EIGENSCHAFTEN VON LIPIDEN, BIOLOGISCHEN MEMBRANEN

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1 69 PLATZ 6: EIGENSCHAFTEN VON LIPIDEN, BIOLOGISCHEN MEMBRANEN Physikalisch-chemische Eigenschaften wie Löslichkeit und Micellenbildung von Lipiden sowie die Lipidkomponenten der Erythrozytenzellmembran werden demonstriert. Die toxische Wirkung freier Fettsäuren und von Detergenzien an Lipidmembranen wird am Beispiel von Erythrozyten nachgewiesen. Vorbereitung: Denaturierung und Löslichkeit von Proteinen (S.15) Lipide (S. 16) Biologische Membranen (S. 18) Chromatographie (S ) Photometrie (S. 31) Bezug zu anderen Plätzen: Bestimmung von Cholesterin im Serum und in Lipoproteinen (2. Studienjahr, Platz 5) EXPERIMENT 6.1: Lipidzusammensetzung der Erythrozytenzellmembran Im folgenden Experiment werden die Lipidkomponenten der Erythrozytenzellmembran untersucht. Lösungen/Material: 1. Pferdeblut, bereits in Plasma und Erythrozyten getrennt. Die EC sind bereits durch dreimaliges Waschen mit isotoner NaCl-Lösung von Plasmaresten befreit worden. 2. Chloroform; Essigsäure 2% in Methanol. 3. Lösungsmittel: Chloroform/Methanol 2:1 (vol/vol) 4. Laufmittel für Dünnschichtchromatographie A: Petrolether/Aethylether/Ameisensäure (60/40/1) Laufmittel für Dünnschichtchromatographie B: Chloroform/Methanol/Wasser: 65/25/4. Die Mischungen sind bereits in verschliessbare Chromatographiegefässe eingefüllt. 5. Referenzsubstanzen: (je 2 mg/ml in Chloroform/Methanol, 2:1 gelöst) Phosphatidylcholin=PC, Phosphatidylethanolamin=PE, Sphingomyelin=SL, Cholesterin=Ch, Cholesterinester(Oleat)=ChE, Triacylglycerin=TG, Ölsäure=FS. 6. Jodkristalle in verschlossenem Tank (Jodgas-Atmosphäre) Lipidextraktion: Ein Plastikröhrchen, welches gegenüber organischen Lösungsmitteln inert ist, enthält bereits 1.0 ml Erythrozyten. Diese sowie ein weiteres Plastikröhrchen beschriften und die Extraktionsanleitung

2 70 befolgen: Plastikröhrchen EC Blindwert zur Ausbalancierung bei der Zentrifugation EC-Lösung bzw. Wasser 1.0 ml 1.0 ml Wasser Essigsäure 2% in Methanol zugeben 3.6 ml 3.6 ml dicht verschliessen und auf Vortex 10 Sekunden gut mischen Chloroform zugeben (Gummiballon benützen) 3.6 ml 3.6 ml dicht verschliessen und auf Vortex 10 Sekunden schütteln. Wasser zugeben 2.0 ml 2.0 ml dicht verschliessen und auf Vortex mind. 30 Sekundenschütteln. Durch dieses Vorgehen werden alle Lipide extrahiert, die noch von den im organischen Lösungsmittel unlöslichen Substanzen abgetrennt werden müssen. Dies geschieht durch Zugabe von Wasser, wobei zwei Flüssigkeitsphasen entstehen, die nicht miteinander mischbar sind. Nur Lipide bleiben in der organischen Phase und lassen sich von Proteinen, die ausfallen und sich in der Grenzschicht zwischen den beiden Flüssigkeitsphasen ansammeln, und von wasserlöslichen Substanzen abtrennen. Anschliessend 5 Minuten bei 2400 Umdrehungen/min zentrifugieren. Die untere, organische Flüssigkeitsphasen der EC-Probe mit Hilfe einer Pasteurpipette abtrennen (Chloroform ist schwerer als Wasser). Gummihütchen auf Pasteurpipette aufsetzen, Hütchen pressen und vorsichtig entlang der Gläschenwandung (leicht schief halten) durch das Material an der Interphase durchstechen, auf den Boden des Gläschens vordringen und die untere Flüssigkeitsphase möglichst vollständig aufsaugen und in ein beschriftetes Gläschen mit Schraubdeckel überführen. Das organische Lösungsmittel in der Kapelle im Luftstrom verdampfen lassen (Wird durch die Co- Assistierenden durchgeführt). Sobald die Probe eingedampft ist, wird ins Gläschen 0.5 ml Chloroform/ Methanol 2:1 zugegeben, mit dem Schraubdeckel verschlossen und auf dem Vortex kräftig geschüttelt. Das Lösungsmittel wird erneut im Luftstrom verdampft. Auftrennung und Nachweis der extrahierten Lipide durch Dünnschichtchromatographie Die Auftrennung der Lipide erfolgt durch Dünnschichtchromatographie (DC) mit Kieselgelplätchen und zwei verschiedenen Laufmittelsystemen. Die Identifizierung der aufgetrennten Lipide erfolgt mittels Referenzsubstanzen dienen. In beiden Trennsystemen wandern die Lipide um so langsamer, je polarer sie sind. Mit Laufmittelsystem A werden die Lipide in die verschiedenen Lipidklassen aufgetrennt, während die Auftrennung der Phospholipide separat mit Laufmittelsystem B durchgeführt wird.

3 71 Vorgehen: Zu den extrahierten, eingedampften Membranlipiden gibt man 0.2 ml Chloroform/Methanol 2:1 und das Gläschen wird dicht verschlossen. Die Lipide durch langsames Drehen und vorsichtiges Schütteln der Gläschen lösen. Auf vier DC-Platten mit Bleistift eine Linie im Abstand von 0.5 cm vom unteren Rand als Auftragungsort fein markieren. Pro DC-Platte vier Punkte als Auftragungsort wie beim aufgestellten Muster mit Bleistift markieren. Zuerst mit der Auftrennung der Phospholipide beginnen, da die chromatographische Auftrennung der Phospholipide (Laufmittelsystem B) etwas mehr Zeit braucht als die Auftrennung in die Lipidklassen. Auftrennung der Phospholipide (Trennsystem B) Zwei DC-Plätchen am oberen Rand B1, B2 beschriften und nach dem angegebenen Schema mit Glaskapillaren (jedesmal frische Kapillare verwenden!) die angegebenen Mengen portionenweise als möglichst kleiner Fleck auftragen (vom Kieselgel aufsaugen lassen, dazwischen das Lösungsmittel durch Blasen verdampfen lassen). DC-Platten: B1 B2 Bahn Probe B1 B2 B3 B* (PE) (PC) (SL) (Gemisch) Vol (µl) EC- EC- Gemisch Extrakt Extrakt B* A* Abkürzungen siehe unter "gelöste Referenzsubstanzen" (Lösungen/Material) B*: Gemisch von Standards B1 - B3 (=PE, PC, SL) A*: Gemisch der Standards A1-A4 (=ChE, TG, FS, Ch), siehe unten Zur Auftrennung DC-PLatten B1 und B2 zusammen in das Chromatographiegefäss mit Laufmittel B stellen und wenn die Laufmittelfront annähernd den oberen Rand erreicht hat, die DC-Platten herausnehmen, Laufmittelfront mit Bleistift markieren und in der Kapelle trocknen lassen. Auftrennung in Lipidklassen (Trennsystem A; Phospholipide und Sphingolipide bleiben am Auftragungsort.) Zwei DC-Plätchen am oberen Rand A1, A2 beschriften und nach dem angegebenen Schema mit Glaskapillaren (jedesmal frische Kapillare verwenden!) die angegebenen Mengen portionenweise als möglichst kleiner Fleck auftragen (vom Kieselgel aufsaugen lassen, dazwischen das Lösungsmittel durch Blasen verdampfen lassen).

4 72 DC-Platten: A1 A2 Bahn Probe A1 A2 A3 A4 (ChE) (TG) (FS) (Ch) Vol (µl) EC- EC- Gemisch Extrakt Extrakt A* B* A*: Gemisch der Standards A1-A4 (=ChE, TG, FS, Ch) B*: Gemisch von Standards B1 - B3 (=PE, PC, SL), siehe oben Die Auftrennung erfolgt analog mit Laufmittel A (siehe unter B). Wenn die Laufmittelfront annähernd den oberen Rand erreicht hat, die DC-Platten herausnehmen, Laufmittelfront mit Bleistift markieren und in der Kapelle trocknen lassen. Anfärbung: Trockene Platten einer Atmosphäre mit Jodgas aussetzen (Jodkristalle in geschlossenem Tank, in Kapelle), bis Lipidflecken gut sichtbar sind (ca. 5 min). Platten aus dem Tank nehmen und Position der Flecken mit Bleistift fein markieren, da die Reaktion reversibel ist und die Färbung nach kurzer Zeit wieder verschwindet. Intensität der Flecken abschätzen und notieren (+ bis ++++). Der Nachweis mit Jod ist qualitativ und färbt nur Lipide an, welche eine Kohlenstoff-Doppelbindung enthalten. Die Menge Lipide kann durch Anfärben mit Molybdänblau abgeschätzt werden. Dazu DC- Platten in Kapelle mit Molybdänblau kurz besprühen (ca. 30 cm Abstand) und im Luftstrom des Föhn ca. 3 min. erhitzen (Föhn im Abstand von ca. 1 cm von DC-Platten halten). Aufgrund der Färbung die relativen Mengen der Lipidkomponenten in der EC-Membran abschätzen. Phosphatidylserin ist äusserst instabil und wird nicht nachgewiesen. Es kommt in der Erythrozytenmembran in geringer Menge vor. Das hauptsächliche Abbauprodukt wandert auf der DC- Platte wie Phosphatidylethanolamin. - Welche Lipide, die in Standardlösungen vorhanden sind, lassen sich in der Plasmamembran nicht nachweisen? - Wodurch wird die Fluidität der Lipid-Membran bestimmt? Wie kann die Fluidität von Lipidmembranen gewährleistet werden in Kaltblütern, z.b in Fischen, die in kaltem Wasser leben? - Die Diffusion von Lipidmolekülen in der Lipidmembran ist recht gross, im Mittel etwa 2 µm pro Sekunde. Welche Bewegung können Phospholipidmoleküle nicht durchführen? (Asymmetrie!)

5 73 EXPERIMENT 6.2: Löslichkeit der Lipide Freie Fettsäuren: Eine Spatelspitze Na-Stearat (Seife) unter leichtem Erwärmen in ca. 6 ml Wasser auflösen und zu gleichen Teilen in 3 Glasröhrchenverteilen. Es bilden sich Micellen (siehe Exp. 6.4). Bei hoher Konzentration der Micellen können sie sich zu grösseren Gebilden zusammen lagern, wodurch die Lösung trüb wird. Zum Gemisch eines der Glasröhrchen mit Pasteurpipette etwas verdünnte H 2 S0 4 zusetzen. Freie Fettsäure fällt aus. Nun das gleiche Volumen (ca. 2 ml) Chloroform zugeben und gut mischen. Es entstehen zwei nichtmischbare Phasen. Der Niederschlag löst sich in der Chloroform- Phase. Weshalb? Dieser Vorgang wird in der Lipidextraktion in Exp. 6.2 angewandt. Schwerlösliche Salze von Fettsäuren: Zu den restlichen zwei Glasröhrchen einige Tropfen einer Lösung von CaCl 2 oder BaCl 2 zusetzen. Es tritt Fällung ein: Ca- und Ba-Salze der Fettsäuren sind schwerlöslich. Triacylglycerine: In 3 Glasröhrchen (A,B,C) je 2 Tropfen Olivenöl geben. Zu (A) 2 ml H 2 0, zu (B) 2 ml 20 % Natriumcholat-Lösung und zu (C) 2 ml Chloroform zufügen. Die 3 Glasröhrchen kräftig schütteln und Löslichkeit vergleichen. Wichtig: Nach Beendigung, alle Chloroform enthaltenden Lösungen im dafür vorgesehenen Behälter sammeln. - Welche physikalisch-chemischen Konstanten bestimmen, ob Fettsäuren als Calciumsalze (Kalkseifen) ausfallen? - Im Blut beträgt die Konzentration von Fettsäuren ungefähr 1 mm und die Konzentration von Ca 2+ ungefähr 2.5 mm. Bei diesen Konzentrationen tritt im Reagenzglas Ausfällung ein. Wieso geschieht dies nicht im Blut? - Welche Produkte entstehen bei der alkalischen Hydrolyse (Verseifung) von Olivenöl? - Weitere typische unpolare Lipide sind Wachse, z.b. die folgende Verbindung: Welche Produkte entstehen bei der alkalischen Hydrolyse dieses Wachses? Wie lassen sich die Produkt sichtbar nachweisen (Exp. 6.1!)

6 74 EXPERIMENT 6.3: Lyse von Erythrozyten mit Seife und Na-Dodecylsulfat (SDS) Prinzip: Fettsäuren und viele amphiphile Lipide sind potentielle Gifte. Sie lagern sich in Lipidmembranen ein und zerstören die Membranstruktur. Dadurch bilden sich sogenannte gemischte Micellen, welche nebst dem Hauptbestandteil an Fettsäuren oder einem Detergens wie SDS auch eine Anzahl Moleküle der Lipidmembran enthalten. Je mehr Lipidmembranen vorhanden sind, desto mehr Fettsäuren oder SDS werden für die Zellauflösung (Lyse)benötigt, was im folgenden Experiment gezeigt wird. Lösungen: Na-Stearat, 1 mm in Wasser SDS (0.12 %), 0.42 mm in Wasser NaCl 1.8 % (doppelt physiologische Konzentration) EC: Erythrozytensuspension in NaCl 0.9 % (physiologische Kochsalzlösung). Die Erythrozyten wurden in NaCl gewaschen, durch Zentrifugation gepackt und 1:8 (vol/vol) in NaCl-Lösung suspendiert. Ausführung: Nach Anleitung der Assistierenden führt ein Teil der Studierenden Versuch A mit Na-Stearat und ein Teil der Studierenden Versuch B mit SDS durch; Resultate gegenseitig austauschen! A: In 8 beschriftete kleine Plastikröhrchen die folgenden Lösungen mit verstellbaren Pipetten zugeben (Volumina in µl): NaCl 1.8 % (µl) Wasser (µl) Na-Stearat 1 mm (µl) Gut mischen, anschliessend EC zugeben. EC (µl) Deckfarbene Durchsichtigkeit (+++ bis -) E 540 nm

7 1. Nach Zugabe der EC alle Proben sanft mischen und beurteilen, ob sich die Durchsichtigkeit der Proben (deckfarbene Durchsicht) ändert und Resultat in der Tabelle festhalten. Durch teilweise oder vollständige Lyse der Erythrozyten wird Licht weniger oder gar nicht mehr gestreut, die Proben werden durchsichtig (lackfarbene Durchsichtigkeit). 2. Alle Röhrchen für 3 Minuten zentrifugieren (Maximale Umdrehungszahl), Grösse des Niederschlags beurteilen und in der Tabelle festhalten. 3. Das Ausmass der Lyse wird durch Messung der Extinktion des freigesetzten Hämoglobins im Überstand bei 540 nm gegen Wasser als Blindwerte bestimmt. Extinktionen in die Tabelle eintragen und als Funktion der zugegebenen Menge Na-Stearat in der Auswertungstabelle im bipweb aufzeichnen. Resultate gegenseitig austauschen! Bestimmen Sie, ab welcher Konzentration Na-Stearat unter den verwendeten Bedingungen Erythrozyten zerstören. Frage zu diesem Experiment anschliessend an Experiment B. 75 B: NaCl 1.8 % (µl) Wasser (µl) SDS 0.42 mm (µl) Gut mischen, anschliessend EC zugeben. EC (µl) Deckfarbene Durchsichtigkeit (+++ bis -) E 540 nm Nach Zugabe der EC alle Proben sanft mischen und beurteilen, ob sich die Durchsichtigkeit der Proben (deckfarbene Durchsicht) ändert und Resultat in der Tabelle festhalten. Durch teilweise oder vollständige Lyse der Erythrozyten wird Licht weniger oder gar nicht mehr gestreut, die Proben werden durchsichtig (lackfarbene Durchsichtigkeit). 2. Alle Röhrchen für 3 Minuten zentrifugieren (Maximale Umdrehungszahl), Grösse des Nieder-

8 76 schlags beurteilen und in der Tabelle festhalten. 3. Das Ausmass der Lyse wird durch Messung der Extinktion des freigesetzten Hämoglobins im Überstand bei 540 nm gegen Wasser als Blindwerte bestimmt. Extinktionen in die Tabelle eintragen und als Funktion der zugegebenen Menge SDS der Auswertungstabelle im bipweb aufzeichnen. Resultate gegenseitig austauschen! Bestimmen Sie, ab welcher Konzentration SDS unter den verwendeten Bedingungen Erythrozyten zerstören. - Im Blutplasma ist die Konzentration von Fettsäuren ungefähr 1 mm. Wieso bleiben Erythrozyten im Blut intakt?