Lipide. bei vielen Organismen als schützende Oberflächenschicht als Vitamine und Signalstoffe (z.b. Hormone)

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1 Lipide, Seite 1 Lipide Einführung Lipide sind wasserunlösliche organische Biomoleküle. Sie können aus biologischem Material mit unpolaren Lösungsmitteln (z.b. Methanol, Chloroform, Diethylether) extrahiert werden. Ihre charakteristischen Eigenschaften werden durch den Aufbau des Kohlenstoff-Gerüstes einerseits und den Gehalt an polaren funktionellen Gruppen andererseits bestimmt. Lipide haben wichtige biologische Funktionen. Sie dienen u.a. als strukturelle Bestandteile aller Membranen (amphipathische Lipide) als Energiespeicher (Depotfett) und als Bau- und Isoliermaterial (Unterhaut- und Organfett) bei vielen Organismen als schützende Oberflächenschicht als Vitamine und Signalstoffe (z.b. Hormone) Die heute übliche Einteilung der Lipide orientiert sich an ihrem Aufbau: Die einfachen Lipide lassen sich durch Hydrolyse nicht aufspalten. Zu dieser Gruppe gehören die Fettsäuren und viele Isoprenoide, z.b. das Steroid Cholesterol (alter Ausdruck: Cholesterin). Bei den komplexen Lipiden ist ein Alkohol (z.b. Glycerol oder Sphingosin) mit mindestens einer Fettsäure und meist weiteren Komponenten verestert. Dies gilt z.b. für die Fette (Acyclglycerole), die amphipathischen Glycerolipide und Sphingolipide. Lipide können auch an andere Biomoleküle gebunden sein, und zwar entweder in kovalenter oder in nicht-kovalenter Bindung. Auf diese Weise entstehen Hybridmoleküle wie Glykolipide und Lipoproteine. Die Versuche demonstrieren Methoden zur Extraktion von Lipiden aus biologischen Material zur Trennung und zum qualitativen Nachweis durch Dünnschichtchromatographie zur quantitativen Lipidbestimmung durch Photometrie. Sie sollen diese Methoden durch Verwendung bekannter Lipide (in Standardlösungen) erproben. Die Analyse von Proben mit unbekannter Zusammensetzung und Konzentration dient der Erfolgskontrolle. Bitte eignen Sie sich gemäß den nachfolgend aufgeführten Stichworten den nötigen theoretischen Hintergrund an. Stichworte zur Vorbereitung Wiederholungsstoff: Strukturmerkmale, chemische Zusammensetzung, Erkennen von Formeln und Bausteinen, Vorkommen, biologische Funktionen von Lipiden Stoffwechsel: Triacylglycerole, Phospholipide, Sphingolipide, ß-Oxidation, Ketonkörper, Fettsäuresynthese, essentielle Fettsäuren Biologische Membranen: Funktion, Aufbau, Zusammensetzung, amphipathisches Verhalten Lipoproteine: Einteilung, Zusammensetzung, Stoffwechsel Trenn- und Analyseverfahren: Dünnschichtchromatographie, Photometrie, Enzymtests Folgende Versuche werden durchgeführt und protokolliert: 1. Dünnschichtchromatographische Trennung von Lipiden aus Blutserum 2. Dünnschichtchromatographische Trennung von Lipiden aus Gehirn 3. Quantitative Bestimmung von Cholesterol und Cholesterolestern im Serum

2 Lipide, Seite 2 Gerätschaften und Lösungen: Für die Versuche werden benötigt : Kieselgel-Dünnschichtplatten (10 cm 5 cm) Eppendorf-Pipetten zum Auftragen der Proben Spritzen und Kanülen zum Abnehmen der Proben Trennkammern mit folgenden n: A: Chloroform/Methanol/Wasser ( , v/v/v) B: Chloroform C: Chloroform/n-Hexan (1+3, v/v) Chloroform/Methanol (2+1, v/v) Phosphat-Sprühreagenz α-naphtol-sprühreagenz Schwefelsäure (50%) Fön Zentrifuge Trockenschrank Schutzbrille und Einmalhandschuhe Photometer Halbmikro-Küvetten (schmale Form) Standardlösungen: Cholesterol Phosphatidylcholin (= Lecithin) Triacylglycerol (= Triglycerid) Cholesterolester Cerebrosid Gangliosid Cholesterol-Testlösung Aufgaben für eine Gruppe aus acht Studierenden ( ): 1. Serumprobe 2. Hirnprobe 3. Cholesterol Probe DC-Platten DC-Tröge Testreagenz pipettieren extrahieren beschriften beschriften inkubieren zentrifugieren konzentrieren auftragen Standards auftragen Platten entwickeln trocknen Platten mit Reagenz besprühen fönen erhitzen im Trockenschrank Auswertung einfüllen Küvetten vorbereiten messen im Photometer Um einen zügigen Ablauf der Versuche zu gewährleisten, klären Sie bitte zunächst innerhalb Ihrer Gruppe, wer welche Aufgaben übernimmt! 1. Wer bearbeitet die Serum-Probe 2. bzw. die Hirn-Probe? 3. Kennzeichnung der DC-Platten 4. Befüllen der DC-Tröge 5. Quantitative Bestimmung von Gesamt-Cholesterol im Serum

3 Lipide, Seite 3 Versuch 1: Dünnschichtchromatographische Trennung von Serum-Lipiden Serum-Lipide werden mit Hilfe eines organischen Lösemittel-Gemisches unter gleichzeitiger Fällung der Serum-Proteine in Lösung gebracht und dünnschichtchromatographisch getrennt (siehe Methodische Einführung). Die getrennten Lipide werden sichtbar gemacht und mit Hilfe bekannter Testsubstanzen charakterisiert. Durchführung: Eppendorf-Gefäß mit 200 µl Serum (steht bereit!) Zugabe von 1000 µl CHCl 3 : MeOH (2 + 1 v/v); es bildet sich ein milchiger Brei. 5 min. gut schütteln; gelegentlich Vortex benutzen. In Eppendorf-Zentrifuge 5 min. bei voller Drehzahl zentrifugieren. Es bilden sich 3 Phasen, von denen die untere mit einer Spritze abgesaugt und in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt wird. Bis auf ca. 50 µl im Heizblock einengen. Von diesem Konzentrat je 2 µl auf DC-Platten punktförmig auftragen. Unbekannte Probe ebenfalls auftragen. Proben-Nr. auf dem Auswertungsblatt notieren. Es werden vier Dünnschichtplatten vorbereitet, je eine Platte wird in A, B oder C entwickelt (Platten S-1, S-2, S-3). Eine weitere Platte wird nacheinander in A (bis 1. Drittel), B (bis 2. Drittel) und C (bis 3. Drittel) entwickelt (Platte S-4). Identifizierung: Nach dem Trocknen werden die Platten (S1 bis S4) mit Ammoniummolybdat-Phosphat- Reagenz besprüht. Die nach kurzem Erwärmen auf 30 bis 40 C (1-2 min im Trockenschrank oder mit dem Fön erhitzen) blau gefärbten Phospholipide werden mit einem weichen Bleistift markiert (Plattenoberfläche nicht zerkratzen). Anschließend werden die Platten im Trockenschrank bei 120 C solange behandelt, bis alle Lipidflecken durch Verkohlung braun/schwarz gefärbt sind. Auswertung: Identifizieren Sie die gefundenen Lipide mit Hilfe der mitgeführten Vergleichsstandards, sowie durch Bestimmung und Vergleich der R f -Werte. Zeichnen Sie die Ergebnisse in das Auswertungsblatt S (Serum) ein.

4 Lipide, Seite 4 Auswertungsblatt S: Lipide im Serum 1. Zeichnen Sie schematisch die gefundenen Lipide in die folgenden Abbildungen ein. Platte S-1 Platte S-2 Platte S-3 Platte S-4 A B C A, B u. C C B A Le Ch Se Tr ChE U Le Ch Se Tr ChE U Le Ch Se Tr ChE U Le Ch Se Tr ChE U Le = Lecithin, Ch = Cholesterol, Se = Serum, Tr = Triacylglycerol, ChE = Cholesterolester, U = unbekannt A = CHCl 3 / CH 3 OH / H 2 O B = CHCl 3 C = CHCl 3 / C 6 H Berechnen Sie für die Standardlipide R f - Werte und tragen Sie diese in die Tabelle ein. R f Lecithin (Le) R f Cholesterol (Ch) R f Triacylglycerol (Tr) R f Cholesterolester (ChE) A B C 3. Beantworten Sie folgende Fragen: wie wurden die Lipide identifiziert? welche Lipide haben Sie im Serum gefunden? welches Lipid haben Sie in der unbekannten Probe gefunden? Proben-Nr.:

5 Lipide, Seite 5 Versuch 2: Dünnschichtchromatographische Trennung von Lipiden aus Gehirn Die Lipide werden aus lyophilisiertem (= gefriergetrocknetem) Gehirngewebe mit Chloroform/Methanol (2+1) extrahiert, wie in Versuch 1 abzentrifugiert und das Lösemittel im Heizblock auf ca. 50 µl eingeengt. Da eine wasserfreie Gewebeprobe verarbeitet wird, bilden sich bei der Zentrifugation keine Phasen. Die Probe wird auf drei Platten (G-2, G-3 und G-4) aufgetragen und in n unterschiedlicher Polarität getrennt. Der Nachweis der Phospholipide erfolgt mit dem Ammoniummolybdat-Phosphat-Reagenz. Zum Nachweis der gehirnspezifischen Ganglioside und Cerebroside wird eine weitere Platte (G-1) in A entwickelt und mit α Naphthol besprüht. Nach kurzer Trocknung muß die Platte noch mit 50%iger Schwefelsäure besprüht werden. Durchführung: Ein linsengroßes Stück lyophilisiertes Gehirn wird in einem 1,5 ml Eppendorf-Gefäß nach Zugabe von 1000 µl Chloroform/ Methanol (2+1, v/v) extrahiert und 5 min gut gemischt (mechanischer Mischer). Der Extrakt wird 5 min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Das Lösemittel wird mit Hilfe einer Pipette abgenommen, in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt und im Heizblock auf ca. 50 µl konzentriert. Auf einer der Platten (Platte G-1) werden Gehirnextrakt, sowie Gangliosid und Cerebrosid/Sulfatid als Vergleichsstandards aufgetragen und in A entwickelt. Auf zwei weiteren Platten werden Gehirnextrakt sowie Lecithin, Cholesterol und Triacylglycerol (=Triglycerid, Fette) als Vergleichsstandards aufgetragen und je in A und B entwickelt. Die Platte G-4 wird in A bis zur halben Höhe und dann nach Trocknung in B vollständig entwikkelt. Bitte die Auftragung der unbekannten Probe nicht vergessen (Nr. notieren). Identifizierung: Platte G-1: Diese Platte wird mit α-naphthol und nach dem Trocknen mit 50%iger Schwefelsäure besprüht (Vorsicht!). Nach Lufttrocknung wird die Platte im Trockenschrank 10 min auf 120 C erhitzt. Die Glykolipide erscheinen als blau-violette Flecken. Platten G-2, G-3 und G-4: Diese Platten werden mit Ammoniummolybdat-Phosphat- Reagenz besprüht und zunächst auf C erhitzt (blaue Färbung der Phospholipide markieren) und anschließend auf 120 C erhitzt (Verkohlung aller Lipide). Auswertung: Mit Hilfe der mitgeführten Standards und nach Berechnung der R f -Werte (relative Wanderungsstrecke) werden die gefundenen Lipide charakterisiert. Zeichnen Sie die Ergebnisse in das Auswertungsblatt G (Gehirn-Lipide).

6 Lipide, Seite 6 Auswertungsblatt G: Lipide im Gehirn 1. Zeichnen Sie schematisch die gefundenen Lipide in die Abbildungen ein. Platte G-1 Platte G-2 Platte G-3 Platte G-4 A A B A u. B B A Ga Hi Ce Le Ch Hi Tr U Le Ch Hi Tr U Le Ch Hi Tr U Le = Lecithin, Ch = Cholesterol, Hi = Hirnprobe, Tr = Triacylglycerol, Ce = Cerebrosid, Ga = Gangliosid, U = unbekannt A = CHCl 3 / CH 3 OH / H 2 O B = CHCl 3 2. Berechnen Sie für die Standardlipide R f - Werte und tragen Sie diese in die Tabelle ein. R f Lecithin (Le) R f Cholesterol (Ch) R f Triacylglycerol (Tr) R f Gangliosid (Ga) R f Cerebrosid (Ce) A B 3. Beantworten Sie folgende Fragen: wie wurden die Lipide identifiziert? welche Lipide haben Sie im Gehirn gefunden? welches Lipid haben Sie in der unbekannten Probe gefunden? Proben-Nr.:

7 Lipide, Seite 7 Versuch 3: Quantitative Bestimmung von Gesamt-Cholesterol im Serum Erhöhte Cholesterol-Spiegel im Blut sind einer der entscheidenden Risikofaktoren für die Entstehung koronarer Herzkrankheiten und anderer Störungen. Deshalb ist die Bestimmung der Cholesterol-Konzentration im Blut eine klinisch wichtige Methode. Der hier angewandte Test erfasst die Gesamtcholesterol-Konzentration im Serum bei 500 nm. Durchführung: Testansätze : Vier gekennzeichnete Eppendorf-Gefäßen enthalten bereits 10 µl Probe Probe 1 Probe 2 Standard Leerwert Cholesterol-haltige 10 µl 10 µl bereits Probe Standard µl -- entdest. Wasser µl halten!!! Cholesterol-Reagenz 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl Man pipettiert 1000 µl Cholesterol-Testreagenz in die Reaktionsgefäße, in denen jeweils 10 µl Probe / Standard / Leerwert bereits enthalten sind. Der Inhalt wird gemischt und man inkubiert 30 min bei Raumtemperatur und mißt dann in Halbmikroküvetten (schmale Form!) bei 500 nm die Absorptionen von Proben und Standards gegen den Leerwert. Auswertung: Die Cholesterol-Konzentration C wird aus den Absorptionen A von Probelösung, Standard und Leerwert wie folgt berechnet. Der Standard enthält 200 mg / dl -1 Cholesterol. A Probe - A Leer C Probe = C Standard A Std - A Leer Berechnen Sie die Gesamtcholesterol-Konzentration in der unbekannten Probelösung in mg dl -1 und in mmol l -1 (molekulare Masse von Cholesterol = 387). Die Normalwerte für Cholesterol im Blutserum liegen zwischen 3.9 und 6.2 mmol l -1

8 Lipide, Seite 8 Fragen 1. Welche chemischen Bindungen finden sich in Triacylgylcerolen, Phosphoglycerol- und Sphingolipiden? 2. Welche Produkte entstehen bei der vollständigen Hydrolyse von Lecithin? 3. Wo in den Phospholipiden liegen mögliche Angriffsstellen für Phospholipasen? 4. Was versteht man unter amphipathischem Verhalten? 5. Was ist ein Emulgator? 6. Welche Lipide kommen in Membranen vor, welche nicht? Begründung? 7. Erläutern Sie den Begriff Membranfluidität? 8. Welche Lipide erwarten Sie im Blutserum, welche im Gehirn? 9. Wie gelangen die Lipide aus der Nahrung ins Blut? 10. Welche Lipide gehören zu den essentiellen Nahrungsbestandteilen? Warum? 11. Wie werden Fettsäuren und komplexe Lipide synthetisiert? 12. Welche Arten von Lipiden werden vom Organismus gespeichert? 13. Wie werden Triacylglycerole, Sphingolipide und Fettsäuren abgebaut? 14. Was versteht man unter Isoprenoiden? Welche gemeinsame Vorstufe haben sie? 15. Welche Lipide werden aus Cholesterol synthetisiert? 16. Was ist die Aufgabe der Carotinoide? 17. Wie sind Lipoproteine aufgebaut und welche Rolle spielen sie? 18. Woraus werden die Prostaglandine gebildet? 19. Wie wird überschüssiges Cholesterol ausgeschieden? 20. Was sind Liposomen, und wie kann man sie therapeutisch einsetzen? Stand: 09/.2001