Biochemie- Seminar 10

Transkript

1 Biochemie- Seminar 10 Verweise mit [DR] bezieht sich auf Duale Reihe - Biochemie von Rassow, Hauser, Netzker und Deutzmann in 2. Auflage; [L] steht für Biochemie und Pathobiochemie von Löffler, Petrides, Heinrich in 8.Auflage. Replikation und Zellzyklus von Leif Ablauf des Zellzyklus - G 1 - Phase (Gap): Zellwachstum, Proteinsynthese, RNA-Synthese anschließend Kontrollpunkt: Zellgröße, DNA-Integrität, Substratverfügbarkeit - S- Phase (Synthese): DNA wird verdoppelt, Synthese von RNA und Proteinen - Kontrollpunkt in früher G2-Phase: Zellgröße, vollständige Replikation, DNA-Schäden G 2 - Phase (Gap): weitere Synthese; Vorbereitung auf Teilung - Mitose (M-Phase) Kontrollpunkt in später M-Phase: korrekte Aufteilung der Chromosomensätze - bei schnell wachsender Zelle dauert Zellzyklus ca. 24 Stunden o Interphase: 23 Std [Interphase = G-Phase und S-Phase] o M-Phase: 1 Std - Verlassen des Zellzyklus bedeutet Übergang von der G 1 -Phase in die G 0 - Phase (Ruhephase): o bei ausdifferenzierten Zellen o bei Entzug von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren Regulation des Zellzyklus - inneres Uhrwerk der Zelle hilft bei Entscheidung über Checkpoint- Passage; besteht aus: o Cykline o Cyklin- abhängige Proteinkinasen (cycline-dependend kinases; cdks) o cdk- Inhibitoren (CKI; binden spezifisch an Cyclin/cdk-Komplexe) - Cycline = strukturell verwandte Proteine, deren Gehalt während Zellzyklus schwankt (durch proteolytischen Abbau); aktivieren die cdks - cdks= durch Cycline aktiviert ( Bildung von Cyclin/cdk- Komplexen); Gehalt während des Zellzyklus ist konstant Aktivität durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung reguliert z.b.: cdk aktivierende Kinase (CAK; aus Cyclin H + cdk7 + Mat1) cdks werden durch Inhibitoren kontrolliert z.b.: p21- Familie, p16- Familie Aktivität der cdks wird über subzelluläre Lokalisation reguliert z.b.: Cyclin B/cdk1- Komplex: während Zellzyklus im Zytosol und enzymatisch inaktiv, in G 2 - Phase Phosphorylierung und Translokation in den Nucleus; ebenso Cyclin C/cdk4- Komplex Beispiele - CyclinB und CDK1 assoziieren zu MPF (M-phase promoting factor; steuert Eintritt der Zelle in die M-Phase) o CDK1-Spiegel ist konstant o CyclinB-Spiegel schwankt zyklusabhängig - 1 -

2 - RB-Protein (Retinoblastom-Protein; Wachstumsfaktor) blockiert Transkriptionsfaktor E2F o Phosphorylierung von RB-Prot. E2F kann Gene aktivieren deren Produkte den Zellzyklus stimulieren Apoptose - [L] S. 227 Abb gezielte Einzel- Zell- Eliminierung durch biochemisches Programm; induzierbar, energieabhängig - Vorgänge: o Fragmentierung des ER + Golgi- Apparat o Chromosomenkondensation o Abbau der Kernhülle o Cyclinabbau - katalysiert durch proteolytische Enzyme: Caspasen o Cysteinproteasen, spalten Proteine hinter Aspartyl- Resten o liegen intrazellulär als enzymatisch inaktive Procaspasen vor; Aktivierung durch limitierte Proteolyse Effektorcaspasen spalten zelluläre Proteine (wie z.b. Proteinkinase C, Reparaturenzyme) Inaktivierung dieser Proteine aktivieren spezielle DNase: Caspase- aktivierte DNase (CAD) Initiatorcaspasen aktiviert über TNF- Rezeptorweg (extrinsisch, s.u.) oder mitochondrialen Weg (intrinsisch, s.u.) - TNF- Rezeptorweg o Bindung von Liganden an TNF- Rezeptor (z.b. TNFα- Rezeptor, Fas- Rezeptor) o Anlagerung von FADD- Adaptermolekül an Rezeptor o Anlagerung und proteolytische Aktivierung von Procaspase 8 (= Initiatorcaspase) zu Caspase 8 o Aktivierung von Effektorcaspasen Apoptose - mitochondrialer Weg o proapoptotische und antiapoptotische Proteine der Bcl-2-Familie regulieren Cytochrom c- Freisetzung aus Mitochondrien; proapoptotisches Heterodimer Bax/Bak bildet hierfür wahrscheinlich eine Pore Cytochrom c bindet an Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor) Apaf-1 aktiviert unter ATP- Verbrauch Initiator- Procaspase 9 zu Caspase 9 Aktivierung von Effektorcaspasen Apoptose o Bim aus Cytoskelett aktiviert bei Störungen Bax/Bak o Bad wird inaktiviert durch Proteinkinase B (aktiviert durch Wachstumsfaktoren) Hemmung der proapoptotischen Wirkung o Bid wird von Caspase 8 zu tbid gespalten aktiviert Bax/Bak [Verbindung zwischen extrinsischem und intrinsischem Weg] - Bcl-2 und einige Proteine aus der Bcl-2- Familie wirken antiapoptotisch - Schicksal der Zelle wird bestimmt durch Balance der Pro- und Antiapoptotischen Proteine Verknüpfung Apoptose und Zellzyklus - Tumorsuppressor p53 bewirkt nach DNA-Schädigung einen Verbleib der Zelle in der G 1 -Phase o Zelle gewinnt Zeit, Schäden zu beheben o p53 bindet an Promotor für cdk- Inhibitor p21 WAF1 p21 WAF1 - Expression - 2 -

3 o p21waf1 hemmt Cyclin D/cdk4, Cyclin E/cdk2, Cyclin A/cdk2 Zellzyklus wird angehalten - ist Schaden zu umfangreich oder irreparabel induziert p53 die Expression von bax Apoptoseweg wird in Gang gesetzt (intrinsisch) DNA- Replikation - Replikation = Verdopplung der DNA vor Zellteilung o semikonservativ: der Doppelstrang wird aufgespalten und jeder Einzelstrang dient als Vorlage für einen neuen Strang Prinzip - Primer leitet Replikation ein [Proc.: Primase; Euc.: DNA-Polymerase α- Teilaktivität] - 3 -OH-Gruppe des neugebildeten Strangs greift nucleophil das α-phosphoratom des nächsten dntp (desoxy-nucleotidphosphat) an Synthese 5-3 ; PP i wird abgespalten DNA-Polymerasen - *Skript 2 Replikation_neu.pdf + Folie 6 - unentbehrlicher Cofaktor ist Mg ++ - einige DNA-Polymerasen haben Fähigkeit zum Korrekturlesen via Exonucleaseaktivität: falsche eingebaute Nucleotide können erkannt und unmittelbar nach Einbau wieder hydrolytisch gespalten werden - wichtiger Faktor von DNA-Polymerasen ist Prozessivität = Zahl der Nucleotide, die von Polymerase an Kette angefügt wird bevor Polymerase wieder abdissoziiert - 3 -

4 Initiation - Protein DnaA bindet an Replikationsursprung (origin of replication); öffnet den Doppelstrang o meist an Orten mit vielen A-T- Basenpaaren, da diese nur 2 Wasserstoffbindungen haben und leichter zu trennen sind [G-C- Paare haben 3 Bindungen] - DnaB und DnaC- Proteine sind Helicasen: entwindet DNA unter ATP- Verbrauch - Topoisomerase I (Einzelstrangbruch) und Topoisomerase II (Doppelstrangbruch) reduzieren physikalische Belastung auf die verwundenen DNA-Stränge - entwundene Stränge werden durch SSBs (single strand binding protein; Tetramere) stabilisiert, diese verhindern eine Reassoziation der Stränge Replikationsgabel wird geformt am Replikon (diejenige DNA- Einheit, in der die einzelnen Replikationsschritte stattfinden) Elongation - DNA- Doppelstränge verlaufen Antiparallel, DNA- Polymerasen können aber nur in Richtung synthetisieren - Führungsstrang ( leading strand ) wird kontinuierlich synthetisiert - verzögerter Strang ( lagging strand ) wird diskontinuierlich synthetisiert o Okazaki- Fragmente aus Basen werden nacheinander abgearbeitet 1. Primersynthese 2. Synthese erstes Okazaki-Fragment und zweiter Primer 3. Synthese zweites Okazaki-Fragment und dritter Primer 4. o bei Prokaryoten: DNA-Polymerase I mit Exonucleaseaktivität entfernt den RNA- Primer und füllt die entstanden Lücken auf; DNA-Ligase verknüpft neu entstandene Stränge (siehe [L] S. 233 Abb. 7.16); Polymerase-Dimer ermöglicht simultane Synthese von lagging strand und leadings strand durch Polymerase-Komplex-Bildung lagging strand bildet eine Schleife zurück zum Komplex o bei Eukaryoten: Polymerase α-primase-komplex macht Initiation der Synthese und Synthese des lagging strand ; Polymerase δ synthetisiert den leadings strand Telomerase - am 3 - Ende des lagging strand kann keine Replikation stattfinden da hier der Primer liegt, der von der Exonuclease entfernt wird DNA-Polymerase kann Lücke nicht auffüllen DNA wird mit jeder Replikation um ein Stück kleiner - Problem wird durch G-reiche Sequenzen an den Telomere (DNA-Enden) gelöst: o Telomerasen (entsprechen reversen Transcriptasen) enthalten RNA mit zur telomeren Sequenz passenden komplementären Basen (A-reich) o Nucleotide des Telomers paaren sich mit Telomerase- RNA - Telomerasen sind aktiv bei Keimbahnzellen und nach maligner Zelltransformation (so kommt es zu keiner normalen Zellalterung sondern z.b. zu neoplastischem Wachstum von Tumoren) - 4 -

5 Inhibitoren der DNA-Replikation Mitomycin - kovalente Quervernetzung der DNA verhindert Trennung der Stränge Biochemie- Seminar 10 Actinomycin - bildet Komplexe mit Guanin-Resten hemmt DNA-abhängige RNA- Biosynthese, in höheren Dosen auch DNA-Replikation Fluorouracil - irreversibler Inhibitor der Thymidylat-Synthase keine drmp-synthese keine Replikation und Reparatur Metothrexat, Aminopterin - kompetetiver Inhibitor der Dihydrofolat-Reductase keine Bildung von THF keine Nucleotid-Synthese Cisplatin - DNA-Schäden Apoptose virale Oncogene - Tumorviren können Gene der Wirtszelle in eigenes Genom integrieren - durch Rekombination und Mutationen entstehen daraus Onkogene - Onkogenprodukte können auf allen Ebenen der Signaltransduktion proliferative Signale auslösen - Prototyp: v-raf, Entstehung aus humanem Protooncogen raf - virales Onkogen v-erbb produziert verkürzten Rezeptor ohne Ligandbindungsdomäne Kontrolle durch EGF (Epidermal Growth Factor) unwirksam konstitutive Aktivität - Zelltransformation durch permanente proliferative Signale retrovirale Vermehrung - durch reverse Transkriptase Einbau des Virus-Genoms ins Wirts-Genoms mittels Integrase 1. Virus-RNA wird mittels reverser Transkriptase in Virus-DNA gewandelt 2. Virus-DNA wird mittels Integrase in Wirts-DNA eingebaut 3. Transkription und Translation dieser Hybrid-DNA schafft neue Virus-Bausteine die dann neue Viruspartikel bilden - 5 -

6 DNA/Protein- Wechselwirkungen und DNA- Reparatur von Leif Wodurch wird DNA geschädigt? Welche Schäden können auftreten? Biochemie- Seminar 10 - Chemikalien und Strahlung führen zu Depurinierung (z.b. durch thermische Spaltung der N- glycosidischen Bindungen); ca Purinbasen pro Zelle in 24 Stunden - Chemikalien und Strahlung führen zu Desaminierung von Cytosin (es entsteht Uracil mutagen wg. Paarung mit Adenin und nicht Guanin) - UV-Licht führt zur Entstehung von Thymidindimeren - Schäden durch Sauerstoffradikale oxidative Schädigung - hydrolytische Angriffe - unkontrollierte Methylierung Schäden, die zum Austausch von Einzelbasen führen - veränderte Sequenz, keine Auswirkungen auf DNA-Gesamtstruktur - Transkription und Replikation unbeeinflußt - Konsequenzen für Tochtergenerationen - Bsp.: o Desaminierung von Basen (Cytosin Uracil) o Fehlpaarungen nach Replikation (Cytosin Adenin) o Fehlpaarung durch Tautomerie (Imino-Adenin paart mit Cytosin statt mit Thymin) o Strangverschiebung durch Polymerase-Slippage Schäden, die zu strukturellen Verzerrungen der DNA führen - physikalische Behinderung bei Transkription und Replikation - entstehende Probleme sind nach Reparatur aufgehoben - keine Folgen für Tochtergeneration - Bsp.: o Einführung kovalenter Bindungen zwischen den Basen (z.b. durch UV-Strahlung Thymin + Thymin wird zu Thymindimer verknüpft) o chemische Modifikation (z.b. durch Alkylierung) o Verlust von Basen (durch Depurinierung) Reparaturmechanismen - allgemeine Strategie: Erkennen des Fehlers Entfernen des Fehlers Schließen der Lücke Ligation direkte Reparatur (nur bei Prokaryoten) - durch photoaktivierte Enzyme - siehe *Skript+ 4 Reparatur.pdf Folie 14 Fehlpaarungsreparatur - verbessert Genauigkeit der Replikation um Mut S gleitet auf dem Strang (hemimethyliert) entlang und tastet auf Fehler ab, findet es einen Fehler, rekrutiert es Mut L und Mut H. - Endonuclease Mut H spaltet nun den Strang an einer GATC-Sequenz - zusammen mit Mut S, Mut L und einer Helicase II baut die Endonuklease I den defekten Strang über die Fehlpaarungsstelle hinaus ab - DNA-Polymerase III füllt wieder auf und DNA-Ligase versiegelt die Bruchstellen - 6 -

7 Basenexzisionsreparatur - Basenveränderung wird erkannt von spezifischen Proteinen, die mit DNA-Glycosylasen aktive Komplexe bilden defekte Base wird entfernt - AP-Endonuclease (apurinic bzw. apyrimidinic; trennt Ribose und Phosphat) und Phosphodiesterase entfernen zur herausgeschnittenen Base gehöriges Desoxyribosephosphat - mittels DNA-Polymerasen und DNA-Ligasen kann die Lücke gefüllt und geschlossen werden - prinzipiell gleiches Verfahren auch bei Depurinierung Nucleotid- Exzisionsreparatur - dient zur Behebung größerer Defekte - nach Erkennung des Schadens durch Multienzymkomplex wird Nucleotide langes Oligonucleotid durch Nucleaseaktivität aus geschädigtem Einzelstrang entfernt - entstandene Lücke wird mittels DNA-Polymerase und DNA-Ligase gefüllt und geschlossen Reparatur bei schweren DNA-Schäden NHEJ (non homologous end-joining) und HEJ (homologous end-joining) - zur Reparatur von Doppelstrangschäden (z.b. durch ionisierende Strahlung oder oxidative Reagenzien) - NHEJ: DNA- Enden werden einfach miteinander verknüpft; trotz Mutation an Bruchstelle anscheinend akzeptable Lösung - HEJ: das doppelt vorhandene intakte Chromosom wird als Matrize zur Reparatur des defekten Chromosoms genutzt Reparatur ohne DNA- Verlust ist so möglich wenn der DNA-Schaden zu groß ist: - p53 induziert Zellzyklus-Inhibitor Cdk-Inhibitor p21 Hemmung des Zellzyklus (Onkogen-induzierte Inaktivierung von p53 führt zu Tumor-Entstehung) Reparaturdefekte Xeroderma pigmentosum - Lichtschrumpfhaut, extreme Empfindlichkeit gegenüber UV-Licht - starke Hautschädigung, hohe Krebsanfälligkeit - Ursache: u.a. Defekt in Excinuclease (Reparatur von Thymindimeren) Fanconi-Anämie - Fehlbildungen,Leukämie - durch fehlerhafte Reparatur von Strangüberkreuzungen BRCA-2 - Brust-u. Eierstockkrebs - Reparatur durch homologe Rekombination fehlerhaft MSH2,3,6 - Dickdarmkrebs - Defekt der Fehlpaarungsreparatur - 7 -

8 Transkription und posttranskriptionelle Modifikation von Leif Grundlagen Biochemie- Seminar 10 Funktionen der RNA - RNA- Biosynthese unterscheidet sich von DNA- Biosynthese: o bei Transkription werden nur einzelne DNA- Abschnitte abgelesen o DNA- Bestand einer Zelle bleibt konstant, RNA wird immer wieder neu synthetisiert - Form der mrna dient als Matrize für Proteinbiosynthese - trna (transfer-rna) bildet den Adapter für Übersetzung des Nucleinsäuren- Codes in eine Aminosäuresequenz - rrna ist Strukturbestandteil der Ribosomen (für Proteinbiosynthese) - RNA dient in Form von Ribozymen als Katalysator - viele kleine RNA- Moleküle haben regulatorische Funktion konstitutive Transkription - Genen für Aufrechterhaltung der basalen Funktionen in Zellen werden konstant exprimiert - Gene = house keeping genes regulierte Gene - Expression variiert je nach Bedarf - durch viele intra- und extrazelluläre Faktoren beeinflusst Prinzip der Transkription - Prinzip ähnelt dem der DNA- Replikation - anders als DNA- Replikation benötigt RNA- Biosynthese keinen Primer - zuerst wird DNA geöffnet und entwunden, beide Stränge haben unterschiedliche Funktion: o o Strang der als Matrize für RNA- Synthese dient = Matrizenstrang ( antisense strand ) anderer Strang entspricht Basensequenz des RNA- Transkripts = codierender Strang ( sense strand ) - DNA-abhängige RNA-Polymerasen sind für Transkription verantwortlich, durch Rotation der DNA bedingte topographische Probleme werden von Topoisomerasen bewältigt Initiation - korrekte Startstelle für Transkription ist durch einen sog. Promotor bzw. eine Promotorregion gekennzeichnet; hierdurch wird die Transkription gesteuert - Promotorregionen auf der DNA werden auch cis- Elemente genannt, die an sie bindenden spezifischen Proteine sind trans- Elemente Elongation - Verknüpfung von Nucleosidtriphosphate (NTPs) durch RNA-Polymerasen zur RNA - chemisch entspricht Reaktionsmechanismus der RNA-Polymerasen dem der DNA- Polymerasen: o 3 -OH-Ende eines Nucleotids greift am α-phosphat des anzufügenden Ribonucleotids an Einbau in wachsende RNA- Kette o anstelle von Thymin enthält die RNA Uracil (bildet aber auch mit Adenin zwei Wasserstoffbrückenbindungen) Termination - spezifische Signale auf der DNA verhindern eine (energieträchtige) überschießende Transkription - 8 -

9 Transkription bei Prokaryoten - RNA-Polymerase (Pentamer mit Untereinheiten 2,,, ) kann RNA selbsttätig synthetisieren, benötigt aber zusätzlichen Sigmafaktor σ zum Auffinden der Promotorregion ( Initiation) - nach Auffinden lagert RNA-Polymerase erstes Nucleosidtriphosphat an (immer ATP oder GTP) Bildung des Initiationskomplexes - nach Knüpfung ca. 10 weiterer Phosphodiesterbindungen dissoziiert Sigmafaktor, da er für Elongation nicht benötigt wird - RNA-Polymerase liest DNA in Richtung ab, synthetisiert RNA in Richtung; dabei findet sog. proofreading statt - Termination findet Rho-abhängig oder Rho-unabhängig statt o ρ abhängig: Proteinfaktor Rho (ρ) bildet hexamere Struktur um entstehende RNA Abtrennung der Polymerase o ρ unabhängig: Ausbildung von Haarnadelstrukturen in der RNA durch Terminationssignale (palindromische repetitive Sequenzen ( inverted repeat )) in den Genen Transkription bei Eukaryoten - RNA-Polymerase I; im Nucleolus; transkribiert für ribosomale RNA (rrna) o α-amanitin-unempfindlich - RNA-Polymerase II; im Zellkern; transkribiert für prä-mrna/ mrna o α-amanitin-empfindlich - RNA-Polymerase III; Zellkern; transkribiert für trna o α-amanitin-wenig empfindlich (große Mengen Gift nötig) - sind ohne allgemeine Transkriptionsfaktoren nicht zur Initiation imstande RNA-Polymerase II - Gene haben bestimmte Erkennungssequenzen für Bindung von Transkriptionsfaktoren; z.b. CAAT-Box, TATA-Box o zur Bildung von Initiationskomplexen notwendig; für optimale Funktion mindestens 2-3 Elemente im Promotor enthalten - eukaryote RNA-Polymerasen können nicht von selbst an DNA binden, benötigen allgemeine Transkriptionsfaktoren (TF) bilden Initiationskomplexe aus RNA-Polymerase II, TFs und Mediator- Proteinen - erhöhte Effektivität durch multiple Initiation mehrere Polymerasen arbeiten gleichzeitig 1. Initiation beginnt mit der Anlagerung des TATA-Bindungsproteins (UE von Transkriptionsfaktor IID) an die TATA-Box [ DNA wird um 80 verbogen, Wechselwirkung zwischen AT-Basenpaaren gelockert] 2. Transkriptionsfaktor IID rekrutiert RNA-Polymerase II; Transkriptionsfaktoren IIB,E,F,H,J lagern sich an C-terminale Domäne (CTD) der RNA- Polymerase II an [C-terminale Domäne (CTD) der RNA-Polymerase II spielt eine so wichtige Rolle, dass die humane RNA-Polymerase II 52 Kopien davon enthält; besteht aus repetitiver Sequenz des Heptapeptids Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser; wichtig weil: geht sehr spezifische Wechselwirkung mit TATA-Box-Bindeprotein ein] 3. Enhancer oder Silencer regulieren über Konformationsänderungen der DNA oder Interaktion mit den Transkriptionsfaktoren oder RNA-Polymerase II die Transkription - 9 -

10 - für Elongation sind viele Proteine des Initiationskomplexes nicht mehr nötig; nur TFIIH verbleibt wegen weiter benötigter Helicase- Aktivität 4. in jedem Heptapeptid der CTD [also 52 beim Menschen] befinden sich 2 Serinreste Phosphorylierung durch CyclinH/cdk7/Mat1-Proteinkinase 5. Verlust der Affinität von RNA-Polymerase II zu Initiatorkomplex [TFIID; verbleibt an TATA- Box] und den meisten Transkriptionsfaktoren - reife mrna entsteht durch einige Modifikationen an der prä-mrna; auch hierbei spielt CTD eine wichtige Rolle Kappe = methyliertes Guaninnucleotid am 5 -Ende a. durch RNA-Triphosphatase wird am 5 -NTP-Ende der prä-mrna ein Phosphatrest abgespalten Diphosphatende entsteht b. Guanylyl-Transferase heftet ein GTP an 5-5 -Triphosphat- Verknüpfung entsteht ([L] S. 263 Abb. 8.10) c. Methyltransferasen methylieren angeheftetes Guaninnucleotid in Position 7 [gelegentlich auch Ribosereste der beiden folgenden Nucleotide] - Vorgang findet kurz nach Beginn der Elongation statt; Kappe hat wichtige Funktionen: o schützt RNA vor Abbau durch 5 -Exonucleasen o ist Signal für Transport der RNA durch Kernporen o Erkennungsmerkmal für Ribosomen (Bindung an 40S-ribosomale UE) - Termination ist Teil der posttranskriptionalen Modifikation 7. Spaltungs-und PolyA-Signale (s.u.) am 3 -Ende der mrna werden zunächst mit transkribiert; CstF (cleavage stimulation factor) und CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) sitzen an RNA-Polymerase bis Spaltungssequenz zugänglich ist 8. RNA-Polymerase arbeitet nach Spaltung weiter und verliert dann Affinität zur DNA posttranskriptionelle Modifikation Spleißen die meisten Gene höherer Eukaryoten sind diskontinuierlich angeordnet Introns: intervenierende Sequenzen die nicht codieren, also nicht in der mrna erscheinen Exons: codierende Sequenzen, erscheinen in der mrna - DNA-Polymerase II kann nicht zwischen Introns und Extrons unterscheiden Introns müssen aus prä-mrna entfernt werden durch spleißen - bedeutsam sind die 5 - und 3 - Spleißstelle und die Verzweigungsstelle innerhalb des Introns o 5 -Spleißstelle durch GU[A/G]G gekennzeichnet o 3 -Spleißstelle durch pyrimidinreiche Sequenz + AG gekennzeichnet o an Verzweigungsstelle ist das Adenin von besonderer Bedeutung - [L] S.265 Abb Prinzip: 1. Spaltung der 5 -Spleißstelle durch Bildung eines cyclischen Intermediats (Bruch des RNA- Strangs und Bildung einer Lasso- Struktur) 2. Abspaltung des 3 -Endes des Introns und Verknüpfung der Exons Spleißen bei einfachen Eukaryoten - RNA kann durch ihre Raumstruktur bei einfachen Eukaryoten die Spleißung selbst katalysieren (= proteinfreies Spleißen), RNA- Moleküle mit dieser Fähigkeit nennt man Ribozyme

11 Spleißen bei höheren Eukaryoten - bei höheren Eukaryoten ist komplexer Apparat aus Proteinen und RNA für korrektes Spleißen nötig Spleißosom - kleine RNA- Moleküle (snrnas) liegen in Komplexen mit Proteinen vor (= snrnps ( small nuclear ribonucleoproteins )); Enfernung von Introns erfolgt in folgenden Schritten: 1. snrnp U1 lagert an 5 - Ende des Introns an 2. snrnp U2 bindet an Verzweigungsstelle innerhalb des Introns 3. snrnps U4, U5 und U6 verdrängen U1 Aktivierung der katalytischen Funktion Spleißdefekte Mutationen können die Spleißstellen unkenntlich machen; dies führt zu verlängerten oder verkürzten Proteinen - alternatives Spleißen o Herstellung unterschiedlicher mrna-transkripte/proteine aus einer prä-mrna o Beispiel: Calcitonin/CGRP-Gen; gewebsspezifische Spleißvarianten liefern Hormone mit unterschiedlicher Funktion Anheftung des Poly-A- Endes - laut Skript posttranslational, laut [L] cotranslational - letzter Vorgang der Transkription besteht in Spaltung am 3 - Ende und Anheftung des Poly-A- Endes (Sequenz aus Adenylresten) durch Polyadenylat-Polymerase - Signal ist die Polyadenylierungssequenz AAUAAA, ausgelöst wird Vorgang von Faktoren aus CTD der RNA-Polymerase II mrna-editing - Veränderung in der Sequenz der prä-mrna ermöglicht Herstellung unterschiedlicher Proteine aus einer mrna (versch. Isoformen) - Bsp: Apolipoprotein B o in Leber synthetisierte Apolipoprotein B 100 hat 513 kda o in Darm synthetisierte Apolipoprotein B 48 hat 250 kda RNA-Polymerase I - transkribiert ribosomale RNA - Promotor besteht aus 2 Teilen: o core promotor im Bereich der Startstelle o Kontrollelement etwa Basenpaare oberhalb - beide Promotorregionen reich an GC-Basenpaaren Prozessierung der Transkripte - Bildung von rrna verläuft bei Pro- und Eukaryoten im Prinzip gleich RNA-Polymerase III - einige Promotoren für 5S-RNA- und trna- Gene liegen innerhalb codierender Sequenz, Promotoren für snrna sind oberhalb des Startpunkts lokalisiert - trna- Moleküle entstehen aus langen Transkripten, die von Nucleasen prozessiert werden müssen; Basen werden modifiziert und Teile durch Spleißen entfernt

12 Abbau und Stabilität der mrna - [L] und die Struktur der mrna determiniert ihre Stabilität deadenylierungsabhängiger mrna-abbau - schrittweiser Abbau des 3 -PolyA-Schwanzes durch PolyA-Nuclease o = Signal zur Entfernung der 5 -Kappe Abbau der RNA durch 5-3 -Exonucleasen endonucleolytischer Abbau - sequenzspezifische Spaltung durch Endonucleasen Signal für 5-3 -Exonucleasen Export der mrna aus dem Zellkern - selektiver Transport (nur voll funktionstüchtige RNA-Moleküle) - reife mrna muss als transportkompetent markiert werden o durch Proteinfaktoren, die während Spleißen an mrna gebunden werden - an markierte mrna lagern sich Proteine, die für Wechselwirkung mit Kernporenkomplex notwendig sind binden an Transportrezeptoren o Bsp: NXF1/p15 - Transport erfolgt unidirektional (nur raus), ist energieaufwendig - unmittelbar nach Export binden cytosolische RNA-Bindeproteine an mrna o wichtige Cofaktoren für ribosomale Translation o dienen der cytoplasmatischen Lokalisation der mrna o führen mrna dem Verdau zu Hemmstoffe der Transkription Actinomycin D - Interkalation zwischen CG-Paaren führt zu Verformung und Transkriptionsabbruch - Pro- und Eukaryonten 3 -Desoxadenosin - Transkriptionsabbruch - Pro- und Eukaryonten Rifamipicin - hemmt RNA-Polymerase - Prokaryoten α-amantin - Gift des Knollenblätterpilzes ( s.o.); hemmt RNA-Polymerase II - Eukaryonten

13 Regulation der Genexpression von Leif Übersichtsvergleich Prokaryonten/ Eukaryonten Biochemie- Seminar 10 Prokaryonten - Transkription und Translation simultan - sehr kurze mrna-hwz - Regulation auf Ebene der Transkription gemäß Operonmodell o Repressorprotein (an Operator gebunden) verhindert Transkription des Gens o Repressorprotein kann durch Induktor entfernt werden Eukaryoten - [L] S. 272 Tab Transkription und Translation räumlich und zeitlich getrennt o Transkription und posttransskriptionelle Prozesse finden im Zellkern statt, Proteinbiosynthese im Cytosol Export der mrna durch Kernporen notwendig - z.t. lange mrna-hwz - Transkriptionsfaktoren steuern die Expression einzelner Gene durch Kontakt mit regulatorischen cis-elementen - Regulation durch o Zugänglichkeit des Chromatins o Transkription o posttranskriptionelle Modifikation o Stabilität der mrna Prokaryonten - Prokaryonten regulieren die Proteinmengen fast ausschließlich auf der Ebene der Transkription: o eine Transkriptionseinheit besteht aus mehreren Genen (polycistronische mrna) o metabolisch kooperierende Genprodukte werden von einem genetischen Element gesteuert o regulierbare Repressor-Proteine determinieren die Genaktivität - Beispiele o Lac- Operon; kontrolliert alle Genprodukte für den Abbau von Lactose; bilateral reguliert über Lactose- und Glucose-Angebot: Lactose und Glucose vorhanden schwache Transkription der Lac-Gene nur Lactose vorhanden Hungersignal camp aktiviert CRP CRP bindet an CRP-Region oberhalb Promotor CRP rekrutiert RNA-Polymerase Transkription der Lac-Gene nur Glucose vorhanden Repressor der Lac-Gene aktiv keine Lac-Transkription keine Lactose oder Glucose vorhanden camp-reaktion (s.o.) aber Repressor aktiv keine Lac-Transkription o Tryptophan-Promotor codiert 5 Enzyme der Tryptophansynthese Tryptophan hemmt als Corepressor die Transkription der Enzymgene zusätzlicher Mechanismus passt die Transkriptionsrate dem aktuellen Bedarf genau an: Attenuation

14 Attenuation - Regulation der trp-mrna-synthese durch Komponenten der Translation und Transkription - Leitsequenz enthält mehrere Codons für Tryptophan - je nach Tryptophan-Angebot der Zelle bildet die mrna unterschiedliche Schleifen die entweder die Transkription blockieren oder erlauben Eukaryonten - eucaryotische Gene werden individuell reguliert - für die Transkription muss ein basaler Transkriptionskomplex am Promotor etabliert werden - Gene werden konstitutiv ( Haushalts-Gene ) abgelesen oder gezielt reguliert o konstitutive Genaktivierung: GC-Boxen, keine TATA-Box, häufig keine CCAAT-Box - Möglichkeiten der Regulation o Zugänglichkeit des Chromatins o Transkription o Posttranskriptionelle Modifikation o Stabilität der mrna o Differenzierung von Geweben o induzierbare/konstitutive Expression; zellspezifische Expression o Veränderung der Genexpression durch extrazelluläre Signale Zugänglichkeit des Chromatins - Auflockerung der Nucleosomenstruktur erfolgt durch Modifikation der Histone - Histon-Acetyltransferasen acetylieren Histone an Lysylresten - weitere Histonmodifikationen: Phosphorylierung, Ribosylierung, Methylierung - Euchromatin: transkriptionell aktiv Heterochromatin: transkriptionell inaktiv - Histonacetylierung o Acetylierung von Lysinresten der Histonprotein- Schwanzregion durch Histon-Acetyl- Transferasen trägt zur Auflockerung der Struktur bei o Histon- Deacetylasen machen Strukturänderungen wieder rückgängig - Histonphosphorylierung o unterschiedliche Konsequenzen je nachdem ob in Interphase oder Mitose Interphase: Phosphorylierung von Serinresten Mitose: dient hier der Chromatinkondensation - Histonmethylierung o durch Methyltransferasen o führt zur Anlagerung von Proteinen die eine spezielle Chromodomäne besitzen Chromatinkondensation und Inaktivierung von Genen o anscheinend irreversibel!

15 Transkriptionsregulation durch Aktivierung und Inaktivierung von Genen - durch DNA-Methylierung o jede differenzierte Zelle entwickelt ein Muster aus an- und abgeschalteten Genen o hierfür wird Methylierungsmuster in das Genom eingebracht Inaktivierung von Genen durch Methylierung am C-Atom 5 eines Cytosinrests in einer Kontrollregion; Zielsequenz sind sog. CpG-Inseln (5 -CG-3 ) o Weitergabe des Methylierungsmusters durch Methyltransferase o Methyltransferasen modifizieren ca. 4% der Cytosinreste o o o Bindung von Methyl-CpG-Bindungs-Protein (MeCP) Blockade der transkriptionellen Aktivität der Methylierungsstatus korreliert mit der Genexpression Methylierung auch für genomic imprinting verantwortlich (Allele paternaler und maternaler Gene werden unterschiedlich exprimiert) Epigenetik - Vererbung von Merkmalen, die nicht auf DNA-Sequenz zurückgeführt werden können - zur An/Abschaltung zelltypspezifischer Genprogramme bei Differenzierung; z.b. Zellzyklusregulator p53 + Tumorsuppressorgene in Tumoren hypermethyliert - Histonmodifikation und DNA-Methylierung regulieren die Genexpression durch Veränderungen der DNA/Protein-Interaktion o Histondeacetylasen (HDAC) verdichten Chromatin o methylbindende Proteine (MDB) senken Genaktivität Transkriptionsfaktoren und -aktivatoren - cis-aktivierende Elemente ( Enhancer ; [L] Tab. 8.3) auf der DNA bieten Bindungsstellen für Transkriptionsaktivatoren entstehender Komplex wirkt als zusätzlicher Faktor für RNA- Polymerase II und stimuliert Initiation der Transkription (= Transaktivierung ) - Transkriptionsaktivator benötigt mindestens 2 Domänen: für DNA-Bindung und Transaktivierungsdomäne - die spezifische Wechselwirkung von TF s mit regulatorischen Sequenzen ist die Basis der eucaryotischen Genregulation o Ausbildung von Wasserstoffbrücken o hydrophobe Interaktionen o symmetrische Strukturen im Protein (Dimere) und in der Zielsequenz (Palindrome) - 4 Hauptklassen von Transkriptionsfaktoren o Helix-loop-Helix (HLH)-Proteine o Helix-turn-Helix (HTH)-Proteine o Zinkfinger-Proteine o Leucin-Zipper-Proteine o Zinkfinger siehe [L] S. 276 Abb Cyteinyl- oder Histidylreste in Peptidkette können durch Zink-Atom komplexiert werden schleifenförmige Struktur ( Finger ) entsteht können in der großen Furche der DNA basenspezifische Kontakte knüpfen kommen z.b. in Familie der Steroidhormonrezeptoren vor

16 Strukturmotiv des Leucin-zippers gewährleistet spezifische DNA-Bindung und Dimerisierung des Bindeproteins - in vielen DNA-Bindeproteinen - enthalten als Monomere 2 Domänen; besondere Fähigkeit zur Bildung von Dimeren (homo und hetero) - viele Transkriptionsaktivatoren treten über Leucin-zippers mit anderen Transkriptionsproteinen in Wechselwirkung in vielen DNA-Bindeproteinen kommen Helix-loop-Helix- Strukturen vor - mit Leucin-zipper verwandt - zwei α-helices sind durch flexible Schleife verbunden - Bildung von Homo- und Heterodimeren gut möglich - DNA-Bindeproteine mit Helix-loop-Helix spielen z.b. bei Muskeldifferenzierung eine Rolle negative Regulation - Transkriptionsfaktor NF-κB (z.b.) reguliert Transport von Transkriptionsaktivatoren aus dem Cytosol in den Nucleus