Biochemische Studien am limb deformity-protein der Vertebraten

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1 Biochemische Studien am limb deformity-protein der Vertebraten Ina ugural-dissertatj.-on zur Erlangung der Doktorwürde der Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät der Ruprecht Karls-Universität Heidelberg vargelegt von Dipl. Biol. Peter Uetz aus Untergruppenbach Januar 1997

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3 INHALT 1 Einl ei tung... 1 Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht: Uetz,P & Zeller,R. (1996) Vector~ for Expression of Protein-A-Tagged Proteins in Vertebrate Cells Anal. Biochem. 237: Uetz,P., Fumagalli,S., James,D.I. & Zeller,R. (1996).'. Molecular Interaction between limb deformity proteins (formins) and Src family kinases J. Biol. Chem. 271 (52): Folgende Sequenzen wurden in der EMBL-Datenbank deponiert: X96612 protein-a Express~onsvektor pcmvpa1 X96610 protein-a Express~onsvektor pcmvp A2 X96611 protein-a ExpresslOnsvektor pcmvp.a3. X85976 Expressionsvector für Ga14-DBD-FUSlonsproteme Historischer Rückblick: Das ld-gen und die Id-Allele... 2 Die normale Entwicklung der Extremitäten bei Wirbeltieren... 3 Der Extremitäten-Phänotyp bei ld-mäusen... 4 Ld ist für die Ausbildung des AER notwendig... 5 Ld wird für den positiven feed-back loop zwischen FGF-4 und Shh gebraucht... 7 Die normale Entwicklung der Nieren bei Säugernieren... 9 Der Nieren-Phänotyp bei ld/ld-mäusen Sonstige Merkmale mutanter ld-mäuse Chromosomale Lokalisation des ld-gens Struktur des Id-Gens Das Ld-Protein (Formin) Der Prolin-Kern Expressionsmuster Die limb deformitylformin-genfamilie cappuccino d iapha no us Andere Homologe Die biochemische Funktion des Ld-Proteins Problemstellung Erge bnisse Der C-Terminus der Ld-Proteine enthält ein Kernlokalisierungssignal Ist Ld ein DNA-bindendes Protein? Die N-terminale Domäne der Ld-Isoform IV reprimiert die Transkription Ld assoziiert mit einem 42 kda-protein Ein signifikanter Anteil von Ld-Proteinen ist mit Membranen assoziiert Ld bindet an SH3-Domänen der Src-Kinase-Familie Ld wird nicht von Src phosphoryliert Ld interagiert mit WW-Domänen Ld interagiert mit bestimmten Profilin-Isoformen Die Überexpression von Ld in Kulturzellen beeinflusst das Cytoskelett Appendix: Ld kann nicht die Funktion von cappuccino in Drosophila übernehmen... 55

4 ~IN~H~A=L~T l1 INHALT iii Diskussion Ld als Kernprotein Das NLS von Ld Phosphorylierung und Kerntransport Kernimport mittels akzessorischer Proteine Zweiteilige Kernimportsignale ("bipartite NLSs") Mögliche Funktion von Ld im Kern Replikation, DNA-Reparatur, DNA-Modifikation, Rekombination Transkription Transkriptionelle Repression Direkte DNA-Bindung durch Ld? Prolinreiche Sequenzen in Transkriptionsaktivatoren Splicing und RNA-Modifikation Strukturelle Prozesse wie Kernskelettaufbau oder Chromatin-Assembly Bindung von Ld an die WW-Domäne Die Ld-SH3-Interaktion Spezifität der Ld-SrcSH3-Interaktion Regulation der Src-Aktivität durch interagierende Proteine Bindung an Profilin Ld und Signaltransduktion Ausblick Material und Methoden DNA-Methoden T -Vektoren für die Klonierung von per-produkten Extraktion von DNA aus Agarose-Gelen Herstellung elektro kompetenter Zellen (E. coli) Elektroporation von Plasmid-DNA in E. coli Pro tein-methoden Biorad-Assay zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen Herstellung von Protein-Gelen, Protein-Lade-Puffer Wes tern -B lot ECL Coomassie-Färbung von Pro tein-gelen Silber-Färbung von Protein-Gelen Imidazol-Zink-Färbung von Protein-Gelen... 8-:1: Markierung lebender Zellen mit 35S-Methionin Fluorographie Native Proteinextrakte aus Kulturzellen.... Immunpräzipitation Af~i~i tä tsreinigung von Protei~~ A~F ~~i~~~ ~~~~~ i~~~ Reml?ur: g von GST-Fusionsproteinen... ::: FraktIOnIerung von Zell extrakten (K C t ern-, y op asma-, Membranfraktionen) Zellkul turtechniken Einf~ieren und Auft~~~~ ~~~ K~i~~~ ~ ~ ii~~ i~.. F iti~~ i.. ~~i ~k~~~ff Calc:umphosphat-Transfektion. von Kulturzell en.... g alrans ormierte Zell-Linie... St b 1 t f n..... Präparation primärer Embryozell en Analyse Luciferase-Assay der Genexpression ß-Galaktosida e-a... s ssay Mikroskopische Techniken Immunfluoreszenz-Färbung von Kulturzellen Drosophila-Techniken Bes~immung der chro~~ ~~ ~~i'~~ L~~~.. ~;~.. T~~~~ ~~~~ CutIcula-Präparation... g xtra te aus Ovarien E k Anhang..... &- Restriktionsenzyme : IgOS ' Plasmid~.~~d.. DNA~K~~~~~~k~ Prolinreiche Konsensusbindun;~~~~ii~~ d~~.. S~~ SH3~D.. ~.: o ane Literatur Danksagung Lebenslauf Zusammenfassung

5 Einleitung Die Embryonalentwicklung der Wirbeltiere ist ein weitgehend unverstandenes Phänomen, auch wenn die zugrundeliegenden Mechanismen zum Teil bekannt sind. Theoretisch läßt sich die Ontogenese in zwei Teilaspekte zerlegen: auf der einen Seite die Differenzierung von embryonalen Zellen und auf der anderen Seite die Musterbildung innerhalb von Zellverbänden. Die Differenzierung ist das Ergebnis differentieller Genexpression, d.h. eine Folge davon, welche Gene in den Tochterzellen nach einer Zellteilung aktiv werden. Im Zusammenhang mit dieser Arbeit stellt das Problem der Differenzierung ein sekundäres Problem dar, da die hier untersuchten limb deformity-proteine vor allem bei der Muster- und Formbildung eine Rolle zu spielen scheinen. Anders als Z.B. bei der Ausbildung des hämatopoetischen Systems, wo differentielle Genexpression für die Identität und damit Funktion der Blutzellen der entscheidende Faktor ist. Differenzierung und Musterbildung wirken bei der Entstehung spezifischer Zellgestalten zusammen. Hierzu gehört z.b. die Frage, wieso ein Epithel röhrenförmig oder flächig gestaltet ist. Die Entstehung einer bestimmten Zellgestalt stellt den Zusammenhang zur Musterbildung her, da ein Muster im Zellverband ohne die dreidimensionale Gestalt der Zellen nur auf zwei Dimensionen beschränkt bleibt. Die Gestalt ganzer Organismen ergibt sich nicht zuletzt aus der Faltung von zweidimensionalen Zellverbänden wie Epithelien und der darin eingeschlossenen Parenchyme. Natürlich kann man diese Teilaspekte in der Praxis schwer trennen und sie spielen eine gleichberechtigte Rolle in der Entwicklung tierischer Embryos. Die in dieser Arbeit untersuchten limb deformity-proteine spielen eine Rolle bei der Musterbildung, da entsprechende Mutanten die Entwicklung der Extremitätenmorphologie nachhaltig stören. Neben dem ld-gen sind mittlerweile eine ganze Reihe weiterer Gene und deren Produkte bekannt, die bei der Extremitätenentwicklung eine Rolle spielen. Durch die gute experimentelle Zugänglichkeit mittels embryologischer, genetischer und molekularbiologischer Methoden sind die Wirbeltiergliedmaßen deshalb ein vorzügliches Modellsystem für die Vertebratenembryologie. Darüber hinaus kann man annehmen, daß die Prinzipien der Extremitätenentwicklung die gleichen sind wie in anderen Organsystemen: vor allem Induktionsprozesse durch lösliche Proteinfaktoren, Auslösung von Signaltransduktionsketten durch diese und schlußendlich die Aktivierung oder Repression zell- oder stadienspezifischer Gene, oft mit der Folge einer erneuten Aussendung von Signalen, findet man in Variationen überall in der Ontogenese (Gilbert 1994, Wolpert 1994, Slack 1993, Ingham & Martinez Arias 1992, McGinnis & Kuziora 1994, Reid 1990, Davidson 1990, Reith & Bernstein 1991, Gurdon 1992, Horvitz & Herskowitz 1992, Jessel & Melton 1992, Green & Smith 1991, New et al. 1991) Das Studium des ld-gens sollte es deshalb auch ermöglichen, einen Einblick in diese grundlegenden Prozesse zu erlangen.

6 Einleitung 2 Historischer Rückblick: Das Id-Gen und die Id~Allele Anfang der Sechziger Jahre wurde eine Maus-Linie entdeckt, die eine rezes~ive Mutation aufwies (Cupp 1962, Green 1962, 1968). Die Mutante wurde II m b deformity (ld) genannt, da in diesen Mäusen die folgenden Aspekte. der Extremitätenentwicklung gestört sind: Tibia und Fibula werden durch einen einzigen Knochen ersetzt, Ulna und Radius sind fusioniert und die Anzahl der Carpalia/Tarsalia sowie der Phalangen ist reduziert. Abgesehen von den mißgebildeten Extremitäten wiesen die homozygoten ld-mäuse in vielen Fällen auch noch einen Defekt der Nierenentwicklung auf, der zum Fehlen einer oder beider Nieren führte. Die ld-allele wurden zumeist nach ihrer Herkunft benannt, z.b. ldl nach den Jackson Laboratories (s. Tab. 1). Insgesamt sind heute 6 unabhängig voneinander entstandene Allele von ld bekannt (Tab. 1). Die Ld Proteine werden auch Formine genannt. Allel Derivatio nominis Quelle IdJ Jackson Laboratories Cll:PP 1962 Id 2 J? W~K et al Id OR Oak RidKe National Laboratories Green 1962 ldhd* Harvard University Woychik et al ld In2 Inversion-Translokation (zwischen Chr ) Woychik et al ld Bri* Brinster V ~g! et al Tab. 1 Die bekannten Allele der ld-mutation und die Herkunft ihrer Namen. *auch als IdTg Hd und IdTg Bri benannt (Tg = Transgen). Neuerdings werden auch die Abkürzungen jmnld-j,jmnld-tghd etc. (für Formin) gebraucht. Die normale Entwicklung der Extremitäten bei Wirbeltieren Die Vertebraten-Extremität entwickelt sich aus mesenchymalen Zellen in der Flanke des frühen Embryos. Der entsprechende Bereich wird "prospektives Extremitäten-Feld" (limb field) genannt. Er liegt zwischen Myotom und Seitenplattenmesoderm (vgl. Abb. 6). Aus letzterem wandern Zellen ein, die sich später zu Knorpel- bzw. Knochenzellen differenzieren. Aus dem Myotom hingegen kommen die Vorläufer der späteren Muskelzellen. Es ist unklar, welche Faktoren das Auswachsen des Mesoderms bewirken. Einer der ersten molekularen Marker der frühen Extremitätenknospe ist FGF-8. Appliziert man FGF-8 auf der Flanke früher Embryos, die noch keine Ausbeulung zeigen, wird das Auswachsen von Extremitätenknospen induziert. Dies gilt auch für Bereiche, aus denen sich normalerweise keine Extremitäten entwickeln (Cohn et al. 1995). FGF-8 oder ein verwandter Faktor könnte also auch in der normalen Entwicklung das Aussprossen der Knospe induzieren. Nachdem die Knospe sich gebildet hat, kann man drei funktionelle Bereiche unterscheiden: Die Zone Polarisierender Aktivität (ZPA) liegt im hinteren Einleitung Mesoderm der Kno~pe und verleiht. ihr Polarität in der anteroposterioren (AP) Ach~e. Tra~splanta!Ion von Zellen. diese.s G.ebiets an das Vorderende der Knospe b~wirken. die E~twicklung von spiegelbildlichen Fingermustern, z.b. die Bildung emes kleme~ FIngers ~nsta.tt des Daumens. Der apikale Ectodermrücken (Apical ec~odern:.al ndge, AER) 1St eme ectodermale Verdickung am Rand der Knospe. Er WIrd.. für das Auswac~~en ~~r Knospe benötigt, da seine Entfernung zu vers tummelten. ExtremItaten führ~n, denen (je nach Zeitpunkt der Entfernung) m~hr oder wemger aus~edehnt distale Elemente fehlen. Die Progresszone (PZ) WIrd von Mesenchym direkt unterhalt des AER gebildet. Sie ist die Zone aktiver Zellteilung, von der. das eigentlic~~ Wachstum der Extremität ausgeht. AER, ZP A und PZ SInd wechselseitig voneinander abhängig. Das AER hält das PZ durch unbekannte Signale in einem proliferierenden Zustand. Die ZP A wird für die Differenzierung des AER gebraucht und das AER für die Aktivität der ZP A. Obwohl mittlerweile zahlreiche Gene bekannt sind, die bei diesen Interaktionen v~rmutlich eine Rolle spiele~. (Tab. 2, Abb. 2), sind die molekularen Grundlagen d~eser Prozessen nur bruchstückhaft bekannt (s. Tickle 1994, 1995, 1996, Eicheie & Tickle 1994, ~ohn.& Tic~e 1?96). Einige Hinweise geben die Expressionsmuster von Genen, die mittlerweile In großer Zahl aus der Extremitätenknospe bekannt sind (Abb. 2). Abb.. 1 Indukti~nsprozesse bei der Extremitätenentwicklung. AufSIcht auf die rechte Extremitätenknospe (oben = anterior) I: erhält die Proliferation der Progresszone 2: erhält die Polarisierende Region (ZP A) 3: erhält die Progresszone (modifiziert nach Eichele & Tickle 1994) Vor allem aus den Expr~ssionsmu.stern. und austransplantationsexperimenten wurden Modelle entwickelt, WIe die verschiedenen Proteine zumindest genetisch miteinander interagieren (Abb. 5). Über direkte molekulare Interaktionen ~st nur weni? bekannt, Z.B. daß Sonic hedgehog (Shh) an das Membranprotem patched bindet und patched damit höchstwahrscheinlich den Shh-Rezeptor darstellt (Heuvel & Ingham 1996).

7 4 Einleitung 5 Einleitung :;;; ;;; ~ Hox 013 HoxA13 Hox 012 Hox 011 Hox 010 HoxA11 ~ HoxA10 Hox09 HoxB8 ~ ~ :> Shh GIi-3 Msx-1 Msx-2 BMP-2 BMP-4 3 CD.~ ::J (") :::r '< 3 '-;J :J :r:- m ::D FGF-4 FGF-8 CD Gen FGF4 FGF8 FGF2 FGF-Receptor 1 Wnt7a Shh RARa/RARy BMP7 BMP2 BMP4 Msxl Evxl Hoxd13 Hoxd11 Hoxa11 Hoxdll/Hoxall early embryonic lethal not known KO-Phänotyp brain phenotype; limbs normal early embryonic lethal distal paws ventralized complete absence of digits and absence or fusion of the paired distal limb bones. In the hindlimb, the tibia and fibula are completely absent, although the femur is formed. In the forelimb, a bony extension of the humerus may represent either a fused ulna/radius or simply a long, bent h umerus loss of anterior skeletal elements polydactylous homozygous mutant embryos died between day 7.0 and 10.5 of gestation early embryonic lethal normal limbs early embryonic lethal truncated digits, delay in ossification, extra postaxial digits very subtle changes in midskeleton very subtle changes in midskeleton lacks radius and ulna, tibia and fibula _ inlich eine Rolle bei der rschl dener Proteine, die WaIU~ e. Gilbert 1994, Abb 2 Expressionsmuster ve e. d difiziert nach folgenden Autoren. Extr~mitätenentwicklung haben (vereinfacht un mo Maden 1994, Haramis et al. 1995). Tab. 2: Gene, die bei der Extremitätenentwicklung (vermutlich) eine Rolle spielen und ihre Phänotypen bei knack out -Mäusen (nach Tickle 1996, Dono, pers. Mitt.; Shh und BMP2 aus TBASE: Der Extremitäten-Phänotyp bei ld-m:.se~ der Regel schon leicht ~on auß~n Homozygote ld-mutanten kann m hik et al. 1985). Die Tiere welsen b~rel~s erkennen (Kleinebre~ht et. al. 1982, ~~~c und Hinterextremitäten auf, wobei. die als Neugeborene mißgebildete -Y l 1 die Vorderbeine. Beide haben wemg~r Hinterbeine stärker be~roffen sm a; bei Mutanten sind insbesondere ~le Fin er als Wildtyp-Tlere und un besten erkennt man den Unt.erschled Hi!erbeine nach hinten ver?ogen. A~kelettpräparaten (Abb. 4). Die emzelnen. h Wl 1dtyp- und ld-mausen an ZWISC en f 1 t t. d dazu in Tab. 3 au ge IS e. Merkma 1 e sm Ld ist für die Ausbildung des AER notwendig Bei IdHd/ldHd-Embryos (Tag 10) ist die anteroposteriore Achse der Vorderextremitätenknospe im Vergleich zu Wildtypembryos im Schnitt um 17% verkürzt (Zeller et al. 1989). Am Tag 11 ist dieser Unterschied noch ausgeprägter und wird auch bei anderen Allelen (ldi/ldi, IdoR/ldOR ) beobachtet. Der Apical Ectodermal Ridge (AER) ist außerdem bei mutanten Embryos kaum oder gar nicht ausgeprägt. Stattdessen ist der Rand der Extremitätenknospe nahezu glatt oder weist nur lokale Verdickungen auf, die bei Wildtyp-Tieren gleichmäßig entlang der Knospe verlaufen.

8 Einleitung 6 Einleitung...!: r t. -..,~, ".2 Abb. 3: Äußeres Erschemungs. b 1 'ld homozygoter ld-mutanten. Oben Wildtyp -, unten ld/ld-maus (aus Woychick et al. 1985). Merkmal SynostoslS. von UI na und Radius Synostosis von Tb' I 1a und Fibula Oligodactylie Syndactylie Fusion der Carpalia Fusion der Tarsalia Fusion der Metacarpalia Fusion der Metatarsalia Beschreibung Verschmelzen von Elle und Speiche. Verschmelzen von Schien- und Wadenbem Fehlen postaxialer Finger Tab. 3 Skelettmerkmale der homo z yg ot-mutanten IdHd-Mäuse. Verschmelzen von Fingern und Zehen Verschmelzen der Handwurzelknochen Verschmelzen der Fußwurzelknochen Verschmelzen der Mittelhandknochen Verschmelzen der Mittelfußknochen daß Retinsäure in hohen rt ist in diesem Zusammenhang, imodistale) Verkürzungen Bemerke~we en ähnliche anteraposleriore (und pra;89 Dies führt ähnlich wie Konzentra lon & T kle 1985, zitiert m Zeller et al. 1 ß)' d führt Retinsäure verursacht (Lee lc. Sk I tt lementen. Au er em AER die ld-mutation zur FuslOn v.on.. e e. e wahrscheinlich indirekt auf das, d AER Retmsaure WIr kt zur da sie Abflachung vermutlich es. pnmar... 1m Mesenchym aktiv wird. Abb. 4 Skeletlpräparate homozygoter/dhd_mäuse (remts) Un Vergleich zum Wil!i!'YP (links; nach Woychik et al. 1985). Ld wird für den positiven feed-back loop zwischen FGF-4 und Shh gebraucht Idlld-homozygote Embryos zeigen eine dramatisch reduzierte Expession von sonic hedgehog (Shh) und von FGF4 in der Extremitätenknospe an den Tagen 10.5 und 11.5 (Chan & Leder 1995, Haramis et a ). Auch die Expression von Evx1 ist in ldlld-knospen reduziert, Wenn auch noch nachweisbar. Niswander et al. (1994) haben gezeigt, daß Shh und FGF4 gegenseitig ihre Expression induzieren bzw. erhalten und damit einen positiven Rückkoppelungskreis errichten. Dieser Kreis ist offensichtlich bei der Id-Mutation gestört, weshalb die Expression von Shh und FGF4 stark abgeschwächt bzw. völlig unterbunden wird. Während Shh anfangs noch schwach nachweisbar ist, findet man keine FGF4- RNA mehr bei Id-Ild-Extremitätenknospen. Man kann deshalb die Vermutung anstellen, daß Ld eher bei der Aktivierung von FGF4 durch Shh beteiligt ist als bei der Aktivierung von Shh durch FGF4. Shh ist ein Marker für die Zone Polarisierender Aktivität (ZP A). Die ZP A ist notwendig für die anteroposteriore Polarität als auch für die Bildung posteriorer Finger. Das Fehlen von Shh-Expression in Id-Mäusen erklärt deshalb das Fehlen dieser Finger in diesen Tieren. Die polarisierende Aktivität wird jedoch nicht direkt von Ld induziert, da die Expression von Shh in Notochord und floor plale von Id-Embryos unverändert

9 Einleitung 8 ist. Dies ist ein weiteres Indiz dafür, daß Ld für die Aktivierung von FGF-4 und für den Erhalt der Shh-Expression erforderlich ist. verändert Bmp-2 J,. Evx-1 J,. FGF-4 J,.* unverändert Bmp-4 Bmp-7 Msx-2 FGF-8 (J,.) patched (ptc)? Hox d11 J,. Hox d12 J,. Hox d13 J,. Shh J,. T b 4 Veränderte Expression von Markergenen in ldlld-homozygoten Mausembryos. *FGF4 ist nicht m~ ~achweisbar (Nach Haramis et al. 1995, Chan et al. 1995, Kuhlman & Niswander, 1996, Zuniga, pers. Mitt.) FGF-8 FGF-4 Einleitung Die normale Entwicklung der Nieren bei Säugetieren Die Niere der Säuger leitet sich aus dem intermediären Mesoderm ab. Im Zervikalbereich entsteht daraus die Vorniere (Pronephrops), die jedoch nur bei Fischen und Amphibien eine funktionelle Bedeutung hat und sich bei Säugetieren wieder zurückbildet. Die hier im Mesoderm entstehenden Lumina entwicklen sich zu Nierenkanälchen, die sich mit einem Flimmertrichter in die Coelomhöhle entleeren. Die entgegengesetzten Enden der Kanälchen biegen sich caudal um und vereinigen sich miteinander zum Vomierengang. Eine funktionelle exkretorische Einheit ergibt sich durch Auswachsen von Kapillaren aus der dorsalen Aorta, die entweder direkt in die Nierenkanälchen einwachsen oder sich in das Coelom vorwölben (äußerer Glomerulus). Im letzteren Fall werden die Ausscheidungen von den zur Coelemhöhle offenen Kanälchen mittels ihres Flimmertichters wieder aufgenommen und in den Vornierengang abgeleitet (Abb. 6 und 7). Die Urniere (Mesonephros) entsteht in der Thorakal- und Lumbalregion. Hier entwickeln sich nur noch innere Glomeruli ohne Flimmertrichter zur Coelomhöhle. Der Vornierengang geht hier in den Urnierengang (W olffscher Gang) über. Letzterer entwickelt sich bei männlichen Embryos zum Ductus deferens, bei Weibchen degeneriert er. Die endgültige Niere der Säuger entsteht aus dem caudalen Abschnitt des intermediären Mesoderms und heißt Nachniere (Metanephros). Das Mesoderm induziert hier auf unbekannte Weise das Aussproßen der Ureterknospe aus dem Urnierengang. Die Ureterknospe wiederum induziert das me~nephrogene Blastem zur Differenzierung der Nierenkanälchen und Glomeruli. )' Obwohl mittlerweile Hunderte von Genen bekannt sind, die in der~mbryonalen niere exprimiert werden, ist nur für wenige eine definierte Funktion in der Nierenentwicklung nachgewiesen (Davies & Bard 1994). Hier seien einige derjenigen Gene erwähnt, die bei Inaktivierung ("knock out") spezifische Störungen der Nierenentwicklung verursachen (Tab. 5). 9 HoxD (Iate) Ld? / BMP-2? BMP-7 Ld? SHH Tl Gli3 HoxD (early) Abb. 6: Entwicklung der Nierenanlage (aus Langman, 1980) immer GIomeruJus äußerer Glomerulus Abb. 5 Modell genetischer Interaktionen in der frühen Extremitätetenknospe. Details im Text (modifiziert nach Duprez et al. 1996)

10 Einleitung Nephrotomes Mesonephric tubules Uninduced intermediate mesoderm Cloaca ("J i, Primary nephric duct Gonad -- Mesonephric "" duct, "!ID.-... Ld c-ret WT-1 Abb. 7: Entwicklung der Nachniere und die Rolle von Ld. (modifiziert nach Carlson 1994). Der Nieren-Phänotyp bei ldlld-mäusen Neben dem namengebenden Extremitätenphänotyp beobachtet man bei ld- Mutanten häufig das Fehlen einer oder beider Nieren (s. Tab. 6, Maas et al. 1994). Letzteres bezeichnet man als Nieren-Agenese. Sind Nieren vorhanden, sind diese meist kleiner als bei Wild typ-tieren (lfhypoplastische lf Nieren). Daneben findet man in diesen Tieren of "Megaureter lf, wobei einer oder beide Ureter erweitert sind. Hydronephrosis und Hydroureter wurden erstaunlicherweise nur beim Id1n2-Allel beobachtet, was möglicherweise auf eine Abhängigkeit vom Mäusestamm hindeutet, aber theoretisch auch eine unabhängige Sekundärrnutation als Ursache haben könnte. Neugeborene Mäuse ohne Niere sterben innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt. Ist nur eine der Nieren vorhanden, scheint diese völlig normal zu funktionieren und die Tiere besitzen eine weitgehend normale Lebenserwartung. Der Nierenphänotyp ist am stärksten bei ldi-homozygoten Mäusen ausgeprägt (vgl. Tab. 6). Dies ist im Hinblick auf den Extremitätenphänotyp erstaunlich, da hier die IdTgBri-Mäuse am stärksten betroffen sind (Chan & Leder 1996). 10 Einleitung 11 Gen AP-2 Bcl-2-/- BMP-7 Phänotyp hypoplastic, retarded development of metanephros (& many other defects in embryo) polycystic disease severe kid hypoplasia ([ethal): early development OK (->E125) but then few nephrons form and cd b ranc h' zn 19 ceases., Cox-2 poor. ureteric bud development apparent by birth; nephrons few and Immature (E14 kidneys look OK) Fu (Fused) GDNF IGFI IGFIR IGFII ld LIM-1 variable failure of ureteric bud!(rowth renal agenesis due to lack 01 ureteric budo Can be rescued in vivo by added CDNF hypoplasia in Zine with that of the whole animal (no SPECIFIC renal effects) similar to ICFI similar to ICF I above variable failure of ureteric bud!(rowth failure of kidney and genital development Pax-2 failure of mesonephros, metanephros & genital dezf~elopment. Neither tubules nor ureteric bud form. Even heterozygote has f/:'< small kidneys y/ PDGF-B PDGF-R-/- RAR -/- c-ret -/- Sd Shh Wnt4 -/- WT-1 -/- very few glomeruli very few glomeruli aplasia (due to lack of ureteric bud) & hypoplasia. Variable phenotype; some RAR subtype redundancy variable failure of ureteric bud invasion, growth and branching. Metaneph~ogenic mesench. can still be induced by spinal cord. h~poplastlc/aplastic Kldney defect of unspecified type kidneys (ureteric bud invasion inhibited) Metanephrogenic mesenchyme won I t epithelialise and wnt4 transcription not activated (not even the mutant message) absence of metanephro-genic mesenchyme Tab. 5: Gene, bei denen durch knock-out-exp..' Nierenentwicklung nachgew'e d (enmente oder Mutationen eme Rolle bei der.' 1 sen wur e aus der Datenbank KIDBASE http./ /mblsg2.sbc.man.ac.uk/kidbase/mutantk.html). ' Cox-2 = cyclooxygenase, Sd=Daruorth's short tail

11 Einleitung 12 Einleitung 13 Definierte morphologische Unterschiede zwischen Wild typ- und ldf-mäusen kann man zuerst am Tag 10.5 der Embryonalentwicklung feststellen. Im mutierten Embryo hat die Ureterknospe zu diesem Zeitpunkt das metanephrogene Mesenchym noch nicht erreicht, während sie im Wildtypembryo schon viel weiter fortgeschritten ist. Dasselbe Ergebnis wurde bei [dor-mäusen beobachtet. Die Differenzierung des metanephrogenen Mesenchyms ist in mutanten Mäusen signifikant verzögert, höchstwahrscheinlich weil der induzierende Einfluß der Ureterknospe zunächst ausbleibt (s.u.). Rekombinations-Experimente mit Mesenchym/Ureter Explantaten aus mutanten und Wildtyp-Mäusen zeigen, daß das Ld-Protein für das Auswachsen der Ureterknospe gebraucht wird. Das Ld-Protein ähnelt darin dem Wilms-Tumor-Protein WT-1, in dessen Abwesenheit ebenfalls keine Ureterknospe auswächst (Kreidberg et al. 1993). WT-1 ist aber auch für die Differenzierung des Mesenchyms erforderlich. Ld ist hingegen im Mesenchym nicht notwendig, da Mesenchym-Explantate aus ld/ld-mäusen normal auf Induktionssignale wie Rückenmark reagieren (Maas et al. 1994). Rückenmark von ld/ld-mäusen kann die Differenzierung des metanephrogenen Mesenchyms genauso gut induzieren wie Wild typ-rückenmark. Dies zeigt, daß der Defekt nicht in der Reaktionsfähigkeit des Mesenchyms liegt, sondern eher in der Induktionsfähigkeit der (nicht auswachsenden) Ureterknospe. Es ist aber nicht klar, ob das Ld-Protein direkt in der Signalübertragung von der Ureterknospe zum Mesenchym gebraucht wird oder "nur" für das Auswachsen der Knospe. In letzterem Fall würde der Defekt auf dem fehlenden Kontakt zwischen Knospe und Mesenchym beruhen. Mäusen mit Isoform IV -spezifischen Deletion haben nur in wenigen Fällen Defekte in der Nierenentwicklung, auf jeden Fall seltener als IdTg Hd oder Id BrL Mäuse (Chan et al. 1995). Sonstige Merkmale mutanter Id-Mäuse Maas et al. (1994) beobachteten bei weiblichen IdJ/ldJ und (seltener) bei IdoR/ldoR-Mäusen eine "signifikante Häufung" imperforierter Vaginae. Erstaunlicherweise findet man diesen Defekt nicht bei ldtghd/ldtghd-weibchen, obwohl dieses Allel sonst den stärksten Mutanten-Phänotyp aufweist. Obwohl das Ld-Protein in einer ganzen Reihe verschiedener Organe und Entwicklungsstadien exprimiert wird (s.u.), sind bei den bisher bekannten Allelen keine anderen Entwicklungsstörungen außerhalb der Extremitäten und der Nieren bekannt geworden. Nieren p hänotyp Allel N beide eine 1 fehlt 1 hypopl beide % Ref. fehlend hypopl. 1 normal 1 normal normal abnorm. Id OR IdTgHd IdJ IdJ (ad.) 23? IdJ (ad.) 325? Id In (2.5)/21* 3 Id Bri Id Bri Tab. 6 Häufigkeit von Nierenanomalien bei neugeborenen homozygoten ld-mäusen (nach Maas et al. 1994, modifiziert). Angegeben ist jeweils die absolute Zahl der betroffenen Mäuse. *M~as et ~L (19~4) geben hier einen Wert von 21% an. Allerdings wurden dabei (n=7) noch 10 wettere Tiere nut Megaureter (s. Text) eingerechnet. Der Wert von 2.5% stammt aus Chan & Leder (1996). (ad.) bei zdl deutet an, daß hier nur adulte Tiere untersucht wurden. Quellen: (1) Maas et al. 1994, (2) Kleinebrecht et al. 1982, (3) Woychik et al. 1990, (4) Messing et al. 1990, (5) Vogt et al Chromosomale Lokalisation des Id-Gens Anfang der Achziger Jahre wurde ein ld-allel im Labor von Phil Leder (Harvard) entdec~t, ~ls.man. dort trans gene Mäuse mit dem c-myc Gen herstellte. OffensIchtlIch msenerte das Transgen in das ld-gen, wodurch derselbe Phänotyp erzeugt wurde, den man schon bei IdJ und ld or beobachtet hatte (Woychik et al. 1985). Dieses Allel (ld Hd ) erlaubte schließlich die Klonierung des Id-Gens (s.u.). ~a da~ IdHd_A~I~1 durch die Insertion eines c-myc-transgens entstanden war, ließ SIch die LokalIsIerung des Gens leicht feststellen. Dazu wurden Southern-Blots vers~h~e?ener so~atischer Maus-Hamster-Zellhybriden mit myc-proben hybndisiert (Woychik et al. 1985). Dabei fand man das ld-gen auf Chromosom 2 der Maus. Das homologe Gen des Menschen wurde auf Chromosom 15 lokalisiert, welches ausgedehnte Syntenie-Bereiche mit dem Maus-Chromosom 2 aufweißt. Die Verhältnisse sind in Tab. 7 dargestellt. Struktur des Id-Gens Das Ld-Gen umfasst ca. 400 kb auf Chromosom 2 der Maus. Es besteht aus mindestens 24 Exons (Wang et al., in press). Diese Struktur erlaubt die Expression verschiedener Spleißvarianten, von denen fünf in Abb. 8 dargestellt sind. Die Verbreitung und Funktion ist jedoch nur bei den Isoformen I-rn und IV näher untersucht worden.

12 Einleitung 14 Einleitung Das Ld-Protein (Formin) Aufgrund der Sequenz ergeben sich keine Hinweise auf die biochemische Funktion von Ld. Obwohl es eine Reihe homologer Proteine bei anderen Organismen gibt, ist auch die Funktion dieser Proteine unbekannt. Durch den Vergleich von Maus- und Hühnerprotein lassen sich jedoch Bereiche unterschiedlicher Konservierung ausmachen, die möglicherweise strukturelle / funktionelle Domänen repräsentieren. Oberflächlich betrachtet wird der Ld-ORF durch eine proline-reiche Sequenz in zwei Hälften geteilt. Die N terminale Hälfte ist zwischen den verschiedenen Homologen kaum konserviert (s. Abb. 11), obwohl die sogenannte "Zentrale Domäne" innerhalb der Vertebraten konserviert wurde. Der C-Terminus ist zwischen Maus und Huhn zu 81 % identisch, was auf die funktionelle Bedeutung dieser Domäne hinweist. Allerdings umfasst dieser Bereich ca. 500 Aminosäuren, sodaß innerhalb dieses Bereichs mehrere unabhängige (strukturelle) Domänen möglich sind. Ld IV: Exons: I 1 "11 10 kb ppp I I 1;// I IFH2" u "'-/ ---~"~.; 11 I" 11" r ~/~!"I~I Hd In2 I Tab. 7 Schematische Darstellung der chromosomalen Lage des ld-gens bei Maus und Mensch, dargestellt als Syntenie-Karte zwischen Mauschromosom ~ und n:enschlichem Chromosom 15 (vereinfacht nach Debry & Seldin 1996, /www3.ncbl.nlm.nih. gov /Homology I). Fron = Ld. Die molekulare Analyse des ld Gens führte auch zu einem besseren Verständnis einiger Id-Mutanten. Chan & Leder (1996) zeigten, daß b.ei Id Hd eine Del~tion.und bei Id 1n2 eine Inversion/Translokation vorliegt, wobei die Bruchpunkte m belden Fällen in Introns liegen und so zu fehlerhaften Sp~eißprodukt~n führ~n. Die resultierenden Proteine sind jeweils verkürzt und welsen C-termmal veranderte Proteine auf (Abb. 9). la Ib IV I I I I 1 1 I I I " 11 I 11 I 11 1II I 11 I I 1III 1III 1111 li/i 1111 Abb. 8: Struktur des ld-gens und die verschiedenen Spleißvarianten (la-iv).

13 Einleitung 16 wt ////////////////./////~,< ~ In2 r PREYLQPFKD KLEEFFKKAK KEHKMJmSHL ENAQKSFE'l'T VGYFGMJ.aIKT GEKEVTPSYV FMVWFEFCSD FKTIWKRESK NISKERLKMA QASVSKLTSE KKVE'l'KlUNP TASLKERLRQ KEASVATN,..../.. ',.'..../ /./... ' /',,/ / /... W.//////////./. 1I11IIII1I11,/'.".../...".,'...,',,,... J 1468 aa \./' 1" ", ~///////////h 1427 aa PREYLQPFKD KLEEFFKKAK KEHKMJmSHL ENAQKSFE'l'T VGYP'GMJ.alKT GEKEVTPSYV FMVWFEFCSD FKTIWKRESK N:ISKER K* A Einleitung Domains: N-terminal Pro C-terminal Chicken (IV) Mouse (I) r " " r , LPPSPPPPPPPPPPPPPPPPPFSDSSLPGLVPPPPPLPTGPTSVTPHFAFGPPL II 11111: :1 1 1: :.11 SPPAPPTPPPLPPPLIPPPPPLP.PGLGPLPPAPPIPPVCPVSPPPPPPPPPPT Ch 695 M Hd Bri PREYLQPFKD KLEEFFKK GSPVLLS:I.A* (Bri 1) PREYLQPFKD KLEEFFKK DSNLWN* (Bri 2) PREYLQPFKD KLEEFFKK G:ILDTY* (Rd) 1364 aa Abb. 9 Schema des Wildtyp-Proteins und der molekular charakterisierten Mutanten mit den Aminosäure-Sequenzen der entsprechenden C-Termini. Der Prolin-Kem Inmitten des Ld-ORF findet sich eine prolinreiche Sequenz von ca. 100 Aminosäuren (Abb. 10). Obwohl sie in beiden Arten mehr als 50% Prolin enthält, gibt es keine darüber hinausgehende Homologie der Nicht-Prolin-Reste. Dies könnte darauf hindeuten, daß dieser Abschnitt eine generelle Funktion als "linker" oder dergleichen hat. Prolin ist ein Helixbrecher und erlaubt dieser "Domäne" deshalb keine definierte dreidimensionale Struktur, wie man sie von einer "echten" Proteindomäne erwarten würde. Trotz dieser strukturellen Einschränkungen hat man für prolinreiche Sequenzen eine Reihe funktioneller Eigenschaften ausgemacht. Dazu gehört die Fähigkeit, Proteine mit SH3- oder WW-Domänen zu binden (Ren et al., 1993, Sudol 1996). Darüberhinaus ist bekannt, daß Profiline an Poly-Prolin binden (Tanaka & Shibata 1985). 705 PPQLSEGCRDFQAPAPPAPPPLPGL... GPPVPPPLPGSGLPPPPPPPGP 696 I I: I. : I : I I : I. : I. I. I 11 I I : 11 I. I PVPPSDG... PPPPPPPPPPLPNVLALPNSGGPPPPPPPPPPPPGLAPPPPP Abb.l0 Vergleich der Prolin-reichen Sequenzen von Maus- und Hühner-Ld. 751 Ch 744 M Expressionsmuster Das Ld-Protein ist in einer Vielzahl von Zellen und Organen exprimiert (Trumpp et al. 1992). Es zeigt darüberhinaus eine bemerkenswerte zeitliche Dynamik, in dem es beispielsweise in Geweben des Nervensystems nur während bestimmter Stadien exprimiert wird (Trumpp et al. 1992, de la Pompa et al. 1995). Einen Eindruck vom Expressionsmuster gibt Tabelle 8. In dieser wird auch zwischen verschiedenen Spleißformen unterschieden, die ebenfalls differentiell exprimiert werden (Chan et al. 1995).

14 Einleitung 18 Einleitung 19 Gewebe/ Trigeminal Ganglia I-rn IV Dorsal Root Ganglia Pronephros Mesoneph. tubules Mesoneph. duct Die limb dejormity/jormin-genfamilie Im Lauf der letzten Jahre wurde eine ganze Reihe von Proteinen kloniert, die Ähnlichkeiten mit dem ld-protein aufweisen. Alle haben eine charakteristische prolin-reiche Sequenz ungefähr in der Mitte, wobei die Homologie nur im "Prolinreichtum", nicht jedoch in der genauen Sequenz zu sehen ist. Dies betrifft insbesondere die Nicht-Prolinreste. Die prolinreiche Sequenz wurde von Castrillon et al. (1995) "Form in Homology Domain 1" (FH1) genannt. Daneben zeichnet sich die ld-familie durch einen mehr oder weniger konservierten C-terminus aus, der bei entfernten Verwandten nur einen kurzen Abschnitt signifikant ähnlicher Sequenz enthält. Diese sogenannte FH2 Domäne liegt im Zentrum des hier als "C-Terminus" bezeichneten Teils des Proteins. Die FH2-Domäne ist bei entfernten Verwandten nur ca Aminosäuren lang. Eine genaue Begrenzung der Domäne läßt sich nicht festlegen, weil die Ausdehnung der Homologie mit der phylogenetischen Distanz bis auf 30 Aminosäuren (bei der Hefe) abnimmt. Ureteric bud Metaneph. mesench. Metanephric kidney AER limb mesenchyme Dermamyotomes Notochord gonads Tab. 8 Expressionsmuster von verschiedenen Ld-Isoformen während der Mausentwicklung (nach Chan et al. 1995).. (1) ohne Angabe des Stadiums, (2) gepunktetes Muster an den Tagen 14.5 und 15.5, (3) postenores Mesenchym, (4) am intensivsten in den vorderen Somiten, die schon fortgeschrittener sind, (5) Tag 15.5, (6) (Maas et al. 1994). Species Protein/ Gene EMBL/GB Swissprot PIR PIR2 Arabidopsis EST Aspergillus FigA R30345 L36341 C. elegans F11H8.4 U40187 Chicken ld X62681 Q05858 A , :p, Drosophila cappuccino U34258 Drosophila diaphanous U11288 P48608 Human EST R39757 Mouse Formin I X53599 Q05860 Sl1515 Mouse Formin IV X62379 Q Rice EST D24760 S. pombe cdc 12 Ll6551 P S. pombe fus 1 L37838 Yeast BNIl L31766 P41832 Yeast YIP9 Z47047 P Tab. 9: Mitglieder der Ld-Genfamilie und ihre accession numbers in verschiedenen Datenbanken Abb. 11 (nächste Seite): Die limb deformity Genfamilie. Gezeigt sind alle bisher bekannten Gene, die mit Ld eine prolinreiche Sequenz ("FH1"Domäne, Pro) und konservierte Sequenzen im C-Teminus ("FH2" Domäne, dunkle Box) gemein haben. Der Pfeil bezeichnet die Stele alternativen Splicings. Zahlen in den einzelnen Pro tein abschnitten geben die Prozentzahl identischer Aminosäuren im Vergleich zum Id-Protein der Mausisofonn I an.

15 Einleitung ro ro ("f) ro ro ro LI') ro ro ro ro ro (j') ro ro ro ~ (j') CX') N ro u:> u:> ("f) LI') (j')..q- 0 ~ 0 0 (j') ~ N N ~ ~ LI') ~ ~ N ~ ro ro LI') ro " ro ("f) ~ ~ CX') (j') 20 Einleitung 21 cappuccino (capu) Das Drosophila-Gen cappuccino wurde als maternal-effect-mutante entdeckt. homozygote capu-weibchen legen Eier, die sowohl Defekte in der anteroposterioren als auch der dorsoventralen Achse aufweisen (Manseau & Schüpbach 1989). Cappuccino spielt darüberhinaus eine wichtige Rolle bei der Polzellenbildung (Keimzellen-Vorläufer). Fünf verschiedene cappuccino-allele wurden in einem Screen nach sterilen Drosophila-Weibchen entdeckt (Tab, 10 und 11, Manseau & Schüpbach 1989). Weibchen mit einem schwachen capu-allel haben Embryos ohne Polzellen und ohnepolar granules. Außerdem ist bei ihnen die Segmentierung des Abdomens gestört. co... C\I C\I C\I C"') 1II li; li; w c:: ro w (f) 'in E 0. ::J.s:::. 0 "C :.c ro «li; w (J) u 'e Allel % der Eier mit abnormer Hülle % der Eier aus denen Larven schlüpfen HK RK 45 2 G7* F <5? BE 60-90? Tab. 10 Vergleich verschiedener capu-allele und ihre Phänotypen (nach Manseauund Schüpbach, 1989 und Emmons et al. 1995). G7 hat im Gegensatz zu den anderen (dorsalisiefenden) Allelen schwach ventralisierende Wirkung! > > 0 (f) c:: ::J 'u 0 U c:: ::J ro 0..s:::. (J) c:: V. (f) (J) ro ro CX') ::J.:::t. U i5 :::c 0 u ~ E.s:::. ~ u ro ro u...s:::.,- (J).s:::. (f) (f) ::J 0 0 c:: 0 (f) (f) ro 0 E 0 Cl Q) Cl Cl Q; U. «Cl ij: (f) ::J Cl (J) (j') 0. a. (f) >- +-' (f) ro (J) >- «Allel G7 2F Defekt EMS-induzierte 1 kb-insertion im Promoterbereich P596~T HK 1750~T RK L767~H bp deletion in intron (zwischen L917 und G918) 38 H976~Y Tab. 11 Molekulare Defekte in verschiedenen capu-allelen (nach Emmons et al. 1995). Alle Mutationen ausser G7liegen im konservierten C-Terminus des Proteins. Die Ursache der gestörten Polzellbildung ist darin zu sehen, daß in den betroffenen Eiern die polar granules (Ribonucleoprotein-Partikel) und deren Komponenten (z.b. vasa) nicht oder nicht richtig lokalisiert werden. ~ Z CO +-' V'l ro Q) :>-

16 Einleitung 22 Die Defekte der Zellularisierung und der Kernwanderung kann man auch bei Behandlung der Embryos mit Cytochalasin B beobachten, einer Droge welche die Actin-Polymerisierung inhibiert. Dies deutet darauf hin, daß das Actin-Skelett bzw. ein Actin-abhängiger Transportvorgang in frühen Embryos betroffen ist. Der dorsalisierende Effekt starker capu-allele wie RK wird an den Dorsal Fortsätze (dorsal appendages) sichtbar, die bei vielen Eiern fusioniert sind und in Extremfällen einen Ring um den vorderen Eipol bilden. Dorsalisierung kann nur in der Anwesenheit von normalem gurken und torpedo-genprodukt beobachtet werden. Daraus schließt man, daß gurken und torpedo "downstream" von capu liegen und die Effekte von capu vermitteln. gurken Pro tein ist in capu-mutanten in der Tat entlang des gesamten Ei Vorderendes lokalisiert (und nicht "in der Ecke" zwischen Oocyten-Membran und Kern) und dieser Lokalisierungsdefekt scheint ursächlich für die Dorsalisierung verantwortlich zu sein. Die anderen genannten Proteine scheinen zusammen mit capu (und spire) für die Lokalisierung posteriorer Determinanten verantwortlich zu sein. In eapu-mutanten wird die Lokalisierung von Staufen am Hinterpol durch vorzeitige cytoplasmatische Strömung verhindert. Die Lokalisierung von Gurken ist dagegen resistent gegen die vorzeitige Strömung. Diese Phänotypen zeigen, daß die Polzellbildung am empfindlichsten auf capu Mutationen reagiert und daß die abdominale Segmentierung und Dorsalisierung zunehmend weniger auf ein voll funktionsfähiges Genprodukt angewiesen sind. diaphanous (dia) Das Drosophila-Gen dia wurde in einern P-Element Screen nach rezessiven sterilen Männchen gefunden. Null-Allele von dia sind erst im frühen Puppenstadium lethai, da maternales Protein für die ersten Larvenstadien ausreicht. Davon abgesehen weisen dia-mutanten Defekte in der Spermatogenese und der Oogenese auf. dia-embryos haben binukleäre Zellen, was auf einen Defekt in der Cytokinese hindeutet (Castrillon & Wasserman 1994). Ein Teil der Neuroblasten ist sogar polyploid, wobei der Grad der Polyploidie von der Stärke des dia-allels abhängt. Der Phänotyp legt nahe, daß dia direkt oder indirekt diejenigen Funktionen des Cytoskeletts beeinflusst, welche die Zellteilung regulieren. Die molekulare Funktion von dia ist jedoch unbekannt. Einleitung 23 Defekt de/eets related to posterior loealization and pole eell fonnation lack of pole cells lack of posterior localization of staufen pro tein lfrom stage 8 onwards) abdominal segmentation defeets (segments missing) abnormal microtubule distribution premature (microtubule based) cytoplasmic streaming (speed of streaming does not correlate with the strength of the mutant allele as shown by egg-shell defects) Dorsalization: dorsal appendages are often fused dorsally and/or extend ventrally around the anterior cicumference expansion of zen ventrally (in some capu embryos, esp. anteriorly) dorsalized cuticles (like grandchildless-knirps mutants) ventral furrow reduced or absent (in strong alleles) altered ftz expression (like grandehildless-knirps mutants) in some capu embryos twist staining is present only in ventral cells at the poles of the embryo the shapes of the follicle ceil imprints in the main body of the eggshell, which are elongated on the dorsal side and regularly shaped on the ventral side in wildtype eggs, do not show a dorsoventral difference. The number of follicle ceil imprints on the main body of the chorion is reduced. eeillarizationieell division incorrect cellularization. Many (50% in HK, 57% in G7IDß of the blastodermstage embryos have patches of cells of different size and density. Nuc1ei often fail to migrate properly along the AP-axis, leading to abnormal distributions of nuclei when they arrive at the periphery. Stages of nuclear division immediately preceding cellularization are often asynchronous. Tab. 12: Defekte bei Eiern/Larven capu-homozygoter Drosophila-Weibchen (aus Manseau & Schüpbach, 1989)

17 Einleitung 24 Andere Homologe Eine ganze Reihe weiterer ld-homologer Gene wurde aus anderen Organismen kloniert. Von keinem dieser Proteine ist jedoch eine genaue biochemische Funktion bekannt. Einige Eigenschaften dieser Gene oder Proteine sind in Tab. 13 zusammengestellt. Die Größe und Aminosäuren-Identität mit dem C-Terminus von Ld geht aus Abb. 11 hervor. fus 1 junctions in conjugation. Conjugation tubes meet, but the (5. pombe) intervening cell walls do not dissolve (Emmons et al. 1995) CDCl2 Mutants do not undergo cytokinesis and fail to form the actin (5. pombe) contractile ring (Emmons et al. 1995) FigA Mutants of figa result in thick, heavily branched hyphae and (A. nidulans) abnormal tips of hyphae. (Marhoul & Adams 1995). BNIl BNIl was identified by mutants that are synthetically lethai with (5. cerevisiae) mutants in CDC12, one of the bud neck filament proteins. Mutants in BNIl result in random bud-site selection in diploids during bipolar budding, suggesting a role in cell polarity in yeast. BNI1 interacts with Rho1p, which is localized at growth sites (including the bud tip) (Kohno et al. 1996). Tab. 13 Funktionen und Phänotypen einiger ld-verwandter Die biochemische Funktion des Ld-Proteins Die Sequenz von Ld und seiner Verwandten läßt keine Schlüsse über die molekulare Funktion zu. Von keinem dieser Proteine ist bekannt, was es in der Zelle tut. Die Lokalisation von Ld im Zellkern legt die Vermutung nahe, daß das Protein bei der Genregulation beteiligt ist. Eine Rolle beim Spleißen ist unwahrscheinlich, da Trumpp et al. (1992) keine Kolokalisation mit snurps gefunden haben. Möglich wäre auch eine strukturelle Funktion, z.b. beim Chromatinaufbau. Bisher wurden jedoch nur wenige Chromatin proteine bekannt, die bei Entwicklungsprozessen eine Rolle spielen. Dazu gehören insbesondere Mitglieder der polycomb-gruppe (Orlando & Paro 1993). Ihre genaue biochemische Funktion ist jedoch unbekannt. Der Phänotyp von cappuccino und BNI-Mutanten läßt eine Rolle im Zusammenhang mit dem Zytoskelett und der Zellteilung vermuten (s. Diskussion). Eine molekulare Funktion erschließt sich aber auch daraus nicht. Problemstellung Die in dieser Arbeit untersuchten Proteine spielen eine Rolle bei der Extremitäten- und Nierenentwicklung der Wirbeltiere. Dies wurde bei Studien der entsprechenden Mutanten deutlich, in denen diese beiden Prozeße erheblich gestört sind. Zu Beginn dieser Arbeit war jedoch völlig unklar, auf welcher Funktionsebene der Defekt liegt, bzw. was die molekulare Funktion dieser Proteine ist. Das primäre Ziel der nachfolgend beschriebenen Untersuchungen bestand deshalb darin, eine molekulare Funktion der limb deformity-proteine zu finden oder zumindest bestimmte Funktionen plausibel zu machen. ERGEBNISSE 25 Der C-Terminus der Ld-Proteine enthält ein Kernlokalisierungssignal Trump et al (1992) zeigten anhand von Immunfluoreszenzbildern, daß das Ld-Protein beim Huhn primär im Zellkern vorkommt. Die Lokalisierung im Zellkern ermöglicht nicht nur Spekulationen über die Funktion, sondern auch über die Regulation des Proteins, da die Aktivität vieler Proteine durch ihre Verteilung gesteuert wird. Ein Beispiel dafür ist NFkB, ein Transkriptionsfaktor, der erst durch Proteolyse eines Bindungspartners vom Cytoplasma in den Zellkern gelangt und erst so seine Rolle bei der Genregulation ausüben kann (Hunt 1989). Aus diesem Grund sollte herausgefunden werden, welcher Teil des Ld Proteins für die Kernlokalisierung zuständig ist. Die Identifikation eines Kernlokalisierungsignals (Nuclear Localization signal = NLS) würde auch die Zuordnung einer definierten Proteinfunktion zu einer bestimmten Domäne erlauben. Methodischer Ansatz Obwohl mehrere Antikörper gegen verschiedene Domänen des Ld Proteins zur Verfügung stehen, wurden die Experimente mit einem Epitop-markiertem Ld-Protein durchgeführt. Als Epitop diente ein Tetramer der sog. Z-Domäne aus Protein A aus 5taphylococcus aureus (nachfolgend vereinfachend "Protein A" genannt), das am N-Terminus des Ld-ORFs eingefügt wurde. Protein A hat mehrere Vorteile als Epitop: Erstens benötigt man zu seinem Nachweis keine spezifischen Antiseren, da alle Antikörper der IgG-Klasse mit großer Affinität direkt daranbinden. Ein weiterer Vorteil ist die Tatsache, daß kommerzielle IgG-Peroxidase- oder IgG-Fluoreszein Konjugate für einen Nachweis zur Verfügung stehen, so daß in den meisten Fällen eine Antikörper-Inkubation für den Nachweis ausreicht. Das gilt sowohl für Western-BIots als auch für Immunfluoreszenz Färbungen. DarübeE hinaus gibt es offenbar keine endogenen Proteine bei Eukaryonten, die Ahnlichkeit mit dem Protein A aufweisen, sodaß bei optimierten Bedingungen praktisch keine Hintergrundsignale beobachtet werden können. Die Z-Domäne aus Pro tein A selbst ist ein kleines Epitop von 58 Aminosäuren (6.6 kda). Ein Tetramer hat nicht nur eine vielfach vergrößerte Affinität zu IgG, sondern auch noch eine Größe, die selbst Fusionen mit kleinen Peptiden im Western-BIot einfach nachweisbar macht (Uetz & Zeller 1996). Das Protein A-Epitop wurde am N-Terminus des Ld-ORF (iso form IV) eingefügt, da der N-Terminus zwischen den verschiedenen Isoformen nicht signifikant konserviert ist (s. Einleitung). Trotzdem scheinen alle Isoformen im Kern vorzukommen. Das deutet darauf hin, daß der N Terminus beim Kerntransport keine Bedeutung hat und funktionell auch nicht auf eine konservierte Aminosäurensequenz angewiesen ist.

18 ERGEBNISSE 26 ERGEBNISSE ~2~7 Um das NLS zu kartieren, wurden entweder Deletionen vom ProtA-Ld IV-Konstrukt angefertigt oder bestimmte Fragmente vom Ld-ORF in einen eigens dafür hergestellten Vektor.kloniert (Uetz & Zeller 1996). Die verwendeten Konstrukte sind in Abb. 14 A und B dargestellt / Abb. 12 Selektion von QT6-Einzelklonen mit hoher Expression des protein-a-ld (IV) Fusionsproteins. Westernblot (ECL) mit IgG-Peroxidase und normalisierten Extrakten aus verschiedenen Klonen. Nur die Klone 8, 22, 26, 33, 39 exprimieren das Fusionsprotein in größeren Mengen. Die Klone 17, 23 und 38 produzieren nur kleine Mengen des Proteins. Von all diesen Konstrukten wurden dann stabil transformierte Zelllinien hergestellt (Abb. 12). Transiente Transfektionen erwiesen sich in einigen Fällen als ungeeignet, da nur ein Teil der Zellen das Protein exprimierte und diese Zellen vermutlich eine so hohe Kopienzahl des jeweiligen Plasmids enthielt, daß das Protein in sehr hoher Konzentration exprimiert wurde. Dies führt dazu, daß nur ein Teil des Fusionsproteins in den Kern transportiert wurde und damit fälschlicherweise eine cytoplasmatische Lokalisierung vorgetäuscht wird. Abb. 13: Verschiedene stabil transformierte Linien von QT6-Zellen, die alle das gleiche Protein A-Ld Fusionsprotein exprimieren. Oben: QT (entspricht dem Klon 33 in der vorhergehenden Abbildung). Das Protein wird trotz/ der Überexpression in den Kern transportiert. Mitte: QT Obwohl für diesen Klon dasselbe DNA-Konstrukt (nämlich #166) verwendet wurde, akkumuliert das Protein im Cytoplasma (vgl. auch mit der vorhergehenden Abb.). Unten: QT Dieses Fusionsprotein hat eine vesikuläre Verteilung, obwohl es im Western Blot nicht von den beiden vorhergehenden unterscheidbar ist. Linke Spalte: Färbung mit dem Farbstoff Hoechst zum Nachweis von DNA. Rechte Spalte: Immunfluoreszenz mit IgG-Rhodamin. Schließlich wurden von den Ze llinien Proteinextrakte entsprechend der Kompartimente Kern, Cytoplasma und Membranen fraktioniert (s. Methodenteil). Die Qualität der Fraktionierung wurden mit folgenden Markern überprüft: Src (Membran), Jun (Kern), Tubulin (Cytoplasma). Ein Protein-A-Ld-Fusionsprotein wird in den Kern transportiert Zunächst wurde ein Protein-A-Konstrukt mit dem kompletten Ld-ORF hergestellt und In QT6-Zellen transfiziert. Die Selektion stabil

19 A ERGEBNISSE 28 ERGEBNISSE 29 transformierter Zellen erlaubte die Isolation einer einheitlichen Zeillinie mit hoher Expression des Fusionsproteins (Abb. 12). Das Fusionsprotein wurde praktisch ausschließlich im Kern beobachtet und war damit nicht vom endogenen Ld-protein zu unterscheiden (Abb. 13). Einige Klone exprimierten das Fusionsprodukt jedoch mit ungewöhnlicher Lokalisation, z.b. Klon #166-17, in welchem das Protein offensichtlich mi t Vesikeln assoziiert war. Diese Klone wurden jedoch nicht weiter charakterisiert. 166 Izzzz~ I 200 i z z z z 199 c z z z z Bpu1102 Esp3 I Bst BstE 11 proline rieh d ~~MJIl kal'.~~ I I I CN Bpu1102 Esp3 I Bst BstE 11 proline rieh i z z z z ~+1".it+~,,",,~d~: :,:;::~;~...,. ::~;;;~~~~~:7 r Pvull 325 Stu I J Id Hd Id In2 (BpuAI) EcoNI C -N 198 BzzzzA y/.... ~ - ",,/" '-",,' I z z z zl Abb. 14A: Lokalisierung des Kemsignals (NLS) in Ld. Die einzelnen Proteine und Deletionen wurden in QT6-Zel1en exprimiert und die Proteine in eine cytoplasmatische (C) und eine nukleäre Fraktion (N) aufgetrennt (Spalte rechts). Für den Kemimport ist eine große Domäne innerhalb des C-Teminus notwendig. Das Ld-NLS erstreckt sich über eine große Domäne im C-Terminus Die ersten Deletionen vom ProtA-Ld-Fusionsprotein zeigten, daß das Kernsignal im basischen C-Terminus des Proteins liegen muss (Abb. 14). Das entspricht insofern der Erwartung, weil sich fast alle Kernsignale durch eine Anhäufung basischer Aminosäuren auszeichnen (Garcia Bustos et al. 1991). Der N-Terminus ist hingegen bei der Isoform IV sauer (d.h. der isoelektrische Punkt, pi, ist< pb 7) Abb. 14B: Lokalisierung des Kernsignals im C-Terminus von Ld. 201 Iz z z zl Entgegen der Erwartung eines konventionellen NLS mit definierter kurzer Peptidsequenz, konnte das NLS nicht weiter als auf ca. 250 Aminosäuren eingegrenzt werden (Abb. 14B). Das spricht dafür, daß hier eine ganze Domäne für den Kerntransport gebraucht wird und nicht nur ein kleines Signalpeptid. Alternativ kann man auch annehmen, daß Ld mittels eines zweiteiligen Kernsignals in den Kern transportiert wird (Boulikas 1993). Eine den Konsensussequenzen von solchen "bipartite

20 be~r~g~e~b~nlll~ss~e~. 30 NLSs" ähnliches Signal konnte jedoch nicht identifiziert werden. Wir nehmen deshalb an, daß Ld im "Huckepack-Verfahren" zusammen mit einem Trägerprotein in den Kern transportiert wird, das möglicherweise ein klassisches NLS besitzt und an die identifizierte NLS-Domäne von Ld bindet. Die Deletion des Kemsignals erklärt den ld-phänotyp Die Lokalisierung eines NLS im C-Terminus von Ld ist eine mögliche Erklärung für den ld-phänotyp, da die bisher molekular charakterisierten Mutanten Deletionen in diesem Bereich aufweisen (s. Abb. 9 in der Einleitung). Aus diesem Grund fraktionierte ich Extrakte aus primären Wild typ- und IdIn2 IldIn2-Mauszellen. Nach diesen Experimenten sind die trunkierten Ld-Proteine immer noch im Kern lokalisiert (Abb. 15). Dieses Ergebnis steht jedoch im Widerspruch zu einern kürzlich von Chan & Leder (1996) veröffentlichten Experiment, wo Id In2 /1dIn2..proteine hauptsächlich cytoplasmatisch waren (Abb. 15). Noch stärker war dieser Effekt bei IdHd IldHd-Zellen wo Ld eine etws größere Deletion aufweist: hier war praktisch alles Ld-Protein im Cytoplasma lokalisiert. Es ist nicht ganz klar, wodurch der Unterschied in beiden Experimenten hervorgerufen wird. Eine mögliche Erklärung besteht in den leicht verschiedenen Fraktionierungsmethoden (s. Methoden). I FPC Id f-tj Id In2 In2lln2 +/+ Ic Nllc NI I wt TNCM wt TNCM Chan & Leder 1996 ERGEBNISSE 31 Ist Ld ein DNA-bindendes Protein? Nachdem es sich herausstellte, daß Ld ein Kernprotein ist, ließen sich versc~iedene Hypothesen über dessen Funktion durch gezielte ExperImente angehen. Die beiden wichtigsten und interessantesten Möglichkeiten lagen i~ Bereich. der Transkription und des Splicings. Letzteres wurde durch ern Ergebms von Trumpp et al. unwahrscheinlich in dem sich herausstellte, daß Ld nicht mit Spleißosomen koloka1isier~ (Trumpp et al. 1992). In diesen Experimenten wurden Imm~nfluoreszenzfärb~ngen mit Antikörpern gegen Ld und ein Snurp Protern gemacht und die subzelluläre Lokalisation beider Proteine mittels konfokaler Lasermikroskopie verglichen. Experime~te von Tr~mpp et al. (Dissertation) und Vogt et al. (1993) zeigt~~ sp~ter, daß Ld J~do~h an ~NA-Cellulose bindet. Cl:> diese Bindung spezifisch ISt, wurde mit erner Ohgonukleotid-Selektion überprüft. Dafür wurden D~ppelstrang-Oligonukleotide mit randomisierter Sequenz im Zentralbereich und Kernextrakte von Hühnerembryos gemischt und Ld anschließend immunpräzipitiert. Die im Präzipität enthaltenen DNA Fragmente wurden dann isoliert und per PCR vervielfacht. Die PCR Produkte wurden dann erneut mit Ld-haltigen Extrakten vermischt und die ganze Prozedur mehrmals wiederholt. Durch dieses Verfahren lassen sich die Bindestellen von DNA-bindenden Proteinen anreichern und ihre Sequenz bestimmen. Im Falle von Ld sequenzierte Trumpp mehrere Dutzend angereicherte Oligos und fand dadurch heraus,.daß Ld offer:.si~~t~ich ~pezifisch mit einer Klasse von OligonuI<leotiden coprazipitiert, die folgende Konsensussequenz enthielt: MCCACCC(C)A. Cl:> Ld tatsächlich an diese DNA-Sequenzen bindet, wurde mit einern Bandshift-Experiment überprüft. Als Oligos dienten dazu die in den oben beschriebenen Experimenten angereichtertern Fragmente, die mit 32p end markiert wurden. Als Proteinquelle wurden wiederum Extrakte aus Hühnerembryos benutzt. Die Spezifität so erzielter Bandshifts wurde mittels s?genann~er Supershifts demonstriert, bei denen durch Zugabe von Anti-Ld-Anhkörpern ein zusätzlicher Bandshift hin zu größeren Komplexen erzielt wurde (Abb. 16). Abb. 15: Fraktionierung von Wildtyp- und mutanten Ld-Zellen. Im Gegensatz zu Chan & Leder (1996) fand ich das Ld(In2)-Protein fast ausschliesslich im Zellkern (N). Chan & Leder fanden einen Grossteil des Proteins im Cytoplasma (C) oder in der Membranfraktion (M). T=Totalprotein.