Regulation! des! Metabolismus! und...!

Transkript

1 Regulation des Metabolismus und...

2 Bakterielle Viren = Bacteriophagen

3 Überblick Transkription langsam (min) Translation langsam (min) posttranslational schnell ( sec)

4 Überblick 1)Transkription langsam (min) Repression & Induktion durch DNA-Bindeproteine negative Kontrolle - Repressor positive Kontrolle - Aktivator Operon vs. Regulon 2) Translation langsam (min) 3) posttranslational schnell ( sec) kovalente & nicht-kovalente Enzymhemmung (Rückkopplung)

5 Induktion des Maltose Operons in E. coli Positive Kontrolle (Maltose) In E. coli sind die Gene für Maltosemetabolismus über das Chromosom verteilt; jedes Gen ist reguliert vom Maltoseaktivatorprotein (REGULON)

6 Globale Regulationsmechanismen = Reaktion auf veränderte Umweltbedingungen betrifft Regulation vieler verschiedener Gene Bsp: wenn E.coli mehrere Zucker gleichzeitig als C-Quelle zur Verfügung hat, wird Glucose immer zuerst verbraucht reguliert durch Katabolitrepression: verhindert Synthese von katabolischen Enzymen, die zur Glucoseverwertung unnötig sind bei anderen Organismen andere Zucker von primärer Bedeutung Sinn der Katabolitrepression: beste C- und Energie-Quelle wird zuerst verbraucht

7 Effekt: Diauxie 2 exponentielle Wachstums- phasen bei 2 C-Quellen ß-Gal-Synthese von Katabolitrepression reguliert Katabolitrepression

8 Katabolitrepression Mechanismus: RNA-Polymerase bindet nur dann an DNA, wenn Katabolitaktivatorprotein (CAP) zuerst gebunden hat CAP = allosterisches Protein, bindet DNA nur in Gegenwart von camp Glucose hemmt camp-synthese und stimuliert camp-transport aus der Zelle Regulation betrifft lac-operon, mal-regulon, und andere katabolische Operons in E. coli

9 Zyklisches Adenosinmonophosphat (AMP) ATP Adenylat-Zyklase camp + PP i

10 Interaktion des camp-bindeproteins (CAP) mit DNA Positive Kontrolle camp C-α trace CAP kontrolliert 7 E. coli Operons. CAP bindet DNA nur, wenn es camp gebunden hat.

11 Regulation des Lactose-Operons Transkript 35 Sequenz Pribnow-Box negative Kontrolle durch lac-repressor, aufgehoben durch Lactose positive Kontrolle durch CAP, ausgelöst durch camp

12 Die stringente Antwort Übergang von aa-überschuss zu aa-mangel: Stop der Synthese von rrna & trna keine Ribosomenneusynthese, keine Translation hemmt Proteinbiosynthese & DNA-Synthese aktiviert Aminosäure-Biosynthese reguliert durch Guanosintetraphosphat ppgpp und Guanosinpentaphosphat pppgpp

13 Die stringente Antwort Guanosinetetraphosphat (ppgpp/pppgpp) Guanosintetraphosphat ppgpp und Guanosinpentaphosphat pppgpp (Alarmone) akkumulieren bei Aminosäure-Mangel gebildet von RelA

14 Die stringente Antwort Bindung nichtbeladener trna an translatierende Ribosomen führt zur Alarmon-Synthese durch RelA

15 Die stringente Antwort

16 Die stringente Antwort, Bsp aus der Natur Caulobacter crescentus

17 Die stringente Antwort, Bsp aus Medizin

18 Weitere globale Kontrollsysteme in E.coli TABLE 8.1 A few of the global control systems known in Escherichia coli a System Signal Primary activity of regulatory protein Aerobic respiration Presence of O 2 Repressor (ArcA) 50+ Anaerobic respiration Lack of O 2 Activator (FNR) 70 + Number of genes regulated Catabolite repression Cyclic AMP concentration Activator (CAP) 300+ Heat shock Temperature Alternative sigma 36 ( 32 ) Nitrogen utilization NH 3 limitation Activator (NR I ) / 12+ alternative sigma ( 54 ) Oxidative stress Oxidizing agent Activator (OxyR) 30+ SOS response Damaged DNA Repressor (LexA) 20+

19 Weitere globale Kontrollsysteme in E.coli: alternative Sigma Faktoren Sigma Faktor = Untereinheit der RNA Polymerase, die für Promotorerkennung verantwortlich ist Konzentration in der Zelle reguliert durch Transkription/Translation und Abbau Aktivität reguliert durch Anti-Sigma-Faktoren

20 Weitere globale Kontrollsysteme in E.coli: Hitzeschockantwort Sigma Faktor 32 instabil, t 1/2 = 30 sec T Anstieg hemmt Sigma Faktor 32 Abbau hohe [Sigma Faktor 32] aktiviert Transkription von Hitzeschockgenen Hitzeschockproteine: auch induziert durch Chemikalien & Strahlung 3 Hauptklassen in E.coli: Hsp70, Hsp60, Hsp10 DnaK = Hsp70; verhindert Proteinaggregation GroEL, GroES = Hsp60 & Hsp10, propagieren Proteinfaltung ausserdem Proteasen, die denaturierte Protein abbauen meist hoch konserviert bei T-Senkung inaktiviert DnaK Sigma 32

21 Weitere globale Kontrollsysteme in E.coli: Kälteschockantwort ausgelöst durch verlangsamte Proteinbiosynthese Kälteschockproteine: Helicasen, Nucleasen, ribosomengebun- dene Proteine, reduzieren Synthese von Makromolekülen ausserdem: Synthese kompatibler löslicher Stoffe als Gefrierschutz

22 Quorum Sensing = regulatorische Wege, die von der Dichte der Zellen der eigenen Art kontrolliert werden stellt sicher, dass eine ausreichende Mengen Zellen einer Spezies vorliegt, bevor eine bestimmte biologische Antwort ausgelöst wird verbreitet bei gram- Bakterien Mechanismus: Zellen synthetisieren und sezernieren acyliertes Homoserinlacton (AHL) Konzentration in der Umgebung nur dann hoch, wenn viele Zellen AHL ausscheiden hohe [AHL] führt zur Bindung an Transkriptionaktivator für spezifische Gene

23 Quorum Sensing wichtig für Virulenzfaktoren (e.g.toxine) Biofilmbildung Biolumineszenz

24 Quorum Sensing Biolumineszenter Vibrio fischeri (produziert Luziferase)

25 Quorum Sensing: andere Beispiele Krankheitserreger: Pseudomonas aeruginosa Quorum sensing führt zu Wachstum als Biofilm auf sezernierten Polysacchariden; steigert Pathogenität & verhindert Eindringen von Antibiotika Staphylococcus aureus sezerniert Peptide, die Wirtszellen & Immunsystem schädigen auch in Archaea

26 Biofilme

27 Biofilme

28 Biofilme

29 Attenuation Regulation durch Kontrolle der Transkription nach deren Initiation d. h. kontrolliert wird die Anzahl vollständiger Transkripte (mrnas) häufig bei Aminosäure-Biosynthese in gram- Bakterien Bsp Tryptophan Operon in E. coli: - Promoter & Operator für negative Kontrolle durch Rückkopplung - zusätzlich am 5 Beginn des Operons: Leadersequenz - diese kodiert Leaderpeptid, das 2 Tryptophan Codons enthält & als Attenuator wirkt

30 Attenuation am Bsp Tryptophan Operon stop Translated leader sequence + Trp: Leaderpeptid wird synthetisiert, Transkription des restlichen Operons terminiert - Trp: Leaderpeptid wird nicht synthetisiert, Transkription des restlichen Operons findet statt

31 Attenuation: Mechanismus -i in Prokaryoten finden Transkription & Translation gleichzeitig statt Attenuation findet statt, wenn die mrna einen stem-loop bilden kann, der mit der RNA-Polymerase interferiert

32 Attenuation: Mechanismus -ii in Prokaryoten finden Transkription & Translation gleichzeitig statt. Attenuation findet nicht statt, wenn die mrna einen stem-loop bildet, der nicht mit der RNA-Polymerase interferiert

33 Attenuation: Mechanismus in Prokaryoten finden Transkription & Translation gleichzeitig statt Attenuation findet nur statt, wenn die mrna einen stem-loop bildet, der mit der RNA-Polymerase interferiert

34 Attenuation: andere Beispiele Isoleucin bitte lernen Sie die 3-Buchstaben Abkürzungen für Aminosäuren (z. B. auf der letzten Seite von Alberts et al., Molekulare Zellbiologie; in jedem Biochemie-Lehrbuch)

35 Attenuation: the movie

36 Signaltransduktion = Weiterleitung von Signalen aus der Umwelt in der Zelle über Sensor in der Cytoplasmamembran an regulatorische Maschinerie in der Zelle meist 2-Komponenten-Systeme: Sensorkinase in der Zellmembran + Response-Regulatorprotein Sensorkinase: hochkonserviert detektiert Umweltsignal Autophosphorylierung an His Übertragung des Phosphats auf Response-Regulator Response-Regulator: DNA-Bindeprotein, das Transkription reguliert

37 Signaltransduktion Regulation über Rückkopplung beteiligt: Phophatase, die Response-Regulator dephosphoryliert die Sensorkinase kann auch Phosphatase-Aktivität haben; alternativ Dephosphorylierung durch zusätzliches Protein Dephosphorylierung läuft mit konstanter Geschwindigkeit langsamer als Phosphorylierung konstitutiv

38 Signaltransduktion: 2-Komponenten-System (O 2, ph, T, Licht, Nährstoffe) 1 autokatalytisch 2

39 TABLE 8.3 Some two-component regulatory systems from Escherichia coli that regulate transcription System Environmental Sensor Response Activity of response signal kinase regulator regulator a Arc System O 2 ArcB ArcA Repressor/Activator Nitrate and Nitrate and NarX and NarL Activator/Repressor nitrite nitrite NarQ anaerobic NarP Activator/Repressor regulation(nar) Nitrogen utilization (Ntr) + NH 4 Pho regulon Porin regulation Beispiele für 2-Komponenten-Systeme Inorganic phosphate Osmotic pessure NR II, the product of glnl NR I, the product of glng PhoR PhoB Activator Activates RNA polymerase at promoters requiring 54. EnvZ OmpR Activator/Repressor In E. coli ~ 50 verschiedene Zweikomponentensysteme nur wenige in Archaea keine in parasitären Bakterien gibt es auch in mikrobiellen Eukaryoten (S. cerevisiae)

40 Chemotaxis in E. coli Bakterien sind zu klein, um Konzentrations-Gradienten entlang einer Zelle zu erkennen; deshalb: - Detektion von zeitlichen Gradienten beim Schwimmen - in Richtung Chemo-Attractant nimmt Taumeln ab, Geraden zu - Chemorezeptoren an der Zytoplasmamembran kontrollieren Flagellenrotation

41 Picture? Regulation der Chemotaxis Schreckstoff (Repellent) MCP= Methylakzeptor- Chemotaxisprotein 5 MCPs in E. coli; jedes erkennt andere Verbindungen CheW ist die Sensorkinase anziehende Stoffe verringern CheA-P, abstossende erhöhen CheA-P

42 Picture? Regulation der Chemotaxis Schreckstoff (Repellent) MCP= Methylakzeptor- Chemotaxisprotein - CheA-P überträgt P auf Response-Regulator CheY, der Geisselrotation steuert - CheY-P bindet an Geisselmotor und induziert Taumeln - CheZ dephosphoryliert CheY-P (konstitutiv)

43 Picture? Regulation der Chemotaxis Schreckstoff (Repellent) MCP= Methylakzeptor- Chemotaxisprotein Anpassung: - CheR methyliert MCP (konstitutiv), CheB-P demethyliert MCP - CheA-P überträgt P auf CheB (langsam) - methyliertes MCP bindet nicht an anziehende Stoffe, besser an Schreckstoffe

44 Regulation der Chemotaxis Komplexe aus mehreren spezifischen Rezeptoren in IM, His-Kinase CheA, Adaptor CheW Effektor diffundiert ins Periplasma, bindet Rezeptor (direkt oder BP) Output: Menge von P-CheY bindet an Flagellenmotor, induziert CW Rotation (= Taumeln) Sourjik & Wingreen, Curr Op Cell Biol, 2012

45 Regulatorische RNAs Regulation durch kleine RNAs (srnas) Nukleotide 1. srna im Signalerkennungspartikel 2. srnas binden an mrna durch komplementäre Basenpaarung = Antisense-RNAs, verhindern Translation, Abbau der mrna

46 srnas ~ Nukleotide Antisense-RNAs

47 Regulatorische RNAs Regulation durch kleine RNAs (srnas) Nukleotide 1. srna im Signalerkennungspartikel 2. srnas binden an mrna durch komplementäre Basenpaarung = Antisense-RNAs, verhindern Translation, Abbau der mrna 3. Riboswitches: am 5 -Ende von mrnas können kleine Moleküle binden Bindung verhindert Translation = Rückkopplungsmechanismus, z.b. in der Thiamin-Synthese

48 (Vitamine) Regulatory RNAs: riboswitches

49 Regulatorische RNAs Regulation durch kleine RNAs (srnas) Nukleotide 1. srna im Signalerkennungspartikel 2. srnas binden an mrna durch komplementäre Basenpaarung = Antisense-RNAs, verhindern Translation, Abbau der mrna 3. Riboswitches: am 5 -Ende von mrnas können kleine Moleküle binden Bindung verhindert Translation = Rückkopplungsmechanismus, z.b. in der Thiamin-Synthese 4. CRISPR als antivirales Verteidigungssystem (Brock, S. 328)

50 Bakterielle Viren φrsg1 Viruses infecting a cell of Rhodobacter sphaeroides Duchrow, M., G. W. Kohring and F. Giffhorn Virulence as a consequence of genome instability of a novel temperate bacteriophage RsG1, of Rhodobacter sphaeroides Arch. Microbiol. 142,

51 Virus Klassifikation 1. Anhand der Wirtszellen: Bakterien, Pflanze, Tier 2. Anhand des Genoms im Viruspartikel (Virion) 3. Es gibt ein formales System der Virusklassifikation, das Viren in verschiedene Taxa einordnet (Ordnungen, Familien, Gattung/ Art), Virusfamilien haben das Suffix viridae (Polioviridae)

52 Haupttypen von Bakterienviren (Bacteriophagen) Das Nucleocapsid von φ6 ist von einer Membran umgeben.

53 Warum binden Phagen an Pili? Wenn der Pilus retrahiert, kann der Phage das Bakterium infizieren.

54 Bestimmung von Phagentitern

55 Bacteriophagen 2 prinzipielle Lebenszyklen: virulent: lysieren Wirte nach Infektion temperent: Phagengenom wird zusammen mit Wirtsgenom repliziert, ohne den Wirt zu töten

56 Replikationszyklus virulenter Phage Phagen: min Animal viruses: 8-40 h

57 Virulente Bacteriophagen, Bsp T4 > 25 Strukturproteine ds DNA Genom ringförmig permutiert, d.h. lineare DNA wird verpackt, entstanden durch Öffnung eines Rings, an verschiedenen Stellen am Ende der DNA: 3-6 kb terminale Wiederholungssequenzen Replikation: zuerst Replikation injizierter, linearer DNA, dann Concatemerbildung durch Rekombination an den Enden Verpackung durch Schneiden mit Endonuclease ein Kopf voll DNA wird verpackt

58 Virulente Bacteriophagen, Bsp T4 Restriktionsenzyme

59 5-Hydroxymethylcytosin gibt es nur in DNA geradezahligen T-Phagen Glykosylierung von Hydroxymethylcytosin verhindert Schneiden durch Wirts-Endonucleasen

60 Virulente Bacteriophagen, Bsp T4 Zeitverlauf einer in T4 Infektion

61 Lysogenie: Temperente Bacteriophagen die meisten Virusgene werden nicht exprimiert Virusgenom ( Prophage ) wird mit Wirtsgenom repliziert und an Tochterzellen weitergegeben unter spezifischen Bedingungen wird Virusbildung induziert Lysogene sind immun gegen Infektion vom selben Phagentyp

62 Temperente Bacteriophagen

63 Temperente Bacteriophagen, Bsp Lambda Head diameter ~ 65 nm

64 Seminar, Do 16.05, hier um 17:15 Prof. Elke Deuerling 1 2 Protein folding and transport in the cell