imports durchgeführt. Dazu wurde die jeweilige DNA in vitro transkribiert, translatiert und in An- oder Abwesenheit von rauen Mikrosomen aus dem ER inkubiert (±Mikrosomen). Als Marker für den erfolgreichen Import in Mikrosomen wurde die Ausbildung von N-verknüpften Glykanen analysiert. Ein EndoH- Verdau diente dazu, glykosylierte Banden zu identifizieren. Abbildung 36 zeigt nach Zugabe von Mikrosomen zur in vitro Transkription/Translations- Reaktion (+Mikrosomen) sowohl bei PrP als auch bei 115α 2 α 3 eine zweite, auf dem SDS-Gel langsamer laufende Bande. Diese Bande konnte nach EndoH-Verdau (+EndoH) nicht mehr detektiert werden, was ein Indiz dafür ist, dass es sich um die glykosylierte Fraktion handelte und die beiden Proteine in vitro importiert wurden (geschlossene Pfeilspitze). Hingegen konnte bei 115/31 CHO +115 keine EndoH-sensitive, langsamer laufende Bande auf dem Gel 64

74 Ergebnisse beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass diese Mutante in vitro nicht in Mikrosomen transloziert werden konnte. Abb. 36. In vitro Analyse des ER-Imports von PrP, 115α 2 α 3 und 115/31 CHO Die DNA der jeweiligen Konstrukte wurde in vitro in An- und Abwesenheit von Mikrosomen aus dem ER (±Mikrosomen) transkribiert/translatiert und dabei mit [ 35 S]-Methionin markiert. Die radioaktiv markierten Proben wurden anschließend, sofern angegeben, mit EndoH behandelt (±EndoH) und anschließend mittels SDS-PAGE aufgetrennt und analysiert. Geschlossene Pfeilspitzen symbolisieren glykosylierte, offene Pfeilspitzen unglykosylierte Proteinfraktionen. Zusammenfassend deuten die gezeigten Resultate darauf hin, dass das Vorhandensein α-helikaler Bereiche unabhängig von der Primärsequenz ein entscheidender Faktor für einen erfolgreichen ER-Import ist. α-helikale Domänen von heterologen Proteinen wie Dpl oder GFR fördern den Import in das ER, während zusätzliche unstrukturierte Bereiche, zum Beispiel von Tau, zu keiner effizienten Translokation führen. Dass strukturierte Domänen für einen produktiven Import notwendig sind, konnte auch in in vitro Versuchen gezeigt werden Effiziente heterologe ER-Signalsequenzen können den ER-Import unstrukturierter Polypeptide nicht fördern Studien haben ergeben, dass die Sequenz des ER-Signalpeptids eines Proteins die Effizienz des ER-Imports stark beeinflussen kann (vgl. Abschnitt 1.5.1). Des Weiteren ist bekannt, dass PrP zu den Proteinen mit einer ineffizienten ER-Lokalisationssequenz zählt (Kim und Hegde, 2002). In einer vorangegangenen Studie unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die Expression von Säugetier-PrP in Hefe mit der Viabilität der Hefezellen interferiert, da die endogene SS von PrP für einen effizienten ER-Import nicht ausreichend war. Durch Austausch des PrP-Signalpeptids gegen die stark hydrophobe SS des 65

75 Ergebnisse Hefeproteins Cre5p konnten der Import wieder hergestellt werden und die negativen Auswirkungen bezüglich der zellulären Viabilität verhindert werden (Heller et al., 2003). Um zu testen, ob das hydrophobere Signalpeptid des Hefeproteins Cre5p die Produktivität des ER-Imports in Säugetierzellen verbessern kann, wurde die endogene ER-SS von PrP gegen die Cre5p-SS ausgetauscht. Während die so generierten Mutanten Cre5p-PrP und Cre5p-115α 2 α 3 verglichen mit PrP und 115α 2 α 3 in der Western Blot Analyse eine Reduktion der unglykosylierten Fraktion aufwiesen, was für eine verbesserte Translokation ins ER spricht, konnte die Cre5p-SS den ER-Import von 115/31 CHO +115 nicht verbessern. Nur eine äußerst geringe Menge an glykosyliertem, EndoH-sensitivem Cre5p-115/31 CHO +115 konnte in der Western Blot Analyse detektiert werden (Abb.37, Cre5p). Zusätzlich wurde eine weitere effiziente SS getestet. In einer vorangegangenen Studie wurde gezeigt, dass das Signalpeptid des Wachstumshormons aus der Ratte (growth hormone, GH) den ER-Import von sekretorischen Proteinen fördern kann (Rutkowski et al., 2003). GH-115/31 CHO +115, bei dem die endogene PrP-SS gegen die des Wachstumshormons ausgetauscht wurde, zeigte im Vergleich zu 115/31 CHO +115 aber ebenfalls keine deutlich verbesserte Translokationseffizienz (Abb. 37, GH). 66

76 Ergebnisse Abb. 37. Effiziente heterologe ER-Signalsequenzen können den ER-Import unstrukturierter Polypeptide nicht fördern. Die ER-SS von PrP (schwarz), dem Hefeprotein Cre5p (blau) und dem Wachstumshormon aus der Ratte (growth hormone, GH, grün) sind gezeigt. Hydrophobe AS sind rot markiert. Ein Hydrophobizitäts-Plot der drei ER- SS ist ebenfalls dargestellt, wobei eine Zahl über Null für hydrophobe AS steht (Kyte und Doolittle, 1982). N2a Zellen wurden transient mit den Konstrukten mit unterschiedlichen SS transfiziert und die Lysate, sofern angegeben, mit EndoH behandelt (±EndoH). Proteine im Gesamtzelllysat wurden mittels Western Blotting unter Verwendung des mab 3F4 analysiert. Das Sternchen markiert unspezifische Hintergrundbanden. Wie schon in mehreren Studien gezeigt wurde, deuten auch die hier dargestellten Ergebnisse darauf hin, dass effiziente Signalsequenzen die Translokation von sekretorischen Proteinen grundsätzlich verbessern können. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass die Translokation unstrukturierter ER-Proteine, die keine α-helikalen Bereiche aufweisen, durch eine effizientere SS kaum gefördert wird p58 IPK fördert die kotranslokationale Degradierung von sekretorischen Proteinen mit ausgedehnten unstrukturierten Bereichen am N-Terminus In einer Studie konnte gezeigt werden, dass das zur Hsp40-Familie zählende Protein p58 IPK eine wichtige Funktion in der cqc übernimmt. P58 IPK liegt dieser Publikation zufolge mit Sec61 assoziiert vor und vermittelt durch Rekrutierung von Hsp70 an die zytosolische Seite des Translokons die kotranslokationale Degradierung von Proteinen unter ER- Stressbedingungen (Oyadomari et al., 2006). Alternativ wurde in einer zweiten Studie postuliert, dass p58 IPK mit BiP assoziiert im ER-Lumen vorliegt und dort indirekt Einfluss auf die Translokation und Maturierung der naszierenden Polypeptidkette ausübt. Da die Translokation ins ER unter anderem von lumenalen Chaperonen gefördert wird, könnte diesem Modell zufolge die reduzierte Menge an frei vorliegendem BiP aufgrund verstärkter Assoziation mit p58 IPK dafür verantwortlich sein, dass die Translokationseffizienz vermindert wird (Rutkowski et al., 2007). Unabhängig von dem genauen Mechanismus stellte sich daher die Frage, ob und in welchem Ausmaß p58 IPK die Translokationseffizienz der in dieser Arbeit untersuchten Mutanten modulieren kann. Um die mögliche Rolle von p58 IPK zu analysieren, wurden N2a Zellen mit den verschiedenen PrP-Konstrukten und p58 IPK oder einem Leervektor kotransfiziert und die Glykosylierung der jeweiligen Mutanten untersucht. Bei allen analysierten Konstrukten konnte in der Western Blot Analyse eine relative Zunahme der 67

77 Ergebnisse Menge an unglykosyliertem Protein nach Überexpression von p58 IPK beobachtet werden (Abb. 38, linke Blots). Während allerdings bei PrP kaum ein Einfluss auf die Glykosylierungseffizienz zu beobachten war, führte die gesteigerte Expression von p58 IPK zu einem deutlich verminderten ER-Import von 115α 2 α 3 und 115Dpl. Bei beiden Konstrukten nahm die Menge der glykosylierten Fraktion (geschlossene Pfeilspitze) in den p58 IPK überexprimierenden Zellen signifikant ab und die der unglykosylierten Fraktion (offene Pfeilspitze) zu. Wie erwartet unterlag die unglykosylierte Fraktion von 115α 2 α 3 in p58 IPK - überexprimierenden Zellen proteasomaler Degradierung (Abb. 38, rechter Blot). Abb. 38. p58 IPK fördert bei sekretorischen Proteine mit erweiterten N-terminalen unstrukturierten Bereichen die kotranslokationale Degradierung. N2a Zellen wurden transient mit den gezeigten Konstrukten und p58 IPK (p58) oder dem Leervektor (-) kotransfiziert und wenn angegeben mit dem proteasomalen Inhibitor MG132 für 3 h bei 37 C inkubiert. Die Expression der Proteine wurde mittels Immunblotting und der Verwendung des mab 3F4 analysiert. Offene Pfeilspitzen markieren unglykosylierte Spezies, geschlossene Pfeilspitzen die glykosylierten Fraktionen. Im rechten Blot wurden die MG132+ Banden direkt neben die MG132- Banden positioniert. Die Banden stammen jedoch von einem Gel. Die Quantifizierung basiert auf mindestens drei unabhängigen Versuchen und zeigt das 68

78 Ergebnisse Verhältnis der Mengen von glykosylierter zu unglykosylierter Proteinfraktion. Die p-werte wurden mittels studentischen t-tests ermittelt; n.s., nicht signifikant. Die Translokationseffizienz der umgekehrt arrangierten Konstrukte α 2 α und Dpl115, bei denen die α-helikale Domäne direkt nach dem Signalpeptid beginnt, wurde durch Überexpression von p58 IPK nicht signifikant beeinflusst (Abb. 38). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass p58 IPK die kotranslokationale Degradierung zwar fördert, das Ausmaß aber abhängig von der Länge und Lage von unstrukturierten Domänen des zu translozierenden Proteins ist. Vor allem bei Proteinen mit erweiterten unstrukturierten Domänen am N- Terminus konnte durch Überexpression von p58 IPK eine deutliche Abnahme der Translokationseffizienz beobachtet werden. Um zusätzlich zu zeigen, dass die beobachteten Effekte des verminderten ER-Imports bei Überexpression von p58 IPK spezifisch für dieses Kochaperon sind, wurde der Glykosylierungsstatus von 115α 2 α 3 auch in Anwesenheit verschiedener anderer Chaperone und Kochaperone analysiert. Diese vergleichende Analyse ergab, dass nur die gesteigerte Expression von p58 IPK signifikant mit dem ER-Import von 115α 2 α 3 interferiert. Die Überexpression von zytosolischem Hsp70 und den Hsp40-Mitgliedern Hdj1 und Hdj2 beeinflussten die Translokationseffizienz genauso wenig wie die gesteigerte Expression des ER-lumenalen Chaperons BiP (Abb. 39). 69

79 Ergebnisse Abb. 39. Die Überexpression von Hsp70, Hdj1, Hdj2 oder BiP hat keinen signifikanten Einfluss auf den ER-Import von 115α 2 α 3. N2a Zellen wurden transient mit 115α 2 α 3 und den angegebenen Konstrukten kotransfiziert. (A) Die Expression von 115α 2 α 3 wurde mittels Immunblotting unter Verwendung des mab 3F4 analysiert. Die offene Pfeilspitze markiert die unglykosylierte, die geschlossene Pfeilspitze die glykosylierte Proteinfraktion. Die Quantifizierung von mindestens drei unabhängigen Versuchen zeigt das Verhältnis von glykosyliertem zu unglykosyliertem 115α 2 α 3. Der p-wert wurde mittels studentischen t-tests ermittelt (B) Western Blot Analyse zur Kontrolle des Expressionslevels der überexprimierten Proteine. Die Expression von Flag-markiertem p58 IPK (p58) und Flag-markiertem Hdj2 wurde mittels mab M2 flag (anti-flag), Hdj1 mittels anti-hsp40 Serum und BiP mittels mab anti- KDEL detektiert. Der mab anti-hsp70 erkennt sowohl endogenes Hsp70 (untere Banden) als auch überexprimiertes, EYFP-Hsp70 (obere Bande) α 2 α 3 wird unter ER-Stressbedingungen vermindert in das ER importiert Die cqc ist ein Mechanismus, der vor allem unter ER-Stressbedingungen verhindern soll, dass die Faltungsmaschinerie im ER überlastet wird, indem Polypeptide noch vor dem vollständigen ER-Import ins Zytosol geleitet werden (Oyadomari et al., 2006, Kang et al., 2006). Des Weiteren zeigten Untersuchungen, dass p58 IPK unter ER-Stressbedingungen 70

80 Ergebnisse hochreguliert wird (Lee et al., 2003). Um einen Hinweis dafür zu erhalten, wie sich ER- Stressbedingungen auf die Translokation auswirken können, wurden die transient mit der Mutante 115α 2 α 3 transfizierten Zellen für die in Abbildung 40 angegebenen Zeiten mit Thapsigargin (TG) inkubiert. Thapsigargin hemmt spezifisch die Ca 2+ -ATPase des ERs. Dadurch erhöht sich die Ca 2+ -Konzentration im Zytosol, während die Ca 2+ -Speicher im ER entleert werden, was in der Induktion von ER-Stress resultiert. Die Western Blot Analyse zeigte, dass nach Inkubation mit TG die Menge an glykosyliertem 115α 2 α 3 deutlich abnahm, während ein Anstieg an unglykosyliertem 115α 2 α 3 detektiert werden konnte. Die Menge an Hsp70 als Kontrollprotein blieb hingegen gleich (Abb. 40). Dieses Resultat deutet darauf hin, dass unter ER-Stressbedingungen eine verminderte Translokation von 115α 2 α 3 in das ER stattfindet. Abb α 2 α 3 wird unter ER-Stressbedingungen vermindert in das ER transloziert. Mit dem Konstrukt 115α 2 α 3 transfizierte N2a Zellen wurden für die angegebene Zeit mit Thapsigargin (TG, 1 µm) inkubiert und anschließend mittels Western Blot analysiert. Der Nachweis von 115α 2 α 3 erfolgte durch den mab 3F4 (anti-prp) während Hsp70 als Kontrolle mittels mab anti-hsp70 detektiert wurde. Die Quantifizierung von mindestens drei unabhängigen Experimenten zeigt das Verhältnis der glykosylierten und unglykosylierten Proteinfraktion. Die Ermittlung des p-wertes erfolgte mittels studentischen T-Tests. Gemeinsam mit in früheren Studien gezeigten Daten deuten die hier gewonnenen Resultate darauf hin, dass p58 IPK die kotranslokationale Degradierung von sekretorischen Proteinen fördern kann. Im Zuge dieser Arbeit konnte überdies herausgefunden werden, dass die verminderte Translokation nach Überexpression von p58 IPK vor allem Proteine mit erweiterten, N-terminal unstrukturierten Bereichen betrifft und spezifisch von p58 IPK und nicht anderen Chaperonen oder Kochaperonen vermittelt wird. ER-Stress führt zudem zu einem verminderten ER-Import von 115α 2 α 3. 71

81 Ergebnisse Zusammenfassung Die umfangreiche Analyse des ER-Imports von PrP und verschiedenen chimären Proteinen hat gezeigt, dass dem Faltungszustand des Polypeptids eine Rolle bei der Translokation ins ER zukommt. Eine vorangegangene Studie hat bereits ergeben, dass die C-terminale, globulär gefaltete Domäne von PrP für einen effizienten ER-Import nötig zu sein scheint (Heske et al., 2004). Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurde dies nun umfassend analysiert. So wurden zuerst verschiedene intrinsische Faktoren der Polypeptide untersucht, die den ER-Import modulieren können. Es konnte deutlich gezeigt werden, dass ein gewisses Maß an α-helikalen Bereichen ausreichend und notwendig für einen produktiven ER-Import ist. Der Einfluss der Sekundärstruktur auf die Translokation ist unabhängig von der Primärsequenz, da auch α-helikale Domänen von heterologen Proteinen wie Dpl oder GFR die Translokation in das ER fördern können. (Abb. 41, Gruppe 1). Des Weiteren wurde eine direkte Korrelation zwischen der abnehmenden Menge an α-helikalen Bereichen und der Translokationseffizienz gezeigt (Abb. 41, Gruppe 2). ER-Proteine, die von unstrukturierten Domänen dominiert sind, werden nicht in das ER importiert, sondern direkt ins Zytosol geleitet und dort proteasomal abgebaut (Abb. 41, Gruppe 3). Außerdem konnte dargelegt werden, dass intrinsische Faktoren, wie (i) die Länge des Polypeptids, (ii) die GPI-Verankerung, (iii) die N-Glykosylierung oder (iv) die Möglichkeit zur Ausbildung einer Disulfidbrücke die Translokation ins ER nicht beeinflussen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der Austausch des endogenen PrP- Signalpeptids gegen eine effizientere ER-SS nicht grundsätzlich zu einem verbesserten Import führt. Die Translokation von Polypeptiden, die gänzlich unstrukturiert sind, konnte durch eine effizientere ER-SS nicht gefördert werden. Dies deutet darauf hin, dass das Fehlen einer Sekundärstruktur gegenüber der Sequenz des Signalpeptids einen dominanten Effekt auf die Produktivität des ER-Imports ausübt. 72

82 Ergebnisse Abb. 41. Zusammenfassung der analysierten Konstrukte und deren ER-Import Effizienz. Gruppe 1 fasst jene Konstrukte zusammen, die effizient ins ER importiert werden (++, +). Gruppe 2 zeigt den Zusammenhang zwischen der Menge an α-helices und der Translokationseffizienz. Je kürzer die α-helikale Domäne im Protein, desto ineffizienter ist ein produktiver Import. Gruppe 3 umfasst diejenigen Konstrukte, die aufgrund fehlender strukturierter Domänen nicht oder nur sehr ineffizient ins ER transloziert werden (-). Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnte des Weiteren gezeigt werden, dass vor allem Polypeptide mit ausgedehnten unstrukturierten Bereichen der kotranslokationalen Qualitätskontrolle der Zelle unterliegen. Diese Proteine werden weder N-glykosyliert, noch von der Signalpeptidase prozessiert. Stattdessen werden sie bereits vor oder während der Translokation zum Proteasom geleitet, wo sie abgebaut werden. Studien zufolge ist das Kochaperon p58 IPK in die cqc involviert (Oyadomari et al., 2006; Rutkowski et al., 2007), was in der hier durchgeführten Arbeit bestätigt werden konnte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass p58 IPK spezifisch Polypeptide mit erweiterten unstrukturierten Bereichen im N-Terminus der kotranslokationalen Degradierung zuführt (Abb. 42). 73

83 Ergebnisse Abb. 42 p58 IPK beeinflusst die ER-Translokationseffizienz von Polypeptiden mit erweiterter unstrukturierter Domäne am N-Terminus. 115α 2 α 3 und 115Dpl stehen unter dem Einfluss von p58 IPK (+) während die darüber gezeigten Konstrukte α 2 α und Dpl115 hinsichtlich ihres ER-Imports weniger stark von p58 IPK beeinflusst werden (-). Schließlich wurde der Einfluss der zellulären Homöostase auf den ER-Import studiert. Die gezeigten Resultate deuten darauf hin, dass ER-Stress die Translokationseffizienz vermindern kann. 74

84 Ergebnisse 2.2 Teil 2 - Biochemische Charakterisierung von PrP-Homologen aus dem Zebrabärbling (Danio rerio) Der evolutionäre Ursprung von humanem PrP sowie seine physiologische Funktion sind immer noch unklar. Analysen ergaben jedoch, dass PrP in Säugetieren hoch konserviert ist und auch in Amphibien und Vögeln fand man PrP-Homologe. Des Weiteren wurden im Zebrabärbling (Danio rerio) sowie in einer Reihe anderer Fischarten wie zum Beispiel dem Kugelfisch (Fugu rubripes) oder dem Lachs (Salmo salar) mit PrP verwandte Proteine entdeckt (Gibbs und Bolis, 1997; Suzuki et al., 2002; Oidtmann et al., 2003; Rivera-Milla et al., 2003; Cotto et al., 2005). Obwohl diese nur sehr geringe Sequenzhomologie zu humanem PrP aufweisen, scheinen einige charakteristische Merkmale konserviert zu sein. Die hydrophobe Domäne (HD) im Mittelteil von PrP liegt mit nahezu identischer AS-Sequenz in den Zebrabärbling-Homologen vor. Des Weiteren konnte bei einigen Zebrabärbling-PrP Isoformen analog zu humanem PrP eine N-terminale Repeat-Region festgestellt werden (vgl. Abschnitt 1.2.6). Zu Beginn dieser Arbeit lagen für PrP-Homologe aus dem Zebrabärbling lediglich bioinformatische Vorhersagen über konservierte Merkmale wie eine hydrophobe N- und C- terminale AS-Sequenz, die möglicherweise als ER-Lokalisationssignal beziehungsweise als GPI-Signalsequenz dienen könnte, vor. Computergestützte bioinformatische Analysen verwiesen des Weiteren bei den mit PrP verwandten Proteinen auf putative N- Glykosylierungsmotive (Cotto et al., 2005). Im zweiten Teil dieser Arbeit sollten PrP- Homologe aus dem Zebrabärbling hinsichtlich ihrer Biogenese, Maturierung und zellulären Lokalisierung untersucht werden. Es sollten erstmals experimentelle Evidenzen dafür geliefert werden, dass die Fischproteine wie vorhergesagt ins ER importiert und glykosyliert werden sowie an der Außenseite der Zellmembran GPI-verankert lokalisiert sind. Für die Analyse wurden zwei verschiedene, erst vor kurzem beschriebene Proteine ausgewählt. Zebrabärbling PrP 1 (zeprp1), welches zur Gruppe der möglicherweise duplizierten langen PrP-Formen im Fisch zählt, ist das wahrscheinlich mit humanem PrP am stärksten verwandte Protein aus dem Zebrabärbling (Cotto et al., 2005). Das zweite Protein, das untersucht werden sollte, ist Zebrabärbling Shadoo 2 (zesho2) und zählt zur Gruppe der Shadoo (Sho)-Proteine, die vom Mensch bis zum Fisch hoch konserviert vorkommen. Sho- Proteine weisen nur eine geringe Sequenzhomologie zu PrP auf und sind viel kürzer ( AS), zeichnen sich jedoch durch eine mit PrP fast identische HD aus. Auch für zesho2 lagen zu Beginn dieser Arbeit lediglich Vorhersagen über eine ER- und GPI-Signalsequenz sowie ein mögliches Glykosylierungsmotiv im C-terminalen Teil des Proteins vor (Premzl et al., 2003). 75

85 Ergebnisse Generierung von zeprp1 und zesho2 und Expression in murinen Neuroblastomzellen Die biochemische Untersuchung der Zebrabärbling-Proteine wurde in einer etablierten Säugetier-Zelllinie durchgeführt. Eine geeignete Zebrabärbling-Zelllinie stand nicht zur Verfügung, doch aufgrund der Tatsache, dass die Mechanismen der Protein-Translokation ins ER sowie der N-Glykosylierung und GPI-Verankerung von der Hefe bis zum Menschen relativ gut konserviert sind, konnte davon ausgegangen werden, dass ER- und GPI- Signalsequenzen sowie N-Glykosylierungsmotive (N-X-T/S) von Fischproteinen auch in Säugetierzellen funktionell sind. Für die Analyse der mit PrP verwandten Proteine aus dem Zebrabärbling schien die Verwendung der in der Prion-Forschung oft benutzten, neuronalen, murinen Neuroblastom-Zelllinie N2a geeignet. Für die biochemische Studie mussten die Zebrabärbling-Proteine zunächst aus einer Danio rerio cdna-bibliothek in den Säugetier-Expressionvektor pcdna3.1/zeo kloniert werden. Dies wurde freundlicherweise von der Gruppe um Dr. Michael Baier durchgeführt. Um eine Detektion der beiden Proteine zu ermöglichen, Antikörper standen nicht zur Verfügung, wurde mittels PCR ein Flag-Epitop (DYKDDDK) direkt hinter die ER-Signalsequenz in beide Konstrukte eingefügt. Eine Sequenzanalyse ergab, dass der verwendete cdna-klon von zeprp1 eine interne Deletion (AS ) aufweist, was auf eine mögliche Spleiß-Variante hindeuten könnte (Abb. 43A). Zuerst wurde das Löslichkeitsprofil der Proteine untersucht. Dazu wurden die Konstrukte transient in N2a Zellen transfiziert. Nach der Lyse in 0,5% Triton X-100/0,5% DOC wurden die Lysate mittels Zentrifugation bei g in eine Detergens-lösliche (S) und -unlösliche (P) Fraktion aufgeteilt. Die Western Blot Analyse ergab, dass beide Zebrabärbling-Proteine in Säugetierzellen gut exprimiert wurden. Maus-PrP (mprp), das als Kontrolle für ein Säugetier-PrP diente, wurde wie erwartet hauptsächlich in der Detergens-löslichen Fraktion gefunden. Im Gegensatz dazu waren die Zebrabärbling-Proteine zeprp1 und zesho2 sowohl in der Detergens-löslichen als auch -unlöslichen Fraktion detektierbar (Abb. 43B). 76

86 Ergebnisse Abb. 43. Expression von zeprp 1 und zesho2 in murinen Neuroblastomzellen. (A) Schematische Darstellung der verwendeten Konstrukte: Maus-PrP (mprp), Zebrabärbling PrP 1 (zeprp1) und Zebrabärbling Sho 2 (zesho2). ER-SS, ER-Signalsequenz; R, Repeat- Region; HD, hydrophobe Domäne; α, alpha-helikale Domäne; β, beta-strang; CHO, N- verknüpfte Glykosylierungsstelle; S-S, Disulfidbrücke; GPI-SS, GPI Signalsequenz; DYKDDDDK, Flag-Epitop. Die AS-Nummerierung der einzelnen Domänen findet sich unterhalb der jeweiligen Konstrukte. In zeprp1 wurde eine Deletion der AS gefunden (Δ ). (B) N2a Zellen wurden mit den Konstrukten aus (A) transient transfiziert. Nach Lyse in 0,5% Triton X-100/0,5% DOC und Trennung des Lysats durch Zentrifugation bei g wurden die Proteine in der Detergens-löslichen (S) und - unlöslichen Fraktion (P) mittels Western Blot unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers (mab) 3F4 für mprp oder mab M2 flag für zeprp1 und zesho2 detektiert zeprp1 und zesho2 werden ins ER importiert und N-glykosyliert Maus-PrP besitzt eine N-terminale ER-SS (AS 1-22), die einen kotranslationalen Import ins ER vermittelt. Im C-Terminus von PrP finden sich zwei Konsensussequenzen für N- 77

87 Ergebnisse Glykosylierung (N180 und N196) (Haraguchi et al., 1989) sowie eine GPI-Signalsequenz (GPI-SS, AS ) (Stahl et al., 1987). Zunächst wird mprp im ER N-glykosyliert sowie GPI-verankert. Danach werden im Golgi die Kernglykane in komplexe Glykane umgewandelt und mprp an die Plasmamembran transportiert, wo es an der Außenseite lokalisiert ist (siehe Abschnitt 1.2.4). Bioinformatische Analysen verweisen bei beiden zu untersuchenden PrP-Homologen des Zebrabärblings auf eine hydrophobe N-terminale Sequenz, die als ER Lokalisationssignal dienen könnte. Des Weiteren wurden drei mögliche N- Glykosylierungsmotive in zeprp1 und ein solches putatives Motiv in zesho2 gefunden. Ein viertes N-Glykosylierungsmotiv in zeprp1 (N367) wurde zwar vorhergesagt (Cotto et al., 2005), kann aber aufgrund des Prolins an zweiter Stelle des allgemein verwendeten Motivs N-X-T/S nicht genutzt werden, da Position X Prolin als einzige AS ausschließt. Um festzustellen ob die Zebrabärbling-Proteine N-glykosyliert sind, wurden sie in N2a Zellen transient exprimiert und die Zellen für 16 h in Gegenwart von Tunicamycin, einem Antibiotikum, das die Anknüpfung des Kernglykangerüsts an die Peptidkette inhibiert, inkubiert. Wie in Abbildung 44A ersichtlich, führte diese Behandlung zu einem veränderten Laufverhalten während der SDS-Gelelektrophorese. Alle Proben, die mit Tunicamycin behandelt wurden, zeigten im Gegensatz zu den unbehandelten Proben eine erhöhte elektrophoretische Mobilität. Dies deutet darauf hin, dass beide Zebrabärbling-Proteine analog zu mprp N-glykosyliert sind. Anschließend sollte die Art der Glykosylierung genauer untersucht werden. Dazu wurden die transient transfizierten N2a Zellen für 16 h in Gegenwart von Swainsonin kultiviert. Swainsonin inhibiert die Golgi-lokalisierte Mannosidase II und somit die Umwandlung von mannosereichen Glykanen in komplexe Strukturen (vgl. Abschnitt 1.5.2). Diese Analyse lieferte den ersten Hinweis, dass zesho2 komplex glykosyliert sein könnte. Die Inkubation mit Swainsonin führte bei zesho2 dazu, dass die obere, elektrophoretisch langsamer laufende Bande (k) der unbehandelten Zellen vollständig verschwand und eine im Vergleich dazu schneller laufende Bande (m) in Swainsonin-behandelten Zelle detektiert werden konnte (Abb. 44B, zesho2). Im Fall von zeprp1 nahm nur die Menge der sehr schwachen obersten Bande (k) nach Inkubation mit Swainsonin ab. Die stärkere Bande (m) darunter konnte in behandelten genauso wie in unbehandelten Zellen detektiert werden (Abb. 44B, zeprp1). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass im Gegensatz zu mprp und zesho2, die beide möglicherweise überwiegend komplex glykosyliert sind, nur ein kleiner Teil der Glykane von zeprp1 komplex glykosyliert vorzuliegen scheint. Um diese Vermutung zu unterstützen, wurde zusätzlich ein Endoglykosidase H (EndoH) - Verdau der Zelllysate durchgeführt. Das Enzym EndoH aus Streptomyces plicatus spaltet 78

88 Ergebnisse spezifisch zwischen zwei N-Acetyl-Glucosamin-Resten, mit denen mindestens fünf Mannoseeinheiten verknüpft sind (vgl. Abschnitt ). Somit können mittels EndoH nur die Glykane abgespalten werden, welche in einer mannosereichen Form vorliegen, während komplex glykosylierte Strukturen nicht verdaut werden können. Ist das zu analysierende Protein EndoH-sensitiv, so hat dies eine erhöhte elektrophoretische Mobilität in einem SDS- Gel zur Folge. Wie in Abbildung 44C zu sehen ist, konnten die Glykane von zesho2 mittels EndoH nicht abgespalten werden, da sich keine Änderung des elektrophoretischen Laufverhaltens der Bande nach EndoH-Verdau ergab (Abb. 44C, zesho2). Dies ist ein weiterer Hinweis auf eine fast vollständige komplexe Glykosylierung dieses Proteins. ZePrP1 hingegen scheint nur teilweise komplex glykosyliert aufzutreten (Abb. 44C, zeprp1). Die Western Blot Analyse ergab, dass nur eine kleine Fraktion von zeprp1 (k) nach EndoH- Verdau kein verändertes Laufverhalten zeigte und somit komplex glykosyliert ist. Dagegen weist eine größere Proteinfraktion von zeprp1 (m) nach EndoH-Behandlung eine erhöhte elektrophoretische Mobilität auf. Dies indiziert, dass zeprp1 überwiegend EndoH-sensitiv und damit mit mannosereichen Glykanen modifiziert ist. Eine Quantifikation aller Ergebnisse ergab, dass nur 35% der zeprp1 Glykane aber 88% von zesho2 komplex modifiziert sind. Der Hauptteil von zeprp1 (65%) liegt in einer mannosereich glykosylierten Form vor. Bei beiden Proteinen wurde kaum eine unglykosylierte Spezies detektiert (Abb. 44D). 79

89 Ergebnisse Abb. 44. ZePrP1 und zesho2 sind N-glykosyliert. (A, B) Transient transfizierte N2a Zellen wurden für 16 h in Gegenwart von (A) Tunicamycin (0,5 µg/ml), welches die Kernglykosylierung inhibiert oder (B) Swainsonin (10 µg/ml), das die Golgi-Mannosidase II und somit die weitere Prozessierung in komplexe Glykane hemmt, inkubiert. Proteine in der Detergens-löslichen (S) und -unlöslichen (P) Fraktion wurden mittels Western Blot unter Verwendung des mab M2 flag analysiert. (C) Um mannosereiche Glykane zu detektieren, wurden Lysate transient transfizierter Zellen mit EndoH inkubiert, welches nur mannosereiche aber keine komplexen Glykane spalten kann. Die Proteine wurden anschließend mittels Western Blot Analyse unter Verwendung des mab M2 flag detektiert. Die verschiedenen N-verknüpften Glykoformen sind links angezeigt. k, Glykane mit komplexen Strukturen; m, mannosereiche Glykane; u, unglykosylierte Proteinfraktion. Das Sternchen markiert unspezifische Banden. (D) Quantitative Analyse der Experimente aus (A, B und C). Die Daten wurden aus mindestens drei unabhängigen Experimenten ermittelt. Gezeigt ist die relative Menge der verschiedenen Glykoformen in Prozent der Gesamtmenge des jeweiligen Konstrukts. 80

90 Ergebnisse zeprp1 und zesho2 werden mit einem GPI-Anker modifiziert und sind an der Außenseite der Plasmamembran lokalisiert Sowohl für zeprp1 als auch für zesho2 lagen bioinformatische Vorhersagen über eine C-terminale, hydrophobe AS-Sequenz vor, die als GPI-Signalsequenz dienen könnten. Deshalb sollte untersucht werden, ob die Zebrabärbling-Proteine analog zu mprp GPI-verankert und an der Außenseite der Zelle lokalisiert sind. Eine mögliche Lokalisierung an der Plasmamembran wurde analysiert, indem transfizierte N2a Zellen vor der Ernte mit Trypsin, welches alle Proteine an der Zelloberfläche abspaltet, inkubiert wurden (Abb. 45A, +Trypsin). Nach Inaktivierung von Trypsin mit Trypsininhibitor wurden die Zellen lysiert und mittels Western Blot analysiert. Parallel wurden Zellen ohne Trypsinbehandlung geerntet (Abb 45A, -Trypsin). Abbildung 45A zeigt deutlich, dass sowohl zeprp1 als auch zesho2 nach Trypsinbehandlung auf dem Western Blot nicht mehr detektiert werden konnten, was dafür spricht, dass die Proteine an der Zelloberfläche lokalisiert waren. Um spezifisch eine mögliche GPI-Verankerung der beiden Zebrabärbling-Proteine zu untersuchen, wurden die Zellen vor ihrer Ernte mit der Phosphatidylinositol-spezifischen Phospholipase C (PIPLC) für 2 h inkubiert (Abb. 45B, C). Dieses Enzym schneidet spezifisch am Phosphatrest der Phosphatidylinositol-Gruppe des GPI-Ankers und setzt somit die Proteine ins Zellkulturmedium frei. GPI-verankerte Proteine können nach einem Verdau mit PIPLC vermindert im Zelllysat und vermehrt im Zellkulturüberstand mittels Western Blot detektiert werden. Um eine Lokalisierung der Proteine im Zellkulturmedium durch eine möglicherweise stattfindende Sekretion zu vermeiden, wurde der Verdau bei 4 C vollzogen. Als Negativkontrolle wurde PrP-CD4, bei dem die endogene C-terminale GPI-Signalsequenz durch die heterologe Transmembrandomäne von CD4 ausgetauscht wurde, in die Analyse miteinbezogen. Wie erwartet konnte PrP-CD4 durch PIPLC nicht freigesetzt werden, da die relative Proteinmenge im Lysat nach der Inkubation mit PIPLC gleichblieb (Abb. 45B, mprp- CD4). Dahingegen konnten mprp und zesho2 nach PIPLC-Inkubation im Zelllysat kaum mehr detektiert werden, was darauf hindeutet, dass sie fast vollständig von der Plasmamembran entfernt wurden. ZeSho2 scheint daher analog zu mprp GPI-verankert zu sein (Abb. 45B, mprp, zesho2). Auffallend war, dass zeprp1 mit dieser Methode nur teilweise freigesetzt werden konnte. Um dieses Phänomen genauer zu untersuchen, wurde auch der Zellkulturüberstand untersucht. Analog zu mprp, das nach PIPLC-Inkubation im Medium detektiert werden konnte, wurde auch ein Teil von zeprp1 von der Plasmamembran abgespalten und tauchte nach PIPLC-Behandlung im Überstand auf (Abb 45C, M). Dieses Resultat zeigte, dass zeprp1 ebenfalls an der Außenseite der Plasmamembran GPIverankert vorliegt. Die partielle Resistenz von zeprp1 beim Verdau mit PIPLC könnte durch die Größe dieses Proteins erklärt werden. Das Enzym PIPLC könnte aus sterischen Gründen 81

91 Ergebnisse einen schlechteren Zugang zu dem GPI-Anker des, im Vergleich zu den anderen analysierten Proteinen, relativ großen, fast 500 AS langen Zebrabärbling-Proteins haben. Abb. 45. ZePrP1 und zesho2 sind GPI-verankerte Proteine, die an der Außenseite der Plasmamembran lokalisiert sind. (A, B, C) Murine Neuroblastomzellen wurden mit den angezeigten Konstrukten transient transfiziert. Beim Konstrukt mprp-cd4 wurde der endogene GPI-Anker von PrP durch die heterologe Transmembrandomäne des Proteins CD4 ersetzt. (A) Um unspezifisch alle Zelloberflächenproteine zu entfernen, wurden die Zellen vor der Zellernte für 5 min bei 4 C mit Trypsin inkubiert (+Trypsin). Parallel wurden Zellen zur Zellernte abgekratzt (-Trypsin). Nach Lyse und Zentrifugation wurde PrP in der Detergens-löslichen (S) sowie -unlöslichen (P) Fraktion mittels Immunblotting analysiert. (B, C) Transfizierte N2a Zellen wurden in Anwesenheit von PIPLC für 2 h bei 4 C inkubiert (+PIPLC) um spezifisch GPI-verankerte Proteine von der Zelloberfläche abzuschneiden. Die Proteine im Lysat (S, P) und im Zellkulturmedium (M) wurden mittels Western Blot unter Verwendung des mab 3F4 (mprp, mprp-cd4) sowie mab M2 flag (zeprp1, zesho2) analysiert. 82

92 Ergebnisse Um die Lokalisierung der beiden Zebrabärbling-Proteine an der Außenseite der Zellen mittels indirekter Immunfluoreszenzanalyse zu untersuchen, wurden die transient transfizierten N2a Zellen mittels Formaldehyd-Behandlung fixiert. Dies hat zur Folge, dass Antikörper nicht in die Zelle diffundieren können. Dadurch können ausschließlich Proteine an der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Eine zusätzliche Behandlung der Zellen mit dem Detergens Triton X- 100 resultiert in einer Permeabilisierung der Zellmembran wodurch Antikörper in der Lage sind, ins Zellinnere zu gelangen. Abb.46. ZePrP1 und zesho2 sind an der Zelloberfläche lokalisiert. N2a Zellen wurden auf Deckgläschen ausgesät und mit den gezeigten Konstrukten transient transfiziert. Zytosolisch lokalisiertes, humanes Parkin (hp) diente als Kontrolle für ein nicht an der Außenseite der Zellen lokalisiertes Protein. Die Lokalisierung wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz von mit Triton X-100 permeabilisierten und nicht-permeabilisierten, fixierten Zellen visualisiert (Cy3). Dafür wurden die Antikörper mab 3F4 (mprp), mab M2 flag (zeprp1, zesho2) und anti-hp Antiserum (hp) verwendet. Maus-PrP sowie die Zebrabärbling-Proteine konnten mit dieser Methode an der Zelloberfläche von nicht-permeabilisierten Zellen detektiert werden. In permeabilisierten Zellen war hauptsächlich eine intensive Golgi-Färbung sichtbar, die durch die starke Überexpression der sekretorischen Proteine zustande kommt. Im Gegensatz zu den an der 83