1. EINLEITUNG 1 1. EINLEITUNG

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1 1. EINLEITUNG 1 1. EINLEITUNG Clostridium sticklandii ist ein stäbchenförmiges, obligat anaerobes, Gram-positives Bakterium (STADTMAN & MC CLUNG, 1957), welches Endosporen bildet und den Clostridien mit geringem GC-Gehalt zugeordnet wird (JOHNSON & FANCIS, 1975). Es kann keine dissimilatorische Sulfatreduktion durchführen und wird aufgrund seines Wachstums auf Aminosäuren als Kohlenstoff- und Energiequelle den proteolytischen Clostridien zugeordnet (ANDEESEN et al., 1989; HIPPE et al., 1991; COLLINS et al., 1994). Die Vergärung der Aminosäuren erfolgt paarweise in einer gekoppelten Oxidations-eduktions-eaktion, welche als Stickland-eaktion bezeichnet wird (STICKLAND, 1934). Dabei kommt es zur Oxidation einer Aminosäure, deren freiwerdende Elektronen zur eduktion der zweiten Aminosäure genutzt werden. C. sticklandii verwendet Serin, Threonin, Arginin, Lysin und Alanin als Elektronendonatoren. Als Elektronenakzeptoren können nur Prolin und Glycin dienen (UHDE, 1990). Die Glycin-eduktion erfolgt durch die Glycin-eduktase zu Acetyl-Phosphat und Ammonium (STADTMAN & ELLIOTT, 1956; STADTMAN, 1978; TANAKA & STADTMAN, 1979; STADTMAN & DAVIS, 1991; AKOWITZ & ABELES, 1989; 1990, 1991; SCHÄDE & ANDEESEN, 1992; ANDEESEN, 1994; WAGNE et al., 1999). Acetyl-Phosphat kann mittels der Acetatkinase zur ATP-Synthese und somit zur Energiekonservierung verwendet werden (BANAD & AKHTA, 1979; AKOWITZ & ABELES, 1989). Beim oxidativen Threonin-Abbau durch die Threonin- Dehydrogenase (WAGNE & ANDEESEN, 1995) entsteht intermediär Glycin (UHDE, 1990), was zu einer internen Stickland-eaktion führt. Die Prolin-eduktion beginnt mit der Isomerisierung des L-Prolins zum D-Isomer durch die Prolin-acemase (UDNICK & ABELES, 1975). D-Prolin wird anschließend durch die D-Prolin-eduktase (EC ) zu δ-aminovalerat umgesetzt (SETO und STADTMAN, 1976). Für die Prolin-eduktion konnte bislang kein energiekonservierender Schritt in Form einer wie für die Glycin-eduktase beschriebenen Substratkettenphosphorylierung nachgewiesen werden (AKOWITZ et al., 1994), obwohl bei Wachstum auf beiden Elektronenakzeptoren Prolin vor Glycin umgesetzt wird (UHDE, 1990). Wachstumsphysiologische Untersuchungen zeigten, daß Prolin essentiell für das Wachstum von C. sticklandii ist (A. PICH, pers. Mitteilung). Das

2 1. EINLEITUNG 2 Bakterium ist im Gegensatz zu den verwandten Organismen Clostridium litorale und Eubacterium acidaminophilum (BAENA et al., 1999) nicht in der Lage, auf Glycin als alleiniger Kohlenstoff- und Energiequelle zu wachsen (ZINDEL et al., 1988; UHDE, 1990; DIETICHS et al., 1991). Für Clostridium sporogenes wurde postuliert, daß die Prolin-eduktion mit der Erzeugung eines ph-gradienten über die Cytoplasmamembran verbunden ist, der möglicherweise zur Energiekonservierung genutzt werden kann. Ob dieser Protonengradient an eine Elektronentransportkette verbunden mit einer ATP-Synthese gekoppelt ist, konnte nicht nachgewiesen werden (LOVITT et al., 1986). Die Glycin-eduktase wurde bereits aus E. acidaminophilum (ANDEESEN, 1994; WAGNE, 1997; SONNTAG, 1998; WAGNE et al., 1999), C. litorale (KEIME & ANDEESEN, 1995) und C. sticklandii (STADTMAN, 1966; TUNE & STADTMAN, 1973; STADTMAN & DAVIS, 1991; GACIA & STADTMAN, 1992; ANDEESEN, 1994; GÄNTZDÖFFE et al., 2001) und weiteren Organismen biochemisch und molekularbiologisch eingehend untersucht. Im Gegensatz zu C. sticklandii können andere Gram-positive Bakterien, wie E. acidaminophilum und C. litorale auch die N-methylierten Glycin-Derivate Betain und Sarkosin reduzieren (HOMANN & ANDEESEN, 1989; FENDICH et al., 1990; ANDEESEN, 1994). Tissierella creatinophilum ist in der Lage, Kreatinin vollständig über Kreatin, Sarkosin und Glycin zu den Produkten Acetat, Monomethylamin, Ammonium und Kohlendioxid zu reduzieren (HAMS et al., 1998a, 1998b). Das Glycin-eduktase-System besteht aus drei Komponenten, dem Selenoprotein A (TUNE & STADTMAN, 1973; GACIA & STADTMAN, 1991; 1992), den substratspezifischen Proteinen B, einem Komplex aus drei Untereinheiten (MEYE et al., 1995; WAGNE, 1997; WAGNE et al., 1999) und den Proteinen C, welche sich aus zwei Untereinheiten zusammensetzen (STADTMAN & DAVIS, 1991; SCHÄDE & ANDEESEN, 1992). Die 22 kda-untereinheit des Glycin-spezifischen Protein B- Komplexes enthält eine Pyruvyl-Gruppe und entsteht zusammen mit der 25 kda- Untereinheit aus einem 47 kda-proprotein GrdE (WAGNE et al., 1999; BEDNASKI, 1999; BEDNASKI et al., 2001). Die dritte Untereinheit des Protein B- Komplexes, die 47 kda-untereinheit GrdB, enthält Selen in Form von Selenocystein

3 1. EINLEITUNG 3 (WAGNE et al., 1999; SONNTAG, 1998; GÄNTZDÖFFE et al., 2001). Die Elektronen zur eduktion des Glycins stammen aus dem NADPH und werden über das Thioredoxin-System auf das Selenoprotein A der Glycin-eduktase übertragen. Das Thioredoxin-System besteht aus zwei Proteinen, der Thioredoxin-eduktase und dem Thioredoxin (DIETICHS et al., 1991). Der eaktionsmechanismus der Glycin-Spaltung gestaltet sich wie folgt (Abb. 1.1): Glycin wird kovalent als Schiff sche Base an eine Carbonyl-Gruppe der 47 kda- Untereinheit des Proteinkomplexes B gebunden (TANAKA & STADTMAN, 1979; AKOWITZ & ABELES, 1989, 1991; MEYE et al., 1995; HAMS et al., 1998b; WAGNE et al., 1999; GÄNTZDÖFFE et al., 2001). Dieses Protein enthält Selen in Form eines TGA-kodierten Selenocysteins. Es erfolgt ein nukleophiler Angriff des Selenol-Anions am α-c-atom des Glycins, wodurch die C-N-Bindung gespalten wird und Ammonium und ein Carboxymethyl-Selenoether entstehen (AKOWITZ & ABELES, 1990, 1991; STADTMAN & DAVIS, 1991; WAGNE et al., 1999). Dieser wird vom Selenoprotein A übernommen und in einen Protein C-gebundenen Acetyl- Thioester überführt. Dieser Acetyl-Thioester wird zu Acetylphosphat gespalten und durch die Acetat-Kinase in Acetat und ATP umgesetzt (STADTMAN, 1989; AKOWITZ & ABELES, 1989; 1990; 1991; STADTMAN & DAVIS, 1991; SCHÄDE & ANDEESEN, 1992; KOHLSTOCK, 2001). Die im Verlauf dieses eaktionsmechanismus oxidierte Selenid-Sulfid-Gruppe am Selenoprotein A wird durch das Thioredoxin-System wieder reduziert (DIETICHS et al., 1991; WAGNE et al., 1999).

4 1. EINLEITUNG 4 H 3 N H O 2 NH NH 2 O NH 2 NADPHH T Trx NADP 2[H] Se P A P SH A S P A Se SH DTT red. DTT ox. S P C SH P C O C CH 3 P P i O C CH 3 NH 4 H O 2 Abb. 1.1: Postulierter eaktionsmechanismus der reduktiven Spaltung von Glycin durch die Glycin-eduktase aus E. acidaminophilum (WAGNE, 1999). : substratspezifischer Protein-B- Komplex, P A : Selenoprotein A, P C : Protein-C-Komplex, T: Thioredoxin-eduktase, Trx: Thioredoxin, P i : anorganisches Phosphat Die kodierenden Gene für die Proteine A, B und C des Glycin-eduktase-Systems sowie für die Komponenten Thioredoxin und Thioredoxin-eduktase des Thioredoxin-Systems sind in einem Operon organisiert (LÜBBES & ANDEESEN, 1993; WAGNE et al., 1999; GÄNTZDÖFFE et al., 2001). Die D-Prolin-eduktase wurde bisher nur aus C. sticklandii biochemisch untersucht und teilweise charakterisiert (SETO & STADTMAN, 1976; SETO, 1980a; ABELES et al., 1994). Die D-Prolin-eduktase wurde als ein membrangebundenes, homodekameres Protein mit einer molekularen Masse von 300 kda beschrieben. Jede der zehn Untereinheiten enthält eine kovalent gebundene Pyruvyl-Gruppe (HODGINS & ABELES, 1967, 1969; SETO & STADTMAN, 1976; SETO, 1980a) und ist aminoterminal blockiert. Es wurde angenommen, daß die Pyruvyl-Gruppe in einem Peptid mit einer molekularen Masse von 4,6 kda lokalisiert sei (SETO, 1979; 1980a; 1980b). Bei Zugabe von Selen zum Wachstumsmedium erreicht die D-Prolin-eduktase eine dreifach höhere Enzymaktivität. Im Gegensatz zur Glycin-eduktase wurde in der D-Prolin-eduktase jedoch kein Selen nachgewiesen (SETO & STADTMAN, 1976). Das Enzym katalysiert die reduktive C-N-ingspaltung des D-Prolins in Gegenwart von Elektronendonatoren, z.b. DTT (HODGINS & ABELES, 1969; SETO,1980a). Dabei wird D-Prolin durch eine enzymgebundene Pyruvyl-Gruppe aktiviert und der ing soll durch einen nukleophilen Angriff des Dithiols auf das α-c-atom des Prolins zu δ-

5 1. EINLEITUNG 5 Aminovalerat gespalten werden. In vivo fungiert NADH als Elekronendonor, von dem aus die Elektronen über eine FAD-abhängige NADH-Dehydrogenase und ein eisenhaltiges Protein auf die D-Prolin-eduktase übertragen werden sollen (STADTMAN, 1965; SCHWATZ & MÜLLE, 1979; SETO, 1980a) (Abb. 1.2). N ADHH NAD FAD H 2 DH FeS D-Prolinreduktase 2[H] FAD N H DTT red. DTT ox. H 2 N Abb. 1.2: Hypothetischer eaktionsmechanismus der reduktiven Spaltung von D-Prolin durch die D-Prolin-eduktase aus C. sticklandii (SETO, 1980a). DH: FAD-abhängige NADH-Dehydrogenase, FeS: Eisen-Schwefel-Protein, δ-aminovalerat ist das Endprodukt der D-Prolin-eduktase-eaktion und kann im weiteren Stoffkreislauf durch andere strikt anaerobe Bakterien zu Ammonium, Acetat, Propionat, Butyrat und Valerat umgesetzt werden, z.b. durch Clostridium aminovalericum (HADMAN & STADTMAN, 1960; BAKE et al., 1987; EIKMANNS & BUCKEL, 1991). Ein weiterer δ-aminovalerat-verwertender Organismus wurde von BAKE et al. (1987) isoliert. BUCKEL et al. (1994) charakterisierten diesen Organismus und bezeichneten ihn als Clostridium viride. C. sticklandii kann δ-aminovalerat auch aus Arginin bzw. seinem Abbauprodukt Ornithin über Prolin als Zwischenprodukt synthetisieren (DYE & COSTILOW, 1968). Die 1 -Pyrrolin-5-Carboxylat-eduktase konnte in C. sticklandii charakterisiert werden (KENKLIES et al., 1999). Aufgrund der wenigen zur Verfügung stehenden Daten zum eaktionsmechanismus und zur egulation der D-Prolin-eduktase aus C. sticklandii sowie der möglichen Beteiligung einer noch nicht aufgeklärten Elektronentransportkette über zwei redoxaktive Proteine (ein Flavo- und ein eisenhaltiges Enzym), war das Ziel dieser Arbeit, die D-Prolin-eduktase weiter proteinchemisch und auch molekularbiologisch zu untersuchen. Das Enzym sollte dazu zunächst bis zur Homogenität gereinigt und danach charakterisiert werden. Anschließend sollte das zugehörige Gen identifiziert und analysiert und der eaktionsmechanismus der D-Prolin-eduktase untersucht werden.