Einfluss technologischer Prozesse auf die Inaktivierung und Tenazität von Norovirus in Lebensmitteln

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1 Einfluss technologischer Prozesse auf die Inaktivierung und Tenazität von Norovirus in Lebensmitteln Schrader et al., 2003 B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 1

2 Foodborne Viruses Virus Spezies Familie Genom Hülle Größe kultivierbar Erkrankung (nm) Norovirus Caliciviridae + ssrna Gastroenteritis Sapovirus Caliciviridae + ssrna Gastroenteritis Hepatitis A Picornaviridae + ssrna a Hepatitis Virus Hepatitis E + ssrna Hepatitis Virus Gattung: Hepevirus Rotavirus Reoviridae dsrna Gastroenteritis Astrovirus Astroviridae + ssrna a Gastroenteritis Enterovirus Picornaviridae + ssrna a Poliomyelitis, Meningitis Adenovirus Adenoviridae dsdna a Gastroenteritis Frühsommer Flaviviridae + ssrna a Meningoenzephalitis Meningo enzephalitis Virus a nicht alle Isolate sind kultivierbar; Wildstämme sind oftmals schwer zu kultivieren (Greening G.E., 2006) B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 2

3 Caliciviridae Genera Norovirus Sapovirus Vesivirus Lagovirus Spezies: u. a. Humanes Norovirus, Murines Norovirus, Porzines Norovirus Spezies: u. a. Porcines EnteroSapovirus Spezies: u. a. Felines Calicivirus Spezies: u. a. Canines Calicivirus humanpathogen: tierpathogen: Norovirus und Sapovirus z. B. Felines Calicivirus, Porzines Norovirus, Murine Norovirus, Canines Calicivirus Einsatz von Felines Calicivirus und Murines Norovirus als Surrogat für Norovirus, da Zellkultur möglich! B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 3

4 Norovirus Übertragung von Mensch zu Mensch, z. B. durch Aerosole oder fäkaloral durch kontaminierte Speisen z. B. Krabben, Muscheln, Salate, Dessert, Früchte (Himbeeren, Erdbeeren), Gemüse, Schinken, Quellwasser durch Wasser durch kontaminierte Gegenstände Kontamination von Lebensmitteln durch Abwässer (z. B. Muscheln, Früchte) oder durch Menschen Hygienemängel! B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 4

5 Surveillance for Foodborne Disease Qutbreaks CDC, 2006 (MMWR 12. Juni 2009) lebensmittelassoziierte Krankheitsausbrüche (foodborne disease outbreaks) Erkrankungen Todesfälle 11 B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 5

6 Surveillance for Foodborne Disease Qutbreaks CDC, 2006 (MMWR 12. Juni 2009) Norovirus (43 %) Samonella 3393 (13 %) Clostridium perfingens 2077 (8 %) Staphylococcus Enterotoxin 659 (3 %) STEC 470 (2 %) Campylobacter 299 (1 %) Listeria 24 (< 1 %) B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 6

7 Foodborne Viruses in Europe Network (FBVE) (seit 1999) Analysis of Integrated Virological and Epidemiological Reports of Norovirus Outbreaks Collected within the Foodborne Viruses in Europe Network from July 2001 to 30 June 2006 (Journal of Clinical Microbiology, 2008, ) Foodborne NorovirusAusbrüche Deutschland Dänemark Spanien Finland Frankreich England/ Wales * Foodborne NorovirusAusbrüche Ungarn Irland Italien Niederlande Norwegen Schweden Slowakei * Es wurden nicht nur lebensmittelassoziierte Ausbrüche registriert! B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 7

8 Gemeldete Viruserkrankungen in Deutschland (Robert Koch Institut, Berlin) Virus Norovirus Erkrankungen foodborne % (Europa) Hepatitis AVirus % Hepatitis EVirus ? FSME ? Rotavirus % B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 8

9 Noroviruserkrankungen in Deutschland (Robert Koch Institut, Berlin, 2008) NorovirusErkrankungsfälle Jahr B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 9

10 4x Tupfer mit Noroviren kontaminiert Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach 64 LFGB Dez Untersuchung von Lebensmitteln Qualitativer Nachweis von Noroviren der Genogruppe I und II auf glatten, festen Oberflächen von Lebensmitteln durch realtime RTPCR 5.3 Konventionelle RTPCR (Norovirus MONSystem) 5.1 Elution der Viren vom Tupfer (in 500 µl PBS) 5.2 RNAExtraktion (QIAamp Viral RNA mini Kit) Eluat < 60 µl 20 µl 10 µl 520 µl Thermocycler (Eppendorf) Agarosegelelektrophorese 5.5 Konventionelle RTPCR (Amplifikationskontrolle MS2) LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics) oder ABI 7500 (Applied Biosystems) oder 5.4 RealTime RTPCR (Norovirus GII) Rotorgene 3000 (Corbett Research) B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 10

11 AiFVorhabenNr (FEI) ( ) Einfluss technologischer Prozesse auf die Inaktivierung und Tenazität von Norovirus in Lebensmitteln B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 11

12 Aspekte des Forschungsprojektes Einsatz von humanem Norovirus GG II.3 Entwicklung einer realtime RTPCR zum quantitativen Nachweis von Norovirus GG II Nachweis intakter Viruspartikel! Verifizierung falsch negativer und falsch positiver PCR Ergebnisse Vergleichbarkeit der CtWerte verschiedener PCRLäufe durch CAmpER und DARTAlgorithmus Wiederfindung im Lebensmittel (Sensitivität der Methode) Protektive Effekte von Lebensmitteln und dessen Einfluss auf die Inaktivierung Ziel: Aussage zur Inaktivierung von Norovirus in verschiedenen LMn B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 12

13 Status NV in LM Anzahl inokulierter Viren im LM Lebensmittelspezifische Matrixeffekte Prozesskontrolle mit MS2Phagen (Dreier et al., 2005) Anzahl Viren nach technologischem Prozess Protektive Wirkung der LM Realtime RTPCR Quantifizierung Realtime RTPCR Quantifizierung Inokulation der Lebensmittel mit einem NVIsolat aus Stuhlproben einer erkrankten Person (GGII.3) Lebensmitteltechnologische Prozesse Erhitzung Kühlung Einfrieren Säuerung Reifung B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 13

14 Inaktivierung freier RNA im Untersuchungsansatz durch RNAse Nachweis intakter Norovirus Capside möglich! Nachweis infektiöser Noroviren nicht möglich! B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 14

15 Inaktivierung / Tenazität von NV: Vergleich von unbehandelten Lebensmittelproben mit behandelten Lebensmittelproben (vor und nach physikochemischer Behandlung) Ketchup Nudelsalat Hackfleisch Apfel Himbeeren Salat Produkt Tiefkühlpizza PizzaBaguette Zigeunersoße Kartoffelsalat Produktbehandlung Erhitzung, 200 C, 12 min Einfrieren, 19 C, 7 d Einfrieren, 19 C, 14 d Erhitzung, 220 C, 15 min Kühlung, 6 C, 58 d, ph = 4.5 Erhitzung, 74 C, 1 min, ph = Kühlung, 6 C, 24 d Kühlung, 6 C, 24 d Erhitzung (braten), 200 C, 30 min Erhitzung (kochen), 100 C, 30 min Einfrieren, 19 C, 8 d Kühlung, 6 C, 2 d Kühlung, 11 C, 7 T Einfrieren, 19 C, 14 T Kühlung, 11 C, 5 T NV Reduktion [log 10 ] (Signifikanz p<0.05) > 4 (s.) 0.4 (n. s.) 1 (n. s.) 0.5 (n. s.) 0.4 (n. s.) 1.7 (s.) 0.5 (n. s.) 1.6 (s.) > 7 (s.) 0.2 (n. s.) B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 15 3 (s.) 0 0? 0.1 (n. s.)

16 The efficacy of preservation methods to inactivate foodborne viruses (L. Baert et al., 2009) Virus Log 10 reduction Reference Hitze HAV Milk 5 Bidawid et al Strawberry 1 Deboosere et al Poliovirus Milk 3 Strazynski et al Calicivirus MNV1 Raspberry puree 1,8; 2,8 Baert et al Hochdruck HAV Oysters 3 Calci et al Sausage 3,2 Sharma et al 2008 Calicivirus FCV Sausage 2,9 Sharma et al 2008 Bestahlung (UV) HAV Salat, Erdbeeren, Frühlingszwiebeln 4,3; 1,3; 4,2; Fino and Kniel (2008) Calicivirus FCV und CaCV Salat, Erdbeeren Frühlingszwiebeln 3,5; 1,1; 2,5; Fino and Kniel (2008) B. Becker/S. Mormann / 2009 / FEI Jahrestagung 16