PRAKTIKUMSTEIL BIOCHEMIE (1. Studienjahr)

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1 60 PRAKTIKUMSTEIL BIOCHEMIE (1. Studienjahr) PLATZ 4: AMINOSÄUREN UND PROTEINE Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Aminosäuren und Proteinen sind eng mit ihrer Fähigkeit verknüpft, Protonen abzugeben und aufzunehmen. Ein Ziel dieses Platzes ist, die ph-abhängigen Ladungsverhältnisse von Aminosäuren und Proteinen verständlich zu machen. Voraussetzung ist das generelle Verständnis des Verhaltens ionisierbarer Gruppen, sowie die damit verknüpfte Bedeutung und Verwendung als Puffersubstanzen (Exp. 4.1, vergleiche auch die Pufferfunktion von Hämoglobin, 2. Studienjahr). Zur Illustration der ph-abhängigkeit von Enzymreaktionen dient Exp und der Reaktionsmechanismus von Chymotrypsin (Exp. 10.1, 2. Studienjahr). Im nativen Zustand nehmen Proteine eine definierte Raumstruktur ein, welche durch die physikalischchemischen Eigenschaften von Aminosäuren in ihrer Abfolge in der Aminosäurensequenz bestimmt ist. In globulären Proteinen befinden sich polare, hydrophile Aminosäurereste hauptsächlich an der Proteinoberfläche, wo sie mit Wasser interagieren. Ausgeprägt hydrophobe Aminosäurereste sind im nativen Zustand überwiegend im für Wasser nicht zugänglichen Proteininnern verborgen. Nach Denaturierung kommen apolare Aminosäurereste mit Wasser in Kontakt und erniedrigen die Löslichkeit des Proteins. Vorbereitung: Aminosäuren und Proteine (S. 10) ph-messung und Titration (S. 20) Photometrie (S. 31) Absorption von Proteinen im UV-Bereich (S. 12) Denaturierung von Proteinen (S. 15) Bezug zu anderen Plätzen (2. Studienjahr): Trennung von Aminosäuren und Proteinen aufgrund ihrer elektrischen Ladung (Platz 4) Titration von Hämoglobin (Platz 2) Proteinbestimmung nach der Biuret-Methode (2. Studienjahr, Platz 4)

2 61 EXPERIMENT 4.1: Titrationskurven von Aminosäuren Prinzip: Die in 0.1 M HCl gelöste protonierte Form einer Aminosäure (Histidin, Glutaminsäure, Glycin oder Lysin) wird mit 0.25 M NaOH bis ph 12 titriert. Die Titrationskurve der Aminosäure wird aus der Differenz des Basenverbrauchs der Lösung und des "Lösungsmittels" (0.1 M HCl in H 2 O) ermittelt. Aus der Titrationskurve werden pk a -Werte, IEP und Konzentration der Aminosäure bestimmt. Ausführung: Vor Versuchsbeginn Bedienungsanleitung des ph-meters lesen und ph-meter mit der aufgestellten ph-eichlösung eichen. Bürette sorgfältig mit 0.25 M NaOH (bis etwa 3 cm über das Skalenende) füllen (Schutzbrille). Meniskus bis zum oberen Ende der Skala absinken lassen (Lauge in Plastikbecher fliessen lassen) und genaue Position ablesen. a) Magnetrührstäbchen in mit Wasser gespültes 100 ml Becherglas legen und 40.0 ml der aufgestellten Aminosäurelösung zugeben. Magnetrührer abschalten. Mit Wasser abgespülte Elektrode vorsichtig eintauchen (darf Rührstäbchen nicht berühren) und ph-wert ablesen. Magnetrührer wieder einschalten. Titration durch Zugabe von kleinen Mengen ( ml) NaOH ausführen. Nach jeder Zugabe Volumen der verbrauchten Lauge und ph notieren. ph-werte als Funktion des Laugenverbrauchs aufzeichnen (bipweb Auswertehilfe; oder auf Millimeterpapier auftragen, Abszisse: ml NaOH (1 cm = 2 ml); Ordinate: ph (1 cm = 1 Einheit). b) Wiederholung der Titration von 40.0 ml "Lösungsmittels" (= 0.1 M HCl). Messwerte in die gleiche Auswertungstabelle im bipweb eintragen (bzw. auf das gleiche Millimeterpapier auftragen). Auf der ausgedruckten graphischen Darstellung die Titrationskurve der Aminosäure aus der Differenz des Basenverbrauchs von Titration (a) und (b) (= horizontaler Abstand der erhaltenen Kurven) in Intervallen von 0.5 ph-einheiten ermitteln und einzeichnen. Äquivalenzpunkte und pk a -Werte bestimmen und die molare Konzentration der Aminosäurelösung berechnen (Hilfe unter bipweb). Welche Aminosäure wurde titriert? Konsultieren Sie die Tabelle im Theorieteil S. 25. In welcher Konzentration lag die Aminosäure vor? Berechnen Sie den IEP der titrierten Aminosäure auf Grund der von Ihnen bestimmten pk a -Werte.

3 62 EXPERIMENT 4.2: Bestimmung des pk a -Wertes der Tyrosinseitenkette Prinzip: 1.2 ph ph 9.7 ph 13 Extinktion Wellenlämge, nm Absorptionsspektrum von Tyrosin bei verschiedene ph-werten Tyrosin hat bei neutralem ph ein Absorptionsmaximum bei 273 nm (Kurve ph 7, Seitenkette vollständig protoniert), im basischen Bereich nach Deprotonierung der Seitenkette (phenolische OH- Gruppe) jedoch bei 295 nm (Kurve ph 13, vollständig deprotoniert in 0.1 M NaOH). Im leicht alkalischen Bereich ist das Spektrum eine Überlagerung der Spektren bei ph 7 und ph 13 (Kurve ph 9.7). Bei 300 nm absorbiert nur die deprotonierte Tyrosinseitenkette, deren Konzentration daher direkt proportional zur Absorption bei 300 nm ist. Der pk a -Wert der Tyrosinseitenkette lässt sich somit nach der Beziehung pk a = ph - log [Tyrosin-O - ]/[Tyrosin-OH] bestimmen. Das Verhältnis [Tyrosin-O - ] zu [Tyrosin-OH] im leicht alkalische ph-bereich kann direkt durch Messung der Absorption bei 300 nm bestimmt werden. In einer leicht alkalischen Probe ist die Konzentration von [Tyrosin-O - ] proportional zur Absorption bei 300 nm. Die Konzentration von [Tyrosin-OH] ist proportional zur Differenz der gesamt Tyrosinkonzentration gemessen aus der Absorption bei 300 nm bei ph 13 und der Absorption bei 300 nm in der leicht alkalischen Probe (in der Abbildung Differenz bei 300 nm zwischen den Kurven ph 13 und ph 9.7). Lösungen: - Tyrosin 3 mm

4 63 - Puffer: Na-Phosphat-Puffer 0.1 M, ph 7.0; Na-Hydrogencarbonat/Carbonat 0.1 M, ph 9.7; Na-Hydrogencarbonat/Carbonat 0.1 M, ph NaOH 0.1 M Ausführung: Vier Röhrchen beschriften und wie folgt ansetzen (Volumina in ml) und mischen: A B C D Tyrosin 3 mm Na-Phosphat ph Na-Hydrogencarbonat/Carbonat ph Na-Hydrogencarbonat/Carbonat ph NaOH 0.1 M 1 E 300 nm E (D-B bzw D-C) pk a Die Extinktion bei 300 nm von A (Blindwert) auf Null abgleichen. Die Extinktion der Proben B, C und D bestimmen und bei den Proben B und C mit Hilfe der Auswertungstabelle im bipweb den pk a - Wertes berechnen. Auswertung: Wie gross ist der Mittelwert des pk a -Wertes der Tyrosinseitenkette? Wie gross ist er im Vergleich zum pk a -Wert der α-aminogruppe von Tyrosin? Zeichnen Sie, wie Tyrosin bei ph 9.5 und 11.5 vorliegt. Bezeichnen Sie jenen Teil des Moleküls, welcher für die Absorption bei 280 nm und 300 nm verantwortlich ist. Tyrosin ph 9.5 ph 11.5

5 - Zeichnen Sie die Strukturformel der Komponenten der im obigen Experiment verwendeten Pufferlösung von ph Wie gross ist der pk a -Wert dieses Puffersystems? (bipweb Lexikon!) 64 EXPERIMENT 4.3: Gleichgewichtsverteilung von Tyrosin, der Tyrosinseitenkette (p-kresol) und Tryptophan in Butanol und Wasser Prinzip: Zwei nicht mischbare Flüssigkeitsphasen, eine wässrige und eine hydrophobe organische Phase, dienen als vereinfachtes Modell globulärer Proteine. Dabei stellt die wässrige Phase die hydrophile Proteinoberfläche und die organische Phase das hydrophobe Proteininnere dar. Mit diesem Model kann das Verhalten freier Aminosäuren und von Aminosäurenseitenketten im Proteinverband untersucht werden. Im folgenden Experiment wird die Gleichgewichtskonzentration verschiedener Substanzen in der Wasserphase und der organischen Butanolphase bestimmt. Das Verhältnis der Konzentration einer Substanz in den beiden Flüssigkeitsphasen im Gleichgewicht wird als ihr Verteilungskoeffizient K org./wässrig bezeichnet. Aus dem Verteilungskoeffizienten lässt sich die freie Energie G o' des Transfers der Substanz von Wasser in Butanol berechnen ( G o' = - R*T ln K org./wässrig ). Für den Transfer einer Aminosäure von Wasser in die organische Phase bzw. von Wasser in den hydrophoben Proteinkern gilt in Näherung G o' (Aminosäure) G o' (Glycin) + G o' (Aminosäureseitenkette). Glycin O C O O C O H C NH 3 + H C NH 3 + H CH 3 CH 2 Tyrosin p-kresol OH OH Damit sich eine Aminosäure im Proteinverband ins Proteininnere verbirgt, muss im allgemeinen die treibende freie Energie des Transfers der Seitenkette negativ sein. Damit auch die stark polaren Amidund Carbonylgruppen der Proteinhauptkette ins Innere gelangen, müssen diese durch die Ausbildung einer Sekundärstruktur Wasserstoffbindungen eingehen können und/oder mit andern Aminosäurenseitenketten eine Wasserstoffbindung ausbilden. Amid- und Carbonylgruppen bilden mit dem Wasser auch Wasserstoffbindungen, welche beim Transfer gebrochen und im Proteininneren neu gebildet werden, wodurch die Nettoenergie der Wasserstoffbindungen beim Transfer von Wasser ins Proteininnere ausgeglichen bleibt.

6 Bei 275 nm ist der millimolare Extinktionskoeffizient in der wässrigen und organischen Phase gleich gross. Der Verteilungskoeffizient der untersuchten Substanzen zwischen der organischen Butanol- Phase und der wässrigen Phase K org./wässrig kann deshalb direkt aus dem aus dem gemessenen Extinktionsverhältnis E org /E wässrig berechnet werden. 65 Lösungen: - Tyrosin 3 mm in Wasser - Tryptophan 1 mm in Wasser - p-kresol 2 mm in Wasser - Pufferlösung: Tris-HCl-Puffer 0.1 M, ph Butanol (Isobutanol) Ausführung: Nach Beendigung der folgenden Experimente, alle Butanol enthaltenden Lösungen im dafür vorgesehenen Behälter sammeln. Vier Glasröhrchen beschriften und nachstehende Lösungen zugeben (Volumina ml): Blindwert Tyrosin p-kresol Tryptophan BL A B C Pufferlösung ph Wasser Tyrosin 0.3 p-kresol 0.1 Tryptophan Butanol E 275 nm organische Phase E 275 nm wässrige Phase E org. /E wässrig 1. Röhrchen der Reihe nach je 10 Sekunden auf dem Vortexschüttler kräftig mischen, die Phasentrennung abwarten und anschliessend Röhrchen nochmals 10 Sekunden mischen und stehen lassen, bis sich die organische Phase (oben) vollständig von der wässrigen Phase (unten) getrennt

7 66 haben. 2. In vier kleine beschriftete Plastikröhrchen org.-bl, org.-a, org.-b und org. -C je 0.2 ml 2-Butanol vorlegen und genau 1.0 ml der oberen organischen Phase der Proben BL, A, B und C in die entsprechenden Röhrchen pipettieren und gut mischen (Vortex-Schüttler). Ebenso in vier w-bl, w-a, w-b und w-c beschriftete Plastikröhrchen 0.2 ml Wasser vorlegen. Mit der Plastikspitze der automatischen Pipetten vorsichtig durch die organische Phase durchstechen und 1.0 ml der unteren wässrigen Phase der Proben BL, A, B und C in die entsprechenden Röhrchen pipettieren und gut mischen (Vortex-Schüttler). 3. Inhalt von Röhrchen org.-bl in Quarzküvette giessen und Photmeter bei 275 nm auf Null abgleichen. Küvetteninhalt wieder in Röhrchen zurück giessen; Küvette nicht ausspülen, sondern umkehren und Flüssigkeitsrest mit Papiertüchlein abtupfen. Nun die Extinktion der Proben org.-a, org.-b und org.-c bei 275 nm messen und in der Tabelle festhalten. Proben in die Röhrchen zurück giessen. 4. Erst wenn alle organischen Proben gemessen sind, Küvette gut mit Wasser spülen, ausschütteln und Flüssigkeitsrest mit Papiertüchlein abtupfen. In der gleichen Weise mit dem Blindwert der wässrigen Phase w-bl das Photometer erneut auf Null einstellen und anschliessend die Probe ins Röhrchen zurück giessen. Extinktion der Proben w-a, w-b und w-c bestimmen und in der Tabelle festhalten. Zwischen den Messungen Küvette nicht ausspülen, sondern erst nach Beendung der Messungen! Auswertung: Bei 275 nm ist der millimolare Extinktionskoeffizient der untersuchten Substanzen in der wässrigen und organischen Phase gleich gross. Somit lässt sich der Verteilungskoeffizient K org./wässrig, welcher das Verhältnis der Konzentration in der organische Phase zur Konzentration in der wässrigen Phase ist, direkt als E org. /E wässrig bestimmen. Die Werte der Verteilungskoeffizienten tabellarisch in die nachstehende Zusammenstellung eintragen. Formeln von Tyrosin bei ph 1 und 8 sowie von Tyrosinmethylester aufzeichnen. Formeln: Glycin p-kresol ph 8 (B) Tyrosin ph 8 (A) Tyrosin ph 1 Tyrosinmethylester ph 8 Tryptophan ph 8 (C) Cystein K org./wässrig Ordnen Sie die K org./wässrig obiger Substanzen in aufsteigender Reihenfolge.

8 67 - Weshalb ist von den obigen Substanzen der Wert K org./wässrig von Glycin am kleinsten? Erklären Sie die Reihenfolge K org./wässrig von Tyrosin ph 8 < Tyrosin ph 1 < Tyrosin-methylester ph 8 < p-kresol ph 8? - Aminosäuren können in hydrophile und hydrophobe Aminosäuren eingeteilt werden. Wenn auf einer relativen Skala der Hydrophobizität Glycin der Wert 0 zugeordnet wird, wie sind dann bei neutralem ph-wert Tyrosin, Cystein, Tryptophan sowie Valin, Leucin, Asparaginsäure und Lysin einzustufen (Werte negativ, 0 oder positiv)? EXPERIMENT 4.4: Löslichkeit von Serumalbumin Es wird die Löslichkeit von nativem und hitzedenaturiertem Serumalbumin untersucht. Proteine mit vielen geladenen Seitenketten sind meist gut wasserlöslich. Die Löslichkeit eines Proteins ist am geringsten, wenn seine Nettoladung Null ist. Dies ist der Fall, wenn das Molekül gleich viele positive wie negative Ladungen trägt. Der ph-wert der wässrigen Lösung, bei dem dies zutrifft, entspricht dem isoelektrischen Punkt (IEP) des Proteins. Manche Proteine fallen am IEP aus (= werden unlöslich). Bei ph-werten über und unter dem IEP bewirken negative bzw. positive Überschussladungen gegenseitige Abstossung der Proteinmoleküle und damit bessere Löslichkeit. Denaturierung verringert in der Regel die Löslichkeit der Proteine. Proteinfällungsreagenzien wie Perchlorsäure, Trichloressigsäure fällen Proteine und Peptide quantitative aus (einfacher Proteinnachweis; Deproteinisierung von Proben in Röhrchen E und F, aber nicht in G!). Lösungen: - Serumalbuminlösung (5 mg/ml) M NaOH; 1 % Essigsäure; 100 % Essigsäure; 0.33 M Perchlorsäure; 0.2 M Trichloressigsäure; 0.3 M HCl Sieben Glasröhrchen beschriften und folgende Lösungen zugeben (ml bzw. Tropfen mit Pasteurpipette):

9 68 A B C D E F G Serumalbuminlösung (ml) M NaOH - 3 Tr % Essigsäure Tr % Essigsäure (ml) M Perchlorsäure (ml) M Trichloressigsäure (ml) M HCl (ml) ph (mit ph-indikatorpapier abschätzen): Ausfällung RG A bis D während 5 min ins siedende Wasserbad stellen. Ausfällung Die Löslichkeit von Serumalbumin wird unter den verschiedenen Bedingungen beobachtet (bei verschiedenen ph-werten nativ und hitzedenaturiert). Ausmass der Ausfällung abschätzen (0 bis +++) und in der Tabelle notieren. Erklären Sie die beobachteten Resultate! - Wie lässt sich nachweisen, ob und wieviel Serumalbumin in Röhrchen A-D nach der Hitzedenaturierung noch in Lösung ist? - Wie wird die Löslichkeit eines Proteins bei gegebenen Bedingungen bestimmt und angeben?

10 69 PLATZ 6: EIGENSCHAFTEN VON LIPIDEN, BIOLOGISCHEN MEMBRANEN Physikalisch-chemische Eigenschaften wie Löslichkeit und Micellenbildung von Lipiden sowie die Lipidkomponenten der Erythrozytenzellmembran werden demonstriert. Die toxische Wirkung freier Fettsäuren und von Detergenzien an Lipidmembranen wird am Beispiel von Erythrozyten nachgewiesen. Vorbereitung: Denaturierung und Löslichkeit von Proteinen (S.15) Lipide (S. 16) Biologische Membranen (S. 18) Chromatographie (S ) Photometrie (S. 31) Bezug zu anderen Plätzen: Bestimmung von Cholesterin im Serum und in Lipoproteinen (2. Studienjahr, Platz 5) EXPERIMENT 6.1: Lipidzusammensetzung der Erythrozytenzellmembran Im folgenden Experiment werden die Lipidkomponenten der Erythrozytenzellmembran untersucht. Lösungen/Material: 1. Pferdeblut, bereits in Plasma und Erythrozyten getrennt. Die EC sind bereits durch dreimaliges Waschen mit isotoner NaCl-Lösung von Plasmaresten befreit worden. 2. Chloroform; Essigsäure 2% in Methanol. 3. Lösungsmittel: Chloroform/Methanol 2:1 (vol/vol) 4. Laufmittel für Dünnschichtchromatographie A: Petrolether/Aethylether/Ameisensäure (60/40/1) Laufmittel für Dünnschichtchromatographie B: Chloroform/Methanol/Wasser: 65/25/4. Die Mischungen sind bereits in verschliessbare Chromatographiegefässe eingefüllt. 5. Referenzsubstanzen: (je 2 mg/ml in Chloroform/Methanol, 2:1 gelöst) Phosphatidylcholin=PC, Phosphatidylethanolamin=PE, Sphingomyelin=SL, Cholesterin=Ch, Cholesterinester(Oleat)=ChE, Triacylglycerin=TG, Ölsäure=FS. 6. Jodkristalle in verschlossenem Tank (Jodgas-Atmosphäre) Lipidextraktion: Ein Plastikröhrchen, welches gegenüber organischen Lösungsmitteln inert ist, enthält bereits 1.0 ml Erythrozyten. Diese sowie ein weiteres Plastikröhrchen beschriften und die Extraktionsanleitung

11 70 befolgen: Plastikröhrchen EC Blindwert zur Ausbalancierung bei der Zentrifugation EC-Lösung bzw. Wasser 1.0 ml 1.0 ml Wasser Essigsäure 2% in Methanol zugeben 3.6 ml 3.6 ml dicht verschliessen und auf Vortex 10 Sekunden gut mischen Chloroform zugeben (Gummiballon benützen) 3.6 ml 3.6 ml dicht verschliessen und auf Vortex 10 Sekunden schütteln. Wasser zugeben 2.0 ml 2.0 ml dicht verschliessen und auf Vortex mind. 30 Sekundenschütteln. Durch dieses Vorgehen werden alle Lipide extrahiert, die noch von den im organischen Lösungsmittel unlöslichen Substanzen abgetrennt werden müssen. Dies geschieht durch Zugabe von Wasser, wobei zwei Flüssigkeitsphasen entstehen, die nicht miteinander mischbar sind. Nur Lipide bleiben in der organischen Phase und lassen sich von Proteinen, die ausfallen und sich in der Grenzschicht zwischen den beiden Flüssigkeitsphasen ansammeln, und von wasserlöslichen Substanzen abtrennen. Anschliessend 5 Minuten bei 2400 Umdrehungen/min zentrifugieren. Die untere, organische Flüssigkeitsphasen der EC-Probe mit Hilfe einer Pasteurpipette abtrennen (Chloroform ist schwerer als Wasser). Gummihütchen auf Pasteurpipette aufsetzen, Hütchen pressen und vorsichtig entlang der Gläschenwandung (leicht schief halten) durch das Material an der Interphase durchstechen, auf den Boden des Gläschens vordringen und die untere Flüssigkeitsphase möglichst vollständig aufsaugen und in ein beschriftetes Gläschen mit Schraubdeckel überführen. Das organische Lösungsmittel in der Kapelle im Luftstrom verdampfen lassen (Wird durch die Co- Assistierenden durchgeführt). Sobald die Probe eingedampft ist, wird ins Gläschen 0.5 ml Chloroform/ Methanol 2:1 zugegeben, mit dem Schraubdeckel verschlossen und auf dem Vortex kräftig geschüttelt. Das Lösungsmittel wird erneut im Luftstrom verdampft. Auftrennung und Nachweis der extrahierten Lipide durch Dünnschichtchromatographie Die Auftrennung der Lipide erfolgt durch Dünnschichtchromatographie (DC) mit Kieselgelplätchen und zwei verschiedenen Laufmittelsystemen. Die Identifizierung der aufgetrennten Lipide erfolgt mittels Referenzsubstanzen dienen. In beiden Trennsystemen wandern die Lipide um so langsamer, je polarer sie sind. Mit Laufmittelsystem A werden die Lipide in die verschiedenen Lipidklassen aufgetrennt, während die Auftrennung der Phospholipide separat mit Laufmittelsystem B durchgeführt wird.

12 71 Vorgehen: Zu den extrahierten, eingedampften Membranlipiden gibt man 0.2 ml Chloroform/Methanol 2:1 und das Gläschen wird dicht verschlossen. Die Lipide durch langsames Drehen und vorsichtiges Schütteln der Gläschen lösen. Auf vier DC-Platten mit Bleistift eine Linie im Abstand von 0.5 cm vom unteren Rand als Auftragungsort fein markieren. Pro DC-Platte vier Punkte als Auftragungsort wie beim aufgestellten Muster mit Bleistift markieren. Zuerst mit der Auftrennung der Phospholipide beginnen, da die chromatographische Auftrennung der Phospholipide (Laufmittelsystem B) etwas mehr Zeit braucht als die Auftrennung in die Lipidklassen. Auftrennung der Phospholipide (Trennsystem B) Zwei DC-Plätchen am oberen Rand B1, B2 beschriften und nach dem angegebenen Schema mit Glaskapillaren (jedesmal frische Kapillare verwenden!) die angegebenen Mengen portionenweise als möglichst kleiner Fleck auftragen (vom Kieselgel aufsaugen lassen, dazwischen das Lösungsmittel durch Blasen verdampfen lassen). DC-Platten: B1 B2 Bahn Probe B1 B2 B3 B* (PE) (PC) (SL) (Gemisch) Vol (µl) EC- EC- Gemisch Extrakt Extrakt B* A* Abkürzungen siehe unter "gelöste Referenzsubstanzen" (Lösungen/Material) B*: Gemisch von Standards B1 - B3 (=PE, PC, SL) A*: Gemisch der Standards A1-A4 (=ChE, TG, FS, Ch), siehe unten Zur Auftrennung DC-PLatten B1 und B2 zusammen in das Chromatographiegefäss mit Laufmittel B stellen und wenn die Laufmittelfront annähernd den oberen Rand erreicht hat, die DC-Platten herausnehmen, Laufmittelfront mit Bleistift markieren und in der Kapelle trocknen lassen. Auftrennung in Lipidklassen (Trennsystem A; Phospholipide und Sphingolipide bleiben am Auftragungsort.) Zwei DC-Plätchen am oberen Rand A1, A2 beschriften und nach dem angegebenen Schema mit Glaskapillaren (jedesmal frische Kapillare verwenden!) die angegebenen Mengen portionenweise als möglichst kleiner Fleck auftragen (vom Kieselgel aufsaugen lassen, dazwischen das Lösungsmittel durch Blasen verdampfen lassen).

13 72 DC-Platten: A1 A2 Bahn Probe A1 A2 A3 A4 (ChE) (TG) (FS) (Ch) Vol (µl) EC- EC- Gemisch Extrakt Extrakt A* B* A*: Gemisch der Standards A1-A4 (=ChE, TG, FS, Ch) B*: Gemisch von Standards B1 - B3 (=PE, PC, SL), siehe oben Die Auftrennung erfolgt analog mit Laufmittel A (siehe unter B). Wenn die Laufmittelfront annähernd den oberen Rand erreicht hat, die DC-Platten herausnehmen, Laufmittelfront mit Bleistift markieren und in der Kapelle trocknen lassen. Anfärbung: Trockene Platten einer Atmosphäre mit Jodgas aussetzen (Jodkristalle in geschlossenem Tank, in Kapelle), bis Lipidflecken gut sichtbar sind (ca. 5 min). Platten aus dem Tank nehmen und Position der Flecken mit Bleistift fein markieren, da die Reaktion reversibel ist und die Färbung nach kurzer Zeit wieder verschwindet. Intensität der Flecken abschätzen und notieren (+ bis ++++). Der Nachweis mit Jod ist qualitativ und färbt nur Lipide an, welche eine Kohlenstoff-Doppelbindung enthalten. Die Menge Lipide kann durch Anfärben mit Molybdänblau abgeschätzt werden. Dazu DC- Platten in Kapelle mit Molybdänblau kurz besprühen (ca. 30 cm Abstand) und im Luftstrom des Föhn ca. 3 min. erhitzen (Föhn im Abstand von ca. 1 cm von DC-Platten halten). Aufgrund der Färbung die relativen Mengen der Lipidkomponenten in der EC-Membran abschätzen. Phosphatidylserin ist äusserst instabil und wird nicht nachgewiesen. Es kommt in der Erythrozytenmembran in geringer Menge vor. Das hauptsächliche Abbauprodukt wandert auf der DC- Platte wie Phosphatidylethanolamin. - Welche Lipide, die in Standardlösungen vorhanden sind, lassen sich in der Plasmamembran nicht nachweisen? - Wodurch wird die Fluidität der Lipid-Membran bestimmt? Wie kann die Fluidität von Lipidmembranen gewährleistet werden in Kaltblütern, z.b in Fischen, die in kaltem Wasser leben? - Die Diffusion von Lipidmolekülen in der Lipidmembran ist recht gross, im Mittel etwa 2 µm pro Sekunde. Welche Bewegung können Phospholipidmoleküle nicht durchführen? (Asymmetrie!)

14 73 EXPERIMENT 6.2: Löslichkeit der Lipide Freie Fettsäuren: Eine Spatelspitze Na-Stearat (Seife) unter leichtem Erwärmen in ca. 6 ml Wasser auflösen und zu gleichen Teilen in 3 Glasröhrchenverteilen. Es bilden sich Micellen (siehe Exp. 6.4). Bei hoher Konzentration der Micellen können sie sich zu grösseren Gebilden zusammen lagern, wodurch die Lösung trüb wird. Zum Gemisch eines der Glasröhrchen mit Pasteurpipette etwas verdünnte H 2 S0 4 zusetzen. Freie Fettsäure fällt aus. Nun das gleiche Volumen (ca. 2 ml) Chloroform zugeben und gut mischen. Es entstehen zwei nichtmischbare Phasen. Der Niederschlag löst sich in der Chloroform- Phase. Weshalb? Dieser Vorgang wird in der Lipidextraktion in Exp. 6.2 angewandt. Schwerlösliche Salze von Fettsäuren: Zu den restlichen zwei Glasröhrchen einige Tropfen einer Lösung von CaCl 2 oder BaCl 2 zusetzen. Es tritt Fällung ein: Ca- und Ba-Salze der Fettsäuren sind schwerlöslich. Triacylglycerine: In 3 Glasröhrchen (A,B,C) je 2 Tropfen Olivenöl geben. Zu (A) 2 ml H 2 0, zu (B) 2 ml 20 % Natriumcholat-Lösung und zu (C) 2 ml Chloroform zufügen. Die 3 Glasröhrchen kräftig schütteln und Löslichkeit vergleichen. Wichtig: Nach Beendigung, alle Chloroform enthaltenden Lösungen im dafür vorgesehenen Behälter sammeln. - Welche physikalisch-chemischen Konstanten bestimmen, ob Fettsäuren als Calciumsalze (Kalkseifen) ausfallen? - Im Blut beträgt die Konzentration von Fettsäuren ungefähr 1 mm und die Konzentration von Ca 2+ ungefähr 2.5 mm. Bei diesen Konzentrationen tritt im Reagenzglas Ausfällung ein. Wieso geschieht dies nicht im Blut? - Welche Produkte entstehen bei der alkalischen Hydrolyse (Verseifung) von Olivenöl? - Weitere typische unpolare Lipide sind Wachse, z.b. die folgende Verbindung: Welche Produkte entstehen bei der alkalischen Hydrolyse dieses Wachses? Wie lassen sich die Produkt sichtbar nachweisen (Exp. 6.1!)

15 74 EXPERIMENT 6.3: Lyse von Erythrozyten mit Seife und Na-Dodecylsulfat (SDS) Prinzip: Fettsäuren und viele amphiphile Lipide sind potentielle Gifte. Sie lagern sich in Lipidmembranen ein und zerstören die Membranstruktur. Dadurch bilden sich sogenannte gemischte Micellen, welche nebst dem Hauptbestandteil an Fettsäuren oder einem Detergens wie SDS auch eine Anzahl Moleküle der Lipidmembran enthalten. Je mehr Lipidmembranen vorhanden sind, desto mehr Fettsäuren oder SDS werden für die Zellauflösung (Lyse)benötigt, was im folgenden Experiment gezeigt wird. Lösungen: Na-Stearat, 1 mm in Wasser SDS (0.12 %), 0.42 mm in Wasser NaCl 1.8 % (doppelt physiologische Konzentration) EC: Erythrozytensuspension in NaCl 0.9 % (physiologische Kochsalzlösung). Die Erythrozyten wurden in NaCl gewaschen, durch Zentrifugation gepackt und 1:8 (vol/vol) in NaCl-Lösung suspendiert. Ausführung: Nach Anleitung der Assistierenden führt ein Teil der Studierenden Versuch A mit Na-Stearat und ein Teil der Studierenden Versuch B mit SDS durch; Resultate gegenseitig austauschen! A: In 8 beschriftete kleine Plastikröhrchen die folgenden Lösungen mit verstellbaren Pipetten zugeben (Volumina in µl): NaCl 1.8 % (µl) Wasser (µl) Na-Stearat 1 mm (µl) Gut mischen, anschliessend EC zugeben. EC (µl) Deckfarbene Durchsichtigkeit (+++ bis -) E 540 nm

16 1. Nach Zugabe der EC alle Proben sanft mischen und beurteilen, ob sich die Durchsichtigkeit der Proben (deckfarbene Durchsicht) ändert und Resultat in der Tabelle festhalten. Durch teilweise oder vollständige Lyse der Erythrozyten wird Licht weniger oder gar nicht mehr gestreut, die Proben werden durchsichtig (lackfarbene Durchsichtigkeit). 2. Alle Röhrchen für 3 Minuten zentrifugieren (Maximale Umdrehungszahl), Grösse des Niederschlags beurteilen und in der Tabelle festhalten. 3. Das Ausmass der Lyse wird durch Messung der Extinktion des freigesetzten Hämoglobins im Überstand bei 540 nm gegen Wasser als Blindwerte bestimmt. Extinktionen in die Tabelle eintragen und als Funktion der zugegebenen Menge Na-Stearat in der Auswertungstabelle im bipweb aufzeichnen. Resultate gegenseitig austauschen! Bestimmen Sie, ab welcher Konzentration Na-Stearat unter den verwendeten Bedingungen Erythrozyten zerstören. Frage zu diesem Experiment anschliessend an Experiment B. 75 B: NaCl 1.8 % (µl) Wasser (µl) SDS 0.42 mm (µl) Gut mischen, anschliessend EC zugeben. EC (µl) Deckfarbene Durchsichtigkeit (+++ bis -) E 540 nm 1. Nach Zugabe der EC alle Proben sanft mischen und beurteilen, ob sich die Durchsichtigkeit der Proben (deckfarbene Durchsicht) ändert und Resultat in der Tabelle festhalten. Durch teilweise oder vollständige Lyse der Erythrozyten wird Licht weniger oder gar nicht mehr gestreut, die Proben werden durchsichtig (lackfarbene Durchsichtigkeit). 2. Alle Röhrchen für 3 Minuten zentrifugieren (Maximale Umdrehungszahl), Grösse des Nieder-

17 76 schlags beurteilen und in der Tabelle festhalten. 3. Das Ausmass der Lyse wird durch Messung der Extinktion des freigesetzten Hämoglobins im Überstand bei 540 nm gegen Wasser als Blindwerte bestimmt. Extinktionen in die Tabelle eintragen und als Funktion der zugegebenen Menge SDS der Auswertungstabelle im bipweb aufzeichnen. Resultate gegenseitig austauschen! Bestimmen Sie, ab welcher Konzentration SDS unter den verwendeten Bedingungen Erythrozyten zerstören. - Im Blutplasma ist die Konzentration von Fettsäuren ungefähr 1 mm. Wieso bleiben Erythrozyten im Blut intakt?

18 77 PLATZ 16: ENZYMKINETIK, STOFFWECHSELREAKTIONEN, EIGENSCHAFTEN VON ZUCKERN Einblick in den Mechanismus einer Enzymreaktion gewinnt man aus der Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit v von der Substratkonzentration [S] (Exp. 16.1), vom ph-wert (Exp. 16.2), von der Temperatur, der Ionenstärke usw. Unsere heutigen Kenntnisse über den Reaktionsmechanismus von Enzymen basieren auf solchen kinetischen Untersuchungen und auf Daten über die Raumstruktur der Enzyme (vgl. Chymotrypsin, Platz 10, 2. Studienjahr). Die hier untersuchten Phosphatasen zeigen geringe Substratspezifität. Ihre natürlichen Substrate sind Phosphatester wie AMP, Zuckerphosphate usw. Für kinetische Untersuchungen eignen sich auch künstliche Substrate, so der hier verwendete synthetische p-nitrophenylphosphatester. Das bei der Hydrolyse dieses Esters freiwerdende p-nitrophenol kann im alkalischen ph-bereich als gelbes p- Nitrophenolat-Anion bei 405 nm photometrisch bestimmt werden. Saure Phosphatasen kommen in Leukozyten, in der Prostata und in Osteoklasten vor. Alkalische Phosphatasen findet man im Darm, in der Leber, in Nierentubulus-Zellen und in Osteoblasten. Beim Mensch sind mehrere Isoenzyme der alkalischen Phosphatase als auch der sauren Phosphatase bekannt. Die Isoenzyme kommen teilweise in unterschiedlichen Zellen vor. Einige der Isoenzyme können getrennt nachgewiesen werden. Aktivitätsmessung dieser Enzyme im Blut hat eine grosse diagnostische Bedeutung und gehört zu den häufig durchgeführten Laboruntersuchungen in der Medizin. Theoretische Grundlagen: Enzymreaktionen S Photometrie S. 31 Kohlenhydrate S.7 Benedictsche Probe S. 9 Bezug zu anderen Plätzen: Titrationskurven von Aminosäuren, Exp Studienjahr: Aktivität und Substratspezifität von Alkoholdehydrogenase, Exp. 1.7 Aktivität von Kreatinkinase, Exp. 1.8 EXPERIMENT 16.1: Bestimmung von K m und V max der sauren Phosphatase, Wirkung von Inhibitoren Prinzip: Für die Bestimmung von K m und V max wird die Reaktionsgeschwindigkeit bei verschiedenen Substratkonzentrationen gemessen. Temperatur, ph und Enzymkonzentration werden konstant ge-

19 halten. Die Substratkonzentration wählt man gewöhnlich zwischen dem 0.1-fachen und 10-fachen des mutmasslichen K m -Wertes. Die in diesem Versuch verwendeten Konzentrationen sind so gewählt, dass ihre Werte über den Messbereich vernünftig verteilt sind. In Exp B und C wird K m und V max in Anwesenheit von Natriumorthovanadat oder NaF bestimmt und beurteilt, ob diese Substanzen kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren der sauren Phosphatase sind. Je eine Gruppe Studierender führt entweder Exp A, oder B oder C durch; anschliessend gibt jede Gruppe ihr Resultate in die gemeinsame Auswertetabelle ein, sodass am Ende alle Teilnehmenden alle Werte und die 3 Michaelis-Menten-Kurven ausdrucken können. Die Frage, die sich am Ende des Exp befindet, soll von allen Gruppen beantwortet werden! 78 A: Ohne Inhibitor Lösungen: Na-Acetatpuffer (0.2 M), ph 5.0 Saure Phosphatase aus Kartoffeln (11 µg/ml) p-nitrophenylphosphat (30 mm); p-nitrophenylphosphat (3 mm); p-nitrophenylphosphat (0.5 mm) NaOH (0.25 M). Ausführung: Folgende Inkubationsansätze vorbereiten: A B C D E F G H I Puffer µl Substrat, 30 mm µl Substrat, 3 mm µl Substrat, 0.5 mm µl Wasser µl RG A bis I mischen und ins 40EC-Wasserbad stellen. In einem weiteren RG ca. 2 ml des Enzyms ebenfalls ins 40EC-Wasserbad stellen. Nach 5 min in genau 0.5-minütigen Abständen je 0.2 ml des vorgewärmten Enzyms zu den Proben A - I geben. Nach 15 min bei 40EC (d.h. 15 min nach der Zugabe von Enzym) 3.4 ml NaOH aus automatischer Pipette wiederum in genau 0.5-minütigen Abständen zu den Proben A - I geben. Extinktionen bei 405 nm gegen Probe I (= Blindwert) ablesen und Werte in untenstehende Tabelle eintragen. Daraus die Konzentration des Produktes, [P] in den Inkubationsansätzen berechnen (Volumen = 0.6 ml). Der Extinktionskoeffizient des p-nitrophenolat- Anions, ε 405, beträgt 18.4 mm -1 cm -1. Unter Annahme, dass die Reaktionsgeschwindigkeit v während der 15-minütigen Inkubationsdauer konstant geblieben ist, Werte für den Umsatz pro Minute (= v)

20 79 berechnen. Probe [S] (mm) E 405 [P] (mm) v (mm min -1 ) A 10 *) *) B 4 C 2 D 1 E 0.75 F 0.50 G 0.25 H *) Werte berechnen und in der Tabelle festhalten. Für die graphische Darstellung der Resultate steht im bipweb eine Auswertehilfe zu Exp zur Verfügung. Falls der Zugang zu bipweb für Sie nicht möglich ist, alle Resultate auf Millimeterpapier aufzeichnen! Resultate in die Auswertungsvorlage Exp im bipweb eingeben. Das in der Auswertungsvorlage verwendete Programm berechnet aus den Messwerten die am besten angepasste Michaelis-Menten- Kurve (Hyperbolische Anpassung). Damit erhält man die Werte für V max und K m, welche mit den Werten in Exp. B und C verglichen werden sollen. Die molekulare Aktivität (min -l ) des Enzyms bezogen auf eine Molekularmasse von 100'000 Da berechnen. B: Mit Natriumorthovanadat (Na 3 VO 4 ; Inhibitor) Lösungen: Na-Acetatpuffer (0.2 M), ph 5.0 Na-Vanadat (Na 3 VO 4 ) 6 mm) in Na-Acetatpuffer ph 5.0 Saure Phosphatase aus Kartoffeln (11 µg/ml) p-nitrophenylphosphat (30 mm); p-nitrophenylphosphat (3 mm); p-nitrophenylphosphat (0.5 mm) NaOH (0.25 M). Ausführung: Folgende Inkubationsansätze vorbereiten:

21 80 A B C D E F G H I Puffer µl Na-Vanadat, 6 mm µl Substrat, 30 mm µl Substrat, 3 mm µl Substrat, 0.5 mm µl Wasser µl RG A bis I mischen und ins 40EC-Wasserbad stellen. In einem weiteren RG ca. 2 ml des Enzyms ebenfalls ins 40EC-Wasserbad stellen. Nach 5 min in genau 0.5-minütigen Abständen je 0.2 ml des vorgewärmten Enzyms zu den Proben A - I geben. Nach 15 min bei 40EC (d.h. 15 min nach der Zugabe von Enzym) 3.4 ml NaOH aus automatischer Pipette wiederum in genau 0.5-minütigen Abständen zu den Proben A - I geben. Extinktionen bei 405 nm gegen Probe I (= Blindwert) ablesen und Werte in untenstehende Tabelle eintragen. Daraus die Konzentration des Produktes, [P] in den Inkubationsansätzen berechnen (Volumen = 0.6 ml). Der Extinktionskoeffizient des p-nitrophenolat- Anions, ε 405, beträgt 18.4 mm -1 cm -1. Unter Annahme, dass die Reaktionsgeschwindigkeit v während der 15-minütigen Inkubationsdauer konstant geblieben ist, Werte für den Umsatz pro Minute (= v) berechnen. Probe [S] (mm) E 405 [P] (mm) v (mm min -1 ) A 10 *) *) B 4 C 2 D 1 E 0.75 F 0.50 G 0.25 H *) Werte berechnen und in der Tabelle festhalten. Für die graphische Darstellung der Resultate steht im bipweb eine Auswertehilfe zu Exp zur Verfügung. Falls der Zugang zu bipweb für Sie nicht möglich ist, alle Resultate auf Millimeterpapier aufzeichnen!

22 Resultate in die Auswertungsvorlage Exp im bipweb eingeben. Das in der Auswertungsvorlage verwendete Programm berechnet aus den Messwerten die am besten angepasste Michaelis-Menten- Kurve (Hyperbolische Anpassung). Damit erhält man die apparenten Werte für V max und K m. Die apparente molekulare Aktivität (min -l ) des Enzyms bezogen auf eine Molekularmasse von 100'000 Da berechnen. 81 C: Mit NaF (Inhibitor) Lösungen: Na-Acetatpuffer (0.2 M), ph 5.0 NaF (2.4 mm) in Na-Acetatpuffer ph 5.0 Saure Phosphatase aus Kartoffeln (11 µg/ml) p-nitrophenylphosphat (30 mm); p-nitrophenylphosphat (3 mm); p-nitrophenylphosphat (0.5 mm) NaOH (0.25 M). Ausführung: Folgende Inkubationsansätze vorbereiten: A B C D E F G H I Puffer µl NaF, 2.4 mm µl Substrat, 30 mm µl Substrat, 3 mm µl Substrat, 0.5 mm µl Wasser µl RG A bis I mischen und ins 40EC-Wasserbad stellen. In einem weiteren RG ca. 2 ml des Enzyms ebenfalls ins 40EC-Wasserbad stellen. Nach 5 min in genau 0.5-minütigen Abständen je 0.2 ml des vorgewärmten Enzyms zu den Proben A - I geben. Nach 15 min bei 40EC (d.h. 15 min nach der Zugabe von Enzym) 3.4 ml NaOH aus automatischer Pipette wiederum in genau 0.5-minütigen Abständen zu den Proben A - I geben. Extinktionen bei 405 nm gegen Probe I (= Blindwert) ablesen und Werte in untenstehende Tabelle eintragen. Daraus die Konzentration des Produktes, [P] in den Inkubationsansätzen berechnen (Volumen = 0.6 ml). Der Extinktionskoeffizient des p-nitrophenolat- Anions, ε 405, beträgt 18.4 mm -1 cm -1. Unter Annahme, dass die Reaktionsgeschwindigkeit v während der 15-minütigen Inkubationsdauer konstant geblieben ist, Werte für den Umsatz pro Minute (= v)

23 82 berechnen. Probe [S] (mm) 1/[S] (mm -1 ) E 405 [P] (mm) v (mm min -1 ) 1/v (mm -1 min) A *) *) *) B C D 1 1 E F G H *) Werte berechnen und in der Tabelle festhalten. Für die graphische Darstellung der Resultate steht im bipweb eine Auswertehilfe zu Exp zur Verfügung. Falls der Zugang zu bipweb für Sie nicht möglich ist, alle Resultate auf Millimeterpapier aufzeichnen! Resultate in die Auswertungsvorlage Exp im bipweb eingeben. Das in der Auswertungsvorlage verwendete Programm berechnet aus den Messwerten die am besten angepasste Michaelis-Menten- Kurve (Hyperbolische Anpassung). Damit erhält man die apparenten Werte für V max und K m. Die apparente molekulare Aktivität (min -l ) des Enzyms bezogen auf eine Molekularmasse von 100'000 Da berechnen. Frage zu Exp Wie gross ist die Dissoziationskonstante K d des Enzymsubstrat-Komplexes im Vergleich zu K m (In Abwesenheit eines Inhibitors, siehe Theorieteil)? - Zu welcher Klasse von Inhibitoren gehören Na 3 VO 4 und NaF? EXPERIMENT 16.2 ph-abhängigkeit der sauren und alkalischen Phosphatase Prinzip: Saure und alkalische Phosphatasen katalysieren beide die hydrolytische Spaltung von Phosphatestern, unterscheiden sich aber durch ihr ph-optimum und den Mechanismus der Spaltung. Im folgenden Experiment wird die ph-abhängigkeit der durch die beiden Enzyme katalysierten Hydrolyse von

24 p-nitrophenylphosphat verglichen. Der Phosphatester wird bei verschiedenen ph-werten mit saurer bzw. alkalischer Phosphatase inkubiert. Die Reaktion wird am Ende der Inkubationszeit durch Zugabe von NaOH abgebrochen. Die enzymatische Aktivität wird durch photometrische Bestimmung des freigesetzten p-nitrophenols ermittelt. Lösungen: - Saure Phosphatase (aus Kartoffeln, 30 µg/ml); alkalische Phosphatase (aus Kälberdarm, 0.02 mg/ml) - Substrat = p-nitrophenylphosphat (10 mm) - NaOH, 0.25 M. - Pufferlösungen (0.1 M): ph 2, HCl-Glycin; ph 4 und ph 5, Essigsäure-Natriumacetat; ph 6, HCl- Histidin; ph 8, HCl-Tris; ph 10, Natriumbicarbonat-Natriumcarbonat; ph 12, Arginin-KOH. 83 Ausführung: 3 Reihen von je 7 RG für saure Phosphatase (A), alkalische Phosphatase (B) und Blindwert (C) vorbereiten und nach folgendem Schema beschriften: ph 2 ph 4 ph 5 ph 6 ph 8 ph 10 ph 12 Reihe A Reihe B (saure Phosphatase) (alkalische Phosphatase) Reihe C (Blindwert) In jedes RG 0.2 ml Substrat pipettieren. Nach obenstehendem Schema je 0.2 ml der entsprechenden Pufferlösung zugeben. Alle Röhrchen zum Vorwärmen ins 40EC-Wasserbad stellen. Daneben in 3 entsprechend markierten Röhrchen 2 ml saure Phosphatase, 2 ml alkalische Phosphatase sowie 2 ml bidestilliertes Wasser (für Blindwerte) ebenfalls vorwärmen. Nach 5 Minuten der Reihe nach in genau 0.5-minütigen Abständen je 0.2 ml vorgewärmte saure Phosphatase zu den Proben der Reihe A geben. Anfangszeit registrieren. In gleicher Weise in 0.5-minütigen Abständen zu den Proben der Reihe B je 0.2 ml vorgewärmte alkalische Phosphatase und zu den Proben der Reihe C (Blindwerte) je 0.2 ml vorgewärmtes Wasser zugeben. Jede Probe genau 15 Minuten ins 40EC-Wasserbad stellen. Reaktion durch Zugabe von 3.4 ml NaOH (automatische Pipette) zu jedem RG in der gleichen Reihenfolge wie oben in genau 0.5-minütigen Abständen abbrechen. Extinktionen aller Proben von Reihe A und B gegen C als Blindwert bei 405 nm ablesen, in Tabelle festhalten und in die Auswertungsvorlage im bipweb eingeben( bzw. auf Millimeterpapier graphisch

25 84 darstellen, falls der Zugang zu bipweb nicht verfügbar ist). - Die experimentell erhaltene Kurve hat eine Form, die an zwei Säure-Basen-Titrationskurven von Aminosäureseitenketten erinnert (vgl. Exp. 4.2). Aus der ph-abhängigkeit der Enzymaktivität erhält man Hinweise auf mögliche funktionelle Aminosäureseitenketten, die für die Enzymaktivität notwendig sind. Welche Seitenketten könnten für die ph-optima der beiden Phosphatasen verantwortlich sein? Welche Ladung tragen diese Seitenketten im aktiven Enzymmolekül? Welche andere nicht zum Enzym gehörende funktionelle Gruppe könnte für eine ph-abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit auch verantwortlich sein, und in welchem ph-bereich? EXPERIMENT 16.3: Alkoholische Gärung Prinzip: Hefe vergärt Saccharose zu Ethanol und CO 2. Die Gasbildung wird in speziell geformten "Gärröhrchen" nachgewiesen. Jodessigsäure hemmt die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase. Das Cyanidanion hemmt die Cytochromoxidase. Das Fluoridanion hemmt die Enolase. Wie sich diese Inhibitoren auf die Gasbildung auswirken wird im folgenden Experiment gezeigt. Überlegen Sie sich im voraus welches Resultat Sie erwarten. Lösungen: Saccharose in Wasser (1%); Saccharose (1%) in NaF (50 mm); Hefesuspension in Wasser (60 Gew.%); KCN (10 mm); Jodessigsäure (l M). Ausführung: 4 RG und 4 Gärröhrchen numerieren. Die RG gemäss untenstehendem Schema beschicken. Inhalt mischen und unter Vermeidung von Luftblasen in Gärröhrchen einfüllen. Resultate nach Minuten festhalten. Saccharose 1% (ml) NaF 50mM, Sacharose 1% (ml) Hefesuspension (ml) KCN 10 mm - 3 Tr. - - Jodessigsäure 1 M (ml) Gasbildung

26 85 Achtung: KCN ist stark giftig! (DL 50 bei der Ratte ist 10 mg/kg Körpergewicht.) In Kontakt mit Säuren entsteht flüchtige Blausäure HCN. Fläschchen nach Gebrauch sofort wieder verschliessen und in Behälter zurückstellen. S Welches Gas wird freigesetzt? Bei welcher Reaktion wird es freigesetzt? S Weshalb wird im anaerob arbeitenden Muskel Glucose zu Milchsäure und nicht zu Ethanol abgebaut? S Weshalb ist Cyanid für Mensch und Tier jedoch nicht für Hefe ein tödliches Gift? Welche Stoffwechselkette wird durch Cyanid blockiert? S Wo spielt Fluorid eine wichtige Rolle im täglichen Leben? Weshalb? EXPERIMENT 16.4: Umwandlung von Zuckern, Nachweis reduzierender Zucher Zucker liegen in Lösung vorwiegend in zyklischer Form vor (S. 7). Sie stehen jedoch im Gleichgewicht mit der offenkettigen Form. Bei alkalischen ph-werten stellt sich über das Endiolat- Zwischenprodukt ein Gleichgewicht zwischen den offenkettigen Formen der Aldosen und Ketosen ein. Über das Zwischenprodukt eines Endiolats können Zucker also ineinander übergeführt werden:

27 In Experiment A wird die Basen-katalysierte Isomerisierung von Fructose zu Glucose und die Epimerisierung von Mannose zu Glucose demonstriert. Im Organismus geschieht bei physiologischem ph-wert die enzymatische Isomerisierung von Glucose-6-Phosphat zu Fructose-6-Phosphat und weiterer phosphorylierter Zucker ebenfalls durch einen Basen-katalysierten Mechanismus. Ein direkte Umwandlung von Glucose zu Fructose findet durch Reduktion des Aldehyds mit NADH zum Polyalkohol D-Sorbit, einem bekannten Süssstoff, statt. D-Sorbit wird durch die Sorbitdehydrogenase mit NAD + zu Fructose oxidiert. Die Enzyme dieser beiden Reaktionen kommen in vielen Insulinunabhängigen Geweben vor. Dies spielt eine besondere Rolle beim Linsengewebe des Auges. Erhöhte Blutglucosewerte beim Diabetes mellitus (Insulinmangel) führen in den Linsenzellen über diese Reaktionen zum Ansteigen der Fructosekonzentration. Da Fructose im Gegensatz zu Glucose mangels eines entsprechenden Transportsystems die Linsenzellen nicht mehr verlassen kann und Fructose in extrahepatischen Geweben nur äusserst langsam abgebaut wird, kann der Anstieg der Fructosekonzentration zu osmotisch bedingtem Wassereinstrom ins Linsengewebe führen. Das Anschwellen des Linsengewebes und Folgestörungen bewirken eine Linsentrübung (= grauer Star). Die Endiolat-Intermediate der Zucker reduzieren Cu 2+ oder Fe 3+. Bei der Ascorbinsäure liegt ein Endiolat bei leicht alkalischem ph-wert bereits in stabiler Forme vor. Die reduzierende Eigenschaft von Ascorbinsäure (= Vitamin C) hat im Organismus eine wichtige Bedeutung. Bei der Kollagensynthese werden Prolinreste hydroxyliert. Vitamin C ist an der Hydroxylierungsreaktion selbst nicht beteiligt. Die Prolinhydroxylase benötigt jedoch Ascorbinsäure, damit das Enzym im aktiven Zustand gehalten werden kann, in welchem Eisen als Fe 2+ vorliegen muss. Ein Mangel an Vitamin C führt zur Mangelkrankheit Skorbut. 86 EXP A: Umwandlung von Zuckern Lösungen: Fructose (1%) und Mannose (1%) in Wasser NaOH 0.1 M Tris-HCl-Puffer 0.5 M, ph 7.5 Drei Glasröhrchen vorbereiten: Fructose (neutraler ph-wert) Fructose (alkalisch) Mannose (alkalisch) Fructose 1 % 2 ml 2 ml - Mannose 1 % ml Wasser 0.1 ml - - NaOH 0.1 M ml 0.1 ml Röhrchen für 2 Minuten ins siedende Wasserbad stellen, dann auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Anschliessend zur Neutralisation zugeben

28 87 Tris-HCl-Puffer 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml Glucosenachweis Nach Neutralisation der Proben soll das Vorhandensein von Glucose nachgewiesen werden, indem je ein Diaburteststäbchen kurz in eine Proben eingetaucht wird. Nach genau 2 Minuten die Farbveränderung beurteilen und mit der Skala auf dem Behälter der Diaburteststäbchen vergleichen. Resultate in obenstehender Tabelle festhalten. Was zeigt das Resultat der Fructose bei neutralem ph-wert? Zeichnen Sie die Formel von Fructose und eines der weiteren möglichen Produkte, welches im Fructoseröhrchen entstehen kann. - Wenn das Röhrchen mit Fructose nicht erhitz wird, lässt sich keine Glucose nachweisen. Weshalb? - Bei der Glykolyse, die Sie bereits kennengelernt haben, werden Zuckerderivate durch Isomerisierung ineinander übergeführt. Welche? - Weshalb liefert die Umwandlung von Glucose über Sorbit zu Fructose nicht auch Mannose (Siehe Einleitung zu Exp. 16.4)? EXP B Nachweis reduzierender Zucker nach Benedict Lösungen: - 1%-ige Lösungen (Gew./Vol.) von Fructose, Glucose, Mannose, Saccharose, Stärke und Ascorbinsäure - Benedict-Reagens (alkalisch Lösung von CuSO 4 in Natriumcarbonat und Natriumcitrat) Sechs RG mit je 0.5 ml einer Zuckerlösung (1 %) und 3 ml Benedict Reagens beschicken und für 2 Minuten ins siedende Wasserbad stellen. Das Resultat wird beurteilt, nachdem die Reagenzgläser einige Minuten bei Zimmertemperatur gestanden sind. Die Reduktionsprobe soll mit Lösungen von Fructose, Glucose, Mannose; Saccharose, Stärke und Ascorbinsäure durchgeführt werden.

29 88 - Worauf ist die grüne Farbe der Lösung und die gelbe oder rote Farbe des Sediments zurückzuführen? - Wie müsste der Test geändert werden, um reduzierende Zucker quantitativ bestimmen zu können? - Welche strukturelle Gemeinsamkeit besteht zwischen der Endiolat-Form von Glucose und Fructose und der Ascorbinsäure (siehe unter Ascorbinsäure im bipweb-lexikon)? - Ascorbinsäure wirkt bei alkalischen ph-werten auch ohne Erwärmen reduzierend. Erklärung? EXPERIMENT 16.5 Eigenschaften von Stärke Prinzip: Dass Stärke in helicaler Form vorliegt, soll im folgenden Experiment gezeigt werden. Jodmoleküle können sich zusammen mit Jodidanionen in die zu Helices aufgewundenen Polysaccharidketten der Stärke einlagern. Der eingelagerte Jod-Jodidkomplex ist tiefblau. Die Farbe verschwindet beim Auffalten der Helixstruktur durch erwärmen (Denaturierung) und erscheint erneut nach Abkühlen und Renaturierung. Es wird die Ausfällung von Stärke mit Ethanol gezeigt. Wie Hitze denaturieret auch Ethanol Stärke reversibel. Lösungen: Stärkelösung 0.2 % in 50 mm Na-Phosphat, ph 7 Jod-Kaliumjodidlösung, je 8 mm Ethanol Ausführung: EXP A: In ein Glasröhrchen 5 ml Wasser, in ein zweites Röhrchen 1 ml Stärke 0.2% und 4 ml Wasser zugeben. In beide Röhrchen 0.2 ml Jod-Kaliumjodidlösung zugeben, Röhrchen gut mischen und Farbe notieren. Beide Röhrchen für 2 Minuten ins 95 0 C-Wasserbad stellen, Farbänderung festhalten und Röhrchen im Eisbad abkühlen lassen. Farbe erneut notieren. EXP B Zwei Glasröhrchen vorbereiten:

30 89 Stärke 0.2 % Wasser Stärke 1 ml - Wasser - 1 ml Portionenweise Ethanol zugeben, jeweils gut mischen, Löslichkeit sowie Farbe beurteilen und notieren. + 1 ml + 1 ml + 1 ml Röhrchen 1 min stehen lassen, dann Jod-Kaliumjodidlösung zugeben Farbe: *) Niederschlag nach Zentrifugation; Farbe beurteilen Farbe nach auflösen in Wasser: Die Stärke ist demnach nativ/denaturiert: Jod-Kaliumjodidlösung 0.1 ml zu beiden Röhrchen zugeben Farbe: Die Stärke ist jetzt nativ/denaturiert: 0.1 ml ml *) Röhrchen für 2 Minuten bei 6'000 Umdrehungen/min zentrifugieren, Überstand abgiessen, Flüssigkeitsreste mit Papiertüchlein der auf den Kopf gestellten Röhrchen abtupfen und Niederschlag beurteilen. Zu beiden Röhrchen 1 ml Wasser geben und auf Vortex mischen bis Niederschlag gelöst ist, Farbe beurteilen und festhalten. Bei welcher Ethanolkonzentration (%) fällt Stärke aus? Erklären Sie weshalb in Anwesenheit von Ethanol die Stärkelösung farblos bis gelbbräunlich ist. Welche Beobachtung zeigt, dass Stärke reversibel denaturiert wurde? - Welche Funktion hat die Stärke? Wo kommt sie in der Natur vor und in welchen Nahrungsmitteln wird sie gefunden? - Was unterscheiden sich Cellulose und Glykogen von Stärke? Wo findet sich beim Menschen Glykogen?