Stammbaum der Enterobacteriaceae

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1 Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae sind peritrich begeißelte gramnegative Stäbchen, die fakulativ aerob sind und eine Atmungskette besitzen. Wichtig sind - Escherichia coli, Darmbewohner (mit 10 6 bis 10 8 /g Kot aber nicht der häufigste, Bifidobacterien und Bacteroides ca /g), Leitkeim für Kotverunreinigung, wichtig für Molekularbiologie, pathogene Stämme (EHEC etc.) - Proteus vulgaris, Darm, Boden, Gewässer; sehr beweglich, schwärmt auf Agar; neigt zu Gestaltänderung - Enterobacter aerogenes, Bodenbewohner, coliform, Unterschied: starke Gasproduktion, auf Eosin-Methylenblauagar rosa Kolonien, E. coli blau-schwarz

2 Enterobacteriaceae - Serratia marcescens, Hostienpilz, Variante von Enterobacter, die roten Farbstoff bildet - Erwinia, z.t. pflanzenpathogen, baut mit Pektinasen deren Stützgerüst ab - Klebsiella pneumoniae, Schleimkapsel, unbeweglich, Erkrankungen der Atemwege, Harnwege, Hirnhaut - Salmonella typhimurium, Lebensmittelvergiftung (Salmonellose) durch sein Lipopolysaccharid - Salmonella typhi, Typhuserreger - Vibrio cholerae, den Enterobacteriaceen nahestehend, Toxin verursacht lebensgefährlichen Durchfall - Yersinia pestis, den Enterobacteriaceen nahestehend, Toxinproduzent, Lungen- und Beulenpest

3 Stammbaum der Enterobacteriaceae

4 Enterobacteriaceae Zur Unterscheidung verschiedener Enterobacteriaceae gibt es zahlreiche biochemische Tests. Auf Lactose wachsen neben Lactobakterien nur Coliforme, die auch β- Galactosidase besitzen. Zur Unterscheidung von E. coli und Enterobacter dienen noch - Säurebildung mit Methylrot, positiv bei E. coli - Citratverwertung: nur Enterobacter - Acetoinprobe: rot mit Alkali, positiv bei Enterobacter

5 Unterschiede verschiedener Enterobacteriaceae

6 Unterschiede verschiedener Enterobacteriaceae

7 Enterobacteriaceae Acetoinbildung aus 2 Pyruvat bei Enterobacter aerogenes: Daraus entsteht durch Butandiol-Dehydrogenase Butandiol (und NAD+), und spontan an der Luft Diacetyl, der Aromastoff der Butter.

8 E. coli und gemischte Säuregärung E. coli spaltet Pyruvat mit Pyruvat-Formiat-Lyase in Acetyl- CoA und Ameisensäure. Das flavodoxinhaltige Enzym ist sehr sauerstoffempfindlich und wird daher fast nur im anaeroben Zustand exprimiert. Die aktive Form des Enzyms ist radikalisch (enthält ein ungepaartes Elektron, daher auch die Sauerstoffempfindlichkeit). Zur Aktivierung wird von einem weiteren Flavodoxin-Enzym (Aktivase) ein Elektron übertragen. Gleichzeitig wird ein S-Adenosylmethionin gespalten.

9 E. coli und gemischte Säuregärung Aktivierung der Pyruvat-Formiat-Lyase

10 E. coli und gemischte Säuregärung Katalysereaktion der Pyruvat-Formiat-Lyase

11 E. coli und gemischte Säuregärung Außerdem kann E. coli Ethanol aus Acetyl-CoA produzieren, Milchsäure aus Pyruvat, und Succinat aus Fumarat (Fumaratatmung, ATP-Bildung). Auch hier ist Pyruvat das Ausgangsprodukt, das (siehe Methyl-Malonyl- CoA-Weg) carboxyliert und dann reduziert wird. Dadurch wird gasförmiges CO 2 assimiliert! Bis 20% des zellulären Kohlenstoffs von E. coli kann aus assimiliertem Kohlendioxid stammen (das Succinat wird also als Ausgangsmaterial für anabolische Wege genutzt, z.b. Aminosäuresynthesen).

12 Clostridien und Buttersäure-/Butanolgärung Clostridien sind peritrich begeißelte grampositive Stäbchen, die hitzeresistente Endosporen bilden. Viele sind strikt anaerob, andere (C. histolyticum, C. acetobutylicum) aerotolerant. Sie können kein Hämin bilden, aber im Medium vorhandenes Hämin in Cytochrome einbauen. Nach dem bevorzugten Nährstoff unterscheidet man saccharophile und peptolytische Clostridien. Einige Arten (C. pasteurianum) können N 2 fixieren. Die meisten Clostridien sind mesophil, einige (C. thermoaceticum) thermophil mit Optima bei C.

13 Verschiedene Gärungstypen bei Clostridien

14 Clostridien und Buttersäure-/Butanolgärung Clostridien bauen Glucose über die Glycolyse ab, das Pyruvat wird mit einer Pyruvat-Ferredoxin-Oxidoreduktase in Acetyl-CoA und CO 2 gespalten. Bei der reinen Buttersäuregärung werden die Elektronen vom Ferredoxin auf H + übertragen, es entsteht H 2. Zwei Acetyl-CoA werden von der Thiolase (Name von Rückreaktion) zu Acetoactyl-CoA (+ CoA) verschmolzen. Durch zwei Reduktionsschritte (Hydroxybutyryl-CoA- Dehydrogenase/NADH zu Hydroxybutyryl-CoA, Wasserabspaltung mit Crotonase zu Crotonyl-CoA, Reduktion der Doppelbindung mit Butyryl-CoA/NADH zu Butyryl-CoA) sind genau die Reduktionsäquivalente der Glycolyse rückübertragen.

15 Clostridien und Buttersäure-/Butanolgärung Durch Übertragung des CoA auf Essigsäure entsteht die freie Buttersäure als Endprodukt. Das so entstandene Acetyl-CoA kann zur ATP-Bildung verwertet werden.

16 Clostridien und Buttersäure-/Butanolgärung Die Übertragung des CoA auf Essigsäure kann auch schon auf der Stufe des Acetoacetyl-CoA geschehen. Das Acetoacetat decarboxyliert spontan zu Aceton. (Die letzten beiden Schritte kommen auch im Menschen vor und spielen bei extremer Ketokörperbildung, z.b. bei starkem Hungern oder Diabetes mellitus, eine wichtige Rolle). Das Aceton kann noch zur Isopropanol reduziert werden. Da die Redoxbilanz aber nicht ausgeglichen ist, muß ein Teil des Butyryl-CoA über das Aldehyd zu Butanol reduziert werden. Das führt zu Verlusten an ATP. (Analog der Acetyl- CoA-Reduktion)

17 Clostridien und Buttersäure-/Butanolgärung

18 Clostridien und Buttersäure-/Butanolgärung Die Mengenverhältnisse der Endprodukte hängen von der Clostridien-Spezies ab, aber auch von den Kulturbedingungen und können sich auch während er Fermentation ändern. So wird unter alkalischen Bedingungen (kreidehaltige Nährböden) mehr Säure und weniger Butanol und Aceton gebildet. Bei C. acetobutylicum wird in der frühen Fermentation eher Butyrat, später mehr Butanol gebildet (letztlich hat sich das Kulturmedium ja geändert und ist saurer geworden).

19 Fermentation von Clostridium acetobutylicum

20 Clostridien und Stickland-Reaktion Einige Clostridien sind auf die Fermentation von Aminosäuren spezialisiert. C. sporogenes oxidiert Alanin und reduziert damit Glycin in der Stickland-Reaktion. Die Energie stammt aus der Bildung von Acetyl-CoA, das zur ATP-Bildung via Acetyl-Phosphat dient. 2 CH 2 NH 2 COOH + 4 H 2 CH 3 COOH + 2 NH ATP CH 3 CHNH 2 COOH + 2 H 2 O CH 3 COOH + NH 3 + CO H + ATP

21 Clostridien und Stickland-Reaktion Dabei wird im oxidativen Ast das Alanin (oder auch Met, Leu, Ile, Val, Ser, Thr, His) zur α-ketosäure desaminiert und dann zu einer Acyl-CoA oxidativ decarboxyliert. Im reduktiven Ast wird Glycin mit einem Selenoenzym über ein intermediäres Keten (CH 2 =C=O) zu Acetylphosphat umgewandelt. Auch andere Aminosäuren können Elektronen für den oxidativen Ast liefern, dabei wird aber kein ATP im reduktiven Ast gewonnen.

22 Clostridien und Stickland-Reaktion

23 Clostridien und Stickland-Reaktion Einige weitere Möglichkeit der Aminosäurevergärung bei Clostridien läuft über die Bildung der verzweigten Aminosäure Citramalat. Da keine Reduktionsäquivalente anfallen, kann das Pyruvat zur Acetyl-CoA - ATPBildung dienen.

24 Clostridien als Krankheitserreger - C. histolyticum, C. septicum sind Bodenbakterien, die in tiefen (anaeroben) Wunden das Gasgangrän verursachen. Durch Proteasen lösen sie das umliegende Gewebe schnell auf, die Wunde blubbert durch die Gärungsgase. - C. tetani, ebenfalls Bodenbewohner, der tiefe, anaerobe Wunden infiziert. Sein Neurotoxin führt zur kompletten Muskelverkrampfung und zum Tod durch Atemlähmung: Wundstarrkrampf. Beim Auftreten der Symptome ist ein Abtöten des Erregers wirkungslos, da das Toxin weiterwirkt. Die Schutzimpfung (vorbeugende Immunisierung) ist sicher und sehr zu empfehlen.

25 Clostridien als Krankheitserreger - C. botulinum produziert das stärkste bekannte Gift. Es ist auch ein Bodenbakterium, das in schlecht sterilisierten Konserven (besonders Fleisch und Bohnen) auftritt. Das Toxin blockiert neuronale Synapsen, Effekt ist eine Erschlaffung der Muskeln und Tod durch Atemstillstand. Künstliche Beatmung kann hier helfen (beim Starrkrampf weniger, da das Gerät gegen die starren Muskeln arbeiten muß).

26 Homoacetat- Fermentation Moorella thermoacetica (früher C. thermoaceticum) produziert Acetat aus Glucose auf einem ungewöhnlichen Weg, dem reduktiven Acetyl-CoA- Weg oder, nach den Entdeckern, Wood- Ljungdahl-Weg.

27 Homoacetat-Fermentation Aus einer Glucose werden zwei normal über die Glycolyse produziert. Das dritte entsteht aus den beiden CO 2, die aus den Pyruvat-Molekülen abgespalten wurden. Eines wird an Tetrahydrofolsäure (THF) zu einer Methylgruppe reduziert und auf ein Vitamin-B12 Derivat, das Corrinoid, übertragen. Das zweite CO 2 wird zu CO reduziert und angehängt. Die Gruppe wird als Acetyl-CoA abgespalten, damit läßt sich ein ATP wiedergewinnen. Netto liefert die Homoacetat-Fermentation ein ATP zusätzlich zu denen der Glycolyse.

28 Homoacetat- Fermentation

29 Homoacetat-Fermentation Das Ganze funktioniert auch mit H 2 als Reduktionsmittel (Moorella besitzt also eine Hydrogenase) und externem CO 2. Dabei wird ein Protonengradient aufgebaut. Aus dem heterotrophen Gärer wird so ein lithoautropher Carbonatatmer.

30 Ungewöhnliche Gärungsformen Einzelne Mikroorganismen leben von der Vergärung ungewöhnlicher Stoffe, wie - Pelobacter acidigalli: Phloroglucin (1,3,5-Benzoltriol) zu 3 Acetat - Pelobacter acetylenicus: Acetylen (C 2 H 2 ) zu Ethanol und Acetat

31 Überlegungen zur Gärung Welche Bedingungen für eine erfolgreiche Gärung gibt es? Zum einen muß die Stoffbilanz aufgehen, insbesondere die Redox-Bilanz. Dabei können (siehe Stickland-Reaktion) auch verschiedene Wege verknüpft werden, bei denen der eine die Reduktionsäquivalente liefert und der andere sie verbraucht. Alle Komponenten dazu müssen aber aus dem Medium stammen bzw. daraus erzeugt werden.

32 Überlegungen zur Gärung Welche Bedingungen für eine erfolgreiche Gärung gibt es? Zum anderen macht die Durchführung einer Gärung für die Zelle nur Sinn, wenn sie etwas davon hat, nämlich nutzbare Energie. Die energetische Bilanz einer Gärung (ΔG) muß unbedingt negativ sein. Das reicht aber noch nicht, es muß mindestens ein konkretes energiespeicherndes Ereignis bei der Gärung involviert sein.

33 Überlegungen zur Gärung Welche Bedingungen für eine erfolgreiche Gärung gibt es? In den meisten Fällen ist das die Bildung eines ATP, häufig über Acetyl-CoA > Acetyl-Phosphat. Es gibt aber Gärungen, bei denen der Energiegewinn nicht für eine ATP-Bildung reicht. Dann ist der konkrete Gewinn eigentlich immer eine Energetisierung an der Cytoplasmamembran, also eine Verstärkung des Ladungsgradienten.

34 Überlegungen zur Gärung So hat die Reaktion von Oxalat 2- zu Formiat - und CO 2 ein ΔG von -26,7 kj/mol, reicht also nicht für ein ATP. Sie treibt aber (einfach durch den Verbrauch des Oxalats!) einen Antiporter von Oxalat gegen Formiat, wodurch eine negative Ladung ins Zellinnere gelangt. Das erhöht das Membranpotential (netto eine positive Ladung mehr draußen). (Oxalobacter formigenes) Bei Oxalobacter formigenes und Propiogenium modestum ist die Decarboxylierung von Succinat zu Propionat (ΔG -20,5 kj/mol) an den Export eines Natriums gebunden, das beim Wiedereintritt zur ATP-Synthese genutzt wird (dabei sind natürlich mehrere Natriumionen pro ATP nötig).

35 Überlegungen zur Gärung Durch Zusammenarbeit der Stoffwechselwege zwischen verschiedenen Mikroorganismen können Gärungen möglich werden, die eigentlich ungünstig sind: Syntrophie. Die Ethanolgärung (2 Ethanol > 2 Acetat + 4 H H + ) hat ein stark positives ΔG =+19,4 kj/reaktion. Wird der Wasserstoff von einem Methanogenen zu Methan umgesetzt (4 H 2 + CO 2 > CH H 2 O, ΔG =-130,7 kj/reaktion), ist die Gesamtbilanz ein negatives ΔG, die kombinierte Reaktion läuft also. Durch die ziehende Weiterreaktion ist die H 2 -Konzentration so niedrig, daß das effektive ΔG der ersten Reaktion negativ wird (ΔG ist ja lediglich der Wert für Standardbedingungen )!