Datenauswertung von Microarrays Genexpressionsanalyse
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- Friedrich Esser
- vor 8 Jahren
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1 Datenauswertung von Microarrays Genexpressionsanalyse Stefan Röpcke Berlin, Auf der zweiten Folie ist das Merkblatt eingefügt. Am Ende finden Sie noch weitere Folien (aus anderen Vorträgen). Zusätzliche Informationen finden Sie auf der Lecture-Seite der Abteilung Vingron. (lectures.molgen.mpg.de/microarray_ws0304) Viel Erfolg für die Prüfung!
2 Merkblatt Prüfungstermin: (genauere Informationen bei der nächsten Veranstaltung) Blockveranstaltung (Teilnahme ist Pflicht): Dienstag 6. Juli oder Donnerstag 8. Juli um 9.00 Uhr, Vorstellung aktueller Forschungsprojekte in der Abteilung Ropers am MPI Kontrollfragen zum Thema Genexpressionsanalyse Die Kontrollfragen sollen Ihnen Anhaltspunkt zum Lernen sein. Als Grundlage gelten Kapitel 10 und 19. Der t-test wird als bekannt vorausgesetzt. 1. Erklären Sie die Grundprinzipien und die wichtigsten Unterschiede folgender Techniken der Genexpressionsanalyse: DNA-Microarrays (gespottet), Oligonukletid- Microarrays (Affymetrix), SAGE (serial analysis of gene expression) 2. Welche Störgrössen oder Fehler können durch wiederholte Messungen der gleichen RNA-Probe auf unterschiedlichen Arrays identifiziert werden? 3. Expressionsdaten müssen in der Regel normiert werden. Was ist das Ziel der Normierung der Expressionswerte zweier Arrays gegeneinander? 4. Stellen Sie sich vor, Ihnen wird ein Datensatz mit folgenden Charakteristika vorgelegt: Datenmatrix (5000x35) mit 20 Arrays von Tumorproben, 15 Arrays von Normalproben, 5000 Gene wurden gemessen. Sie möchten mit Hilfe des t-tests Gene identifizieren, die differenziell zwischen Tumor- und Normalprobenn exprimiert sind. 1. Was müssen Sie im Vorfeld prüfen (Voraussetzungen des t-tests), um interpretierbare p-werte zu erhalten? 2. Worauf müssen Sie bei der Interpretation des p-wertes achten, wenn Sie die t- Statistik für alle 5000 Gene berechnen?
3 Übersicht Datenanalyse von Oligo-Arrays Normalisierung, Verdichtung, Datenverwaltung Krebsforschung Entdeckung differenzieller Gene im Bronchialkarzinom Entdeckung von Antisense-Transkripten Zusammenhang zwischen Struktur und Expression von Genen
4 Oligo-Array-Experiment Extraktion der poly-a-rna Amplifikation und Markierung der RNA Fragmentierung Hybridisierung Färbung
5 Datenanalyse für Oligonukleotid-Arrays ligopaar M M Feature Oligoset [Gen] 1. Feature Normalisierung Offset Subtraktion Median-Zentrierung M Datenverdichtung AvgDiff-Methode (Affymetrix) PM MM als Intensität - Perfect Match 2. Detektionsscore Wilcoxon-Teststatistik -> p-wert Hypothese (H1): PM > MM 3. Repräsentative Intensität PMQ-Methode: 3. Quartil der PM-Intensitäten Strukturierte Speicherung Relationales Datenbanksystem Lade- und Auswerteroutinen
6 PMQ-Methode im Vergleich zu AvgDiff 8 Array-Experimente mit RNA der Zelllinie RT PMQ-Methode 2000 AvgDiff-Methode (Affymetrix) Häufigkeit 1000 Häufigkeit Relative Unterschiede der Intensitäten, logarithmiert (ln) und normiert PMQ-Methode robustes Verfahren bei starken Qualitätsschwankungen der Arrays und der RNA
7 Übersicht Datenanalyse von Oligo-Arrays Normalisierung, Verdichtung, Datenverwaltung Krebsforschung Entdeckung differenzieller Gene im Bronchialkarzinom Entdeckung von Antisense-Transkripten Zusammenhang zwischen Struktur und Expression von Genen
8 Expressionsanalyse in der Krebsforschung Am Beispiel des Bronchialkarzinoms Proteinexpression Genexpression Phänotyp Differenzielle Proteinexpression Differenzielle Genexpression Kandidatengen: differenziell exprimiert in Tumorzellen für Diagnostik und Therapie
9 Datensätze Publikationen in PNAS 2001 Technologie Array Charakteristik Gewebetypen Replikate Hybridisierung Garber et al. cdna-array Brown/Botstein, Stanford ~ Spots Adenokarzinom 41 Plattenepithelkarzinom 16 Normal 5 Andere Mit einer Referenzprobe (Mix von 11 Zelllinien) Bhattacharjee et al. Oligonukleotid-Array Affymetrix HG-U95Av2 ~ Oligsets Adenokarzinom 139 Plattenepithelkarzinom 21 Normal 17 Andere Eine RNA-Probe pro Array
10 Vergleichende Analyse - Überblick cdna-array Oligo-Array Filtern Normierung (LOESS), Logarithm. (ln) LogSignal Normierung (LOESS), Logarithm. (ln) Validierung an Replikaten LogRatio [Bsp. log(t/n)] LogSignal Tumor LogSignal Normal Sequenzabgleich Vergleich der Mittelwerte pro Gen Validierung an Replikaten LogSignal Tumor LogSignal Normal 3644 LogRatios Tumor versus Normal t-teststatistik Vergleich der Resultate LogRatios Tumor versus Normal t-teststatistik
11 Validierung der Normalisierung an Hand von Replikaten cdna-array-daten, normalisiert Oligo-Array-Daten, normalisiert PK1.AD1 grün: blau: höchsten 10% niedrigsten 10% Regressionskurve AD1.NL1 LogRatio: log( PK / AD ) PK1.AD2 PK2.AD PK2.AD2 LogRatio: log( AD / NL ) AD1.NL2 AD2.NL AD2.NL2 LogRatio: log( PK / AD ) LogRatio: log( AD / NL )
12 Vergleich des Einflusses der Technologie und des Gewebetyps Oligo-Array Expression (LogSignal) Tumor Normal 0 2 Tumor, LogSignal Tumor, LogSignal cdna-array Oligo-Array cdna-array Expression Normal, LogSignal
13 Vergleich der errechneten differenziellen Expression zwischen den Array-Plattformen Für 134 von 799 Genen überlappt der Interquartilsbereich nicht. Intensität (LogSignal) Schema * * *** * x x Häufigkeit Verteilungen aller LogRatio-Werte (T/N) für das Beispielgen sparcl (139X17) 205 (41X5) T N pro Gen: jede T- gegen jede N-Probe LogRatio: log( T/N )
14 Kriterium für differenzielle Expression t-testsstatistik Schwelle: p-wert < 0.05 Mittleres LogRatio Schwelle: unter den 10% kleinsten oder grössten
15 ROTE Punkte: differenzielle Gene in einem der Datensätze Korrelation der mittleren LogRatios Beste Konkordanz in den Extrema Plattenepithelkarzinom versus normale Lunge Adenokarzinom versus normale Lunge > 0: höher im Tumor, < 0: niedriger im Tumor Mittleres LogRatio Oligo-Arrays Mittleres LogRatio - cdna-arrays
16 Differenziell exprimierte Gene Zahl der Gene Oligo-Array, PEK Oligo-Array, ADK cdna-array, PEK cdna-array, ADK PEK 99 Hoch in T N Repräsentative Intensität Zwei differenzielle Gene als Beispiele ADK 81 PEK: Plattenepithelkarzinom ADK: Adenokarzinom 136 Normale Lungenproben Tetranectin Plattenepithelkarzinomproben PLAU
17 Übersicht Datenanalyse von Oligo-Arrays Normalisierung, Verdichtung, Datenverwaltung Krebsforschung Entdeckung differenzieller Gene im Bronchialkarzinom Entdeckung von Antisense-Transkripten Zusammenhang zwischen Struktur und Expression von Genen
18 Entdeckung von Antisense-Transkripten Fragment Genomische Sequenz 2 Oligosets: Sense, Antisense 21 (102) Gene zeigen Antisense-Expression in 76 (310) Experimenten DC13 (A) kb 9,5 7,5 4,4 2,4 1,35 Herz Gehirn Plazenta Lunge Leber Skelettmuskel Niere Pankreas Milz Thymus Prostata Hoden Ovar Dünndarm Kolon PBL (B) Herz Gehirn Plazenta Lunge Leber Skelettmuskel Niere Pankreas Milz Thymus Prostata Hoden Ovar Dünndarm Kolon PBL Northern-Blot Validierung 3/4 positiv Sense 0,24 MTN1 MTN2 MTN1 MTN2 Antisense
19 Zusammenhang zwischen Genstruktur und -expression Violett: Intron-enthaltende Gene 90% Perzentil 75% Perzentil Mittleres Expressionssignal Genlänge (logarithmische Skala, log e )
20 Ergebnisse 1. Robustes Verfahren zur Auswertung von Oligo-Arrays 2. Anwendbarkeit für die Krebsforschung 3. Technische Varianz dominiert Probenvarianz 4. Antisense-Transkripte weit häufiger als erwartet 5. Hoch exprimierte Gene sind im Mittel kürzer.
21 Datenanalyse Berechnung eines repräsentativen Expressionswertes und einer Signifikanz Probe Pair Feature Gesättigter Wert PM MM Wilcoxon test nicht-parametrisc gepaart Testet PM > MM 75% Perzentil der PM-Intensitäten
22 Komplexe Methoden in der Expressionsanalyse Clusteranalyse Data Mining Diskriminanzanalyse assen sich die Gewebeproben gruppieren? Gene Gewebeproben A B : H Farbkodierung hoher Wert niedriger Wert Worin unterscheiden sich Probengrupp Gene A B C D E F G H Tumor Normal ODER UND Entscheidend: Definition der Ähnlichkeit Gesucht: konsistent hoch- bzw. runterregulierte Gene Entscheidend: ausreichende Probenz
23 iteraturdaten: Cluster von Zelllinienexperimenten Scherf et al: A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer, Nature Genetics, march 2000
24 Konservative Interpretation der Resultate Clusteranalyse Data Mining Diskriminanzanalyse assen sich die Gewebeproben gruppieren? Gene Gewebeproben A B C D Ähnlichkeitsgraph > Hierarchisches Clustern nicht sinnvoll Worin unterscheiden sich Probengrupp Tumor Normal A B C D E F G H I J K L Gesucht: konsistent über- bzw. unterexpremierte Gen Zu geringe Probenz führt zu hoher Rate falsch-positiven.
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