Entwicklung einer knockin Mauslinie mit Expression von humanem CD22 zum Test therapeutischer Anwendungen künstlicher CD22-Liganden

Transkript

1 Entwicklung einer knockin Mauslinie mit Expression von humanem CD22 zum Test therapeutischer Anwendungen künstlicher CD22-Liganden Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Miriam Wöhner aus Nürnberg

2 Als Dissertation genehmigt von der Naturwissen- schaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink Erstberichterstatter: Prof. Dr. Lars Nitschke Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Alexander Steinkasserer

3 Inhalt 1 Einleitung B-Zellen B-Zell Populationen Signalweiterleitung in B-Lymphozyten Siglecs CD Inhibition des BZR-Signals Phänotyp der CD22 knockout Maus Ligandenbindung von CD CD22 knockin-mäuse mit mutierten Ligandenbindungs- und Signalleitungs- Domänen Modifikationen der α2,6 verlinkten Sialinsäuren verstärken die Affinität der CD22-Bindung Das Homing von B-Zellen Immunotoxine zur Behandlung von B-Zell Lymphomen Pseudomonas Exotoxin A Gekoppelte Immunotoxine CD22-Immunotoxine Epratuzumab BL Weitere gegen CD22 gerichtete Immunotoxine Mausmodelle für Leukämien und Lymphome Zielsetzung der Arbeit Material Antikörper und Konjugate Antibiotika Chemikalien Puffer, Lösungen und Medien Annexin-Bindepuffer Anti-His-TBS Brij-Lysepuffer B-Zell Medium Coomassie-Entfärber Coomassie-Färbelösung Diethanolaminpuffer Elektrophoresepuffer ELISA Blockierungspuffer ELISA Substrat ELISA Verdünnungspuffer EMFI-Medium ES-Zell Medium FACS Puffer Gey s Lösung His-Dialysepuffer (10x) His-Elutionspuffer His-Waschpuffer I

4 Indo-Mix KPO 4 -Puffer Krebs-Ringer Lösung Lämmli-Puffer (6-fach) LB Medium Loading Dye (10x) Lysepuffer Mausschwänze MACS-Puffer Nalm6 RPMI-Medium PBS (10x) Periplasma-Extraktionspuffer Ponceau Stain Puffer 1 (Mini-Präp) Puffer 2 (Mini-Präp) Puffer 3 (Mini-Präp) Running Buffer (SDS-Gelelektrophorese) Sorbitol SSC 10x Stripping-Puffer für Westernblotmembranen TB-Medium TBE-Puffer (5x) TBS-Tween-TritonX TE-Puffer Transfer-Puffer 10 x (Western Blot) TfB TfB Zinkchlorid (1 M) Zelllinien Versuchstiere Sialinsäurederivate Bakterien PCR-Primer Reaktionssysteme (Kits) Geräte und Software Methoden Zellkultur Lebendzellzahlbestimmung HL60-, Daudi- und Nalm6- Zellen Einfrieren von Zellen Auftauen von Zellen Durchflusszytometrische Analyse humaner Zellkulturzellen Embryonale Fibroblasten-Zellen und Embryonale Stammzellen Kultivierung von EMFIs Präparation embryonaler Fibroblasten Wegfrieren embryonaler Fibroblasten und embryonaler Stammzellen Auftauen von EMFIs und ES-Zellen Kultivieren und Passagieren von ES-Zellen Vorbereitung der ES-Zellen für die Blastozysteninjektion Transfektion von ES-Zellen mit DNA II

5 Etablierung der Screening PCR mit Kontrollvektor-transfizierten ES-Zellen Picken von ES-Zell-Kolonien nach der Selektion Arbeit mit kompetenten Bakterien Kompetente Bakterien Transformation von kompetenten BL21 Bakterien Kultur und Lagerung von E.coli Proteinexpression, Proteinextraktion und Proteinaufreinigung Protein-Expression im präparativen Maßstab Dialyse der Periplasmaextraktionspuffer-Proteinlösung Aufreinigung des Proteins über einen His-Tag Einfrieren von Proteinen Konzentrierung von Proteinlösungen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Westernblot Strippen der Membran Bestimmung der Proteinkonzentration mit Hilfe eines BSA-Standards Färbung mit Coomassie Brillant Blau Dialyse der Sialinsäurederivat-gekoppelten Substanzen Entfernung von Endotoxin Kopplung der Sialinsäurederivate an das rekombinant hergestellte Protein ETA Zytotoxizitätstest Arbeit mit DNA Agarosegelelektrophorese Isolierung von DNA DNA-Mini-Präparation (Schnellverfahren) Qiagen-Maxi Restriktionsverdau von DNA Gelextraktion Blunt-End Cloning mit dem CloneJet PCR cloning kit DNA Insert Ligation in Vektor DNA Sterilfällen von DNA Gewinnung genomischer DNA aus ES-Zellen Southern Blot Verdau der genomischen DNA Blotten des Agarosegels Radioaktives Labeln der Sonde Fixierung der DNA auf der Membran Hybridisierung der Membran Detektion Strippen der Membran Sequenzierung von DNA Tierexperimente Aufbereitung von Organen Durchflusszytometrische Analyse von Zellen Messung des Calciumsignals in B-Zellen Komplement-vermittelte T-Zell-Lyse Test des Immunotoxins Dimer-ETA im Xenotransplantations-Mausmodell III

6 3.6.6 Experimente zum Homing der rezirkulierenden B-Zellen ins Knochenmark mit Hilfe von CD22-Liganden Adaptiver Transfer CFSE markierter Zellen Endozytose von CD22 nach Antikörperbindung Untersuchungen der Antikörperantworten immunisierter Mäuse Immunisierung von Mäusen Thymus-unabhängige Immunantworten Thymus-abhängige Immunantworten Präparation von Serum ELISA Immunpräzipitation Versuche mit humanem Blut Lymphoprep-Gradienten Aufreinigung von humanen Lymphozyten Aufreinigung von Zellen durch das MACS Verfahren Bestimmung der Antikörpersekretion nach Inkubation mit Sialinsäurederivaten ELISA zur Bestimmung der Antikörpersekretion stimulierter humaner B-Zellen nach Inkubation mit Sialinsäurederivaten PCR PCR mit Proofreading PCR Enzym Screening PCR PCR zur Herstellung einer Sonde Typisierung von Mäusen Ergebnisse Generierung der Huki CD22 Maus Klonierung des Targeting Vektors Klonierung des Kontrollvektors Etablierung der humcd22 Screening PCR Transfektion embryonaler Stammzellen mit dem Targeting Vektor Bestätigung positiver ES-Zell Klone Injektion der ES-Zellen in Blastozysten von C57Bl/6 Mäusen Analyse der Huki CD22 Mäuse B-Zellen im Blut der Huki CD22 Mäuse exprimieren humanes, aber kein murines CD Milz- und Lymphknoten-B-Zellen der Huki CD22 Mäuse exprimieren humanes, aber kein murines CD Vergleich der hcd22-expression auf B-Zellen in humanem Blut und im Blut der Huki CD22 Mäuse zeigt niedrige Expression von CD22 auf B-Zellen der Huki CD22 Mäuse B-Zellpopulationen in Knochenmark und Milz der Huki CD22 Mäuse sind signifikant verändert Veränderte Zellzahlen in Knochenmark und Milz der heterozygoten Huki CD22 Mäuse Signifikant reduziertes Homing der rezirkulierenden B-Zellen der Huki CD22 Mäuse ins Knochenmark Erhöhter Calciumeinstrom nach Stimulation des BZR in Milzzellen der Huki CD22 Mäuse CD22 auf B-Zellen der Huki CD22 Maus wird nach Stimulation des BZR phosphoryliert und SHP-1 wird rekrutiert IV

7 4.2.9 CD22 auf B-Zellen der Huki CD22 Mäuse wird nach Antikörperbindung endozytiert Unveränderte natürliche Antikörperlevel verschiedener Antikörper-Isoformen in Huki CD22 Mäusen Unveränderte Immunantwort der Huki CD22 Mäuse nach Immunisierung mit einem Thymus-unabhängigen Antigen Unveränderte Immunantwort der Huki CD22 Mäuse nach Immunisierung mit einem Thymus-abhängigen Antigen Analyse der knockin Mäuse mit mutierten Ligandenbindungs- und Signalleitungs- Domänen von CD CD22 R130E und CD22 Y2,5,6F Mäuse zeigen signifikant veränderte Serum- Antikörperlevel Veränderte Antikörperantworten bei Thymus-unabhängiger Immunisierung der CD22 R130E, CD22 Y5,6F und CD22 Y2,5,6F Mäuse Veränderte Antikörperantworten bei Thymus-abhängiger Immunisierung der CD22 R130E, CD22 Y5,6F und CD22 Y2,5,6F Mäuse Signifikante Veränderung im Homing der rezirkulierenden B-Zellen der CD22 Y2,5,6F Mäuse ins Knochenmark Verringerte Assoziation des CD22 auf B-Zellen der CD22 R130E Mäuse mit dem BZR nach Stimulation der Zellen in einem Proximity ligation assay (PLA) Analyse des Immunotoxins BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA Leichte unspezifische Toxizität des linker-eta Keine unspezifische Toxizität des BPC-Neu5Ac-Dimer Eine zweite Behandlung mit dem Dimer-ETA reduziert den Anteil der lebenden Zellen weiter Nach Dimer-ETA Behandlung sind verschiedene Zellpopulationen in Wildtypmäusen reduziert Nach Dimer-ETA Behandlung generieren die Mäuse eine Antikörperantwort des IgG-Isotyps Versuche mit dem Dimer-ETA Immunotoxin in einem Xenotransplantationsmodell Rezirkulierenden B-Zellen zeigen keine Veränderung im Homing ins Knochenmark nach Behandlung von Mäusen mit CD22-Liganden Erhöhung der Antikörpersekretion stimulierter humaner Zellen nach Sialinsäurederivat-Behandlung in vitro Diskussion Analyse der Huki CD22 Mäuse Vergleich der hcd22 Expression auf B-Zellen in humanem Blut und im Blut der Huki CD22 Mäuse zeigt niedrige Expression von CD22 auf B-Zellen der Huki CD22 Mäuse Veränderung der Ligandenbindedomäne zwischen humanem und murinem CD22 erklärt nicht den Phänotyp der Huki CD22 Mäuse Vergleich der Sequenzen der humanen und murinen ITIM-Motive im zytoplasmatischen Schwanz von CD22 zeigt unterschiedliche Aminosäuresequenzen B-Zellpopulationen in Knochenmark und Milz der Huki CD22 Mäuse sind signifikant verändert Erhöhter Calciumeinstrom nach Stimulation des BZR in Milzzellen der Huki CD22 Mäuse V

8 6.1.6 Unveränderte natürliche Antikörperlevel und Immunantworten nach Immunisierung der Huki CD22 Mäuse CD22 auf B-Zellen der Huki CD22 Mäuse wird nach Antikörperbindung endozytiert Verwendbarkeit der Huki CD22 Maus als Mausmodell für gegen CD22 gerichtete Immunotoxine und Antikörper Analyse der CD22 R130E, CD22 Y5,6F und CD22 Y2,5,6F Mäuse Veränderte Antikörperantworten bei Thymus-unabhängiger Immunisierung der CD22 R130E, CD22 Y5,6F und CD22 Y2,5,6F Mäuse Veränderte Antikörperantworten bei Thymus-abhängiger Immunisierung der CD22 R130E, CD22 Y5,6F und CD22 Y2,5,6F Mäuse Signifikante Veränderung im Homing der rezirkulierenden B-Zellen der CD22 Y2,5,6F Mäuse ins Knochenmark Verringerte Assoziation des CD22 auf B-Zellen der CD22 R130E Mäuse mit dem BZR nach Stimulation der Zellen in einem Proximity ligation assay (PLA) Analyse des Immunotoxins BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA Probleme bei der Herstellung des BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA Zytotoxizitätstests Nach BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA Behandlung sind verschiedene Zellpopulationen in Wildtypmäusen reduziert Nach BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA -Behandlung generieren die Mäuse eine Antikörperantwort des IgG-Isotyps Etablierung eines Mausmodells zum Testen des BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA in vivo Verunreinigung der ETA -Präparation durch Lipopolysaccharide CD22 Expression auf weitere Zelltypen Unspezifische Toxizität des ETA Rezirkulierenden B-Zellen zeigen keine Veränderung im Homing ins Knochenmark nach Behandlung von Mäuse mit CD22-Liganden Erhöhung der Antikörpersekretion stimulierter humaner Zellen nach Sialinsäurebehandlung in vitro Zusammenfassung Summary Abkürzungen Literatur Vektorkarten Danksagung Lebenslauf Publikationsliste VI

9 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Siglec Familie... 7 Abbildung 2: Regulation des B-Zellrezeptorsignals durch CD Abbildung 3: Struktur von Me-Neu5Ac und BPC-Neu5Ac Abbildung 4: Retrograder Transport von Exotoxin A ins Zytosol der Zelle Abbildung 5: Muster zum Picken der ES-Zell-Kolonien auf eine 96-well Platte Abbildung 6: Schematische Darstellung von ETA -RDEL auf Proteinebene Abbildung 7: Struktur des BPC-Neu5Ac-Dimers Abbildung 8: Überprüfung der Kopplung des BPC-Neu5Ac-Dimer an ETA Abbildung 9: Testverdau der möglichen Targeting Vektor Vorläufer VL2 mit dem Enzym HindIII Abbildung 10: Sequenzierung der cdna des humanen CD Abbildung 11: Testverdau der möglichen Vorläufer VL3 des Targeting Vektors mit PscI Abbildung 12: Testverdau der möglichen Vorläufer des Targeting Vektors VL4 mit HindIII 82 Abbildung 13: Testverdau der möglichen Vorläufer des Targeting Vektors VL5 mit PciI Abbildung 14: Testverdau der möglichen Targeting Vektoren mit PstI und HindIII Abbildung 15: Schematischer Aufbau des Targeting Vektors Abbildung 16: Testverdau der möglichen Kontrollvektoren Abbildung 17: Screening-PCR für die transfizierten embryonalen Stammzellen Abbildung 18: Southern Blot Analyse der positiven Klone über den kurzen Arm des Konstrukts mit einer externen Sonde Abbildung 19: Southern Blot Analyse der positiven Klone über den kurzen Arm des Konstrukts mit einer internen Sonde Abbildung 20: Southern Blot Analyse der positiven Klone über den langen Arm des Konstrukts mit einer externen und einer internen Sonde Abbildung 21: PCR Typisierung der Nachkommen der chimären Männchen von Klon VI Abbildung 22: B-Zellen im Blut der Huki CD22 Mäuse exprimieren humanes, aber kein murines CD Abbildung 23: Milz- und Lymphknoten-B-Zellen der Huki CD22 Mäuse exprimieren humanes, aber kein murines CD Abbildung 24: Vergleich der hcd22-expression auf B-Zellen in humanem Blut und im Blut der Huki CD22 Mäuse zeigt niedrige Expression von CD22 auf B-Zellen der Huki CD22 Mäuse Abbildung 25: B-Zellpopulationen im Knochenmark der Huki CD22 Mäuse sind signifikant verändert Abbildung 26: B-Zellpopulationen in der Milz der Huki CD22 Mäuse sind signifikant verändert Abbildung 27: Veränderte Zellzahlen in Knochenmark und Milz der heterozygoten Huki CD22 Mäuse Abbildung 28: Signifikant reduziertes Homing der rezirkulierenden B-Zellen der Huki CD22 Mäuse ins Knochenmark Abbildung 29: Erhöhter Calciumeinstrom nach Stimulation des BZR in Milzzellen der Huki CD22 Mäuse Abbildung 30: CD22 auf B-Zellen der Huki CD22 Maus wird nach Stimulation des BZR phosphoryliert und SHP-1 wird rekrutiert Abbildung 31: CD22 auf B-Zellen der Huki CD22 Mäuse wird nach Antikörperbindung endozytiert VII

10 Abbildung 32: Unveränderte natürliche Antikörperlevel verschiedener Antikörper-Isoformen in Huki CD22 Mäusen Abbildung 33: Unveränderte Immunantwort der Huki CD22 Mäuse nach Immunisierung mit einem Thymus-unabhängigen Antigen Abbildung 34: Unveränderte Immunantwort der Huki CD22 Mäuse nach Immunisierung mit einem Thymus-abhängigen Antigen Abbildung 35: CD22 R130E und CD22 Y2,5,6F Mäuse zeigen signifikant veränderte Serum- Antikörperlevel Abbildung 36: Veränderte Antikörperantworten bei Thymus-unabhängiger Immunisierung der CD22 R130E, CD22 Y5,6F und CD22 Y2,5,6F Mäuse Abbildung 37: Veränderte Antikörperantworten bei Thymus-abhängiger Immunisierung der CD22 R130E, CD22 Y5,6F und CD22 Y2,5,6F Mäuse Abbildung 38: Signifikante Veränderung im Homing der rezirkulierenden B-Zellen der CD22 Y2,5,6F Mäuse ins Knochenmark Abbildung 39: Verringerte Assoziation des CD22 auf B-Zellen der CD22 R130E Mäuse mit dem BZR nach Stimulation der Zellen in einem Proximity ligation assay Abbildung 40: Leichte unspezifische Toxizität des linker-eta Abbildung 41: Keine unspezifische Toxizität des BPC-Neu5Ac-Dimers Abbildung 42: Eine zweite Behandlung mit dem Dimer-ETA reduziert den Anteil der lebenden Zellen weiter Abbildung 43: Nach Dimer-ETA Behandlung sind verschiedene Zellpopulationen in Wildtypmäusen reduziert Abbildung 44: Nach Dimer-ETA Behandlung generieren die Mäuse eine Antikörperantwort des IgG-Isotyps Abbildung 45: Xenotransplantationsversuch Abbildung 46: Xenotransplantationsversuch Abbildung 47: Xenotransplantationsversuch Abbildung 48: Rezirkulierenden B-Zellen zeigen keine Veränderung im Homing ins Knochenmark nach Behandlung von Mäusen mit CD22-Liganden Abbildung 49: Rezirkulierenden B-Zellen zeigen leichte Veränderung im Homing ins Knochenmark nach Behandlung von Mäusen mit CD22-Liganden Abbildung 50: Erhöhung der Antikörperantwort stimulierter humaner Zellen nach Sialinsäurederivat-Behandlung Abbildung 51: DHS (DNAseI-hypersensitive sites) Analyse des murinen Cd22 Gens Abbildung 52: Vergleich der Aminosäuresequenz des zytoplasmatischen Teils des murinen und humanen CD Abbildung 53: Vorläufer des targeting Vektors zur Generierung der Huki CD22 Maus Abbildung 54: Targeting Vektor zur Generierung der Huki CD22 Maus Abbildung 55: Plasmid des ETA -RDEL VIII

11 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Relatives inhibitorisches Potential des BPC-Neu5Ac Tabelle 2: Liste der verwendeten Antikörper Tabelle 3: Verwendete Antibiotika Tabelle 4: Chemikalienauflistung Tabelle 5: Auflistung der verwendeten Zelllinien Tabelle 6: B-Zellpopulationen in Knochenmark, Milz und Peritoneum der Huki CD22 Mäuse sind signifikant verändert IX

12 Einleitung 1 Einleitung 1.1 B-Zellen B-Zellen sind die wichtigsten Mediatoren der humoralen Immunität, d.h. nach Antigen- Bindung sezernieren sie hochspezifische Antikörper. Diese neutralisieren oder opsonisieren eingedrungene Antigene. Der B-Zell-Rezeptor (BZR) ist die membrangebundene Form des Antikörpers, den die B-Zelle nach Aktivierung und Differenzierung sekretiert. Die Spezifität des BZR kommt durch das Rearrangement der Immunglobulin-Gensegmente der schweren und leichten Immunglobulin-Kette während der B-Zellentwicklung zustande. Hierbei werden die V H D H und J H Gensegmente der schweren Kette und die V L und J L Gensegmente der leichten Kette zusammengefügt, die Enden werden prozessiert, die Terminale Desoxynukleotid-Transferase fügt Nukleotide ein und es wird jeweils der konstante Teil der schweren bzw. der leichten Immunglobulin-Kette angehängt. Der variable Teil der schweren und der leichten Kette bilden zusammen die Antigen-Bindungsstelle der B-Zelle. Durch das Rearrangement der Immunglobulingene kann jede denkbare Kombination und entsprechend auch jede mögliche Spezifität des BZR entstehen. Um Autoimmunreaktionen der B-Zellen zu vermeiden, durchlaufen diese während ihrer Entwicklung eine negative Selektion (Janeway 2001) B-Zell Populationen In der Maus und wahrscheinlich auch im Menschen existieren zwei Hauptpopulationen der B- Lymphozyten, die B1- und die B2-Zellen. Die Existenz der B1-Zellen im Menschen ist umstritten, wurde aber von Griffin et al. beschrieben (Griffin et al. 2011; Griffin and Rothstein 2011). Zu den B2-Zellen zählen vor allem die follikulären B-Zellen (FO), sowie die Marginalzonen B-Zellen (MZ). Beide Populationen können die Immunglobulin (Ig) Klasse wechseln und zu Gedächtniszellen differenzieren (Hardy et al. 2007; Martin and Kearney 2002). B1-Zellen hingegen zeigen Charakteristika des angeborenen Immunsystems und werden auch als innate like beschrieben. Sie sind im Gegensatz zu den B2-Zellen vor allem für die Thymus-unabhängige Immunantwort vom TypII wichtig (Fagarasan and Honjo 2000; Martin et al. 2001). 1

13 Einleitung Die B1-Zellen stellen die eine große Lymphozytenpopulation im Peritoneum von Labormäusen dar. Man findet sie außerdem in der Pleurahöhle, in der Milz, in den Peyer- Plaques und im Blut. In den anderen lymphatischen Organen, wie Lymphknoten und im Knochenmark wurden sie bisher nicht nachgewiesen (Berland and Wortis 2002; Hayakawa et al. 1985). Man kann die B1 Zellen anhand ihres Oberflächenphänotyps unterscheiden. Die B1 Zellen sind CD23 -, CD43 +, B220 lo, IgM hi und können in weitere Subpopulationen unterteilt werden. Die peritonealen B1a-Zellen tragen die Oberflächenmarker CD5 + und Mac1 +. Die B1b-Zellen tragen Mac1 +, jedoch kein CD5 auf der Oberfläche, wohingegen die B1-Zellen der Milz CD5 + sind, aber kein Mac1 exprimieren (Kantor 1991). Als wichtigste Aufgabe der B1a Zellen gilt die Produktion von natürlichen Antikörpern (Haas et al. 2005). Natürliche Antikörper sind meist schon vor einer Infektion vorhanden. Experimente mit keimfrei gehaltenen Mäusen zeigten, dass natürliche Antikörper auch in Abwesenheit von Mikroorganismen gebildet werden (Bos et al. 1989; Haury et al. 1997; Hooijkaas et al. 1984). Sie bestehen meist aus Antikörpern des IgM-Isotyps, sind oft schwach autoreaktiv und binden gleichzeitig unterschiedliche, häufig vorkommende bakterielle Strukturen wie LPS, oder Phosphorylcholin (Baumgarth et al. 2005). B2 Zellen entwickeln sich aus lymphoiden Vorläuferzellen (Common Lymphoid Progenitor, CLP).Werden in den CLP die B-Zell-spezifischen Gene angeschaltet, so bezeichnet man dieses erste definierte Stadium der B-Zell-Entwicklung als Prä-Pro-B-Zellen. Diese entwickeln sich zu Pro-B-Zellen und schließlich zu Prä-B-Zellen. In diesem Stadium wird ein Prä-B-Zell-Rezeptor exprimiert. Nun beginnt das Rearrangement der leichten Kette. Wird membranständiges IgM exprimiert, bezeichnet man die Zellen als unreife B-Zellen (Janeway 2001). Unreife B-Zellen, die das Knochenmark verlassen, werden als T1 Zellen bezeichnet und wandern in die Milz. Gelangen diese in die Follikel und exprimieren mehr IgD, IgM und CD23, so bezeichnet man sie als T2 Zellen. Diese Zellen tragen aber noch Marker, die sie als unreife B-Zellen kennzeichnen. Die meisten unreifen B-Zellen reifen in der Milz zu reifen, follikulären B-Zellen oder Marginalzonen B-Zellen (Pillai and Cariappa 2009). Marginalzonen B-Zellen findet man in der Marginalzone der Milz. Diese Zellen erkennen ihr Antigen durch teilweise invariante Rezeptoren, die aus kanonischen Ig-Sequenzen bestehen. Diese lösen eine schnelle Differenzierung der Zellen zu antikörpersekretierenden Zellen aus. Ihre wichtigste Aufgabe liegt wahrscheinlich in der Abwehr von zirkulierenden Pathogenen im Blut. Wie die B1-Zellen spielen auch die Marginalzonen B-Zellen eine wichtige Rolle in 2

14 Einleitung der Thymus-unabhängigen Immunantwort vom TypII. Bei den meisten reifen B-Zellen handelt es sich um follikuläre B-Zellen. Sie befinden sich vor allem in B-Zell Follikeln in sekundären lymphatischen Organen in der Nähe der T-Zell-Zone und spielen eine wichtige Rolle in Thymus-abhängigen Immunantworten (Pillai and Cariappa 2009) Signalweiterleitung in B-Lymphozyten Als erster Schritt in der Signalleitung erfolgt nach der Antigenbindung an die B- Zellrezeptoren ein Kreuzvernetzen dieser Rezeptoren, was zu einer Tyrosin-Phosphorylierung durch Tyrosin Proteinkinasen führt (Brunswick et al. 1991; Campbell 1990). Eine monovalente Antigenbindung an den BZR ist hierbei unzureichend, da sie zu keiner Kreuzvernetzung des BZR führt. Es wird mindestens ein F(ab) 2 Fragment benötigt. Bindet der BZR sein spezifisches Antigen, so verschiebt sich der B-Zell-Antigenrezeptor-Komplex innerhalb der Membran in spezialisierte Mikrodomänen, die so genannten Lipid rafts, in denen sich auch die, für die weitere Signaltransduktion wichtigen, Second messengers befinden (Holländer G. A. 2006). Das Zusammenlagern der B-Zellrezeptoren aktiviert die Tyrosinkinasen Btk, Lyn und Fyn (Brunswick et al. 1991), die mit dem B- Zellrezeptorkomplex assoziieren (Yamanashi et al. 1991). Btk, Fyn und Lyn phosphorylieren die Tyrosine in den ITAM-Motiven (Immunoreceptor tyrosine-based activation motif), die in jeder Ig und Ig -Kette vorhanden sind und die konservierte Sequenz (D/E)X 7 (D/E)XXYXX(L/I)X 7 YXX(L/I) tragen (Cambier 1995; Kurosaki et al. 1995; Reth 1989). Syk bindet an die phosphorylierten ITAMs der Ig Kette über seine SH2-Domänen und wird so aktiviert, was wiederum eine Signalleitung auslöst (Kimura et al. 1996). SH2- Domänen sind Phospho-Tyrosin Bindemotive. Über SH2-Bindung werden wichtige Aktivierungsvorgänge für verschiedene Signalwege ausgelöst. Aktiviertes Syk phosphoryliert das Gerüstprotein BLNK/SLP65 (Engels et al. 2001; Kabak et al. 2002). Die Phospholipase C- 2 (PLC- 2) (Coggeshall et al. 1992) wird zusammen mit BLNK an die Zellmembran rekrutiert, PLC- 2 und Btk binden über ihre SH2-Domänen an das phosphorylierte BLNK und formen einen Signalkomplex, der PLC- 2 phosphoryliert (Takata and Kurosaki 1996). Aktiviertes PLC- 2 hydrolisiert das Membranlipid Phosphatidylinositol 3,4-biphosphat (PIP 2 ) und spaltet es in Inositol 1,4,5-Triphosphat (IP 3 ) und Diacylglycerol (DAG) (Carter et al. 1991). PLC- 2 initiiert damit drei wichtige Signalwege. DAG bleibt membrangebunden, während IP 3 in das Zytosol diffundiert, an IP 3 -Rezeptoren am Endoplasmatischen Retikulum 3

15 Einleitung bindet und damit die Ausschüttung von Calcium aus dem intrazellulären Speicher ER ins Zytosol auslöst (Berridge 1993). Die erhöhte Calciumkonzentration im Zytosol bewirkt das Öffnen von CRAC-Kanälen (calcium release-activatited calcium channels) in der Plasmamembran und damit einen weiteren Calciumeinfluss aus dem extrazellulären Raum. Das Calcium bindet an Calmodulin, das damit seine Konformation ändert und die Serin/Threonin Phosphatase Calcineurin aktiviert. Calcineurin dephosphoryliert dann den Transkriptionsfaktor NFAT, der nun in den Nukleus gelangt und dort als Transkriptionsfaktor wirkt (Gwack et al. 2007). Ein weiterer Effekt der gestiegenen Calciumkonzentration zusammen mit dem gebildeten DAG betrifft die Proteinkinase C (PKC), die nun aktiviert wird und die Serinkinase I B-Kinase (IKK) aktiviert. Dies führt dazu, dass der Inhibitor von NF B (I B) abgebaut wird, wodurch der Transkriptionsfaktor NF B nun ebenfalls in den Nukleus gelangen kann. Ein weiterer Signalweg, der durch den BZR initiiert wird und Proliferation auslöst, beginnt mit der Aktivierung kleiner G Proteine. Die GDP-gebundene Form der kleinen G Proteine ist inaktiv, kann aber durch Austausch des GDP zu GTP aktiviert werden, ein Vorgang, der durch GEFs (Guanine exchange factors) katalysiert wird. Diese aktivierte Form wird jedoch schnell wieder durch die im G Protein enthaltene GTPase umgewandelt. Das wichtigste kleine G Protein in der Signalweiterleitung der B-Zelle ist Ras. DAG aktiviert den GEF RasGRP, welcher wiederum Ras aktiviert, wodurch die MAP Kinase Kaskade eingeschaltet wird. Zunächst wird die Serin/Threonin Kinase MAP Kinase Kinase Kinase (MAPKKK), genannt Raf, phosphoryliert, die dann die MAP Kinase Kinase (MAPKK), auch als Mek bezeichnet, phosphoryliert. Schließlich wird die MAP Kinase bzw. Erk aktiviert. Ras kann auch durch einen zweiten Weg über GEF und den Guanin Nukleotidaustauschfaktor SOS aktiviert werden (Reth and Wienands 1997). SOS wird über das Adaptorprotein Grb2, das an das phosphorylierte Protein BLNK gebunden ist, rekrutiert (Wienands et al. 1998). Das Ziel der MAP Kinase Kaskade ist die Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1. Das aktivierte Erk phosphoryliert den Transkriptionsfaktor Elk-1, der mit Hilfe eines zweiten Transkriptionsfaktors, dem Serum response factor, die FOS Transkription steigert. Außer Erk wird noch der Transkriptionsfaktor Jun benötigt, um AP-1 zu bilden. Jun wird konstitutiv im Zytoplasma exprimiert, wird durch die Proteinkinase JNK aktiviert und in den Nukleus translokalisiert, wo er auf FOS trifft. 4

16 Einleitung Das BZR-Signal wird durch Corezeptoren moduliert. Diese Corezeptoren bestehen aus costimulatorischen Proteinen oder Co-Rezeptorkomplexen wie CD19, CD21 und CD81. Es werden aber auch negative Regulatoren wie CD22 (Nitschke et al. 1997) und FcγRIIb, die das B-Zellrezeptorsignal herunterregulieren können, exprimiert. (Janeway 2001) 1.2 Siglecs Siglecs gehören zur Immunglobulin Superfamilie und sind Sialic-acid binding Immunoglobulin-like lectins, also sialinsäurebindende Immunglobulin-ähnliche Lektine, und werden auch als TypI Lektine bezeichnet. Bei Lektinen handelt es sich um spezifische kohlenhydratbindende Proteine. Die Mitglieder dieser Familie von Oberflächenproteinen sind Adhäsionsmoleküle, die Sialinsäuren in spezifischen Verknüpfungen binden. Sie werden auf Zellen des Immunsystems exprimiert. Eine Ausnahme ist MAG (myelin associated glycoprotein), das auf myelinierten Gliazellen exprimiert wird (Quarles 2007). Andere Siglecs wurden außer auf Zellen des Immunsystems auch in anderen Zelltypen gefunden. So wird Siglec-11 beispielsweise nicht nur auf Makrophagen, sondern auch auf Microglia des Gehirns exprimiert (Angata et al. 2002). Alle Siglecs zeigen ähnliche Strukturen. So bestehen sie aus Immunglobulin-ähnlichen Domänen im extrazellulären Teil, deren Anzahl jedoch variiert. Im zytoplasmatischen Bereich finden sich Stellen für eine mögliche Tyrosin-Phosphorylierung. Oft sind diese Tyrosine Teil eines ITIM-Motivs (immunoreceptor based inhibitory motif). N- terminal tragen die Siglecs eine V-set Ig-Domäne zur Sialinsäurebindung (siehe Abbildung 1). In den meisten Siglecs befindet sich in der V-set Domäne ein wichtiges Arginin, das eine Salzbrücke mit negativ geladenen Carboxylgruppen der Sialinsäuren bildet. Zwei weitere aromatische Aminosäuren in dieser Domäne sind ebenfalls konserviert in der Siglec-Familie und dienen der Ligandenerkennung (Alphey et al. 2003; Attrill et al. 2006a; Attrill et al. 2006b; Dimasi et al. 2004; May et al. 1998; Zaccai et al. 2003; Zaccai et al. 2007). Sialinsäure ist ein Überbegriff für eine große Familie von 9-Kohlenstoff-Zuckern, Derivaten von Neuraminsäuren, die als terminale Zucker in Glycoproteinen vorkommen. Neuraminsäuren stellen die häufigste Form der Sialinsäure im Menschen dar und werden durch eine Aminogruppe an der C-5 Position charakterisiert, die N-acetyliert ist. Sie werden deshalb auch als N-Acetyl Neuraminsäuren (Neu5Ac) bezeichnet. In den meisten Vertebraten 5

17 Einleitung kann die Acetyl Gruppe durch die Hydrolase Cmah in eine N-Glycolyl-Gruppe konvertiert werden. Hieraus resultiert die N-Glycolyl Neuraminsäure Neu5Gc (Pillai et al. 2011). Alle bekannten Siglecs, außer Siglec-6, erkennen Sialinsäuren, die normalerweise auf vielen Zelloberflächen und auf extrazellulären Glycoproteinen vorkommen (Crocker et al. 2007; Crocker and Redelinghuys 2008). Die Siglecs zeigen aber eine große Varianz in der Spezifizität für verschiedene Glycosid-Bindungen der Sialinsäuren. So bevorzugt CD22 beispielsweise α2,6-gebundene Sialinsäuren, wohingegen MAG α2,3-gebundene Sialinsäuren bevorzugt (Zaccai et al. 2003). Die humanen und murinen Siglecs können, wie in Abbildung 1 zu erkennen, in zwei Gruppen unterteilt werden. Die Mitglieder der ersten Gruppe sind Sialoadhesin (Siglec-1), CD22 (Siglec-2), das Myelin-assoziierte Glycoprotein (MAG, Siglec-4) und Siglec-15. Sie zeigen wenig Sequenzhomologie untereinander und haben in allen Säugern klare Orthologe (Angata et al. 2007; Crocker and Redelinghuys 2008). Von den 13 humanen und 9 murinen Siglec- Proteinen sind also 4 hoch konserviert (Tateno et al. 2007). Die zweite Gruppe der Siglecs besteht aus CD33-verwandten Siglecs, die untereinander eine sehr hohe Sequenzhomologie aufweisen. Diese zweite Gruppe scheint sich relativ schnell durch Genduplikation, Exonshuffling, den Verlust von Exons oder durch Genkonversion zu entwickeln (Angata et al. 2004; Crocker and Redelinghuys 2008). Oft finden sich keine klaren Orthologe zwischen verschiedenen Säugetieren (Angata et al. 2004). 6

18 Einleitung Abbildung 1: Siglec Familie Schematische Darstellung der einzelnen humanen und murinen Mitglieder der Siglec-Familie. Die Siglecs können in zwei Gruppen unterteilt werden. Die erste Gruppe, deren Mitglieder während der Evolution konserviert blieben, aber nur % Sequenzhomologie untereinander aufweisen, besteht aus Sialoadhesin, CD22, MAG und Siglec-15. Die zweite Gruppe, die CD33-verwandten Siglecs, haben sich im Laufe der Evolution stark zwischen den Spezies verändert. Die einzelnen Mitglieder der Subfamilie besitzen aber innerhalb einer Spezies bis zu 80 % Sequenzähnlichkeit. In der Abbildung werden Siglec-12 und Siglec-13 nicht gezeigt, da diese bisher bei Primaten gefunden wurden, nicht aber bei Menschen (Angata et al. 2004). Siglec-16 wird ebenfalls nicht gezeigt. (Ajit Varki; Richard D. Cummings 2009; Jellusova 2010) Eine weitere Einteilungsform unterteilt die Siglecs nach ihrer Funktion in drei Gruppen. Die erste Gruppe besteht hier nur aus Siglec-1 und Siglec-4, die keine inhibitorischen Signalmotive tragen und neutrale Transmembrandomänen besitzen. In der zweiten Gruppe befinden sich alle Siglecs, deren hauptsächliche biologische Funktion vermutlich in der inhibitorischen Wirkung über ITIMs besteht. Hierzu zählt CD22. Zu der dritten Gruppe gehören die Siglecs, die positiv geladene Gruppen in der Transmembranregion tragen z.b. Siglec-H und Siglec-15). Diese positiv geladene Gruppe ermöglicht eine Assoziation mit dem Transmembranprotein DAP-12, dessen Transmembranbereich negativ geladen ist und das ein ITAM trägt. Über die Phosphorylierung dieses ITAMs wird über die Syk-Tyrosinkinase- Familie ein aktivierendes Signal vermittelt (Pillai et al. 2011). 7

19 Einleitung CD22 CD22 ist ein Mitglied der konservierten Siglecs und wird von B-Zellen ab dem prä-b-zell Stadium exprimiert. Neue Studien haben ergeben, dass es auch auf gastrointestinalen Eosinophilen (Wen et al. 2012), Neuronen (Mott et al. 2004), humanen Basophilen (Han et al. 2008; Toba et al. 2002), auf kultivierten humanen Mastzellen (Yokoi et al. 2006) und T- Zellen (Sathish et al. 2004) exprimiert wird. Allerdings handelt es sich bei Sathish et al. um die einzige Gruppe, die CD22 auf T-Zellen nachweisen konnten. Auch bei den anderen eben genannten Zellpopulationen war die Expression von CD22 schwach und die funktionelle Bedeutung ungeklärt. Auf B-Zellen findet man CD22 vor allem auf reifen B-Zellen. Auf Plasmazellen ist CD22 herunterreguliert (Walker and Smith 2008). Untersucht man die CD22 Expression auf B-Zellen in der Milz, so findet man die geringste CD22 Expression auf T1 Zellen, wohingegen FO, MZ und T2 Zellen CD22 stärker exprimieren. Interessanterweise sind genau die Zellpopulationen, die in CD22 knockout Mäusen reduziert sind, diejenigen, die CD22 stark exprimieren. CD22 könnte also die Reifung der transitionellen B-Zellen in der Milz regulieren (Santos et al. 2008). Bei CD22 handelt es sich um einen inhibitorischen Co-Rezeptor, der mit dem B-Zellrezeptor assoziiert ist. Es bindet an α2,6 verknüpfte Sialinsäuren. Die Struktur von CD22 ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Die extrazelluläre Domäne des CD22 besteht aus sieben Ig-Domänen, von denen die zwei amino-terminalen Domänen an der Bindung von Sialinsäure beteiligt sind. Vor allem der Aminosäure Arginin an Position 130 des murinen CD22 wird eine zentrale Rolle bei der Ligandenbindung zugeschrieben (Alphey et al. 2003; Attrill et al. 2006a; Attrill et al. 2006b; Dimasi et al. 2004; May et al. 1998; van der Merwe et al. 1996; Zaccai et al. 2003; Zaccai et al. 2007). Im Menschen gibt es eine zweite Spleißform des CD22. Die Exons 6 und 7 werden hier ausgelassen, was dazu führt, dass das resultierende CD22 nur 5 Ig-Domänen hat (Stamenkovic et al. 1991; Wilson et al. 1991). Der zytoplasmatische Schwanz enthält sechs konservierte Tyrosine, von denen drei (Y783, Y843, Y863 in der Maus, Y762, Y822, Y842 im Menschen) zu ITIMs gehören. Ein weiteres Tyrosin ist Teil eines ITIM-like Motivs (Y817 in der Maus, Y796 im Menschen) und eins wird für die Rekrutierung von Grb-2 benötigt (Y828 in der Maus, Y807 im Menschen) (Fujimoto et al. 2006; Otipoby et al. 2001). 8

20 Einleitung Es wurde gezeigt, dass CD22 ein endozytierender Rezeptor ist. Der Anteil von CD22 im Inneren der Zellen kann bis zu dreimal so hoch sein, wie der von CD22 auf der Zelloberfläche (Du et al. 2008; Shan and Press 1995). CD22 wird aber nicht, wie lange angenommen, nach der Endozytose degradiert, sondern wird wieder auf die Zelloberfläche recycelt. Liganden von CD22 werden hierbei vom CD22 getrennt und akkumulieren im Zellinneren, während CD22 über die Endosomen wieder auf die Oberfläche transportiert wird. An CD22 gebundene Antikörper bleiben jedoch an CD22 gebunden und werden mit dem CD22 an die Zelloberfläche zurücktransportiert (O'Reilly et al. 2011). CD22 befindet sich auf der Zellmembran vor allem in clathrin-coated pits Mikrodomänen, in denen es in homomultimeren Komplexen vorliegt. Bindet der B-Zell-Rezeptor ein Antigen, so werden der Rezeptor und CD22 in lipid rafts transloziert und das hier lokalisierte Lyn kann eine Phosphorylierung von CD22 katalysieren (Han et al. 2005) Inhibition des BZR-Signals Die inhibitorische Wirkung des CD22 wird über Tyrosin-Phosphorylierung von ITIM- Motiven (Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) im zytoplasmatischen Schwanz von CD22 ausgelöst. Ein ITIM besteht aus einer konservierten Sequenz (Ile/Val/Leu/Ser)-X- Tyr-X-X-(Leu/Val), die ein phosphorylierbares Tyrosin enthält, das durch Lyn phosphoryliert wird (Bolland and Ravetch 1999). Nach Kreuzvernetzung des B-Zell Rezeptors wird CD22 sehr schnell phosphoryliert, wobei die Src Kinase Lyn eine entscheidende Rolle spielt (Smith et al. 1998). Phosphoryliertes CD22 bietet Bindestellen für viele SH2-Domänen enthaltende Moleküle wie Lyn und Syk (Tuscano et al. 1996), die Tyrosin- Phosphatase SHP-1 (Doody et al. 1995; Law et al. 1996) und PLC-γ2 (Law et al. 1996). Wie in Abbildung 2 dargestellt, bindet die Tyrosin-Phosphatase SHP-1, die auch in anderen Regulations-Signalwegen wichtig ist, an phosphorylierte ITIM-Motive, wird aktiviert, und dephosphoryliert verschiedene Substrate, die das Calciumsignal inhibieren (Doody et al. 1995). SLP65/BLNK ist ein solches Zielsubstrat von SHP-1 in B-Zellen (Gerlach et al. 2003). Des Weiteren aktiviert SHP-1 eine Calciumpumpe, so dass Calcium aus den Lymphozyten gepumpt wird und das Calciumsignal beendet oder vermindert wird (Chen et al. 2004). Phosphoryliertes CD22 kann weitere Signalmoleküle, wie beispielsweise Grb-2, binden. Mäuse, denen Grb-2 in den B-Zellen fehlt, zeigen eine erhöhte Calciumantwort nach Stimulation des B-Zell-Rezeptors und eine erniedrigte CD22 Phosphorylierung. Dies könnte 9

21 Einleitung ein Hinweis darauf sein, dass eine Interaktion von CD22 und Grb-2 einen weiteren Regulationsmechanismus der B-Zell-Aktivierung darstellt (Ackermann et al. 2011; Jang et al. 2011). Bei Zellen, die einen Klassenwechsel zu IgG durchgeführt haben, wurde gezeigt, dass das Calciumsignal nach Stimulation stärker als bei einem IgM BZR ist. Die Signale, die über IgG im Zellinneren ausgelöst werden, scheinen sich von den des IgM BZR zu unterscheiden (Horikawa et al. 2007; Waisman et al. 2007). Mäuse, die nur IgG1 auf der Membran der B- Zellen exprimieren, zeigen ein starkes Calciumsignal. Dieses kann jedoch verstärkt werden, wenn man CD22 ausschaltet. CD22 könnte also auch bei IgG BZR Signalen eine inhibierende Rolle spielen (Waisman et al. 2007) Abbildung 2: Regulation des B-Zellrezeptorsignals durch CD22 Die Abbildung zeigt schematisch die unterschiedlichen Bindungspartner von CD22 und die Signalwege, die von CD22 beeinflusst werden (Jellusova and Nitschke 2012). Neue Studien zeigen, dass CD22 auch in anderen Signalwegen eine Rolle spielt, die vom BZR Signalweg unabhängig sind. Beispielsweise übt CD22 eine regulierende Funktion in TLR (Toll-like receptor) Signalwegen aus. (Jellusova et al. 2010; Kawasaki et al. 2011; O'Reilly et al. 2011; Tuscano et al. 1999) Phänotyp der CD22 knockout Maus CD22- knockout (-/-) Mäuse zeigen eine erhöhte BZR-vermittelte Calciummobilisierung in B-Zellen der Milz (Nitschke et al. 1997; O'Keefe et al. 1996; Otipoby et al. 1996; Sato et al. 10

22 Einleitung 1996). CD22-defiziente Zellen zeigen einen teilweise aktivierten Phänotyp, indem sie MHCII stärker und IgM weniger stark als Wildtyp B-Zellen exprimieren. B-Zellen CD22-defizienter Mäuse zeigen eine erhöhte Apoptoserate nach einer anti-igm Stimulation und eine verstärkte Proliferation nach LPS Stimulation. Die Zahl von rezirkulierenden B-Zellen im Knochenmark und die Population der transitionellen B-Zellen und der Marginalzonen B-Zellen in der Milz sind in CD22-/- Mäusen verkleinert. (Nitschke et al. 1997; O'Keefe et al. 1996; Otipoby et al. 1996; Samardzic et al. 2002; Sato et al. 1996). Die Marginalzonen B-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei Thymus-unabhängigen Immunantworten vom Typ II. Dies erklärt, warum bei CD22 defizienten Mäusen die Immunantwort auf TNP-Ficoll verringert ist (Nitschke et al. 1997; Otipoby et al. 1996; Samardzic et al. 2002). CD22-/- Mäuse zeigen allerdings normale Antikörperantworten nach einer Immunisierung mit Thymus-abhängigen Antigenen (Nitschke et al. 1997; Otipoby et al. 1996; Sato et al. 1996). Allerdings scheint die Dynamik in diesen Zellen verändert zu sein. Bei einem Versuch mit adaptiv transferierten CD22-/- Zellen zu Thymus-abhängigen Immunantworten, war der erste proliferative Schub der B-Zellen stärker, wenn CD22 nicht exprimiert wird. Keimzentren formten sich schneller und Plasmablasten entwickelten sich früher. Die Zahl der antikörperproduzierenden Zellen sank später aber wieder (Onodera et al. 2008) Ligandenbindung von CD22 Die Ligandenbindestelle von CD22 liegt N-terminal in der ersten Ig Domäne. Diese vermittelt die Bindung von α2,6 verknüpfte Sialinsäuren (Varki and Angata 2006). Die Affinität von CD22 für diese Sialinsäuren ist niedrig, aber da diese in hoher Konzentration auf den murinen und humanen B-Zellen vorliegt, ist CD22 meist konstitutiv in cis an diese B-Glycoproteine gebunden, also maskiert (Collins et al. 2002; Collins et al. 2006a; Danzer et al. 2003; Razi and Varki 1998). Diese Sialinsäuren befinden sich beispielsweise auf Zellmembranproteinen wie CD45, dem B-Zell-Rezeptor oder auf CD22-Proteinen selbst (Adachi et al. 2012; Bakker et al. 2002; Hanasaki et al. 1995). Die Nähe von CD22 und IgM scheint nötig für die inhibitorische Wirkung von CD22 zu sein (Doody et al. 1995). Diese Interaktion scheint aber eher auf Proteininteraktionen zu beruhen, als auf Sialinsäurebindung, da die Assoziation dieser Proteine mit CD22 mit mutierter Ligandenbindedomäne nicht signifikant verändert ist (Zhang and Varki 2004). Stattdessen scheint CD22 selbst der wichtigste cis Ligand zu sein. Auf ruhenden B-Zellen finden sich deshalb CD22 Homomultimere (Han et al. 2005). 11

23 Einleitung Die biologische Funktion der cis-ligandenbindung konnte bisher nicht eindeutig geklärt werden (Walker and Smith 2008). Es wurden verschiedene Ansätze verwendet, um die CD22- Liganden-Bindung zu untersuchen. Einer davon ist das Ausschalten der ST6Gal-I Sialyltransferase, die Sialinsäuren auf Galaktose in α2,6-verknüpfung überträgt und so den natürlichen Liganden für CD22 bereitstellt. Mäuse ohne St6Gal-1, also Mäuse ohne diese CD22-Liganden, zeigen Hypoimmunantworten (Collins et al. 2006b; Ghosh et al. 2006; Grewal et al. 2006). Sie haben eine reduzierte B-Zell-Proliferation und reduzierten Calciumeinstrom. Die Phosphorylierung von CD22 ist erhöht und es wird verstärkt SHP-1 rekrutiert (Collins et al. 2006b; Grewal et al. 2006). Dazu passend wurde in ST6GalIdefizienten Mäusen eine verstärkte Assoziation von CD22 mit dem BZR gefunden (Grewal et al. 2006). CD22-/- Mäuse haben eine normale B-Zell-Entwicklung, zeigen jedoch einen erhöhten Calciumeinstrom nach Stimulation durch den Mangel an negativer Regulation. Mäuse die weder CD22 noch ST6GAL-I tragen, zeigen den gleichen Phänotyp, wie CD22- defiziente Mäuse (Collins et al. 2006b; Ghosh et al. 2006; Grewal et al. 2006). Ein weiterer experimenteller Ansatz betrifft die 2,6Sia-Bindedomäne von CD22. CD22AA Mäuse, bei denen die Aminosäuren Arginin 130 und Arginin 137, die für die Interaktionen mit den Sialinsäuren in vitro nötig sind, durch Alanin ersetzt sind, haben den gleichen Phänotyp wie CD22-defiziente Mäuse. Diese Mäuse zeigen jedoch normale Tyrosin-Phosphorylierung und normalen Calciumeinstrom nach der Stimulation des BZR (Poe et al. 2004). Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die Bindung von Sialinsäure die inhibitorische Funktion von CD22 negativ reguliert. Versuche mit murinen CD22-/- Zellen, die retroviral mit CD22 transfiziert wurden, das keine Sialinsäure mehr binden kann, zeigten jedoch eine schwächere CD22 Tyrosin-Phosphorylierung, eine reduzierte Assoziation mit SHP-1 und ein verstärktes Calciumsignal (Jin et al. 2002; Kelm et al. 2002). Dies wiederum deutet darauf hin, dass die Sialinsäurebindung für die inhibitorische Wirkung von CD22 essentiell ist. Eine eindeutige Aussage über die Funktion der cis-liganden lässt sich aufgrund der gegensätzlichen Ergebnisse nicht treffen. Auch die Bindung von CD22 in trans an α2,6 verknüpfte Sialinsäuren auf anderen Zellen kann die Aktivierung von B-Zellen modulieren. Tritt die B-Zelle in Kontakt mit Zellen, die CD22-Liganden tragen, so führt dies zu einer Hemmung der B-Zellantwort, was die Vermutung nahe legt, dass die Bindung von CD22 an Liganden in trans ein möglicher Mechanismus ist, um eigene von körperfremden Zellen zu unterscheiden und das BZR-Signal 12

24 Einleitung entsprechend zu modulieren (Lanoue et al. 2002). Verschiedene Studien zeigen, dass CD22 auf einer kleinen Gruppe ruhender B-Zellen unmaskiert vorliegt (Danzer et al. 2003; Floyd et al. 2000) oder auf aktivierten B-Zellen nach der BZR-Kreuzvernetzung unmaskiert wird (Razi and Varki 1998), was es dem CD22 ermöglichen würde, an Liganden benachbarter Zellen in trans zu binden. Es ist für die Bindung niedrigaffiner Sialinsäuren zwar nötig, dass CD22 unmaskiert wird, höher affine Sialinsäuren können jedoch in einer Konkurrenzreaktion das CD22 von seinen cis-liganden lösen und so die CD22 Signalleitung aktivieren, oder eine Verschiebung auf der Zelloberfläche ermöglichen (Collins et al. 2006a). Es scheint deshalb so, als würde ein dynamisches Gleichgewicht existieren, in dem CD22, je nach der Affinität bzw. Avidität der Liganden, zwischen cis und trans Interaktionen wechseln kann. Wird nun Entwicklungsstadiums-spezifisch bewusst CD22 maskiert oder unmaskiert, so kann das Gleichgewicht zugunsten einer der Interaktionen verschoben werden (Walker and Smith 2008). Diese eben genannten B-Zellpopulationen mit unmaskiertem CD22 finden sich vermehrt im Knochenmark (Floyd et al. 2000). Zusätzlich treten sie häufiger bei Marginalzonen B-Zellen, transitorischen B-Zellen und peritonealen B1a-Zellen auf (Danzer et al. 2003). In Subpopulationen humaner B-Zellen wird CD22 nach anti-igm und CD40 Stimulation demaskiert. Dies legt die Vermutung nahe, dass demaskiertes CD22 einen aktivierten Zustand dieser B-Zellen anzeigt. Des Weiteren kann auch die Expression des CD22 auf der Zellmembran verändert werden. Nach IgM Stimulation wurde auf konventionellen B2-Zellen die CD22 Expression reduziert. Wird jedoch mit LPS oder anti- CD40 stimuliert, so erhöht sich die CD22 Expression auf der Zellmembran. Diese Regulation kann auf Ebene der mrna stattfinden (Lajaunias et al. 2002), aber auch durch CD22 Internalisierung (Chan et al. 1998). Die bislang verfügbaren Daten deuten darauf hin, dass die negativ regulierende Wirkung des CD22 sowohl über cis, als auch über trans Interaktionen ausgelöst werden kann und dass beide Methoden das B-Zell-Signal modulieren können. Beide Interaktionsarten sind wichtig, um die inhibitorische Wirkung des CD22 auf die B-Zell-Aktivierung zu kontrollieren (Jellusova and Nitschke 2012; Nitschke 2009, 2005; Walker and Smith 2008). 13

25 Einleitung CD22 knockin-mäuse mit mutierten Ligandenbindungs- und Signalleitungs-Domänen Poe et al. generierten zwei knockin Mauslinien mit Mutationen im murinen CD22. Eine Mauslinie trägt ein verkürztes CD22-Molekül, bei dem die beiden äußersten Ig-Domänen nicht exprimiert werden. Die zweite Mauslinie trägt Mutationen in den beiden, für die Sialinsäurebindung entscheidenden, Argininresten. Beide Mauslinien zeigen eine geringere CD22- und IgM-Expression und eine verstärkte MHCII-Expression auf den B-Zellen. Nach BZR-Stimulation in vitro proliferieren die Zellen weniger. In vivo ist die turnover-rate jedoch erhöht. Diese Phänotypen stimmen mit denen der CD22-/- Maus überein. Das Calciumsignal und die Tyrosinphosphorylierung zeigen jedoch keine Unterschiede zum Wildtyp (Poe et al. 2004). Um die Funktion der Ligandenbindedomäne und der ITIM-Motive des CD22 näher zu untersuchen, wurden weitere knockin Linien generiert (Geus 2006; Obermeier 2011). Die CD22 R130E Mäuse tragen eine Mutation in der Ligandenbindedomäne. Die Zahl der rezirkulierenden B-Zellen im Knochenmark ist in diesen Mäusen nicht reduziert, aber wie die CD22-/- Mäuse zeigen auch die CD22 R130E Tiere eine verringerte Anzahl an MZ B-Zellen in der Milz. Das Calciumsignal der B-Zellen dieser Mäuse nach Stimulation des B-Zell- Rezeptors ist deutlich reduziert, verglichen mit Zellen von Wildtypmäusen. Dies liegt vermutlich daran, dass das CD22 der R130E Mäuse nicht mehr in der Lage ist Oligomere zu bilden. Da CD22 selbst Liganden für andere CD22 trägt, liegen es Oligomeren vor (Han et al. 2005). Da diese Multimerisierung durch die Unfähigkeit des mutierten CD22, Sialinsäure zu binden, nicht mehr erfolgt, kann das CD22 verstärkt mit dem BZR assoziieren und das Signal stärker inhibieren. Bei Co-Immunpräzipitationen konnte gezeigt werden, dass CD22 stärker mit dem BZR interagiert, wenn die Ligandenbindedomäne mutiert ist (Obermeier 2011). Um zu untersuchen, welche Rolle die Signalleitungsdomänen des CD22 spielen, wurde knockin Mäuse mit Mutationen in den ITIMs generiert. Bei den Mäusen der CD22 Y5,6F Linie sind die Tyrosine Nummer 5 und 6 des intrazellulären Teils des CD22 mutiert. Somit sind zwei der drei ITIM-Motive in diesen Mäusen nicht mehr vorhanden. Bei den Mäusen der Linie CD22 Y2,5,6F ist zusätzlich das dritte ITIM-Motiv durch Mutation des zweiten Tyrosins verändert. Das Calciumsignal ist in B-Zellen der CD22 Y5,6F Mäuse nach Stimulation des BZR erhöht. Das der B-Zellen der CD22 Y2,5,6F Mäuse liegt noch über dem 14

26 Einleitung der CD22 Y5,6F Mäuse. Analysiert man verschiedene B-Zell Populationen, so findet man weniger MZ B-Zellen in der Milz beider Mauslinien. Die Anzahl der rezirkulierenden B- Zellen im Knochenmark ist ebenfalls reduziert. Dieser Effekt ist in den CD22 Y2,5,6F Zellen deutlicher ausgeprägt, als in den CD22 Y5,6F Mäusen (Obermeier 2011) Modifikationen der α2,6 verlinkten Sialinsäuren verstärken die Affinität der CD22-Bindung In Mäusen werden die Sialinsäuren in zwei Formen exprimiert: Neu5Ac und Neu5Gc. Das Enzym Cmah bewirkt die Umwandlung von Neu5Ac zu Neu5Gc. Dieses ist während der Evolution des Menschen verloren gegangen. Menschen exprimieren deshalb ausschließlich Neu5Ac (Varki 2009). Humanes CD22 kann beide Formen der Sialinsäure binden, wohingegen murines CD22 bevorzugt Neu5Gc bindet. Die Biochemiker R. Brossmer aus Heidelberg und S. Kelm aus Bremen haben, zusammen mit der Gruppe Nitschke, basierend auf bekannten Kristallstrukturen von Sialoadhesin (Siglec-1) als Co-Kristall mit α2,3 Sialinsäure, das Sialinsäurederivat BPC-Neu5Ac (Methyl-α-9-N- Biphenyl-4-carbonyl-amino-9-deoxy-Neu5Ac) entwickelt, das hochspezifisch an humanes CD22 bindet. BPC-Neu5Ac (Abbildung 3 rechts) bindet mit 200-fach höherer Affinität an humanes CD22 als der natürliche Ligand Neuraminsäure (Abbildung 3 links), aber nur mit sehr geringer Affinität an murines CD22 oder an andere Siglecs (Kelm et al. 2002). Das relative inhibitorische Potential der beiden Sialinsäuren (rip) ist in Tabelle 1 dargestellt. Methyl-α-Neu5Ac (Me-α-Neu5Ac) Methyl-α-9-N-(biphenyl-4-arbonyl)-amino-9-desoxy-Neu5Ac (BPC-Neu5Ac) Abbildung 3: Struktur von Me-Neu5Ac und BPC-Neu5Ac Strukturelle Darstellung von Neu5Ac in der α2,6-verknüpfung der natürlichen Liganden von CD22 (links) und von dem Sialinsäurederivat BPC-Neu5Ac (rechts) 15

27 Einleitung Me-Neu5Ac BPC-Neu5Ac hcd22 rip mcd22 rip 1 5 Tabelle 1: Relatives inhibitorisches Potential des BPC-Neu5Ac Vergleich des relativen inhibitorischen Potentials (rip) von Me-Neu5Ac und BPC-Neu5Ac auf humanem und murinem CD22 (Kelm et al. 2002) Eine Strukturanalyse der Gruppe von Y. Jones in Oxford zeigte, dass BPC-Neu5Ac mit hydrophoben Aminosäuren in der Bindetasche von Sialoadhesin interagiert (Zaccai et al. 2003). Es wurde vorhergesagt, dass über die Aminosäuren Methionin und Arginin von humanem CD22 eine besonders stabile Interaktion mit der Biphenylgruppe von BPC-Neu5Ac möglich wäre. Diese Aminosäuren sind jedoch in murinem CD22 nicht konserviert, was die hohe Affinität des hcd22, nicht aber des mcd22 für BPC-Neu5Ac erklärt (siehe Tabelle 1). BPC-Neu5Ac verdrängt den endogenen cis-liganden von CD22 und kann, da es hochaffin bindet, die Calcium-Signalleitung erhöhen (Kelm et al. 2002). BPC-Neu5Ac bindet jedoch nicht ausschließlich an hcd22, sondern auch an schwächer an Sialoadhesin. Andere Siglecs spielen scheinbar jedoch keine Rolle bei der Bindung der BPC-Neu5Ac Sialinsäuren (Chen et al. 2010) Das Homing von B-Zellen Die Gewebelokalisation bzw. das Homing bezeichnet die Fähigkeiten eines Zelltyps, seinen Zielort zu finden. Zytokine und Chemokine steuern die Organisation der peripheren lymphatischen Gewebe und die Fähigkeit der B- und T-Zellen, ihre verschiedenen Zielorte zu finden. Das Homing ist also die Zielortbestimmung der Lymphozyten beim Ansteuern ihres zukünftigen Standortes. In erwachsenen Mäusen entwickeln sich die B-Zellen im Knochenmark, bis sie ein Stadium erreichen, indem sie Oberflächen-IgM exprimieren und als transitorische B-Zellen das Knochenmark verlassen. Die Zellen wandern in die Milz, in der sie zu langlebigen B-Zellen reifen, die IgD stark exprimieren. Diese Zellen zirkulieren durch den Körper, bis sie schließlich auch ins Knochenmark zurückkehren. Es wurde beobachtet, dass CD22-Liganden auf Endothelzellen im Knochenmark, aber nicht in anderen Organen, konstitutiv exprimiert werden (Nitschke et al. 1999). Es wäre möglich, dass CD22 als 16

28 Einleitung Homing-Rezeptor von rezirkulierenden B-Zellen ins Knochenmark dient. CD22 scheint hierbei mit 2,6Sia auf den Endothelzellen von Sinusioden des Knochenmarks zu interagieren (Nitschke et al. 1999). Das Blockieren der Liganden im Knochenmark mit löslichem CD22 Fc-Protein reduziert die Zahl der rezirkulierenden B-Zellen im Knochenmark. CD22- defiziente Mäuse zeigen eine verringerte Anzahl von rezirkulierenden B-Zellen im Knochenmark (Nitschke et al. 1997). Poe et al. konnten aber beispielsweise keinen Homing- Defekt der B-Zellen mit CD22 mit Mutationen in der Ligandenbindedomäne nachweisen (Poe et al. 2004). 1.3 Immunotoxine zur Behandlung von B-Zell Lymphomen In Deutschland erkranken jährlich mehr als Menschen an einem malignen Non- Hodgkin-Lymphom der B-Zell-Reihe. In den westlichen Industrieländern steigt die Inzidenzrate der Erkrankung kontinuierlich an und hat sich innerhalb der letzten Jahrzehnte fast verdoppelt (Fisher and Fisher 2004). Es besteht eine direkte Beziehung zwischen der Überlebensrate von Tumorpatienten und der Anzahl der noch überlebenden Tumorzellen nach Operationen, Strahlen- und Chemotherapie. Die vollständige Eliminierung maligner Zellen ist bei allen neoplastischen Erkrankungen die Voraussetzung für eine langfristige Heilung. Resterkrankungen könnten durch eine zielgerichtete Immuntherapie im Anschluss an eine Standardtherapie bekämpft werden. Eine weitere weit verbreitete und die B-Zellen betreffende Krankheit ist Systemic Lupus Erythematosus (SLE). Eine halbe Million Menschen in Europa sind von dieser Autoimmunkrankheit betroffen. SLE führt zu einem Verlust der immunologischen Toleranz, wodurch Autoantikörper gebildet werden, die in den Nieren akkumulieren, wo sie die Krankheit auslösen (Ehlers et al. 2006). Autoantikörper sind nicht per se pathogen. Gesunde Individuen tragen ebenfalls detektierbare Level von Autoantikörpern (Bullock et al. 1979). Da B-Zellen eine wichtige Rolle bei den oben genannten Krankheiten spielen, werden verschiedene B-Zell-Oberflächenproteine als Ziel für die Therapie genutzt. Ein Antikörper- Toxin Konjugat, das CD33 bindet, ist Gemtuzumab. Bispezifische Antikörper binden an zwei Zielantigene. Hierzu zählt Blinatumomab, das gegen CD19 und CD3 gerichtet ist (Hoelzer 2011). Rituximab, ein unkonjugierter Antikörper bindet an CD20, ein Oberflächenprotein auf 17

29 Einleitung B-Zellen. Es internalisiert nur langsam. Rituximab ist ein chimärer humaner/muriner Antikörper. Es führt zu einer effizienten B-Zell Depletion. Aus in vitro Studien resultieren verschiedene Modelle, wie Rituximab seine Zielzellen tötet. Hierzu gehört complementdependet cytotoxicity, antibody-dependent cytotoxicity und die Induktion von Apoptose (Maloney et al. 2002). Für junge Chronische Lymphatische Leukämie (CLL) Patienten besteht momentan die Standardtherapie aus einer Kombination von Rituximab und Fludarabine-basierter Chemotherapie (Biberacher et al. 2011). Paul Ehrlich beschrieb 1896 erstmals das drug targeting nach dessen Prinzip Immunotoxine entwickelt werden. Er beschrieb ein magic bullet, einen gewebespezifischen Träger, der Toxine zu neoplastischen Geweben bringt (Messmer and Kipps 2005). Immunotoxine sind komplexe Makromoleküle mit zwei verschiedenen funktionellen Einheiten (Vitetta et al. 1983). Die erste Komponente ermöglicht die Bindung an eine Zielzelle. Sie besteht hierzu beispielsweise aus monoklonalen Antikörpern, Zytokinen, Liganden oder löslichen Rezeptormolekülen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Sialinsäure zur spezifischen Bindung an CD22 genutzt. Die zweite Komponente ist ein Toxin, welches optimaler Weise internalisiert und in der Zielzelle freigesetzt wird und wirkt. Immunotoxine verbinden also eine hohe Spezifität mit zytotoxischer Potenz. Bisher ist noch kein ausschließlich tumorspezifischer Antikörper beschrieben, da die meisten Zielstrukturen auch auf den normalen menschlichen Geweben exprimiert werden. Somit ist der Ausschluss von Kreuzreaktivität mit lebenswichtigen menschlichen Organen eine wichtige Voraussetzung bei der Entwicklung neuer Immunotoxine. Der Schwerpunkt der Immunotoxinforschung hat sich auf die Suche nach spezifischen Antigenen von Leukämien und Lymphomen verschoben. Die Zytotoxizität hängt vom gewählten Antikörper und dessen Affinität zu dem Zielantigen ab. Eine wichtige Rolle spielt auch die Anzahl der Zielantigene auf der Tumorzelle. Es kommt zum Wirkungsverlust des Immunotoxins, wenn das erkannte Antigen nicht von der Zielzelle internalisiert wird oder wenn der Antigen-Immunotoxinkomplex zu schnell lysosomal abgebaut wird (Barth et al. 1997; Kreitman and Pastan 1994). Des Weiteren kann es zum so genannten shedding kommen, bei dem die Zellen die Zielantigene nicht mehr exprimieren und so von dem Immunotoxin nicht mehr gebunden werden können (Matthey et al. 2004). Ein weiteres Problem beim Einsatz von Immunotoxinen ist, dass der Patient das vascularleak-syndrome (VLS) entwickeln kann. Durch einen direkten toxischen Effekt des 18

30 Einleitung Immunotoxins an den Endothelzellen kommt es zur Extravasion von Flüssigkeit (Barth et al. 1997). Symptome hiervon sind Gewichtszunahme und ein Anstieg des Serum Albumin- Levels (Amlot et al. 1993). Ein weiteres Kennzeichen von VLS ist die Erhöhung der vaskulären Permeabilität, begleitet von dem Austreten von Flüssigkeit und Proteinen, was zu Ödemen und Organversagen führt. Die Ursachen hierfür sind noch nicht genau verstanden (Baluna and Vitetta 1997) Pseudomonas Exotoxin A Die für Immunotoxine verwendeten Toxine sind pflanzlicher (z.b. Saporin) oder bakterieller Herkunft. Bakterielle Toxine wie das Pseudomonas Exotoxin A (ETA) oder Diphteriatoxin, werden in Endo- und Exotoxine unterteilt. Endotoxine sind an der äußeren Hülle gramnegativer Bakterien lokalisiert. Sie bestehen aus Lipopolysacchariden, wie zum Beispiel dem Lipid A. Exotoxine sind komplexe Proteine, die als Ausscheidungsgifte von Bakterien freigesetzt werden. Eine Untergruppe der Exotoxine ist die Klasse der AB-Toxine. Diese Toxine sind aus zwei Komponenten zusammengesetzt. Teil A bringt die katalytische Aktivität mit sich und Teil B, der auch aus mehreren Untereinheiten bestehen kann, ist für die spezifische Bindung an die Zielzelle verantwortlich. Zu dieser Klasse von Immunotoxinen gehört auch das Exotoxin A. Das Pseudomonas Exotoxin A (ETA) wird vom Bakterium Pseudomonas aeruginosa exprimiert. Dieses gramnegative Bakterium ist stäbchenförmig und mit Haftfimbrien besetzt. Es kann eine Vielzahl toxischer Proteine exprimieren, die Gewebeschäden verursachen und die menschliche Immunabwehr beeinflussen können (Iglewski et al. 1977; Wieland et al. 2002). ETA besteht aus drei funktionellen Domänen (Allured et al. 1986). Die Domäne I befindet sich im N-terminalen Bereich des ETA mit einer Größe von 28kDa und trägt die Bindedomäne (Gray et al. 1984). Sie besteht aus den Untereinheiten a und b, die in der Kristallstruktur sehr nahe aneinander liegen, in der Aminosäuresequenz jedoch durch Domäne II getrennt sind. Die Domäne Ia ist für die Bindung des Toxins an die Zielzelle verantwortlich (Hwang et al. 1987). Die Bedeutung der Domäne Ib ist noch ungeklärt (Siegall et al. 1989). Das C-terminale Fragment ist 37 kda groß und enthält die Translokationsdomäne (Domäne II) und die ADP-Ribosylierungsdomäne (Domäne III) (Gray et al. 1984). 19

31 Einleitung Das Funktionsprinzip von ETA ist in Abbildung 4 dargestellt. Wie hier zu erkennen, bindet ETA mit seiner Domäne Ia an einen α 2 -makroglobulin Oberflächenrezeptor (Kounnas et al. 1992), der daraufhin über coated pits und das Endoplasmatische Retikulum internalisiert und proteolytisch prozessiert wird. ETA kann hierbei auf verschiedenen Wegen das ER erreichen. Der Transport vom Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) zum ER kann entweder über den Golgi-Apparat erfolgen, oder aber auch direkt. Durch die zelluläre Protease Furin wird das Toxin im ER innerhalb der Domäne II gespalten (Chiron et al. 1994; Ogata et al. 1992). Durch Translokation erreicht das C-terminale Fragment, welches aus Teilen der Domäne II und der vollständigen Domäne III besteht, das Zytosol. Hierzu ist eine spezielle Endoplasmatische Retikulums-Retentionssequenz notwendig, wie die Aminosäuresequenz KDEL, die an den KDEL Rezeptor bindet (Ogata et al. 1992). Das Toxin katalysiert im Inneren der Zielzelle die ADP-Ribosylierung des Elongationsfaktors 2 und blockiert somit die Proteinbiosynthese der Zelle, was wiederum zum Zelltod führt (Kreitman and Pastan 1994). Abbildung 4: Retrograder Transport von Exotoxin A ins Zytosol der Zelle Rot: Domäne I des ETA; blau: Domäne II, grün: Domäne III des ETA. 20

32 Einleitung Die Domäne Ia, also die Bindedomäne, kann ersetzt werden. Auf diese Weise kann ein rekombinantes Toxin hergestellt werden. Die Retentionssequenz kann ebenfalls ohne Aktivitätsverlust verändert werden. Mögliche Aminosäuresequenzen sind REDLK, REDL, KDEL oder RDEL (Chaudhary et al. 1990; Theuer et al. 1993). Es wurde beobachtet, dass Immunotoxine und Peptide, die mit KDEL oder RDEL enden, an den KDEL-Rezeptor im Endoplasmatischen Retikulum binden, die die mit REDLK, der nativen Sequenz von ETA enden, aber nicht. ETA mit KDEL oder RDEL am C-Terminus hat eine hundertfachfach höhere zytotoxische Aktivität als ETA mit REDLK (Kreitman and Pastan 1995). Endet ETA beispielsweise mit der Sequenz LDEL, so ist das Protein nicht toxisch. Des Weiteren werden nichtbasische Aminosäuren im ER-Retentionsmotiv nicht toleriert und die Toxizität geht verloren (Chaudhary et al. 1990) Gekoppelte Immunotoxine Werden Immunotoxine durch chemische Kopplung der Antikörper an das Toxin hergestellt, so ist es wichtig, dass die Verbindung zwischen der Bindungsstruktur und dem Toxin eine schnelle Dissoziation in der Blutbahn verhindert und trotzdem eine intrazelluläre Freisetzung des Toxins gewährleistet. Diese Kriterien werden z.b. von Kopplungsreagenzien erfüllt, die sterisch geschützte Disulfidbrücken enthalten (Barth et al. 1997) CD22-Immunotoxine Aufgrund seiner hohen Expression auf vielen B-Zellen ist CD22 sehr gut als Ansatzpunkt zur Therapie geeignet, da es auf der überwiegenden Mehrzahl aller malignen B-Zell-Lymphome (Pawlak-Byczkowska et al. 1989), auf 65 % der B cell acute lymphoblastic leukemia (BLL) Zellen (Hurwitz et al. 1988) und auf 51 % aller kindlichen Vorläufer B-ALL-Zellen (Herrera et al. 2003) exprimiert wird. Neue Ergebnisse zeigen, dass CD22 auch auf der Oberfläche praktisch aller B cell precursor acute lymphoblastic leukemia (BCP-ALL) exprimiert wird (Boue and LeBien 1988). Verschiedene therapeutische Ansätze beinhalten anti-cd22 Antikörper mit pflanzlichen und bakteriellen Toxinen (Kreitman et al. 1993), RNasen (Schirrmann et al. 2009), Ribosomen inaktivierende Proteine (Flavell et al. 1997) und deflycosylierende Ricin A Ketten (Ghetie et al. 1991). CD22 ist außerdem ein endozytierender Rezeptor. Die Endozytose wird bei Antikörper- oder Ligandenbindung 21

33 Einleitung ausgelöst, was CD22 zu einem gutes Zielprotein für Immunotoxine macht (O'Reilly and Paulson 2009). Verschiedene Antikörper, die an CD22 binden, wurden bisher getestet. Antikörper, die die Ligandenbindungsstelle von CD22 blockieren, lösen starke Zelldepletion bei B-Zellen und B- Zell-Lymphomen aus. Dies könnte ein weiterer Ansatzpunkt für eine B-Zell gerichtete Therapie sein (Haas et al. 2006) Epratuzumab Epratuzumab (LymphoCide ) ist ein humanisierter anti-cd22 IgG1 monoklonaler Antikörper. Es bindet CD22 an der dritten extrazellulären Domäne (Epitop B), ohne dass die Ligandenbindungsstelle blockiert wird. Durch die Bindung induziert Epratuzumab CD22 Phosphorylierung und ADCC ohne aber direkt apoptotisch zu wirken, oder das Töten der Zellen durch Aktivierung des Komplementsystems auszulösen (Traczewski and Rudnicka 2011). In in vitro und in vivo Studien wurde gezeigt, dass die Oberflächenexpression von CD22 bei Behandlung mit Epratuzumab abnimmt (Jacobi et al. 2008). In Phase II Studien und einer in einer early Phase III abgebrochenen Studie wurde die Wirksamkeit des Epratuzumab gegen SLE gezeigt (Traczewski and Rudnicka 2011) BL22 Ein Immunotoxin, das CD22 als Zielprotein benutzt, ist BL22. BL22 wird momentan in Phase I und II klinischen Studien getestet, in denen es komplette Remission bei 80 % der Patienten bei hairy cell leukemia zeigte. Dieses Immunotoxin trägt die variable Domäne des anti- CD22 monoklonalen Antikörpers RFB4, gekoppelt an ein 38 kda Fragment des ETA. In Phase I Studien zeigte BL22 keine Nebenwirkungen wie Allergien, vascular leak syndrome (VLS) oder hemolytic uremic syndrome. Die Halbwertszeit im Blut beträgt 35 bis 248 Minuten. 3 von 23 Personen entwickelten neutralisierende Antikörper gegen BL22 (Wayne et al. 2010). ETA, das radioaktiv markiert wurde, zeigte eine deutlich geringere Halbwertszeit. Nach 2 Stunden konnte nur noch 5 % des ETA im Blut nachgewiesen werden, wohingegen von BSA zu diesem Zeitpunkt noch 30 % im Blut nachweisbar war (Pavlovskis and Shackelford 1974). 22

34 Einleitung HA22 ist die Weiterentwicklung von BL22. Es bindet durch Mutationen in der Binderegion mit höherer Affinität an CD22 (Salvatore et al. 2002) Weitere gegen CD22 gerichtete Immunotoxine Weitere Immunotoxine, die gegen humanes CD22 gerichtet sind, sind beispielsweise Inotuzumab, ein humanisierter anti-cd22 monoklonaler Antikörper, der an Calicheamicin gekoppelt ist (Kantarjian et al. 2012) und an Doxorubicin-beladene liposomale Nanopartikel gekoppeltes BPC-Neu5Ac als hochaffiner Ligand für CD22 (Chen et al. 2012). 1.4 Mausmodelle für Leukämien und Lymphome In der biomedizinischen Forschung wird für bestimmte Tierarten, die spontan oder nach einer gezielten Einleitung eine bestimmte Erkrankung entwickeln, auch der Begriff Tiermodell verwendet. Durch die Forschung an solchen Tiermodellen sollen Hinweise zu den Ursachen und zur Behandlung von menschlichen Erkrankungen gewonnen werden. Somit sind Tiermodelle essentiell, um das Wissen über Krankheitspathogene zu erweitern und um neue Therapien zu entwickeln (McCormack et al. 2005). Die Ähnlichkeit des menschlichen und murinen Immunsystems erlaubt das Studium menschlicher Krankheiten, Neoplasien und Entartungen von Immunzellen im Mausmodell. Diese Tiermodelle sind somit unter anderem in der Onkologie, bei der Erforschung von Autoimmunität, Allergien, Infektionen und Transplantationen wichtig. Ein viel verwendetes Mausmodell sind SCID-Mäuse (severe combined immunodefiency disease). Diese tragen eine Mutation in einem Gen, dessen Produkt verantwortlich für die DNA-Reparatur und die Rekombination der VDJ-Segmente ist. Ohne dieses Protein ist die Generierung von T- und B-Zellrezeptoren nicht möglich. Dies führt zu einem Block in der Entwicklung dieser Zelltypen, es bilden sich keine reifen T- und B-Zellen. Die Mäuse haben jedoch ein funktionierendes angeborenes Immunsystem. Allerdings ist die Blockierung der VDJ-Rekombination unvollständig und sie wird mit steigendem Alter durchlässiger (Thomsen et al. 2005). 23

35 Einleitung Bei NOD Mäusen, handelt es sich um Nonobese diabetic mice. Sie tragen multiple Defekte in der angeborenen Immunität. Zu diesen Defekten gehört, dass diese Mäuse kein C5-Protein exprimieren und somit das Komplementsystem nicht aktivieren können. Ebenfalls gestört ist die Aktivierung der natürlichen Killerzellen (Johansson et al. 2004). Diese kombinierten Defekte in NOD/SCID-Mäusen ermöglichen eine bessere Xenotransplantationsrate von z.b. menschlichen AML-Zellen und anderen B-Zell Lymphomen, als beispielsweise in SCID-Mäusen, da bei diesen Mäusen zusätzlich zum fast fehlenden adaptiven Immunsystem auch die NK-Zell-Aktivität stark verringert ist. Die Xenotransplantate behalten die morphologischen, phänotypischen, genotypischen und biologischen Charakteristika der eingesetzten AML-Zellen. Jedoch zeigen auch in diesen Modelltieren nur ca. 70 % der eingesetzten AML-Proben ein messbares Anwachsen (McCormack et al. 2005). 24

36 Zielsetzung 1.5 Zielsetzung der Arbeit Um Immunotoxine und Antikörper, die humanes CD22 als Zielprotein nutzen, besser erforschen zu können, sollte eine CD22 knockin Maus generiert werden, die humanes statt murinem CD22 auf der Oberfläche der B-Zellen exprimiert. Zunächst sollte hierfür ein Targeting Vektor kloniert werden, der die cdna des humanen CD22 enthält. Nach der Klonierung des Targeting Vektors sollte die Embryonale Stammzelllinie (ES-Zelllinie) E14CreAG mit diesem transfiziert werden. Nach erfolgreichem PCR-Screening und Bestätigung der positiven Klone per Southern Blot, sollten ES-Zellen dieser Klone in Blastozysten injiziert werden. Die resultierende Huki CD22 knockin Maus sollte nun analysiert werden. Hierbei sollte insbesondere untersucht werden, ob sie humanes CD22, jedoch kein murines CD22 auf der B-Zell Oberfläche exprimiert, ob die B-Zellentwicklung normal verläuft, ob das humane CD22 nach Antikörperbindung endozytiert wird und ob die Signalweiterleitung nicht beeinträchtigt ist. Weitere Untersuchungen sollten sich mit den Antikörperantworten nach Immunisierung und dem Homing der B-Zellen befassen. In einem weiteren Versuchskomplex sollten die, in unserer Gruppe generierten, CD22 knockin Mäuse mit Mutationen in der Ligandenbindedomäne und Signalleitungsdomäne, die CD22 R130E, die CD22 Y5,6F und die CD22 Y2,5,6F Mäuse, weiter analysiert werden. So sollten die Thymus-unabhängige und abhängige Immunantwort, die natürlichen Antikörperlevel, das Homing der B-Zellen und die Co-Lokalisation des CD22 mit dem BZR in diesen Mäusen untersucht werden. Die dritte experimentelle Aufgabenstellung befasste sich mit der Anwendung hochaffiner Sialinsäurederivate als künstliche Liganden für CD22. BPC-Neu5Ac-Dimer wurde an ETA gekoppelt und dieses Immunotoxin sollte zunächst in vitro auf Zelllinien getestet werden. In einem nächsten Schritt sollte es in vivo in einem Xenotransplantationsmodell eingesetzt werden. Des Weiteren sollten mit hochaffinen Sialinsäurederivaten Experimente zur Inhibition von CD22 und damit einhergehender verstärkter Antikörperproduktion, sowie zum CD22-vermittelten Homing von B-Zellen durchgeführt werden. 25

37 Material 2 Material 2.1 Antikörper und Konjugate Spezies Eingesetzte Firma Isotyp, Klon Verdünnung Fc-block 2.4G2 1:100 Arbeitskreis (Anti-CD32/16) - für die Durchflusszytometrie muriner Zellen AnnexinV FITC 1:400 BioVision Anti-IgD FITC 11.26C-1 1:100 Arbeitskreis Anti-IgM PE g F(ab ) 2 1:40 Caltag Laboratories Anti-IgM FITC :100 Arbeitskreis Anti-CD1d FITC 1B1 1:50 BD Pharmingen Anti-CD11b (Mac1) FITC r IgG2b, 1:50 ebioscience M1/70 Anti-CD19 FITC 103 1:200 Arbeitskreis Anti-CD21 FITC 7E9 1:200 Arbeitskreis Anti-CD22.2 PE m IgG1, 1:100 BD Pharmingen Cy34.1 Anti-CD23 PE B3B4 1:200 ebioscience Anti-CD25 bio PC61 1:200 ebioscience Anti-CD4 PE r IgG2a, 1:200 BD Pharmingen GK1.5 Anti-CD43 PE 1:250 BD Pharmingen Anti-CD45.1 FITC m IgG2a, 1:1000 BD Pharmingen A20 Anti-CD45R/B220 APC r IgG2a, RA3-6B2 1:200 ebioscience 26

38 Material Anti-CD45R/B220 PE-Cy5 r IgG2a, 1:200 BD Pharmingen RA3-6B2 Anti-CD45R/B220 FITC r IgG2a, 1:100 ebioscience RA3-6B2 Anti-CD5 PE r IgG2a, 53-1:200 BD Pharmingen 7.3 Anti-CD5 APC :100 ebioscience Anti-CD8a FITC r IgG2a, 53-1:50 ebioscience 6.7 ckit PE 2B2 1:100 ebioscience Anti-MHCII FITC (IA b ) :50 BD Pharmingen Streptavidin PE Cy5 1:300 ebioscience Streptavidin PE Cy5.5 1:200/1:400 ebioscience -für die Durchflusszytometrie humaner Zellen Anti-CD19 Pe 4G7 1:100 Becton Dickinson Anti-CD20 FITC 1:100 Coulter Anti-CD22-bio 1:100 Ancell Anti-CD22 PE ebio4kb128 1:50 ebioscience -für die Komplement vermittelte T-Zell Lyse Anti-CD4 IgM, RL µl Hybridomüberstand Arbeitskreis /Milz Anti-CD8 IgM, µl Hybridomüberstand Arbeitskreis /Milz Anti-CD90 (Thy-1) IgM, AT µl Hybridomüberstand Arbeitskreis /Milz -zur Stimulation von B- Zellen Anti-Maus-IgM gf(ab ) µg/ml JacksonImmunoresearch Anti-Maus-IgM B µg/ml Arbeitskreis Anti-human-IgM gf(ab ) 2 JacksonImmunoresearch 27

39 Material -für ELISA Anti-IgG AP/ UNLB g polyklonal 1:1000 SouthernBiotech Anti-IgM AP/ UNLB g polyklonal 1:1000 SouthernBiotech Anti-IgA AP/ UNLB g polyklonal 1:1000 SouthernBiotech Anti-IgG1 AP/ UNLB g polyklonal 1:1000 SouthernBiotech Anti-Ig2a AP/ UNLB g polyklonal 1:1000 SouthernBiotech Anti-Ig2b AP/ UNLB g polyklonal 1:1000 SouthernBiotech Anti-Ig3 AP/ UNLB g polyklonal 1:1000 SouthernBiotech Anti-IgG human AP 1:300 JacksonImmunoresearch Anti-IgM human AP 1:300 JacksonImmunoresearch Anti-IgA human AP 1:300 JacksonImmunoresearch - Westernblot Antikörper Maus anti-humancd22 migg1 monoclonal 1:1500 Santa Cruz Biotechnology Kaninchen anti-murincd22 1:5000 Geschenk von P. Crocker Maus anti-ziege-hrp 1:5000 Jackson Dianova Ziege anti-mouse-hrp 1:5000 Jackson Dianova Maus anti-phosphothyrosin (4G10) 1:5000 Millipore Ziege anti-kaninchen-hrp 1:5000 Jackson Dianova Kaninchen anti-shp1 1:5000 Millipore -Antikörper für Immunpräzipitation Maus anti-human CD22 -Antikörper für MACS Aufreinigungen Anti-humanCD19 Micro Beats migg1 monoclonal migg1 monoclonal 2-4 µg Santa Cruz Biotechnology Miltenyi Biotech Anti-murinCD19 MicroBeats rigg2a Miltenyi Biotech Tabelle 2: Liste der verwendeten Antikörper Abkürzungen: m Maus, r Ratte, g Ziege 28

40 Material 2.2 Antibiotika Substanz Ampicillin Aprotinin Ionomycin Kanamycin Leupeptin Penicillin/Streptomycin Firma Sigma Roche Sigma Sigma Boehringer Gibco Tabelle 3: Verwendete Antibiotika 2.3 Chemikalien Substanzen Strukturformel Hersteller Aceton C 3 H 6 O Roth Acrylamid-Bisacrylamid (29:1) (Rotiphorese Gel) Roth Agar Sigma Agar-Agar Roth Agarose Roth Albumin murin Alkaline Phosphatase Boehringer Ammoniumsulfat H 8 N 2 O 4 S Roth APS (Ammoniumpersulfat) (NH 4 ) 2 S 2 O 8 Sigma Betain C 5 H 11 N0 2 Sigma Bovine Serum Albumin Roth BriJ 58 (Polyoxyethylen 20 cetylether) Roth Brillant Blue G (Coomassie) C 47 H 48 N 3 O 7 S 2 Na Sigma Bromphenolblau Merck Calciumchlorid Dihydrat CaCl 2 x 2H 2 O Roth Casein Hydrolysat (Pepton) Gibco 29

41 Material Chloroform (Trichlormethan) CHCl 3 Roth DEPC (Diethylpyrocarbonat) Roth Diethanolamin C 4 H 11 NO 2 Roth Di-Kaliumhydrogenphosphat-trihydrat K 2 HPO 4 x 2 H 2 O Sigma DMF (N,N-Dimethylformamide) C 3 H 7 NO Applichem DMSO (Dimethylsulfoxid) C 2 H 6 SO Roth Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat Na 2 HPO 4 x 2H 2 0 Roth EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) C 10 H 16 N 2 O 8 Roth EDTA Dinatriumsalz C 10 H 14 N 2 Na 2 O 8 x H 2 O Applichem Essigsäure C 2 H 4 O 2 Roth Ethanol C 2 H 6 0 Roth Ethanol vergällt Roth Ethidiumbromid Roth FCS Biotech Ficoll 400 Sigma Formaldehyd CH 2 O Roth Glucose (D(+)-Glucose-Monohydrat) C 6 HO x H 2 O Merck Glycerin C 3 H 8 O 3 Applichem Glycin C 2 H 5 NO Roth Harnstoff CH 4 N 2 O Roth Hefeextrakt Roth HEPES C 8 H 18 N 2 O 4 S Sigma Imidazol C 3 H 4 N 2 Roth IPTG (Isopropyl β-d-thiogalactoside) C 9 H 18 O 5 S Applichem IPTG (Isopropyl β-d-thiogalactoside) Roth Kaliumacetat C 1 H 3 KO 2 Roth Kaliumchlorid Kcl Roth Kaliumhydrogenphosphat KH 2 PO 4 Roth Kaliumpermanganat KMnO 2 Sigma Kanamycinsulfat Roth Leupeptin Konservierer Wasserbad Roth L-Glutamin Gibco 30

42 Material Magnesiumchlorid Hexahydrat MgCl x 6 H 2 O Roth Magnesiumsulfat Heptahydrat MgSo 4 X 7 H 2 O Merck Maltose Monohydrat C 12 H 22 O 11 x H 2 O Merck Manganchlorid Tetrahydrat MnC l2 x 4 H 2 O Roth Mercaptoethanol (2-Mercaptoethanol) Gibco Methanol CH 4 O Roth Methylenblau C 16 H 18 CIN 3 S Sigma Milchpulver Roth MOPS C 7 H 15 NO 4 S Roth Natriumacetat Trihydrat C 2 H 3 NaO 2 x 3H 2 0 Merck Natriumazid NaN 3 Sigma Natriumcarbonat Na 2 CO 3 Merck Natriumchlorid NaCl Roth Natriumhydrogenphosphat Monohydrat NaH 2 PO 4 x H 2 O Merck Natriumhydroxid NaOH Roth Natriumpyruvat Gibco Natronlauge 1N NaOH Roth Neuraminidase (Sialidase) Roche Ni-NTA Agarose Qiagen Non-Essential Amino Acids Gibco Pageblue Protein Staining Solution Fermentas Paraformaldehyd CH 2 O Roth Phenol C 6 H 6 O Roth Phenol/ Chloroform Roth Ponceau Stain Propanol (2-Propanol) C 3 H 8 O Roth Propidiumiodid (PI) 50ug/ml C 27 H 34 I 2 N 4 Sigma Proteinase K Roche 4x Roti Load Phenol Roth Saccharose C 12 H 22 O 11 Roth Salzsäure 37 % HCl Roth Salzsäure 4N HCl Roth SDS (Laurylsulfat) C 12 H 25 O 4 SNa Sigma 31

43 Material TEMED (NNNN-Tetramethylethylenediamin) C 6 H 16 N 2 Sigma TRIS C 4 H 11 NO 3 Roth Triton X100 C 33 H 60 O 10 Roth Trypan Blau Sigma Trypton/Pepton aus Casein Roth Türk sche Lösung Roth Tween 20 Roth Wasserstoffperoxid 30 % H 2 O 2 Roth Western Blotting Detecting Reagents 1+2 Amersham Zinkchlorid ZnCl 2 Roth Tabelle 4: Chemikalienauflistung 2.4 Puffer, Lösungen und Medien Annexin-Bindepuffer Für 50 ml: 0,14 M NaCl 1,4 ml 5 M NaCl 2,5 mm CaCl 2 1,25 ml 100 mm CaCl 2 50 mm HEPES/NaOH ph 7,4 5ml aus 500 mm HEPES/NaOH ph 7,4 mit entionisiertem Wasser aufgefüllt Anti-His-TBS Für 1 l: 10 mm Tris ph7,4 10 ml 1 M Tris ph 7,4 0,15 M NaCl 30 ml 5 M NaCl mit entionisiertem Wasser aufgefüllt Brij-Lysepuffer Für 100 ml: 100 mm Tris (ph 7,5) 10 ml 1 M Tris, ph 7,5 70 mm NaCl 1,4 ml 5 M NaCl 5 mm EDTA 1 ml 0,5 M EDTA 32

44 Material 1 % Brij (Brij58) 1 ml Brij (bei 56 C verflüssigen) mit entionisiertem Wasser aufgefüllt Brij-Lysepuffer mit Zusätzen (frisch angesetzt): Für 15 ml Brij Lysepuffer: 1 mm NaOVanadat 300 µl 1 mm PMSF 150 µl 5 µg/ml Leupeptin 75 µl 1 µg/ml Aprotenin 15 µl B-Zell Medium 100 U/ml Penicillin G 100 µg/ml Streptomycin 2 mm L-Glutamin 1x nicht essentielle Aminosäuren, Stammkonzentration 100x 1 mm Natrium Pyruvat 50 µm 2-Mercaptoethanol 10 % PAN FCS in Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) Coomassie-Entfärber Für 1 l: 50 % (v/v) Methanol 500 ml 10 % (v/v) Eisessig 100 ml mit entionisiertem Wasser aufgefüllt Coomassie-Färbelösung 100 ml Coomassie-Entfärber 0,25 g Coomassie Brilliant Blue G 33

45 Material Diethanolaminpuffer Für 1 l: 0,5 mm MgCl2 6H20 0,1 g 0,02 % (w/v) Na-Azid 0,2 g 9,7 % (v/v) Diethanolamin 97 ml mit entionisiertem Wasser aufgefüllt, ph auf 9,8 mit 10 M HCl eingestellt Elektrophoresepuffer Für 1 l: 250 mm Tris 30,3 g 1,92 M Glycin 144,13 g 1 % (w/v) SDS 10 g mit entionisiertem Wasser aufgefüllt ELISA Blockierungspuffer 1 % (w/v) BSA 0,05 % (w/v) Natrium-Azid mit PBS aufgefüllt ELISA Substrat 1 mg pnitrophenylphosphat/ml Diethanolamin Puffer ELISA Verdünnungspuffer 0,1 % (w/v) BSA 0,05 % (w/v) Natrium-Azid mit PBS aufgefüllt EMFI-Medium 100 U/ml Penicillin 100 µg/ml Streptomycin 34

46 Material 2 mm Glutamin 100 µm ß-Mercaptoethanol 10 % ES-FCS in DMEM mit Glutamax ES-Zell Medium 100 U/ml Penicillin 100 µg/ml Streptomycin 2 mm Glutamin 100 µm ß-Mercaptoethanol 15 % ES-FCS U/ml LIF in DMEM mit Glutamax Einfachselektionsmedium: 250 ml ES-Medium 1 ml G418 (100 g/ml) Doppelselektionsmedium: 500 ml ES-Medium 2 ml G µl Gancyclovir FACS Puffer Für 1 l: 1x PBS 100 ml 10xPBS 0,1 % (w/v) BSA 1 g BSA 0,05 % (w/v) Natrium-Azid 500 μl 10 % Natrium-Azid-Lösung mit entionisiertem Wasser aufgefüllt 35

47 Material Gey s Lösung Gey s Lösung setzt sich aus 14 Teilen ddh 2 O, 4 Teilen Lösung A, 1 Teil Lösung B, 1 Teil Lösung C zusammen Lösung A Für 1 l: 654 mm NH 4 Cl 35 g NH 4 Cl 25 mm KCl 1,85 g KCl 8,4 mm Na 2 HPO 4 1,5 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O 0,88 mm KH 2 PO 4 0,12 g KH 2 PO 4 28 mm Glucose 5 g Glucose oder 5,5 g Glucosemonohydrat mit entionisiertem Wasser aufgefüllt, sterilfiltriert Lösung B Für 250 ml: 20,7 mm MgCl 2 1,05 g MgCl 2 x 6H 2 O 5,7 mm MgSO 4 0,35 g MgSO 4 x 7H 2 O 30,8 mm CaCl 2 0,85 g CaCl 2 oder 1,1259 g CaCl 2 x2h 2 O mit entionisiertem Wasser aufgefüllt, autoklaviert Lösung C Für 250 ml: 267,8 mm NaHCO 3 5,625 g NaHCO 3 mit entionisiertem Wasser aufgefüllt, sterilfiltriert Gey s Lösung 350 ml H 2 O 100 ml Lösung A 25 ml Lösung B 25 ml Lösung C 36

48 Material His-Dialysepuffer (10x) Für 6 l: 0,5 M NaOH 117 g NaOH 0,6 M NaH 2 PO g NaH 2 PO 4 3 M NaCl 1051,92 g NaCl 0,1 M Imidazol 40,85 g Imidazol mit entionisiertem Wasser aufgefüllt His-Elutionspuffer Für 1 l: 0,05 M NaH 2 PO 4 6,90 g NaH 2 PO 4 0,3 M NaCl 17,54 g NaCl 0,25 M Imidazol 17,00 g Imidazol mit entionisiertem Wasser aufgefüllt His-Waschpuffer Für 1 l: 0,05 M NaH 2 PO 4 6,90 g NaH 2 PO 4 0,3 M NaCl 17,54 g NaCl 0,02 M Imidazol 1,36 g Imidazol mit entionisiertem Wasser aufgefüllt Indo-Mix 1 µm Indo-1-AM 15 % Pluronic F-127 in DMSO KPO 4 -Puffer Für 1 l: 155 mm KH 2 PO 4 21,10 g KH 2 PO 4 72 mm K 2 HPO 4 125,40 g K 2 HPO 4 37

49 Material mit entionisiertem Wasser aufgefüllt, anschließend autoklaviert Krebs-Ringer Lösung 10 mm HEPES (ph 7) 140 mm NaCl 4 mm KCl 1 mm MgCl 2 1 mm CaCl 2 10 mm Glucose mit entionisiertem Wasser aufgefüllt Lämmli-Puffer (6-fach) Für 1 ml: 0,12 M Tris/HCl ph 8,8 800 µl 1,5 M Tris/HCl ph 8,8 6 % SDS 3 ml 20 % SDS 20 % ß-Mercaptoethanol 200 µl 50 % Glycerin 5 ml 0,3 M Bromphenolblau 0,02 g mit entionisiertem Wasser aufgefüllt LB Medium 10 g/l Trypton 5 g/l Hefeextrakt 10 g/l NaCl mit entionisiertem Wasser aufgefüllt, ph auf 7 eingestellt und autoklaviert Loading Dye (10x) 15 % Ficoll in entionisiertem Wasser lösen bei 50 C 0,25 % Bromphenolblau 0,25 % Xylene Cyanol 38

50 Material Lysepuffer Mausschwänze Für 500 ml: 10 mm Tris/HCl ph 8,0 5 ml 1 M Tris/HCl ph 8,0 5 mm EDTA ph 8,0 5 ml 0,5 M EDTA ph 8,0 0,2 % SDS 5 ml 20 % SDS 0,2 M NaCl 20 ml 5 M NaCl mit entionisiertem Wasser aufgefüllt MACS-Puffer 500 ml PBS 5 % PAN FCS oder 0,5 % BSA 2 mm EDTA Nalm6 RPMI-Medium 100 U/ml Penicillin G 100 µg/ml Streptomycin 1,2 mm L-Glutamin 1x nicht essentielle Aminosäuren, Stammkonzentration 100x 1 mm Natrium Pyruvat 50 µm 2-Mercaptoethanol 10 % PAN FCS in Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) PBS (10x) Für 1 l: 137 mm NaCl 8 g NaCl 2,7 mm KCl 0,2 g KCl 8 mm Na 2 HPO 4 1,15 g Na 2 HPO 4 1,76 mm KH 2 PO 4 0,24 g KH 2 PO 4 mit entionisiertem Wasser aufgefüllt, ph 7,4 39

51 Material Periplasma-Extraktionspuffer Für 1 l: 0,1 M Tris/HCl ph 8,0 100 ml 1 M Tris/HCl ph 8,0 0,5 M Saccharose 171,15 g mit entionisiertem Wasser aufgefüllt, anschließend autoklaviert Ponceau Stain 0,1 g Ponceau Stain 100 ml 5 % Essigsäure Puffer 1 (Mini-Präp) Für 100 ml: 50 mm Glukose 0,99 g 25 mm Tris ph 8,0 2,5 ml 1 M Tris ph 8,0 10 mm EDTA ph 8,0 2,0 ml 0,5 M EDTA ph 8,0 mit entionisiertem Wasser aufgefüllt Puffer 2 (Mini-Präp) Für 10 ml: 0,2 M NaOH 2 ml 1 M NaOH 1 % SDS 1 ml 10 % SDS mit entionisiertem Wasser aufgefüllt Puffer 3 (Mini-Präp) Für 100 ml: 3 M Kalium-Acetat 29,4 g Kalium-Acetat mit entionisiertem Wasser aufgefüllt, ph auf 4,8 mit Eisessig eingestellt 40

52 Material Running Buffer (SDS-Gelelektrophorese) Für 1 l: 0,25 M Tris 30,3 g 1,9 M Glycin 144,13 g 1 % (w/v) SDS 10 g mit entionisiertem Wasser aufgefüllt Sorbitol 728,72 g/l Sorbit mit entionisiertem Wasser aufgefüllt SSC 10x Für 1 l: 300 mm tri-natriumcitrat-dihydrat 88,23 g 3 M NaCl 117,32 g mit entionisiertem Wasser aufgefüllt, ph 7 eingestellt mit HCl Stripping-Puffer für Westernblotmembranen Für 10 ml: 62,5 mm Tris ph 6,7 1 ml 625 mm Tris ph 6,7 2 % SDS 2 ml 10 % SDS 7 % ß-Mercaptoethanol 70 µl mit entionisiertem Wasser aufgefüllt TB-Medium 60 g Trypton 120 g Hefeextrakt 20 ml Glycerin auf 4500 ml mit entionisiertem Wasser aufgefüllt, anschließend autoklaviert 41

53 Material TBE-Puffer (5x) Für 5 l: 0,45 M Tris 270 g Tris 0,01 M EDTA 100 ml aus 0,5 M EDTA-stock 0,44 M Borsäure 137,5 g Borsäure mit entionisiertem Wasser aufgefüllt TBS-Tween-TritonX Für 1 l: 0,02 M Tris ph 7,4 20 ml aus 1 M Tris ph 7,4 0,5 M NaCl 100 ml aus 5 M NaCl 500 µl Tween 20 2 ml Triton x 100 auf 1000 ml mit entionisiertem Wasser aufgefüllt TE-Puffer Für 1 l: 0,5 mm Tris/HCl ph 8,0 0,5 ml aus 1 M Tris/HCl ph 8,0 5 mm EDTA ph 8,0 10 ml aus 0,5 M EDTA ph 8,0 mit entionisiertem Wasser aufgefüllt Transfer-Puffer 10 x (Western Blot) Für 1 l: 250 mm Tris 30,3 g Tris 1,92 M Glycin 144,13 g Glycin mit entionisiertem Wasser aufgefüllt Um 1x Transfer-Puffer zu erhalten wurde 1 Teil 10x Transfer-Puffer mit 2 Teilen Methanol und 7 Teilen entionisiertem Wasser gemischt 42

54 Material TfB1 Für 1 l: 30 mm Kaliumacetat 2,9 g 50 mm Manganchlorid 9,9 g 100 mm Kaliumchlorid 7,5 g 10 mm Calciumchlorid 1,47 g 15 % Glycerol 150 ml mit entionisiertem Wasser aufgefüllt, ph auf 5,8 eingestellt, dann sterilfiltriert TfB2 Für 1 l: 10 mm MOPS 2,1 g 75 mm Calciumchlorid 11 g 10 mm Kaliumchlorid 0,75 g 15 % Glycerol 150 ml mit entionisiertem Wasser aufgefüllt, ph auf 7,0 eingestellt, dann sterilfiltriert Zinkchlorid (1 M) 3,407 g Zinkchlorid auf 25 ml mit entionisiertem Wasser aufgefüllt, anschließend sterilfiltriert 2.5 Zelllinien Zelllinie Zelltyp Referenz Oberflächenmarker HL60 Humane AML (Collins et al., 1977) CD19 -, CD22 - Daudi Humanes Burkitt-Lymphom (Ohsugi et al., 1980) CD19 +, CD22 + Nalm6 Humane Vorläufer-B-ALL (Hurwitz et al., 1979) CD19 +, CD22 + Tabelle 5: Auflistung der verwendeten Zelllinien 43

55 Material 2.6 Versuchstiere Die Tiere wurden unter sterilen und standardisierten Umweltbedingungen (22±1 C Raumtemperatur, 50± 10 % relative Luftfeuchtigkeit, 12 Stunden Tag-Nacht-Zyklus) gehalten und erhielten autoklaviertes Futter und Streu (ssniff Spezialdiäten, Soest, Germany) und angesäuertes Trinkwasser (ph 4,0). Alle Versuche wurden gemäß dem deutschen Tierschutzgesetz durchgeführt. Versuchstiere: BALB/c CD22-/- (C57BL/6) CD22 R130E (C57BL/6) CD22 Y5,6F (C57BL/6) CD22 Y2,5,6F (gemischter Hintergrund C57BL/6, 129sv) CD45.1 (BALB/c) C57BL/6 Huki CD22 (gemischter Hintergrund C57BL/6, 129sv) NOD/SCID (NOD.CB17-Prkdc scid /NcrCrl) 2.7 Sialinsäurederivate Methyl-α-9-Neu5Ac Methyl-α-9-N-(biphenyl-4-carbonyl)-amino-9-deoxy-Neu5Ac (Me-Neu5Ac) (BPC-Neu5Ac) Die Inhibitoren wurden von Professor Reinhard Brossmer am Zentrum für Biochemie in Heidelberg synthetisiert. 2.8 Bakterien BL21(DE3): F-, dcm, ompt, hsdsb, (rb-, mb-), gal, λ(de3) (Studier et. al., 1986) DT5α: F- enda1 glnv44 thi-1 reca1 rela1 gyra96 deor nupg Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYAargF)U169, hsdr17(rk- mk+), λ 44

56 Material 2.9 PCR-Primer 22ex2AS: CTC ACC TCC CTC TCT CTC CTG CTA TTT 22promClas2: TCG TAT CGA TTC THC TCC TGC CTT CGG TGT CD22-2kb KA: TGA GCG GCC GCT CCA CAA ACA CCA TTC TT CD22in4-SalS: GTT GTC GAG GCT CTC AGG TT humcd22mw1: TGA TCC GTG CAC TGG CAT AC humcd22mwneu3: ACC TGT GTG CTC AGC CTA AG OlneoE2: CGG TAT CGC CGC TCC CGA TT OlneoE3: CGC CTT CTA TCT CCT TCT TGA humcd22sonde1: TGG GGT TCA AAC TCA AGT CCT humcd22sonde2: TTA GGC TGA GCA CAC AGG TTC humcd22sonde3: CCT CTG TGG GAT TGA CCT TG humcd22sonde4: CCT CTG ACC ATA GTC ACC TG humcd22sondela1: GAC AGG ACT CTT ATC GGT AAC humcd22sondela2: GAG ATT TCC TTG ACC TTA GTT GC humcd22sondela3: CAT TGA ATC TGT CTG CAG CTC C humcd22sondela4: GGG TGC CGG AAC TAG AAA CTT humcd22 Maus h S: CTC AAA AAC CCA TTT ACT TGA GTC humcd22 Mausm&h S: ATT ACC TGT GCT CCT CTT GAT humcd22 Maus m S: CTT GCT TAG AAA GGT ACA GCT CA 2.10 Reaktionssysteme (Kits) EndoTrap blue von profos zur LPS-Entfernung von bakteriell exprimierten Proteinen QIAGEN Plasmid Maxi Kit zur sauberen Aufreinigung von Plasmid-DNA Random Primers labeling system von Invitrogen zum radioaktiven Labeln der Sonde Nucleotide Removal Kit von Quiagen zum Aufreinigen der Southern Blot Sonden QIAquick Gel Extraction Kit zum Aufreinigen von DNA aus Agarosegelen Clone Jet PCR Cloning Kit zum Klonieren eines Fragmentes in einen blunt-end-vektor Extensor Mastermix von Thermo Scientific zum Screenen der ES-Zellen 45

57 Material 2.11 Geräte und Software Autoklav Schütt Brutschrank Heraeus Cellquest Software Becton Dickinson CellQuest Pro FlowJo Durchflusszytometer FACSCalibur Becton Dickinson Durchflusszytometer LSR II Becton Dickinson ELISA-Reader VERSAmax Molecular Devices Gene Construction Kit Textco-SciQuest GraphPad Prism v4,0b GraphPad Software Imaging Screen K BioRad Microsoft Office Microsoft Molecular Imager TM -FX BioRad PCR-Maschine Gene Amp 9600 Perkin-Elmer PCR-Maschine Primus 96plus Aviso PCR-Maschine Professional Trio Biometra Prism GraphPad Software Sequence Navigator Applied Biosystem Sterilwerkbank BDK (UV6.12 S) Screen Eraser-K BioRad Taumeltisch Peq lab (Mini Rocker MR-1) Trockenspannrahmen Biorad Quantity One BioRad UV Stratalinker Stratagene Zentrifuge Megafuge1.0R Heraeus Zentrifuge 5415C Eppendorf Zentrifuge 5415R Eppendorf Zentrifuge CLGPR Beckman Zentrifuge J2-HS Beckman 46

58 Methoden 3 Methoden 3.1 Zellkultur Alle Arbeiten mit Zellkulturzellen wurden unter sterilen Bedingungen an einer Sterilwerkbank (BDK, UV 6.12 S) durchgeführt. Auch alle Medien und anderen Substanzen, die mit den Zellen in Kontakt kamen, wurden soweit möglich steril behandelt, um Kontaminationen zu verhindern. Die Nährmedien und das Einwegplastikmaterial wurden steril bezogen. Glasmaterial wurde für 3 Stunden bei 180 C im Thermoschrank sterilisiert. Thermolabile Lösungen wurden durch Sterilfiltration entkeimt (0,2 µm, Roth). Andere Lösungen und Puffer wurden bei feuchter Hitze (121 C) und 1,5 bar für 20 Minuten autoklaviert Lebendzellzahlbestimmung Zur Bestimmung der Lebendzellzahl in der Neubauer-Zählkammer wurden den Zellsuspensionen ein 10 µl Aliquot entnommen und mit 90 µl Trypanblau vermischt. Von dieser Mischung wurden 10 µl auf die Neubauer-Zählkammer aufgetragen. Der Farbstoff kann die Membran der lebenden Zellen nicht durchdringen. Somit werden nur tote Zellen blau gefärbt. Diese wurden nicht mitgezählt. Die Zellzahl konnte nun durch folgende Formel berechnet werden: Zellen pro Großquadrat x Verdünnungsfaktor x 10 4 = Zellzahl/ml HL60-, Daudi- und Nalm6- Zellen Bei den verwendeten primären Zelllinien handelt es sich um Zellen, die in Suspensionskultur wachsen. Diese wurden in ihrem entsprechenden Medium in sterilen Zellkulturflaschen im Brutschrank bei einer Temperatur von 37 C und einer Atmosphäre mit gesättigtem Wasserdampfdruck und 6 % CO 2 kultiviert. Alle zwei Tage wurden die Zellen 1:10 gesplittet, indem das alte Medium bis auf wenige Milliliter abgesaugt wurde und neues, vorgewärmtes Nalm6-Medium nachgefüllt wurde. 47

59 Methoden Einfrieren von Zellen Zunächst wurden die Zellen gezählt Zellen wurden abzentrifugiert und in 1 ml eiskaltem sterilem Einfriermedium aufgenommen. Das Einfriermedium bestand aus 50 % RPMI- Medium mit 40 % FCS und 10 % DMSO. Die Zellen mussten nach Zugabe des Einfriermediums immer gekühlt bleiben, damit das DMSO die Zellen nicht beschädigte. Die Zellen wurden zunächst bei -80 C weggefroren. Für eine längere Lagerung wurden sie in flüssigem Stickstoff aufbewahrt Auftauen von Zellen Die Zellen wurden durch Zugabe von warmem Nalm6-Medium aufgetaut, mit 10 ml Medium gewaschen und anschließend in frischem Medium aufgenommen und kultiviert Durchflusszytometrische Analyse humaner Zellkulturzellen Für die durchflusszytometrische Analyse wurden je 1x 10 6 Zellen pro Ansatz benötigt. Diese wurden bei 4 C und 1500 rpm für 5 Minuten zentrifugiert und nach Verwerfen des Überstandes in 100 µl FACS-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe des Antikörpers wurden die Proben 20 Minuten im Dunkeln bei 4 C inkubiert. Es wurde dann 1 ml FACS-Puffer zugegeben und die Proben wurden bei 4 C und 1500 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Die Zellen wurden nach Verwerfen des Überstandes in 200 µl FACS-Puffer aufgenommen und im Durchflusszytometer gemessen Embryonale Fibroblasten-Zellen und Embryonale Stammzellen Kultivierung von EMFIs ES-Zellen wurden auf einer konfluenten Schicht von inaktivierten Feeder-Zellen kultiviert. Als Feeder-Zellen dienten embryonale Fibroblasten (EMFIs). Diese wurden bei der Expansion bis zu 5-mal passagiert. Ihre Inaktivierung erfolgte durch Mitomycin C. Dabei wurde das Medium des Kulturgefäßes entfernt und durch EMFI-Medium mit Mitomycin C (10 µg/ml) ersetzt. Anschließend wurden die Zellen zwei Stunden bei 37 C im Brutschrank inkubiert, das Mitomycin-Medium abgesaugt und die adhärenten Zellen 3 mal mit PBS gewaschen, bevor frisches EMFI- oder ES-Medium auf die Zellen pipettiert wurde. 48

60 Methoden Präparation embryonaler Fibroblasten Zunächst wurden Mäuse verpaart, in diesem Falle meist SiglecG-/- Weibchen mit C57BL/6 Männchen. Die Weibchen tragen das Gen für die Neomycin-Resistenz, so dass die resultierenden EMFIs im Selektionsmedium überleben können. Die Weibchen wurden drei Tage lang jeden Morgen auf einen möglichen Begattungspfropfen untersucht. 14 Tage nach der Befruchtung wurden die schwangeren Mäuse geopfert, die Embryonen entnommen und in einer Schale mit PBS vorsichtig vom Dottersack und der Plazenta getrennt. In einer frischen Schale mit PBS wurden nun Kopf und Leber der Embryonen mit einem Skalpell und einer spitzen Pinzette entfernt. Die übrigen Körper (maximal 20) wurden anschließend durch eine 10ml-Spritze mit einer 18-gauge Kanüle in ein 50 ml Zentrifugengefäß gepresst. Es wurden nun 5-15 ml Trypsin/EDTA zugegeben und bei 37 C für 15 Minuten inkubiert. Nach anschließender Zugabe von 1 Volumen PBS und Mischen wurde kurz gewartet, damit das Gewebe sich absetzen konnte, der Überstand wurde in ein neues Gefäß überführt, mit 1 Volumen EMFI-Medium gemischt und zentrifugiert (1300 rpm, 5 min, 4 C). Nach vorsichtigem Abnehmen des Überstandes mit einer Pipette wurde das Pellet in EMFI-Medium aufgenommen und, je nach Menge, in mittelgroße Zellkulturflaschen verteilt. Das übrige Gewebe wurde wiederum mit 5-15 ml Trypsin/EDTA versetzt und 15 Minuten bei 37 C inkubiert. Die obigen Schritte konnten ca. 4 Mal durchgeführt werden, wobei die größte EMFI-Ausbeute beim zweiten und dritten Mal erreicht wurde. Ab ca. 1 Stunde nach dem Aussähen der Zellen auf die Zellkulturflaschen wurde das Medium in den Flaschen gewechselt und die EMFIs wurden, sobald die Flaschen konfluent bewachsen waren, zunächst bei -80 C und ca. 3 Tage später im flüssigen Stickstoff weggefroren. Ein Embryo entspricht bei diesem Vorgehen ca. 0,5 bis 1 mittleren Flasche und ca. 1,5 weggefrorenen Aliquots Wegfrieren embryonaler Fibroblasten und embryonaler Stammzellen Die Zellen wurden zunächst mit PBS gewaschen. Anschließend wurden sie 5 Minuten mit Trypsin/EDTA bei 37 C inkubiert. Durch Zugabe von EMFI- bzw. ES-Medium wurde das Trypsin inaktiviert. Die Zelllösung wurde nun zentrifugiert (1300 rpm, 5 min, 4 C) und das Pellet in Einfriermedium aufgenommen. Dieses bestand zu 90 % aus ES-FCS mit 10 % 49

61 Methoden DMSO. Die Zellen wurden in Kryoröhrchen in einen Mister Frosty auf -80 C gestellt und nach einigen Tagen im Stickstoff gelagert Auftauen von EMFIs und ES-Zellen Zur Langzeitlagerung wurden ES-Zellen in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Beim Auftauen wurden die Kryoröhrchen mit der jeweiligen eingefrorenen Zellsuspension möglichst schnell in EMFI- bzw. ES-Medium aufgetaut. Nach dem Abzentrifugieren (1300 rpm, 5 min, 4 C) wurde der Überstand verworfen und die Zellen in EMFI-bzw. ES-Medium aufgenommen. Die EMFIS wurden nun in eine frische Gewebekulturflasche überführt und bei 37 C inkubiert. Die ES-Zellen wurden in eine vorbereitete Gewebekulturflasche, die mit inaktivierten EMFIs konfluent bewachsen war, überführt und ebenfalls bei 37 C und 10 % CO 2 inkubiert Kultivieren und Passagieren von ES-Zellen ES-Zellen wurden in ES-Medium auf einer konfluenten Schicht inaktivierter EMFIs kultiviert. Wurden die Zellenkolonien zu dicht oder zu groß, wurden diese passagiert. Dies war im Normalfall alle 2-4 Tage der Fall. Hierzu wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und durch Inkubation mit Trypsin/EDTA (5 min, 37 C) vom Boden der Zellkulturflasche gelöst. Anschließend wurden die Zellen der Suspension durch auf- und abpippetieren vereinzelt. Nach Zentrifugation (1300 rpm, 5 min, 4 C) wurden die Zellen in ES-Medium aufgenommen und in Gewebekulturflaschen mit inaktivierten, konfluent bewachsenen EMFIs ausgesät. Hierbei wurden die Zellen typischerweise 1:3 verdünnt. Alternativ wurde ein Teil der Zellen weggefroren und der Rest auf einer gleich großen Gewebekulturflasche ausgebracht. Die Zahl der Passagen wurde sorgfältig notiert und bei Injektion der ES-Zellen wurde auf eine niedrige Passagen-Zahl geachtet Vorbereitung der ES-Zellen für die Blastozysteninjektion Für die Injektion wurde eine 12 cm-durchmesser-gewebekulturschale mit dicht genug gewachsenen ES-Zellen benötigt. Diese Platte wurde zunächst mit PBS gewaschen. Es wurden nun 2 ml Trypsin/EDTA zugegeben und für 10 Minuten bei 37 C inkubiert. Nach Zugabe von 10 ml ES-Medium wurden die Zellen vereinzelt. Dabei wurde darauf geachtet, nicht zu kräftig auf und ab zu pipettieren, aber die Zellen trotzdem zu vereinzeln. Die 50

62 Methoden Suspension wurde in der Schale gelassen und für 15 Minuten bei 37 C inkubiert. Dabei heften sich die EMFIs schneller an den Boden, als die ES-Zellen. Anschließend wurde der Überstand sehr vorsichtig abgenommen und in ein 15 ml Zentrifugengefäß pipettiert. Danach wurden weitere 4 ml ES-Medium ins Zentrifugengefäß zugegeben und für 3 Minuten bei 800 rpm zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen in 4 ml ES-Medium mit HEPES (200 µl 1 M HEPES in 10 ml ES-Medium) resuspendiert und 30 Minuten auf Eis gestellt. Die ES-Zellen setzen sich in dieser Zeit ab, weshalb es wichtig ist, das Gefäß nicht zu bewegen. Nach Verwerfen des Überstandes wurden die ES-Zellen in 0,5 bis 1 ml ES-Medium mit HEPES aufgenommen und zur Blastozysteninjektion abgegeben Transfektion von ES-Zellen mit DNA Hierzu wurde eine dicht genug mit ES-Zellen bewachsene mittlere oder große ES- Zellkulturflasche benötigt. Idealerweise wurden ca. 1x 10 7 Zellen eingesetzt. Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen für 5 Minuten in Trypsin/EDTA bei 37 C inkubiert. Die Zellen wurden vereinzelt, die Trypsin-Reaktion wurde durch Zugabe von ES-Medium gestoppt und die Suspension für 5 Minuten bei 4 C und 1300 rpm zentrifugiert. Die Zellen wurden in 700 µl ES-Medium aufgenommen und µg der linearisierten und sterilgefällten DNA wurde in Wasser zugegeben. Nach Elektroporation bei 250 V und 500 µf bei RT wurden die ES- Zellen auf Zellkulturschalen mit inaktivierten EMFIs ausgesät. Es wurden 12 Schalen verwendet, von denen eine zur Kontrolle immer normales ES-Medium erhielt. Bei einer Schale wurde das Medium am nächsten Tag zu Einfachselektionsmedium gewechselt, bei den restlichen 10 zu Doppelselektionsmedium. Wurde statt mit dem Targeting Vektor mit dem Kontrollvektor transfiziert, so wurden die ES-Zellen auf 3 Schalen verteilt und nur mit Einfachselektionsmedium selektioniert Etablierung der Screening PCR mit Kontrollvektor-transfizierten ES- Zellen Waren die ES-Kolonien nach der Selektion auf den Schalen groß genug gewachsen, so dass man sie mit bloßem Auge erkennen konnte, wurden ca. 10 Klone gepickt. Der Rest der Schalen wurde weggefroren. Die Lyse der Zellen erfolgte nach demselben Protokoll wie bei den mit dem Endkonstrukt transfizierten Zellen. Die Lysate wurden anschließend verwendet, 51

63 Methoden um die Screening-PCR zu etablieren. Hierzu wurden mit den Lysaten so lange PCRs getestet, bis die meisten Lysate eine positive Bande zeigten Picken von ES-Zell-Kolonien nach der Selektion Nach der Selektion in Doppelselektionsmedium wurden die ES-Zell-Kolonien typischerweise an Tag 8-10 gepickt. Zum Picken der Kolonien wurden je 50 µl PBS in 96-well Platten nach folgendem Muster vorgelegt: Abbildung 5: Muster zum Picken der ES-Zell-Kolonien auf eine 96-well Platte grau: wells, in die ES-Einzelkolonien gesetzt werden Von den Gewebekulturschalen wurde das Medium abgesaugt und 10 ml PBS zugegeben. Eine Pipette wurde auf 25 µl eingestellt. Mit der Pipettenspitze wurde um den Klon herumgefahren und die ES-Kolonie mit 25 µl PBS eingesaugt. Das PBS mit dem ES-Zell-Klon wurde in eine Vertiefung (well) einer U-förmigen 96 well-platte gegeben. Unter dem Mikroskop konnte überprüft werden, ob sich in jedem well ein ES-Klon befand. Anschließend wurde 25 µl Trypsin/EDTA zu jedem well gegeben und die Platten wurden für 5 Minuten bei 37 C inkubiert. Es wurde nun 100 µl PBS zugegeben und die Zellen in den wells durch auf- und abpipettieren vereinzelt. Die Vereinzelung konnte ebenfalls unter dem Mikroskop überprüft werden. Da es für die Zellen schädlich ist, zu lange trypsiniert zu werden, sollte das Vereinzeln jeweils nach zwei Platten durchgeführt werden. 100 µl der Zellsuspensionen wurden nun mit einer 12er Multichannel-Pipette mit freien Positionen in vorbereitete 48-well- Platten, konfluent bewachsen mit inaktivierten EMFIs, überführt. Die übrigen Zellen wurden in der ursprünglichen 96-well Platte belassen und bei 1300 rpm für 5 Minuten abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und pro well wurde 25 µl Wasser zugegeben. Nun wurden 52

64 Methoden die Platten für 15 Minuten auf 80 C gestellt, um die Zellen in hypotonischer Lösung zum Platzen zu bringen. Nach Zugabe von 25 µl Proteinase K pro well (Endkonzentration 0,1 mg/ml) wurden die Platten mit Parafilm abgedichtet und bei 56 C über Nacht inkubiert. Mit den so gewonnenen Zelllysaten wurde die Screening-PCR durchgeführt. 3.2 Arbeit mit kompetenten Bakterien Kompetente Bakterien Um kompetente Bakterien des E. coli Stammes BL21 herzustellen, wurden Zellen des BL21 Stammes frisch auf einer Agarplatte ausplattiert und über Nacht in einem Brutschrank bei 37 C bebrütet. Am nächsten Tag wurde eine Einzelzellkolonie in 6 ml LB-Medium gegeben und über Nacht bei 37 C geschüttelt. Von dieser Kultur wurden dann je 2 ml Lösung in 200 ml SOC Medium pipettiert und ca. zwei Stunden bei 37 C und 200 rpm geschüttelt. Nach der Inkubation wurde der Ansatz für fünf Minuten auf Eis gestellt und dann für 15 Minuten bei 3500 rpm und 4 C zentrifugiert. Die Zellen wurden nun wieder auf Eis gestellt, nach Verwerfen des Überstandes in 20 ml TfBI resuspendiert und 30 Minuten inkubiert. Nach erneutem 15-minütigen Zentrifugieren bei 3500 rpm und 4 C wurde der Überstand verworfen und die Zellen wurden in 5 ml eiskaltem TfB2 Puffer resuspendiert. Schließlich wurden sie bei 4 C aliquotiert und bei -80 C eingefroren Transformation von kompetenten BL21 Bakterien Ein 50 µl Aliquot von kompetenten BL21 oder DT5 Bakterien wurde auf Eis aufgetaut und mit 100 bis 500 ng DNA vermischt. Nach 10 bis 30-minütiger Inkubation auf Eis wurde die Mischung für zwei Minuten in einen Heizblock bei 42 C gestellt. Nach anschließenden weiteren zwei Minuten auf Eis wurden 200 µl LB-Medium zugegeben und die Bakterien wurden zwischen 10 Minuten und einer Stunde bei 37 C inkubiert. Es wurden dann unterschiedliche Mengen der transformierten Bakterien auf LB-Platten mit einem geeigneten Antibiotikum ausplattiert und über Nacht bei 37 C in einen Brutschrank gestellt. Das Antibiotikum auf der Platte dient zur Selektion der Plasmide, da hier nur Bakterien mit entsprechender Antibiotika-Resistenz wachsen können. 53

65 Methoden Kultur und Lagerung von E.coli Kurzzeitkultur Für eine Kurzzeitkultur wurden E.coli-Zellen auf LB-Agarplatten (bei Bedarf mit Antibiotikum) ausgestrichen und über Nacht im Brutschrank (Heraeus) bei 37 C inkubiert. Die Lagerung der Platten erfolgte luftdicht verschlossen im Kühlschrank bei 4 C. Übernachtkultur Unter sterilen Bedingungen wurden 5 ml LB-Medium (bei Bedarf mit Antibiotikum) mit einer Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht bei 37 C inkubiert. Lagerung Um E.coli-Zellen über längere Zeit zu lagern, wurden 600 µl einer Übernachtkultur mit 400 µl 80 % Glycerin versetzt und bei -80 C eingefroren. Nach dem Antauen konnten die so gelagerten Zellen wieder auf Agar-Platten ausgestrichen werden. 3.3 Proteinexpression, Proteinextraktion und Proteinaufreinigung Protein-Expression im präparativen Maßstab Die Aufreinigungsmethode wurde abgeleitet von Barth et al. (Barth et al. 2000). Zunächst wurden zwei Vorkulturen angeimpft. Zu 45 ml TB-Medium wurden 5 ml KPO 4 -Puffer, 25 µl ZnCl 2, 2,5 ml 20 % Glucose und 50 µl Kanamycin mit einer Konzentration von 50 mg/ml gegeben. Die Vorkulturen wurden mit zuvor transfizierten BL21-Bakterien von einer LB- Platte angeimpft. Hierzu wurden möglichst viele Kolonien von einer Platte aufgenommen und zum Animpfen eines Kolbens verwendet. Die Vorkulturen wurden dann bei 28 C über Nacht geschüttelt. Mit Hilfe der Vorkultur wurden 10 Kolben mit je 450ml TB-Medium auf eine od 600 von 0,1 eingestellt. Es wurde hierzu so viel Bakterienlösung von der Vorkultur der Hauptkultur zugegeben, bis die od 600 erreicht war. Die 450 ml TB-Medium pro Kolben wurden mit 50 ml KPO 4 -Puffer, 250 µl ZnCl 2 und 500 µl Kanamycin mit einer Konzentration von 50 mg/ml versetzt. Die Hauptkulturen wurden bei 28 C geschüttelt, bis eine od 600 von 1,3 bis 1,6 erreicht wurde. Anschließend wurden die Hauptkulturen unter Stress gesetzt. Hierzu wurden 20 g NaCl, 62,5 ml 4 M Sorbitol und 5 ml Glycin-Betain zugegeben und die Temperatur wurde auf 26 C gesenkt. Nach ca. einer Stunde wurde das pet- Expressionssystem durch Zugabe von 1 ml 1 M IPTG pro Kolben induziert. Um die Induktion 54

66 Methoden zu überprüfen, wurden zu den Zeitpunkten 0 h (Augenblick der Induktion), 1 h und 20 h wurden je 1 ml Probe entnommen und die od 600 gemessen. Diese drei Proben wurden direkt nach der Entnahme zentrifugiert (4000 rpm, 5 min, RT) und der Überstand wurde abgenommen. Pro od 600 der Proben wurden nun 50 µl TB-Medium und die gleiche Menge zweifach Lämmli-Puffer zugegeben. Diese Proben wurden als Induktionskinetikkontrolle auf ein 10 % SDS Gel aufgetragen. Die Hauptkulturen wurden 20 Stunden nach der Induktion in 1 Liter Zentrifugationsbechern für 20 Minuten bei 4000 rpm und 4 C zentrifugiert. Das Pellet konnte bei -80 C eingefroren werden und weitere Hauptkulturen konnten darauf gegeben und abzentrifugiert werden, um die Menge der E. coli Zellen und damit die Menge des vorhandenen Proteins zu erhöhen. Die Pellets wurden in insgesamt einem Liter Periplasmaextraktionspuffer gelöst. Bei 4 C wurde das Periplasma auf einem Rührer für drei Stunden resuspendiert. Anschließend wurden die Zelltrümmer bei rpm und 4 C für eine Stunde abzentrifugiert. Der Überstand enthielt die Proteine Dialyse der Periplasmaextraktionspuffer-Proteinlösung Um Proteine über einen His-Tag aufzureinigen, mussten störende Substanzen aus dem Periplasmaextraktionspuffer zunächst durch Dialyse entfernt werden. Die Dialyse erfolgte dreimal im 20fachen Volumen, also in 20 Litern His-Dialysepuffer für 4 Stunden bei 4 C. Die Dialysemembran ( MWCO) wurde vor Gebrauch für 30 Minuten im Dialysepuffer inkubiert und anschließend mit der Proteinlösung gefüllt Aufreinigung des Proteins über einen His-Tag 1 ml einer Ni-NTA-Agarose (Quiagen) pro Liter Flüssigkeit wurde über Nacht bei 4 C in den dialysierten Periplasmaaufschluss eingerührt. Die Lösung wurde nun in 50 ml Gefäßen für je 5 Minuten bei 1500 rpm und 4 C abzentrifugiert. Die Überstände wurden gesammelt und konnten später nochmals aufgereinigt werden. Die abzentrifugierte Ni-NTA-Agarose wurde auf ein Säulchen aufgetragen. Der Durchfluss wurde bei 4 C aufbewahrt. Die Säule wurde zweimal mit je 6 ml Waschpuffer gewaschen. Anschließend wurde sechsmal mit 500 µl Elutionspuffer eluiert. Zur Aufbewahrung der Elutionsfraktionen wurden diese mit 0,05 % Sodiumazid versetzt. 55

67 Methoden Einfrieren von Proteinen Um Proteine langfristig zu lagern, wurden den Proben 20 % Glycerin zugegeben und sie wurden bei -20 C aufbewahrt Konzentrierung von Proteinlösungen Die Elutionsfraktionen konnten zum Konzentrieren des Proteins durch einen AMICON Microconcentrator (Firma Millipore, Eschborn) eingeengt werden. Dies erfolgte nach Angaben des Herstellers. Die Membran des Konzentrators wurde zunächst mit einer Passivierungslösung (0,5 % BSA in 1x PBS) abgesättigt, um das Anheften von Protein an die Membran zu verhindern. Nach einem Waschschritt mit 1x PBS wurde der Konzentrator mit den zu konzentrierenden Proteinlösungen gefüllt und bei 4000 g und 4 C so lange zentrifugiert, bis das Protein in ausreichend kleiner Flüssigkeitsmenge konzentriert war. Die Pufferbedingungen verändern sich bei dieser Art der Konzentrierung nicht. Typischerweise wurden 3 ml Lösung ungefähr 10 Minuten lang zentrifugiert und so auf ein Flüssigkeitsvolumen von etwa 500 µl eingeengt SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Zur Analyse von Proteinen wurde eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) durchgeführt. Die SDS-Gele wurden nach folgenden Rezepten gegossen. Sammelgel 3 % 650 µl Bisacrylamide 30:0,8 (w/v) 625 µl Tris (ph 6,8) 1,0 M 50 µl 10 % SDS 3,7 ml H 2 O 10 µl TEMED 25 µl 10 % APS Trenngel 7 % 2,5 ml Bisacrylamide 30:0,8 (w/v) 2,5 ml Tris (ph 8,8) 1,5 M 100 µl 10 % SDS 56

68 Methoden 4,85 ml H 2 O 10 µl TEMED 50 µl 10 % APS Trenngel 10 % 3,33 ml Bisacrylamide 30:0,8 (w/v) 2,5 ml Tris (ph 8,8) 1,5 M 100 µl 10 % SDS 4,0 ml H 2 O 10 µl TEMED 50 µl 10 % APS Die Protein-Proben wurden mit reduzierendem Ladepuffer (6x SDS-Probepuffer oder 4x Rodi-Load) versetzt, für 6 Minuten bei 96 C im Heizblock aufgekocht und anschließend in die Taschen des Gels pipettiert Westernblot Nach der Auftrennung des Proteins über ein SDS-Gel wurde der Transfer auf eine Membran durchgeführt. Auf das zu blottende Gel wurde hierzu eine Membran gelegt. Diese wurden zwischen sechs Whatman-Papiere gelegt und in den Fluidblotter geklemmt. Dieser Zusammenbau erfolgte in schon vorher verwendetem Transfer-Puffer. Nach Zugabe von frischem Transferpuffer wurde die Apparatur über Nacht bei 4 C an ein Stromnetz angeschlossen, das auf 40 V eingestellt war. Am nächsten Tag wurde die Membran in Ponceau-Stain gelegt, bis Proteinbanden sichtbar wurden. Dies dient der reversiblen Färbung von Proteinen und erlaubt so die Kontrolle des Proteintransfers. Die Lösung wurde anschließend mit Wasser abgewaschen. Die Membran wurde zunächst blockiert. Hierzu wurde 5 % Milchpulver in PBS mit 1 % Tween verwendet. Es wurde mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurde die Membran gewaschen. Dafür wurde sie dreimal für 7 Minuten in PBS mit 0,1 % Tween geschwenkt. Nun wurde Primärantikörperpuffer (PBS mit 0,1 % Tween und 5 % BSA) mit dem Primärantikörper zugegeben und über Nacht bei 4 C inkubiert. Nach erneutem Waschen in PBS mit 0,1 % Tween wurde der Sekundärantikörper in PBS mit 0,1 % Tween zugegeben und für mindestens 57

69 Methoden 1,5 Stunden auf dem Schüttler inkubiert. Nach erneutem Waschen der Membran für 3 mal 7 Minuten in PBS mit 0,1 % Tween konnte die Membran leicht getrocknet und entwickelt werden. Hierfür wurde die Membran in eine Kassette gelegt und mit je 1ml Detektionsreagenz I und II (GE Healthcare) befeuchtet. Als Detektionssystem für den Westernblot wurde das horseradish peroxidase-system (HRP) verwendet. Im Photolabor wurde ein Film (Kodak) auf die Membran aufgelegt und dieser dann entwickelt. Die Membranen konnten anschließend für weitere Färbungen bei -20 C gelagert werden. Anti-His Westernblot Die Membran wurde eine Stunde in 20 ml Anti-His-TBS mit 3 % BSA inkubiert. Anschließend wurde Anti-His-Antikörper (1:2000) zugegeben und erneut für eine Stunde inkubiert. Nun wurde die Membran zunächst dreimal je 5 Minuten mit TBS-Tween-Triton und anschließend 5 Minuten mit Anti-His-TBS gewaschen. Im Anschluss wurde die Membran für eine Stunde in 30 ml Anti-His-TBS mit 10 % Milchpulver und 6 µl goat-antimouse-antikörper, der also in einem Verhältnis von 1:5000 zugegeben wurde, inkubiert. Schließlich wurde vier Mal mit TBS-Tween-Triton gewaschen. Die Membran konnte nun entwickelt werden Strippen der Membran Die Membran wurde in 10 ml Stripping-Puffer für 30 Minuten bei 56 C inkubiert. Anschließend wurde sie mit PBS mit 0,1 % Tween gewaschen. Sie konnte nun gemäß dem Westerblot-Protokoll blockiert und gefärbt werden Bestimmung der Proteinkonzentration mit Hilfe eines BSA-Standards Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde BSA, welches ein Molekulargewicht von 75 kda besitzt, als Markerprotein eingesetzt. Aus einer BSA-Stammlösung (1 µg/µl) wurde eine Verdünnungsreihe angesetzt. Diese, sowie eine definierte Menge der Proteinlösung, wurden auf das SDS-Gel aufgetragen. Nach der Färbung des Gels mit Coomassiefärbelösung konnte anhand eines Vergleiches der Stärke der BSA-Banden und der Stärke der Proteinbanden die Konzentration der Proteinlösung abgeschätzt werden. 58

70 Methoden Färbung mit Coomassie Brillant Blau Mit Coomassie Brillant Blau wurden die Proteinbanden nach einer Polyacrylamid- Gelelektrophorese angefärbt. Die Nachweisgrenze dieses Verfahrens liegt bei ca. 200 bis 400 ng Protein pro Spur. Zur Färbung des Gels wurde dieses in Coomassiefärbelösung eingelegt, erhitzt und ca. 10 Minuten unter Schwenken auf einem Taumeltisch (Peq lab, Mini Rocker MR-1) inkubiert. Das Gel wurde nun mit Wasser gewaschen und anschließend in Coomassie- Entfärbelösung geschwenkt, bis sich auf dem Gel deutliche Proteinbanden abzeichneten und nur noch eine geringe Hintergrundfärbung zu sehen war. Das Gel wurde anschließend in Wasser gelegt und in einem Trockenspannrahmen getrocknet Dialyse der Sialinsäurederivat-gekoppelten Substanzen Die Dialyse der Proteinlösungen erfolgte in Mini Dialyse Units ( MWCO, Fa. Pierce) für dreimal je eine Stunde gegen 2 Liter 1x PBS bei 4 C, unter Rühren Entfernung von Endotoxin Da LPS in den ETA -Aufreinigungen Probleme bei den Xenotransplantations-Mausmodellen verursachen kann, wurden Endotoxine mit Hilfe des Endo Trap Blue Systems von Profos aus den Proteinlösungen entfernt. Zunächst wurde das Säulchen unten geöffnet und nachdem der darin befindliche Regenerationspuffer ausgelaufen war, wurde die Säule zweimal mit je 3 ml Regenerationspuffer gewaschen. Anschließend wurde das Säulchen äquilibriert. Hierzu wurden zweimal je 3 ml PBS mit 0,1 % Ca 2+ bzw. Elutionspuffer mit 0,1 % Ca 2+, je nachdem in welchem Puffer sich das Protein befand, auf das Säulchen gegeben. Die Proteinprobe wurde in einem Volumen von 1 ml auf das Säulchen gegeben und der Durchfluss wurde aufgefangen, genau wie die anschließenden Elutionsfraktionen. Eluiert wurde mit entsprechendem Puffer, also PBS oder Elutionspuffer mit Calcium. Nach erfolgter Elution wurde die Säule durch Zugabe von zweimal 3 ml Elutionspuffer bzw. PBS regeneriert. Zum Lagern des Säulchens wurde dieses mit 3 ml Regenerationspuffer und 0,02 % Sodium Azid befüllt und bei 4 C aufbewahrt. Die Waschfraktion und die Elutionsfraktionen wurden anschließend durch ein Microconcentrator Einengungssäulchen von AMICON (Firma Millipore, Eschborn) eingeengt. Es wurde auf eine Flüssigkeitsmenge von ca. 500 µl eingeengt. 59

71 Methoden Kopplung der Sialinsäurederivate an das rekombinant hergestellte Protein ETA Um ein vollständiges Immunotoxin zu erhalten, mussten durch Kopplung die Toxin- mit der Bindekomponente stabil verbunden werden. Das gesamte Protein Lys 3 -Gly 2 -Strep-His-ETA - RDEL (Wöhner 2009) besitzt, inklusive seines Lys 3 -Gly 2 -Linkers, 6 Lysine, an welche die Sialinsäurederivate gekoppelt werden konnten. In Abbildung 6 ist zu erkennen, dass sich drei der Lysine N-terminal des Proteins auf dem Lys 3 -Gly 2 -Linker befinden. Drei weitere Lysine sind über das Protein verteilt. Die Kopplungsreaktion fand über eine aktivierte Azogruppe der Sialinsäurederivate an die freien Aminogruppen der Lysine und des N-Terminus statt. Die Sialinsäurederivate konnten folglich potenziell an sechs Stellen des Proteins binden. Abbildung 6: Schematische Darstellung von ETA -RDEL auf Proteinebene Die Pfeile zeigen die sechs möglichen Kopplungsstellen der Sialinsäurederivate an das ETA -Protein Abbildung 7: Struktur des BPC-Neu5Ac-Dimers Zur chemische Kopplung der Sialinsäurederivate, wie das BPC-Neu5Ac-Dimer (Abbildung 7), an ETA oder Albumin wurden von Prof. Dr. Reinhard Brossmer am Biochemiezentrum Heidelberg die Sialinsäurederivate zunächst chemisch aktiviert. Hierzu wurde adipic acid dinhs-ester im 30-fachen Überschuss zu der Sialinsäurelösung, in der DIPEA im 50-fachen Überschuss vorlag, zugegeben. Diese aktivierte Substanz wurde lyophilisiert und nach 60

72 Methoden Erlangen verschickt. Zur chemischen Kopplung wurden die Substanzen in DMF gelöst und im 50-fachen Überschuss sofort zu ETA in His-Elutionspuffer oder PBS mit ph 8 gegeben. Das Gemisch wurde für 4 Stunden bei RT inkubiert. Nach erfolgter Kopplung wurde die Immunotoxinlösung zunächst dialysiert. Dies war vor allem nötig, um überschüssige, ungekoppelte Sialinsäuren zu entfernen, die sich sonst bei Versuchen mit dem Immunotoxin als störend erweisen könnten, indem sie mit dem Immunotoxin um die Bindungsstellen am CD22 konkurrieren könnten. Nach erfolgter Dialyse gegen PBS wurde die Immunotoxinlösung sterilfiltriert. Als Kontrolle zu den Sialinsäure-ETA Substanzen wurde ein ETA mit abgesättigtem Linker hergestellt. ETA wurde hierzu mit Adipic acid dinhs statt dem BPC-NeuAc-Dimer gekoppelt. Zur Bestimmung, ob die Kopplung der Sialinsäurederivate an das ETA erfolgreich war, wurden 0,5-1,5 µg des Immunotoxins auf ein 10 % SDS Gel aufgetragen und mit Coomassie gefärbt. Hierzu wurde das Gel für ca. 30 Minuten in Coomassie-Färbelösung gelegt und anschließend in Coomassie-Entfärber gelegt (Abbildung 8). Ist deutlich eine Kopplungsleiter zu erkennen, so wurden verschieden viele BPS-Neu5Ac-Dimer mit einer Größe von ca. 2 kda an ETA gebunden. Abbildung 8: Überprüfung der Kopplung des BPC-Neu5Ac-Dimer an ETA Coomassie-gefärbtes SDS Gel, beladen mit 0,7 µg ETA (ca. 45 kda, links), Gel beladen mit 0,9 und 1,8 µg Dimer-ETA (rechts); zu sehen ist die Kopplungsleiter, die entsteht, da die ETA -Proteine verschiedene Mengen des Dimer mit einem Molekulargewicht von ca. 2 kda gebunden haben. 3.4 Zytotoxizitätstest Im Toxizitätstest wurden verschiedene CD22-positive B-Zelllinien verwendet. HL60 diente als Negativkontrolle. Es wurde mit Dreifachansätzen in 48-well-Platten gearbeitet. Pro Ansatz wurden Zellen in 600 µl eingesetzt. Das BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA wurde in einer Konzentration von 1,5 µg/ml zugegeben. Dies entspricht 30 nm pro Ansatz. Zu den 61

73 Methoden Zeitpunkten 0 h, 24 h, 48 h, 72 h wurden je 150 µl der Zellsuspensionen steril entnommen und in FACS-Röhrchen bei 1300 rpm und 4 C 5 Minuten zentrifugiert. Die Pellets wurden anschließend in 1 ml PBS gewaschen. Danach wurden die Zellen mit 194,5 µl Annexin Puffer, 5 µl PI (50 µg/ml Stammlösung) und 0,5 µl Annexin-FITC resuspendiert und gefärbt. Nach mindestens 10 Minuten Färbezeit im Dunkeln bei 4 C wurden die Proben im Durchflusszytometer gemessen. 3.5 Arbeit mit DNA Agarosegelelektrophorese Zunächst wurde ein Agarosegel aus 0,5 TBE-Puffer und 0,8-2 % Agarose hergestellt. Die Agarose wurde im TBE-Puffer durch Kochen gelöst. Sobald das Gel leicht abgekühlt war, konnten 2-5 µl Ethidiumbromid (EtBr) zugegeben werden und das Gel konnte in eine Gelkammer (Biorad) mit eingestecktem Kamm gegossen werden. Das ausgehärtete Gel wurde dann in eine mit 0,5 TBE-Puffer gefüllte Elektrophoresekammer überführt. Der Kamm wurde nun entfernt und die Proben, die mit Ladepuffer versetzt waren, in die Taschen des Gels pipettiert. Nun wurde eine Spannung von 80 bis 140 V angelegt und das Gel ein bis zwei Stunden laufen gelassen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel unter einem UV-Gerät (Alpha Innotech) analysiert und fotografiert Isolierung von DNA DNA-Mini-Präparation (Schnellverfahren) Am Vortag wurde eine Kolonie transformierter Bakterien in 2 ml LB-Medium mit 2 µl Antibiotikum angeimpft und über Nacht bei 37 C geschüttelt. Die Übernachtkultur wurde für 2 Minuten bei 6000 rpm und Raumtemperatur zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen in 100 µl Puffer P1 resuspendiert und anschließend vorsichtig mit 200 µl Puffer P2 gemischt. Nach 2 bis 5 Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur (RT) wurden 150 µl Puffer P3 zugegeben und nach vorsichtigem Mischen durch Invertieren wurde für 5 Minuten bei rpm und RT zentrifugiert. Der Überstand wurde nun in ein frisches 1,5 ml Kunststoff-Reaktionsgefäß überführt und mit 720 µl Isopropanol gut gemischt. Anschließend wurde die Mischung für 10 Minuten bei rpm und RT zentrifugiert. Der Überstand 62

74 Methoden wurde verworfen und es wurden 700 µl 70 % Ethanol zugegeben. Nach 4 Minuten Zentrifugation bei rpm und RT wurde der Überstand verworfen und die DNA getrocknet. Schließlich wurde die DNA in 50 µl Wasser mit 0,16 µl RNase aufgenommen und für 30 Minuten bei 37 C resuspendiert Qiagen-Maxi Die Isolierung von Plasmiden im größeren präparativen Maßstab erfolgte mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit nach den Angaben des Hersteller-Protokolls (QIAGEN Plasmid Purification Handbook 08/2003) Restriktionsverdau von DNA Die Reaktionsansätze hatten ein Volumen von 20 bis 50 µl. Die darin enthaltenen Puffer und Enzyme wurden von Fermentas bezogen und nach den Angaben des Herstellers angewandt. Es wurden ng DNA eingesetzt Gelextraktion DNA konnte mit Hilfe des Gel extraktion kits von Qiagen aus einem Agarosegel extrahiert werden. Hierzu wurde das Gelstück mit der DNA ausgeschnitten und gewogen. Pro 100 mg Gel wurden nun 300 µl Puffer QG zugegeben und bei 50 C so lange inkubiert, bis das Gel sich vollständig gelöst hatte. Nun wurden pro 100 mg Gel 100 µl Isopropanol zugegeben und auf ein Säulchen gegeben. Nach 1 Minute Zentrifugation bei rpm wurde der Durchfluss verworfen, 500 µl Puffer QG zugegeben und erneut zentrifugiert. Nach Verwerfen des Durchflusses wurden 750 µl Puffer PE zugegeben und das Säulchen für 2 Minuten stehen gelassen, bevor erneut für 1 Minute bei rpm zentrifugiert wurde. Nach Verwerfen des Durchflusses wurde das Säulchen erneut zentrifugiert. Anschließend wurde es in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß gestellt, 30 µl Puffer EB wurden zugegeben und nach 1 Minute Wartezeit wurde bei rpm für 1 Minute zentrifugiert. Die DNA befand sich nun im Durchfluss Blunt-End Cloning mit dem CloneJet PCR cloning kit Es wurde gemäß dem CloneJet Protokoll vorgegangen. 4 µl des PCR-Produktes, 5 µl reaction buffer, 0,5 µl des pjet1.2/blunt cloning vector (50 ng/µl) und 0,5 µl Ligase wurden gemischt 63

75 Methoden und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Bis zu 5 µl dieses Ligationsmixes konnten für die Transformation kompetenter Bakterien verwendet werden DNA Insert Ligation in Vektor DNA ng der linearisierten Vektor-DNA wurden mit Insert-DNA im Verhältnis 1:1 bis 1:3, mit 10x Ligationspuffer und mit T4 DNA Ligase gemischt. Dieser Ansatz wurde für eine Stunde bei 22 C inkubiert und konnte anschließend transformiert werden Sterilfällen von DNA Die DNA wurde gegebenenfalls zunächst verdaut. War dies der Fall, so wurde sie anschließend für 10 Minuten bei 65 C oder 80 C, abhängig von der Inaktivierungstemperatur des verwendeten Enzyms, inkubiert. Es wurde nun auf 100 µl Gesamtvolumen mit sterilem Wasser aufgefüllt. Es wurden zunächst 10 µl 3 M Na-Acetat ph 5,2 und 250 µl eiskalter Ethanol (99 %) zugegeben und gemischt. Die Lösung wurde mindestens 2 Stunden, aber bestenfalls über Nacht bei -20 C inkubiert. Bei rpm wurde anschließend für 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand unter einer Sterilbank verworfen. Nun wurden 250 µl 70 % Ethanol zugegeben und erneut für 15 Minuten bei rpm zentrifugiert. Das Pellet wurde unter der Sterilbank getrocknet und in 100 µl sterilem Wasser aufgenommen Gewinnung genomischer DNA aus ES-Zellen Um möglichst wenig DNA der EMFIs mit aufzureinigen, wurden die ES-Zellen zunächst von einer mittleren Flasche auf eine große Flasche umgesetzt. Diese große Flasche war mit Gelantine beschichtet und nicht mit EMFIs bewachsen. Sobald diese sehr dicht mit ES-Zellen bewachsen war, wurden die Zellen durch Behandlung mit Trypsin/EDTA vom Boden gelöst und vereinzelt. Zunächst wurden die ES-Zellen in 7 ml eiskaltem PBS resuspendiert und anschließend für 5 Minuten bei 1300 rpm zentrifugiert. Nach erfolgtem Waschen mit 10 ml eiskaltem PBS wurden ca. 2x 10 7 Zellen abgezählt und erneut in eiskaltem PBS gewaschen. Das Pellet wurde anschließend in 2 ml Lysepuffer1 resuspendiert. Es wurden nun 2 ml Lysepuffer2 dazugegeben und gut gemischt. Schließlich wurde Proteinase K zugegeben (0,4 mg/ml) und die Proben über Nacht bei 56 C inkubiert. Am nächsten Tag wurde unter einem 64

76 Methoden Abzug 1 Volumen, also 4 ml, Phenol/Chlorophorm/Isoamylalkohol-Lösung 25:24:1 zugegeben und gut gemischt, bis die Lösung weiß erschien. Es wurde nun für 20 Minuten bei 3000 g und 4 C zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze abgenommen und in ein neues Eppendorfgefäß (15 ml) überführt. Die weiße Interphase wurde zurück gelassen und mit dem Überstand wurde weitergearbeitet. Obige Schritte wurden 3-mal durchgeführt. Schließlich wurde dem Überstand 1 Volumen Chlorophorm zugegeben und gemischt. Nach Zentrifugation für 20 Minuten bei 3000 g und 4 C wurde der Überstand, also die wässrige Phase, erneut mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze abgenommen und mit Chlorophorm versetzt. Nach Zentrifugation und Abnehmen des Überstandes wurde dieser in ein 50 ml Eppendorfgefäß überführt und es wurden 0,5 Volumen 7,5 M Ammoniumacetat und 2 Volumen eiskalter Ethanol (99 %) zugegeben. Die Lösung wurde nun geschüttelt, wobei die DNA als graue Masse ausfiel. Dieses Gespinst konnte mit einer hakenförmig gebogenen Pasteurpipette aus der Lösung geholt werden. Es wurde kurz in 70 % Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet. Die DNA wurde in 100 µl Tris ph 8,5 (10 mm) bei 4 C über Nacht gelöst Southern Blot Verdau der genomischen DNA Zunächst wurde 30 µg genomische DNA in einem Volumen von 50 µl über Nacht verdaut. Hierzu wurden 50 units des Restriktionsenzyms zugegeben und am nächsten Morgen nochmals 25 units. Es wurde ein Kontroll-Agarosegel mit 3 µl der Ansätze beladen. Sah die DNA verdaut aus, so wurden die Ansätze auf ein 0,6-1 % Agarosegel mit Taschen, die mit 50 µl beladen werden konnten, aufgetragen. Das Gel wurde entweder für ca. 4 Stunden bei 100 V, oder über Nacht bei ca. 40 V laufen gelassen. Bei Bedarf wurde die Voltzahl am nächsten Morgen leicht erhöht. War die DNA weit genug im Gel gelaufen, so wurde dieses mit einem Lineal unter UV-Licht fotografiert Blotten des Agarosegels Überschüssiges Gel ohne DNA oder Standard wurde abgeschnitten. Das Gel wurde nun für 20 Minuten in 0,25 M HCl auf einen Taumeltisch gestellt. Es wurde anschließend zweimal für 15 Minuten in 0,4 M NaOH gewaschen. Nun wurde der Kapillarblot aufgebaut. Hierzu wurde 65

77 Methoden eine Wanne mit 0,4 M NaOH befüllt und eine Glasplatte darüber gelegt. Aus nassem Whatman-paper (8 mm) wurde eine Pufferbrücke über die Glasplatte in die Wanne gelegt. Das Gel wurde nun spiegelverkehrt und blasenfrei auf diese Brücke gelegt und eine befeuchtete Membran und 3 nasse Whatman-paper kamen -ebenfalls blasenfrei- auf das Gel. Schließlich folgte ein Stapel von trockenen Zellstofftüchern. Diese wurden gewechselt, wenn sie sich voll Puffer gesaugt hatten. Den Abschluss bildete eine weitere Glasplatte mit einem Gewicht darauf. Das Gel wurde nun ca. 20 Stunden geblottet Radioaktives Labeln der Sonde Hierzu wurde das Random Primers labeling system von Invitrogen verwendet. 25 ng der zuvor durch Verdau oder PCR aufgereinigten Sonde wurden für 5 Minuten gekocht und anschließend für eine Minute auf Eis gestellt. Es wurden je 2 µl datp, dgtp und dttp- Solution, 15 µl Random Primers Buffer mixture und 1 µl Klenow Fragment zugegeben und mit Wasser auf 45 µl aufgefüllt. Im Isotopenlabor wurden nun 5 µl alpha-32p dctps zugegeben, der Ansatz wurde gemischt und die Lösung für eine Stunde bei 25 C inkubiert. In dieser Zeit wurde die Membran vorbereitet. Es wurden nach dieser Stunde 5 µl Stopp-Puffer zugegeben und die überschüssigen Nukleotide wurden mit Hilfe des Nucleotide removal kit entfernt. Hierzu wurden 250 µl Puffer PN zugegeben, die Lösung wurde auf ein Säulchen gegeben, für 1 Minute bei 6000 rpm zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Nach Zugabe von 500 µl Puffer PE wurde erneute für eine Minute bei 6000 rpm zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Dieser Schritt wurde wiederholt. Nach Verwerfen des Durchflusses wurde das leere Säulchen bei rpm für 1 Minute zentrifugiert und anschließend in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß gestellt. 100 µl Puffer EB wurden zugegeben, alles eine Minute stehen gelassen und dann bei rpm zentrifugiert Fixierung der DNA auf der Membran Nach Abbau des Kapillarblots wurde zunächst das Gel auf der Membran markiert. Die Membran wurde in 2x SSC geschwenkt und in einem UV-Stratalinker UV-kreuzvernetzt. 66

78 Methoden Hybridisierung der Membran Die Membran wurde zunächst in Miracle Hyb Lösung für 15 Minuten bei 68 C vorhybridisiert. Das Volumen der Lösung berechnete sich aus der Größe der Membran, die mit 180 µl multipliziert wurde. Es wurde jedoch nie mehr als 20 ml Miracle Hyb pro Membran eingesetzt. Zur radioaktiv markierten Sonde wurden nun Probe Hybridization Buffer gegeben. Pro 1 ml Miracle Hyb Lösung wurden 10 µl Hybridisierungspuffer verwendet. Die Sonden-Lösung wurde für 2 Minuten gekocht und dann zu der Membran in der Miracle Hyb Lösung gegeben. Die Hybridisierung erfolgte bei 68 C über Nacht im Hybridisierungsofen Detektion Die hybridisierte Membran wurde zweimal für 15 Minuten in 2x SSC mit 0,1 % SDS bei Raumtemperatur gewaschen. Anschließend folgte ein weiterer Waschschritt mit 0,1x SSC mit 0,1 % SDS für 30 Minuten bei 60 C. Die Membran wurde nun leicht getrocknet und möglichst blasenfrei in Frischhaltefolie eingewickelt. Sie wurde nun in eine Phosphor-Imager Kassette mit belichtetem Screen eingelegt und nach frühestens 24 Stunden in einem Phosphor-Imager eingelesen Strippen der Membran Die Membranen konnten gestrippt werden. Hierzu wurde 0,1x SSC mit 0,1 % SDS zum Kochen gebracht, über die Membran gegossen und zweimal für 15 Minuten mit 0,1x SSC mit 0,1 % SDS gewaschen Sequenzierung von DNA Die Sequenzierung von DNA erfolgte durch die Firma GATC. Verschickt wurden 30 μl einer, über Qiagen Miniprep aufgereinigten, Plasmid-DNA mit einer Konzentration von ng/µl und 30 μl des Primers in einer Konzentration von 10 pmol/μl. Die Auswertung erfolgte mit dem Programm Sequence Navigator. 67

79 Methoden 3.6 Tierexperimente Aufbereitung von Organen So schnell wie möglich nach dem Töten der Tiere wurden die Organe entnommen. Zunächst wurde das Peritoneum mit ca. 1 ml PBS mit 5 % FCS gespült. Anschließend wurden Lymphknoten, Milz und Blut entnommen. Die Organe wurden durch Zellsiebchen gepresst und die Zellen in PBS mit 5 % FCS aufgenommen. Schließlich wurden die Oberschenkelknochen der Hinterbeine entnommen, aufgeschnitten und mit PBS mit 5 % FCS gespült. Alle entnommenen Zellen mit Ausnahme der Lymphknoten wurden nun für 5 Minuten bei 1400 rpm und 4 C abzentrifugiert und in Gey s Solution resuspendiert. Nach 5 Minuten auf Eis wurde wieder bei 1400 rpm und 4 C für 5 Minuten zentrifugiert. Das Blut wurde ein zweites Mal mit Gey s Solution behandelt. Alle Zellen wurden von nun an gleich behandelt Durchflusszytometrische Analyse von Zellen Zellen wurden nach der Erythrozytenlyse mit FACS-Puffer gewaschen und 1-3x 10 6 Zellen wurden anschließend in 25 µl FACS-Puffer unter Zugabe der entsprechenden Antikörper im Dunkeln bei 4 C für mindestens 20 Minuten gefärbt. Anschließend wurden sie mit FACS- Puffer gewaschen und gegebenenfalls mit einem Zweitantikörper in 25 µl FACS-Puffer für 20 Minuten im Dunkeln bei 4 C gefärbt. Schließlich wurden die Zellen nochmals gewaschen, in 200 µl FACS-Puffer aufgenommen und durchflusszytometrisch in einem FACS Calibur gemessen Messung des Calciumsignals in B-Zellen 5x 10 6 Zellen wurden in 700 µl RPMI Medium mit 5 % PAN FCS aufgenommen und mit 7 µl Indo-Mix versetzt. Die Proben wurden nun unter Schütteln für 25 Minuten bei 30 C inkubiert. Es wurde abschließend 700 µl RPMI Medium mit 10 % PAN FCS zugegeben und die Zellen wurden für 10 Minuten bei 37 C im Schüttler inkubiert. Die Zellen wurden nun zweimal mit FACS-Puffer gewaschen. Zentrifugiert wurde hierbei immer bei 1300 rpm für 5 Minuten bei 4 C. Die Zellen wurden danach in 50 µl FACS-Puffer mit entsprechenden Verdünnungen der Antikörper Mac-1-FITC und CD5-PE und Fc-block für 30 Minuten bei 4 C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend zweimal mit Krebs-Ringer gewaschen und in 68

80 Methoden 500 µl Krebs-Ringer aufgenommen. Zur Analyse des Calciumeinstroms wurden die Zellen, die im Dunkel auf Eis aufbewahrt wurden, 1:10 mit warmem Krebs-Ringer verdünnt und nach 50 Sekunden Messung der Basislinie mit verschiedenen Mengen eines anti-igm Antikörpers stimuliert. Die Messung erfolgte mit einem LSRII mit UV-Laser. Ausgewertet wurde mit der FlowJo Software Komplement-vermittelte T-Zell-Lyse Zur Lyse der T-Zellen wurden entsprechende Organe zunächst entnommen und die Zellen durch Pressen durch ein Zellsieb und Spülen mit PBS mit 5 % PAN FCS vereinzelt. Die Erythrozyten wurden durch 5 minütige Behandlung mit Gey s Solution depletiert. Die übrigen Zellen wurden mit B-Zell Medium gewaschen und anschließend in 1 ml B-Zell Medium aufgenommen. Nun wurden 1,5 ml einer Mischung von Hybridomüberständen zugegeben. Hierfür wurden je 500 µl RL174,2 anti-cd4, AT83A anti-thy1 und anti-cd8 verwendet. Die Zellen wurden für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit B-Zell Medium gewaschen und in 3 ml B-Zell Medium aufgenommen. Es wurden 330 µl baby-rabbit Komplement (Caderlane, Biozol) zugegeben. Nach 45 Minuten Inkubation bei 37 C wurden die Zellen erneut mit B-Zell Medium gewaschen und in B-Zell-Medium aufgenommen Test des Immunotoxins Dimer-ETA im Xenotransplantations-Mausmodell Mindestens 8 Wochen alten NOD-/SCID-Mäusen wurden 5x 10 6 Nalm6-Zellen intravenös gespritzt. Durch diese Behandlung mit humanen Tumorzellen entwickelten die Tiere nach ca. zwei bis drei Wochen eine Hinterbeinparalyse. In diesem Stadium mussten die Tiere getötet werden, um ihnen unnötiges Leid zu ersparen. Die Zellen wurden so konzentriert, dass ein Maximalflüssigkeitsvolumen von 300 µl pro Tier nicht überschritten wurde. Drei Tagen nach dem Spritzen der Nalm6-Zellen wurde ein Teil der Mäuse mit dem Dimer-ETA in PBS behandelt. Dieses wurde ebenfalls intravenös in einem Volumen von 100 µl in die Schwanzvene der Tiere gespritzt. Die Tiere wurden täglich beobachtet. Sobald sie die Hinterbeine nicht mehr bewegen konnten, sie einen deutlichen Buckel hatten und das Fell stumpf und struppig aussah, wurden sie durch zervikale Dislokation getötet. 69

81 Methoden Experimente zum Homing der rezirkulierenden B-Zellen ins Knochenmark mit Hilfe von CD22-Liganden CD45.1 oder C57Bl/6 Mäusen wurden 20 µg des BPC-Neu5Ac-Derivat-Albumins intravenös verabreicht. Ein Teil der Mäuse war unbehandelt, einige Mäuse wurden nach 24 und 48 Stunden getötet und die restlichen Mäuse wurden nach 7 Tagen getötet. Milz- und Knochenmarkszellen wurden aufbereitet und durchflusszytometrisch untersucht. Hierzu wurden die Antikörper IgD-FITC, B220-PE Cy5 und IgM-PE bzw. IgM-PE und B220-FITC verwendet Adaptiver Transfer CFSE markierter Zellen Zunächst wurden die Milzen der Spendermäuse entnommen und eine Erythrozytenlyse und eine T-Zell-Lyse durchgeführt. Die B-Zellen wurden anschließend in FACS-Puffer aufgenommen und gezählt. Die Zellen wurden so eingestellt, dass die Konzentration 1x 10 7 Zellen pro 500 µl FACS-Puffer betrug. CFSE wurde nun in FACS-Puffer auf eine Konzentration von 10 µm verdünnt. Pro 500 µl Ansatz wurden 500 µl der CFSE-Verdünnung zugegeben und die Ansätze wurden für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden sie mit RPMI-Medium mit 10 % FCS gewaschen und in RMPI- Medium mit 10 % FCS für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zweimaligem Waschen der Zellen mit PBS wurde die Zellzahl auf 1x 10 7 Zellen pro 100 µl PBS eingestellt und es wurden jedem Empfängertier 100 µl der Zellsuspension intravenös gespritzt. Die Empfängertiere wurden 24 Stunden nach der Zellinjektion getötet und Milz und Knochenmark wurden entnommen. Die Erythrozyten wurden lysiert und 4x 10 6 Zellen mit B220-PE und IgD-bio, unter Zugabe eines Fc-blocks in je 50 µl FACS-Puffer in einem ersten Schritt für 20 Minuten gefärbt. Nach Waschen der Zellen wurde eine zweite Färbung mit Strep-PE Cy5 in je 50 µl FACS-Puffer durchgeführt. Nachdem die Zellen erneut mit FACS- Puffer gewaschen wurden, wurden sie in 500 µl FACS-Puffer aufgenommen und durchflusszytometrisch analysiert. Hierbei wurden mindestens eine Million Zellen aufgenommen Endozytose von CD22 nach Antikörperbindung Einer Huki CD22 und einer Wildtypmaus wurden die Milzen entnommen. Nach Vereinzelung der Zellen und Erythrozytenlyse wurden die Zellen mit anti-cd19 microbeats gefärbt und 70

82 Methoden durch das MACS Verfahren aufgereinigt. Die Zellen wurden anschließend gezählt. Es wurden 2x 10 6 Zellen für den Endozytoseversuch benötigt. Die Zellen wurden in Mausmedium aufgenommen. Da pro Zeitpunkt 50 µl entnommen wurden, wurden 500 µl Medium benötigt. Probe ungefärbt wurde vor dem Färben entnommen und fixiert. Gefärbt wurde mit 1:100 Fcblock und 1:50 anti-hcd22-pe für Zellen der Huki CD22 Maus bzw. mit 1:100 anti-mcd22- PE für Zellen der Wildtypmaus. Die Zellen wurden nun für eine Stunde bei 4 C inkubiert. Anschließend wurde 2 Proben entnommen. Probe 0 min mit Glycin wurde gewaschen und fixiert, wohingegen Probe 0 min ohne Glycin nur fixiert wurde. Weitere Proben wurden zu den Zeitpunkten 2,5 min, 5 min, 10 min, 30 min, 60 min, 120 min und 180 min entnommen, gewaschen und fixiert. Zum Waschen der Proben wurden 200 µl 0,2 M Glycin/HCl ph 2,5 auf Eis vorgelegt. Der Waschschritt mit Glycin ph 2,5 entfernt extrazellulär gebundene Antikörper. Die Proben wurden nun zugegeben und für 5 Minuten bei 4 C inkubiert. Es wurden nun 1 ml PBS zugegeben und für 5 Minuten bei 1300 rpm und 4 C inkubiert. Die Zellen wurden in 400 µl PBS mit 2 % Paraformaldehyd resuspendiert und für 30 Minuten bei 4 C fixiert. Die Zellen wurden anschließend mit 1 ml PBS gewaschen, in 200 µl FACS- Puffer aufgenommen und bei 4 C gelagert. Sie konnten nun durchflusszytometrisch analysiert werden. 3.7 Untersuchungen der Antikörperantworten immunisierter Mäuse Immunisierung von Mäusen Bei der Immunisierung wurde zwischen T-Zell-unabhängigen und abhängigen Immunantworten unterschieden. Immunisiert wurde jeweils durch intraperitoneales Spritzen der entsprechenden Substanzen in einem Volumen von 100 µl Thymus-unabhängige Immunantworten Die Tiere wurden mit TNP-Ficoll behandelt. Die Stammlösung hatte eine Konzentration von 1 mg/ml und wurde in PBS 1:10 verdünnt. Die Mäuse wurden hiermit intraperitoneal gespritzt und Serum wurde an Tag 0, 5, 7, 11 und 14 entnommen. 71

83 Methoden Thymus-abhängige Immunantworten Zunächst wurde NP-KLH mit PBS und Alu-Gel-S im Verhältnis 1:1:2 gemischt. Für 20 Mäuse wurden je 200 µl NP-KLH (10 mg/ml) und 200 µl PBS mit 400 µl Alu-Gel-S gemischt und die Mischung für eine Stunde im Dunkeln inkubiert. Nach Zugabe von 5 ml PBS wurde die Mischung bei 1300 rpm für 5 Minuten bei 4 C zentrifugiert. Das Pellet wurde in PBS aufgenommen, so dass eine Endkonzentration des NP-KLH von 1 mg/ml erreicht wurde. Je 100 µl dieser Lösung wurde den Mäusen intraperitoneal an Tag 0 und 21 gespritzt. Die Mäuse wurden in diesem Fall an Tag 0, 7, 14, 21, 28 und 35 geblutet. Frühestens 2 Monate nach der zweiten Immunisierung konnten die Mäuse erneut mit NP-KLH behandelt werden. Sie wurden nun an den Tagen 0, 7 und 14 geblutet, wobei sie an Tag 14 getötet wurden und Blut aus dem Herzen entnommen wurde Präparation von Serum Zur Gewinnung von Serum wurde Mäusen Blut entnommen. Lebten diese, wurde das Blut unter einer Rotlichtlampe aus der Schwanzvene durch Anritzen des Schwanzes entnommen. Bei toten Mäusen wurde das Blut mittels einer Kanüle aus dem Herzen entnommen. Das Blut wurde nun für 1 Stunde bei 37 C bzw. über Nacht bei 4 C inkubiert und anschließend bei rpm und 4 C für 5 Minuten zentrifugiert. Die Seren konnten nun bei -20 C gelagert oder direkt für einen ELISA verwendet werden ELISA Für die Analyse der Antikörperantworten wurden Maxisorp-Platten verwendet. Diese wurden zunächst beschichtet, wobei in jedes well 50 µl einer Antigen Lösung pipettiert wurden. Für die Detektion von NP-KLH spezifischen Antikörpern wurde 5 µg/ml NP17-BSA in PBS verwendet. Im Falle von TNP-Ficoll Immunisierungen wurde TNP-BSA in einer Konzentration von 10 µg/ml verwendet. Für die Detektion der natürlichen Antikörper wurde 1 µg/ml goat anti-maus-isotyp Antikörper verwendet. Die Verdünnungen wurden mit PBS hergestellt. Die Platten wurden nun für 2 Stunden bei 37 C oder über Nacht bei 4 C in einer feuchten Kammer inkubiert. Anschließend wurden 200 µl Blocking-Puffer, bestehend aus PBS mit 1 % BSA und 0,05 % Azid, zugegeben. Nach zweistündiger Inkubation bei 37 C wurden die Platten dreimal mit PBS gewaschen. Auf einer 96-well Platte mit U-förmigem Boden wurden die Verdünnungen angesetzt. In der ersten Reihe wurde hierzu je 100 µl 72

84 Methoden ELISA-Puffer mit 1:20 Serum für die Seren, die bei Immunisierungen gewonnen wurden, vorgelegt. Nur bei Immunisierungen mit NP-KLH wurden die Seren ab Tag 21 1:200 verdünnt. Für die Detektion natürlicher Antikörper wurden die Seren 1:200 in der niedrigsten Verdünnung eingesetzt. In jeder weiteren Reihe wurden 60 µl Serum vorgelegt und dann je 30 µl aus der vorherigen Reihe zugegeben, gemischt und 30 µl in die nächste Reihe pipettiert. Es wurde also seriell 1:3 verdünnt. Als Standard wurde ein Pool von Seren von den späteren Tagen der Immunisierungen bzw. monoklonale Maus Antikörper des gleichen Isotyps in der höchsten Konzentration von 0,1 µg/µl verwendet. Von den Verdünnungen wurden nun je 50 µl auf die gewaschenen ELISA-Platten übertragen. Einige wells blieben hierbei stets ohne Serum, um einen Leerwert für die Messung zu haben. Nach Inkubation für 2 Stunden bei 37 C bzw. über Nacht bei 4 C in einer feuchten Kammer, wurden die Platten erneut 3 mal mit PBS gewaschen und 50 µl einer Verdünnung von sekundären Isotyp-spezifischen Antikörpern wurde in jede Vertiefung pipettiert. Die sekundären Antikörper waren mit alkalischer Phosphatase gekoppelt. Nach erneuter Inkubation und wiederholtem Waschen konnte nun 100 µl der Substratlösung (1 mg p- Nitrophenylphosphat/ml Diethanolamin Puffer) zugegeben werden. Die alkalische Phosphatase setzt die ursprünglich farblose Substratlösung in eine gelbe Lösung um, deren optische Dichte bei einer Wellenlänge von 405 nm im ELISAreader vermessen wurde. Die Ergebnisse wurden mit SoftmaxPro ausgewertet. 3.8 Immunpräzipitation Für die Immunpräzipitation wurden Milzzellen verwendet. Nach erfolgter Erythrozyten- und T-Zell-Lyse wurden die Zellen in B-Zell Medium aufgenommen. Danach wurden mindestens 4x 10 6 Zellen pro Ansatz in 500 µl B-Zell Medium aufgenommen und mit F(ab) 2 bei 37 C stimuliert. Es wurde für 0, 2, 5 und 10 Minuten stimuliert. Nach Abzentrifugieren der Zellen bei 3000 rpm und 4 C für 5 Minuten wurden sie in 1 ml kaltem Brij-Lysepuffer mit frisch zugesetzten Proteaseinhibitoren gelöst und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Während der Inkubation der Zellen im Lysepuffer wurde die Sepharose vorbereitet. Abhängig vom Antikörper wurde entweder SepharoseA oder SepharoseG verwendet. In dieser Arbeit wurde nur SepharoseG verwendet. Hiervon wurden 30 µl pro Ansatz dreimalig mit Brij-Lysepuffer gewaschen. Anschließend wurde die gewaschene Sepharose in 100 µl pro Ansatz Brij- 73

85 Methoden Lysepuffer aufgenommen. Die nun lysierten Proben wurden bei rpm für 10 Minuten bei 4 C abzentrifugiert. Die Überstände wurden in neue Reaktionsgefäße überführt und je 100 µl der vorbereiteten Sepharosebeats wurden zusammen mit dem Fängerantikörper zugegeben. Von dem Maus anti-cd22 Antikörper wurden 2 µg eingesetzt. Die Proben wurden nun bei 4 C über Nacht rotiert. Die Ansätze wurden dreimal in Lysepuffer ohne Zusätze gewaschen. Das Pellet wurde anschließend mit Roti Load versetzt, auf ein PAGE Gel aufgetragen und es wurde ein Western Blot durchgeführt. 3.9 Versuche mit humanem Blut Lymphoprep-Gradienten Aufreinigung von humanen Lymphozyten Zunächst wurde Spendern Blut abgenommen und steril mit PBS verdünnt. Auf 230 ml Blut kamen hierbei 130 ml PBS. 50ml Reaktionsgefäße wurden vorbereitet und mit je 15 ml Lympho-Prep gefüllt. Das verdünnte Blut wurde nun langsam und vorsichtig übergeschichtet. Bei 22 C wurden die Proben für 30 Minuten bei 1500 U/min (Einstellungen der Zentrifuge Megafuge1.0R accel.4/decell2) zentrifugiert. Die Hälfte des Plasmas, also die oberste, gelbliche Schicht, wurde nun abgesaugt und die darunter befindliche Schicht mit den weißen Blutzellen wurde vorsichtig abgenommen. Hierbei wurden je drei Proben in einem Reaktionsgefäß gepoolt. Die Proben wurden nun mit PBS mit 2 mm EDTA gewaschen und je zwei Pellets wurden gepoolt. Das Zentrifugieren erfolgte bei 4 C für 15 Minuten mit 1100 U/min (accel.9/decell4). Das Pellet wurde erneute mit PBS mit 2 mm EDTA gewaschen und gepoolt. Zum Zentrifugieren wurden die Einstellungen 4 C, 10 Minuten, 900 U/min (accel.9/decell.2) verwendet. Bei einem dritten Waschschritt mit poolen wurde bei 4 C, 12 Minuten, 700 U/min (accel.9/decell2) zentrifugiert, Nach diesem Waschen wurde das Pellet in Medium oder MACS-Puffer aufgenommen und die Zellen wurden gezählt. Hierzu konnte Türk sche Lösung oder Trypanblau verwendet werden Aufreinigung von Zellen durch das MACS Verfahren Durch das MACS Verfahren können einzelne Zellpopulationen anhand ihrer Oberflächenmarker isoliert werden. Hierzu wurden die Zellen zunächst für 10 Minuten bei 4 C und 1300 rpm zentrifugiert, Die Zellen wurden nun in 80 µl MACS-Puffer pro 10 7 Zellen resuspendiert. Pro 10 7 Zellen wurden 20 µl CD19 beats zugegeben. Nachdem die Proben gut 74

86 Methoden gemischt wurden, wurden sie für 15 Minuten bei 4 C inkubiert. Die Zellen wurden nun mit MACS-Puffer gewaschen. Hierbei wurden 2 ml pro 10 7 Zellen zu den Proben gegeben und bei 1300 rpm und 4 C für 10 Minuten zentrifugiert. Die Zellen wurden nun in 500 µl MACS- Puffer resuspendiert. Für die magnetische Separation wurden LS-Säulchen verwendet. Diese wurden zunächst mit 2 ml MACS-Puffer äquilibriert. Die Zellen wurden auf die Säulchen, die sich in Magneten befanden, gegeben. Die Säulen wurden nun dreimal mit je 1 ml MACS- Puffer gewaschen. Anschließend wurden die Säulen aus den Magneten genommen, es wurde 5 ml MACS-Puffer zugegeben und schnell mit einem Stempel durchgedrückt Bestimmung der Antikörpersekretion nach Inkubation mit Sialinsäurederivaten CD19 positive humane B Zellen wurden auf 5x 10 5 Zellen pro 60 µl B-Zell-Medium eingestellt. Hierzu wurden teils frisch durch MACS aufgereinigte Zellen und teils eingefrorene B-Zellen verwendet. Die Zellen wurden steril auf wells aufgeteilt. Zu je 60 µl Zellen in Medium kamen dann 15 µl der zu testenden Substanzen. Diese hatten eine Konzentration von 10 µm. Nach 5 Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurde 1 ml B-Zell Medium zugegeben. Anschließend wurden die Zellen stimuliert. Die Stimulation erfolgte entweder mit 10 µl/ml F(ab) 2 anti-igm, 14 µl/ml IL-2 und 10 µl/ml CD40L oder mit 2,5 µg/ml CpGs und 14 µl/ml IL-2, oder mit 1 µg/ml P484 (TLR7) und 14 µl/ml IL-2. Die Zellen wurden im Brutschrank bei 37 C und 5 % CO 2 inkubiert. An den Tagen 7, 9 und 11 wurde je 300 µl Überstand abgenommen und damit ein ELISA durchgeführt ELISA zur Bestimmung der Antikörpersekretion stimulierter humaner B- Zellen nach Inkubation mit Sialinsäurederivaten Das gebrauchsfertige anti-iggam Serum wurde 1:1000 in PBS verdünnt. Die Maxisorp Platten wurden mit 50 µl dieser Lösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4 C über Nacht beschichtet. Die Platten wurden dann dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden sie für eine Stunde blockiert. Hierzu wurden 200 µl pro well PBS mit 1 % BSA und 0,05 % Azid verwendet. Nach erneutem Waschen der Platten mit PBS wurden 50 µl pro well der bereits verdünnten Überstände und des Standards aufgetragen. Zur Verdünnung der Seren wurden Verdünnungsplatten vorbereitet. In der obersten Reihe wurden die wells mit je 300 µl der zu testenden Überstände befüllt. In die folgenden wells wurden 200 µl ELISA-Puffer 75

87 Methoden vorgelegt. Die Überstände wurden nun 1:3 nach unten verdünnt, es wurden also je 100 µl in die nächste Reihe pipettiert. Als Standard wurde ein 500 ng/ml konzentrierter Protein- Standard verwendet. Für Platten zum Nachweis von IgM-Antikörpern wurde der Standard 1;63 verdünnt, für IgG 1:1000 und für IgA 1:195. Er wurde ebenfalls 1:3 nach unten verdünnt. Nach Auftragen der verdünnten Überstände und der Standards wurden die Platten für 2 Stunden bei 37 C oder über Nacht bei 4 C inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und anschließend wurde je 50 µl der Gebrauchsverdünnungen der APkonjugierten Antiseren gegen IgG, A und M aufgetragen. Diese wurden zuvor 1:300 in PBS verdünnt. Nach 2 Stunden Inkubationszeit bei 37 C wurden die Platten erneut gewaschen und 100 µl Substratlösung (1 mg p-nitrophenylphosphat/ml Diethanolamin Puffer) zugegeben. Die alkalische Phosphatase setzt die ursprünglich farblose Substratlösung in eine gelbe Lösung um, deren optische Dichte bei der Wellenlänge von 405 nm im ELISAreader vermessen wurde. Die Ergebnisse wurden mit SoftmaxPro ausgewertet PCR Für diese Arbeit wurden viele verschiedene PCRs angewendet. Hierbei wurde eine Annealingtemperatur eingestellt, die berechnet war aus der niedrigsten Primer- Schmelztemperatur +3 C. Bei der Extensionszeit wurden 30 Sekunden pro 1 kb als Richtwert genommen. Die Initiationstemperatur betrug meist 98 C für 1 Minute. Denaturiert wurde für 10 Sekunden bei 98 C. Die finale Extension wurde bei 72 C für 10 Minuten durchgeführt PCR mit Proofreading PCR Enzym Diese PCR wurde bei der Klonierung eines Teils des langen Arms des humcd22- Endkonstrukts verwendet. Ansatz: Programm: 0,5 µl High Fidelity DNA Polymerase (Phusion) 98 C 1 min 10 µl 5x Phusion HF Puffer 35x 98 C 10 sec 1 µl 10 mm dntps 69,5 C 30 sec 1,5 µl Primer (10 pmol/µl) 72 C 1 min 1 µl DNA 72 C 10 min auf 50 µl mit Wasser auffüllen Als Primer wurden 22ex2AS und 22promClas2 verwendet. 76

88 Methoden Die gleiche PCR nur mit einer Annealingtemperatur von 63 C wurde für die Klonierung des kurzen Arms des humcd22-endkonstrukts verwendet. Hierzu wurden die Primer CD22-2kb KA und CD22in4-SalS verwendet Screening PCR Die PCR, die zum Screenen der ES-Zellen nötig war, konnte mit der normalerweise verwendeten SuperTaq Polymerase nicht etabliert werden. Stattdessen wurde der Mastermix Extensor von Thermo Scientific verwendet. Trotzdem war es nötig, eine nested-pcr durchzuführen, also einen Teil des ersten PCR-Produkts als Template für eine zweite PCR zu benutzen. Die erste Runde dieser nested-pcr wurde mit den Primern humcd22mw1 und OlneoE2 mit 35 Zyklen durchgeführt. Für die zweite PCR wurden die Primer humcd22mwneu3 und OlneoE3 und 27 Zyklen verwendet. Als Template wurde 1 µl des Produktes der ersten PCR eingesetzt. Ansatz: Programm: 5 µl Mastermix 94 C 4 min 0,3 µl Primer 35/27x 94 C 45 sec 3,4 µl Wasser 60 C 45 sec 1 µl Lysat 72 C 2 min 30 sec 72 C 10 min PCR zur Herstellung einer Sonde Zur Herstellung der verschiedenen internen und externen Sonde wurde stets der gleiche PCR- Ansatz verwendet. Ansatz: Programm: 0,5 µl Supertaq Polymerase 98 C 1 min 5 µl 10x Supertaq Puffer 35x 98 C 10 sec 1 µl 10mM dntps 61 C 40 sec 1,5 µl Primer (10 pmol/µl) 72 C 1 min 1 µl DNA 72 C 10 min auf 50 µl mit Wasser auffüllen 77

89 Methoden Für die erste externe Sonde wurden die Primer humcd22sonde1 und humcd22sonde2 verwendet. Da diese Sonde an sehr vielen Orten im Genom band, wurde eine neue externe Sonde für den Southern Blot über den kurzen Arm hergestellt, mit den Primern humcd22sonde3 und humcd22sonde4. Für die externe Sonde für den Southern Blot über den langen Arm wurde eine Sonde mit Hilfe der Primer humcd22sondela1 und humcd22sondela2 hergestellt. Eine zweite externe Sonde für den Verdau über den langen Arm für den Southern Blot wurde mit den Primern humcd22 SondeLA3 und humcd22 SondeLA4 hergestellt Typisierung von Mäusen Zur Typisierung von Mäusen wurde eine PCR verwendet. Hierzu musste aber zunächst die DNA der Mäuse gewonnen werden. Schwanzbiopsien der Mäuse wurden hierzu in 300 µl Lysepuffer und 10 µl Proteinase K über Nacht bei 56 C inkubiert. Die Proben wurden bei rpm und 4 C für 5 Minuten zentrifugiert. 1 µl dieser DNA-Lysate wurde als Template eingesetzt. Ansatz: Programm: 0,1 µl Supertaq Polymerase 98 C 1 min 5 µl 10x Supertaq Puffer 40x 94 C 45 sec 1 µl 10mM dntps 57 C 45 sec 1,5 µl Primer (10 pmol/µl) 72 C 1,5 min 1 µl DNA 72 C 10 min auf 50 µl mit Wasser auffüllen Die verwendeten Primer waren humcd22 Maus m S, humcd22 Maus h S, humcd22 Maus m&h S. Die Wildtypbande hatte eine Größe von 500 bp, die knockin-bande von 300 bp. 78

90 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Generierung der Huki CD22 Maus Eine knockin Maus sollte generiert werden, die humanes CD22 statt murinem CD22 auf der Oberfläche der B-Zellen exprimiert, um Immunotoxine und Antikörper, die humanes CD22 als Zielprotein haben, im Mausmodell testen zu können. Zur Generierung dieser Huki CD22 Mauslinie wurde zunächst ein Targeting Vektor kloniert Klonierung des Targeting Vektors Der Targeting Vektor für die Generierung der Huki CD22 Mauslinie sollte aus einem langen Arm bestehen, der die Exons 1-3 und einen Teil des Exons 4 des murinen Cd22 enthält. Dieser Teil von Exon 4 und Exon 3 kodieren für das murine Signalpeptid, das bewirkt, dass CD22 an die Zelloberfläche transportiert wird. In frame sollte hinter die DNA für das Signalpeptid die cdna des humanen CD22 kloniert werden, gefolgt von einem polya-signal und einer mit loxp Stellen umgebene Neomycin-Kassette. Der darauf folgende kurze Arm sollte das Exon 5 enthalten. Grundlage für den Targeting Vektor war der Vektor pkstkneoloxp-psci. Zunächst wurde die Sequenz des polya Signals aus dem Vektor IRES-eGFP (Clonetech) mit den Primern polya- Bsu15Ifw und polya-bamhirev amplifiziert. Das entstandene PCR Fragment und der Vektor pkstkneoloxp-psci wurden nun mit den Enzymen BamHI und Bsu15I verdaut, anschließend ligiert und in den E.coli Stamm DT5α transformiert. Es wurde nun die DNA von 12 verschiedenen Klone, die auf Amp + -LB Platten gewachsen waren, aufgereinigt und ein Kontrollverdau mit dem Enzym HindIII durchgeführt (Abbildung 9). 11 dieser Klone konnten als positiv bestätigt werden und Klon 10 wurde weiterverwendet. Der so erhaltene Vektor VL2 bzw. polya_pks-psci wurde nun für den nächsten Klonierungsschritt verwendet. 79

91 Ergebnisse Abbildung 9: Testverdau der möglichen Targeting Vektor Vorläufer VL2 mit dem Enzym HindIII Erwartete Bandengrößen: 4265, 2916 bp; #7-12 waren positiv Die cdna des humanen CD22 wurde mit Hilfe der Primer cdna-pciirev und cdna- Bsu15Ifw aus humanen Blutzellen amplifiziert und in den Vektor pjet (Clone JetTM PCR Cloning kit) kloniert. Die cdna konnte nun sequenziert werden (Abbildung 10). 80

92 Ergebnisse Abbildung 10: Sequenzierung der cdna des humanen CD22 Sequenz der cdna des humancd22 im Vektor pjet (Query), Sbjct: Vergleichssequenz ensembl ( C57Bl/6 Maus. Gezeigt ist der Bereich, in dem Mutationen gefunden wurden. Kästchen zeigen Punktmutationen, die aber keine Auswirkung auf die Aminosäuresequenz haben (stille Mutationen). Die humancd22 cdna im Vektor pjet und der Targeting Vektor Vorläufer VL2 wurden mit den Enzymen Bsp1407I und Bsu15I verdaut, die DNA Stücke der cdna und des geöffneten VL2 wurden ligiert und in den E.coli Stamm DT5α transformiert. Der Kontrollverdau der DNA der auf Amp + -LB-Platten gewachsenen Klone wurde mit dem Enzym PscI durchgeführt (Abbildung 11). Es wurden 10 Klone untersucht, von denen 4 als positiv bestätigt werden konnten. Klon 9 wurde weiterverwendet und der Targeting Vektor Vorläufer VL3, bzw. cdna+polya_pks_psci war somit erfolgreich kloniert worden. Abbildung 11: Testverdau der möglichen Vorläufer VL3 des Targeting Vektors mit PscI Erwartete Bandengrößen: 4230, 3657, 840, 755 und 197 bp; #7-10 waren positiv 81

93 Ergebnisse Der lange Arm des Vektors wurde in zwei Teilstücken amplifiziert. Der erste Teil enthält die DNA der Exons 1 bis 3 und den ersten Teil von Exon 4 des murinen Cd22 Gens. Dieser Teil lag bereits aus einem früheren Projekt von Caroline Geus in dem Vektor pkscd22ex1-5r130e vor (Geus 2006). Dieser Vektor und der Vektor VL3 wurden mit den Enzymen PscI und Bsu15I verdaut, anschließend ligiert und in DT5α Zellen transformiert. DNA von 10 der so erhaltenen Klone wurde mit dem Enzym HindIII kontrollverdaut (Abbildung 12). Alle getesteten Klone waren positiv, Klon 9 wurde weiterverwendet und somit wurde der Targeting Vektor Vorläufer VL4, bzw. cdna+polya+ex1-3_pks-psci erfolgreich kloniert. Abbildung 12: Testverdau der möglichen Vorläufer des Targeting Vektors VL4 mit HindIII Erwartete Bandengrößen: 4745, 2916, 2636, 1071, 769, 194, 142 und 94 bp; #5-10 waren positiv Als nächster Schritt wurde die zweite Hälfte des langen Arms per PCR aus genomischer DNA der Mauslinie 129sv unter Verwendung der Primer 22prom-LAfw und 22prom-LArev amplifiziert. Dieses DNA Fragment wurden in den Vektor pjet kloniert und ansequenziert (Ergebnisse nicht gezeigt). Nach Bestätigung dieses Fragments wurden dieses und der Vektor VL4 mit den Enzymen NheI und Bsu15I verdaut, sie wurden ligiert und in DT5α E.coli Bakterien transformiert. Mit der aufgereinigten DNA von 12 Klonen wurde ein Testverdau mit dem Enzym PciI durchgeführt (Abbildung 13). Der Targeting Vektor Vorläufer VL5 war mit Bestätigung der Klone 1 und 7 erfolgreich kloniert. Der Klon 7 wurde für den nächsten Klonierungsschritt verwendet. 82

94 Ergebnisse Abbildung 13: Testverdau der möglichen Vorläufer des Targeting Vektors VL5 mit PciI Erwartete Banden: 11207, 3276, 1554 und 228 bp; #7 war positiv Nun fehlte noch der kurze Arm des Targeting Vektors. Aus Caroline Geus Vektor pks- R130E-Kontrollplamid (Geus 2006) konnte dieses DNA Fragment mit den Enzymen NotI und SalI ausgeschnitten werden. Nachdem der Targeting Vektor mit den gleichen Enzymen verdaut wurde, konnte nach erneuter Ligation und Transformation in den E.coli Stamm DT5α der fertige humancd22 Targeting Vektor mit Hilfe verschiedener Verdaue bestätigt werden. Es wurden hierbei die 4 einzigen Kolonien einer Amp + -LB-Platte getestet, die sich alle als positiv bestätigten. Hierzu wurde mit den Enzymen PstI und HindIII verdaut (Abbildung 14). Abbildung 14: Testverdau der möglichen Targeting Vektoren mit PstI und HindIII Erwartete Banden für den Verdau mit PstI (links): 5865, 5004, 3180, 987, 923, 840, 755, 197 bp; erwartete Bande für den Verdau mit HindIII (rechts): 4736, 2956, 2633, 1604, 1071, 905, 769, 194, 142, 94 bp; #2 und 3 waren positiv, wobei bei #3 beim Verdau mit HindIII die DNA nicht vollständig geschnitten wurde, wodurch die Banden bei 6000 bp zu erklären sind. 83

95 Ergebnisse Der Targeting Vektor wurde somit erfolgreich kloniert (Abbildung 15). Abbildung 15: Schematischer Aufbau des Targeting Vektors Targeting Vektor für die Huki CD22 Maus (oben); unten: Kreuzungsschema der DNA des Wildtyp Cd22 Gens und des Targeting Vektors; mut Allel: DNA nach erfolgtem Einbau des Targeting Vektors; cdna: cdna des humanen CD22; Pfeilspitzen: loxp Stellen; 1-8: Exons 1-8 des murinen Cd22; kariertes Kästchen: polya Kassette; neo: Neomycin Kassette; HSV-tK: HSV-tK Kassette; Kreuze zeigen die Bereiche der homologen Rekombination 84

96 Ergebnisse Klonierung des Kontrollvektors Zur Generierung des humcd22-kontrollvektors konnte der Vektor pks-r130e- Kontrollplamid von Caroline Geus (Geus 2006) verwendet werden. Zunächst wurde aus genomischer DNA der Mauslinie 129sv ein 2 kb großes Stück amplifiziert. Dieses enthielt die flankierenden Intronsequenzen und die Sequenz des Exons 5 des murinen Cd22 Gens. Hierzu wurden die Primer CD22in4-SalS und CD22-2kbKA verwendet. Das amplifizierte DNA Stück und der Kontrollvektor von Caroline Geus wurden nun mit den Enzymen NotI und SalI verdaut, das große Fragment des Kontrollvektors und der neue kurze Arm wurden ligiert und in DT5α E.coli transformiert. Nach erfolgter DNA Präparation von 11 Klonen und einem Kontrollverdau mit dem Enzym HindIII und mit SalI und NotI wurden 3 Klone als positiv bestätigt (Abbildung 16). Abbildung 16: Testverdau der möglichen Kontrollvektoren Erwartete Banden des Verdaus mit HindIII (links).: 3033, 2074, 1876, 1604, 226 bp; erwartete Banden des Verdaus mit NotI und SalI (rechts): 6800, 2000 bp; #1,8 und 11 waren hier positiv Klon 11 wurde als humcd22-kontrollvektor für die Transformation von E14CreAG ES- Zellen verwendet Etablierung der humcd22 Screening PCR Zunächst wurde der humcd22 Kontrollvektor durch Verdau mit dem Enzym NotI linearisiert. Anschließend wurde der Vektor sterilgefällt und E14CreAG (129sv Hintergrund, exprimieren Protamine-Cre) (O'Gorman et al. 1997) ES-Zellen wurden hiermit transfiziert. Nach 10 Tagen 85

97 Ergebnisse wurden 10 einzelne ES-Zell Klone gepickt und lysiert. Mit diesen Lysaten wurde die Screening PCR etabliert Transfektion embryonaler Stammzellen mit dem Targeting Vektor Der Targeting Vektor wurde zunächst am kurzen Arm durch Verdau mit dem Enzym NotI linearisiert. Die DNA wurde anschließend sterilgefällt und die ES-Zellen der Linie E14CreAG wurden mit diesem Vektor durch Elektroporation transfiziert. Diese Zellen wurden nun auf Schalen, die mit inaktivierten embryonalen Fibroblasten (EMFIs) konfluent bewachsen waren, ausgesät und am folgenden Tag unter Selektionsdruck mit Doppelselektions-ES-Medium gesetzt. Die Selektion sollte bewirken, dass nur Zellen mit eingebauter neo-kassette, aber ohne eingebaute HSV-tk Kassette wachsen konnten. An Tag 10 wurden 480 Klone gepickt und per PCR gescreent Bestätigung positiver ES-Zell Klone Bei der Screening PCR zeigten zunächst über 20 Klone die erwartete Bande bei 2400 bp. Jedoch konnten nur 2 Klone (V.6.4 und VI.1.1) bei einer Wiederholung der Screening PCR als positiv bestätigt werden (Abbildung 17). Abbildung 17: Screening-PCR für die transfizierten embryonalen Stammzellen Bestätigungs-Screening-PCR möglicher positiver Klone. St: Standard, -: negative Klone, Pfeile: erwartete Bande bei 2400 bp, V.6.4 und VI.1.1: bestätigte positive Klone Von diesen beiden Klonen wurden bei jeder Passage Aliquots weggefroren. Bei Passage 10 wurden die Zellen auf Gelatine umgesetzt und genomische DNA per Phenol-Chlorophorm 86

98 Ergebnisse Extraktion gewonnen. Diese DNA wurde nun für Southern Blot Analysen verwendet. Hierbei sollte bestätigt werden, dass die DNA an der richtigen Stelle und nur in einer Kopie eingebaut wurde. Hierzu wurden Southern Blots über den langen und den kurzen Arm durchgeführt und es wurde jeweils mit einer externen und einer internen Sonde detektiert. Zur Analyse über den kurzen Arm wurden die DNAs der beiden positiven Klone und Wildtyp DNA mit dem Enzym PstI verdaut. Die externe Sonde war mit den Primern humcd22 Sonde 3 und humcd22 Sonde 4 per PCR im Programm Sonde (siehe ) amplifiziert worden. Die erwarteten Banden hatten eine Größe von 6759 bp für das WT Cd22 Gen und 7985 bp für das eingebaute Huki CD22 Targeting Konstrukt (Abbildung 18). Abbildung 18: Southern Blot Analyse der positiven Klone über den kurzen Arm des Konstrukts mit einer externen Sonde oben: schematisches Bild der beiden Allele, gestrichelte Linie: DNA außerhalb des Vektors, neo: Neomycin Kassette, cdna: humane CD22 cdna; unten: Southern Blot von PstI verdauter DNA aus ES-Zell Klonen, Pfeile: erwartete Größe des Allels. Für einen weiteren Southern Blot über den kurzen Arm wurden die DNAs der Klone V.6.4 und VI.1.1 und die 129sv-genomische DNA mit dem Enzym SacI verdaut und mit einer internen Sonde hybridisiert. Die interne Sonde war Teil der humanen CD22 cdna und wurde 87

99 Ergebnisse aus dem Targeting Vektor Vorläufer VL3 gewonnen. Der Vektor wurde hierzu mit dem Enzym EcoRI verdaut und die erwartete Bande bei ca. 720 bp wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten und aufgereinigt. Die erwartete Bande bei diesem Southern Blot sollte bei 6600 bp laufen. Auch diese Southern Blot Analyse war positiv (Abbildung 19). Abbildung 19: Southern Blot Analyse der positiven Klone über den kurzen Arm des Konstrukts mit einer internen Sonde oben: schematisches Bild des mutierten Allels, gestrichelte Linie: DNA außerhalb des Vektors, neo: Neomycin Kassette, cdna: humane CD22 cdna; unten: Southern Blot von SacI verdauter DNA aus ES-Zell Klonen, Pfeile: erwartete Größe des Allels. Zwei weitere Southern Blot Analysen erfolgten über den langen Arm des Konstrukts. Hierzu wurden die DNAs der Klone V.6.4 und VI.1.1 und die 129sv-genomischen DNA mit dem Enzym SalI verdaut. Eine Membran wurde mit einer externen Sonde, die mit den Primern humcd22 Sonde LA3 und humcd22 Sonde LA4 mit dem PCR Programm Sonde amplifiziert wurde, hybridisiert. Eine weitere Analyse erfolgte mit der internen Sonde, die auch für die Analyse über den kurzen Arm verwendet wurde (Abbildung 20). 88

100 Ergebnisse Abbildung 20: Southern Blot Analyse der positiven Klone über den langen Arm des Konstrukts mit einer externen und einer internen Sonde oben: schematisches Bild des mutierten Allels, gestrichelte Linie: DNA außerhalb des Vektors, neo: Neomycin Kassette, cdna: humane CD22 cdna; unten: Southern Blot von SalI verdauter DNA aus ES-Zell Klonen, Pfeile: erwartete Größe des Allels Da alle Southern Blot Analysen positiv waren, wurden die beiden ES-Zell-Klone V.6.4 und VI.1.1 als bestätigt betrachtet und in Blastozysten injiziert Injektion der ES-Zellen in Blastozysten von C57Bl/6 Mäusen Die Zellen wurden für die Injektion wie unter beschrieben vorbereitet. Klon V.6.4 wurde einmal injiziert. Hieraus resultierten sechs hochchimäre Männchen, von denen zwei jedoch steril waren. Die anderen vier Böcke erzeugten nach Verpaarung mit C57Bl/6 Weibchen nur schwarze Nachkommen. Da die E14CreAG ES-Zellen von der Linie 129sv stammen, sollten Nachkommen, die heterozygot sind, die Fellfarbe agouti haben. Der ES-Zell Klon VI.1.1 wurde zweimal injiziert. Es wurden vier hochchimäre Böcke geboren, die alle nach der Verpaarung mit C57Bl/6 Weibchen Nachkommen mit der Fellfarbe agouti bekamen. Wie erwartet, wurde etwa die Hälfte der Nachkommen per PCR als heterozygot bestätigt (Abbildung 21). 89

101 Ergebnisse +/- +/+ +/+ +/+ St +/- +/- +/+ +/+ +/- 500bp 400bp 300bp 200bp Abbildung 21: PCR Typisierung der Nachkommen der chimären Männchen von Klon VI.1.1 St: Standard, +/-: heterozygote Mäuse, +/+: Wildtyp Mäuse, Pfeile: erwartete Größen der Wildtyp und der knockin Bande Bei der Verpaarung dieser F1 Generation wurden homozygote humancd22 knockin (Huki CD22) Mäuse geboren. Der Genotyp der Mäuse konnte mit Hilfe der Typisierungs-PCR bestätigt werden (nicht gezeigt). Die DNA für diese PCR wurde aus Schwanzbiopsien gewonnen. 4.2 Analyse der Huki CD22 Mäuse Nachdem die Huki CD22 Mauslinie erfolgreich generiert war, sollten die Mäuse nun charakterisiert werden. Hierzu wurde die Expression von humanem CD22, die B- Zellpopulationen in Milz, Knochenmark und Peritoneum, das Calciumsignal und die Signalweiterleitung nach Stimulation des BZR, die Antikörperantworten nach Immunisierung und die Endozytose des humanen CD22 untersucht B-Zellen im Blut der Huki CD22 Mäuse exprimieren humanes, aber kein murines CD22 Zunächst sollte bestätigt werden, dass in der Huki CD22 Maus das murine CD22 durch humanes CD22 ersetzt wurde. Den Huki CD22 Mäusen wurde hierzu Blut durch Anritzen des Schwanzes entnommen und die Erythrozyten wurden depletiert. Die übrigen Zellen wurden mit dem B-Zell Marker B220 und einem Antikörper gegen humanes CD22 bzw. murines CD22 gefärbt (Abbildung 22). 90

102 Ergebnisse Abbildung 22: B-Zellen im Blut der Huki CD22 Mäuse exprimieren humanes, aber kein murines CD22 Durchflusszytometrische Analyse murinen Blutes nach Erythrozytenlyse, gezeigt sind B220 positive Zellen; +/+: Wildtyp Maus, +/Huki CD22: heterozygote Huki CD22 Maus, Huki CD22: homozygote Huki CD22 Maus. Heterozygote Mäuse exprimieren murines und humanes CD22 auf den B-Zellen des Blutes. Huki CD22 Mäuse tragen nur humanes, kein murines CD22 auf der Oberfläche der B- Zellen des Blutes. Heterozygote Mäuse tragen wie erwartet humanes und murines CD22 auf der Oberfläche der B-Zellen. Huki CD22 Mäuse tragen humanes, aber kein murines CD22 auf der Oberfläche der B-Zellen Milz- und Lymphknoten-B-Zellen der Huki CD22 Mäuse exprimieren humanes, aber kein murines CD22 Es sollte nun bestätigt werden, dass humanes CD22 auch auf B-Zellen in Milz und Lymphknoten das murine CD22 ersetzt. Hierzu wurden Zellen von Milz und Lymphknoten, nach erfolgter Erythrozytendepletion im Falle der Milzzellen, durchflusszytometrisch analysiert. Hierzu wurden die Zellen mit Antikörpern gegen murines oder humanes CD22 und dem B-Zell Marker B220 gefärbt. 91

103 Ergebnisse Abbildung 23: Milz- und Lymphknoten-B-Zellen der Huki CD22 Mäuse exprimieren humanes, aber kein murines CD22 FACS-Färbung muriner Milz- und Lymphknotenzellen von Wildtyp und Huki CD22 Mäusen. Gezeigt sind Zellen im Lymphozyten-Gate. A: Die Färbung der Milzzellen zeigt, dass Huki CD22 Mäuse humanes, aber keine murines CD22 auf der Oberfläche B220 positiver Zellen exprimieren. Milzzellen der Wildtypmäuse exprimieren murines CD22, aber kein humanes CD22. B: Die Färbung der Lymphknotenzellen zeigt, dass Huki CD22 Mäuse humanes, aber kein murines CD22 auf der Oberfläche B220 positiver Zellen exprimieren. Wie in Abbildung 23 dargestellt, exprimiert die Huki CD22 Maus humanes CD22, aber kein murines CD22 auf Milz- und Lymphknoten-B-Zellen. Eine kleine Population der unreifen B- Zellen (15,5 %) in der Milz der Huki CD22 Mäuse exprimieren nur wenig humanes CD22. 92

104 Ergebnisse Vergleich der hcd22-expression auf B-Zellen in humanem Blut und im Blut der Huki CD22 Mäuse zeigt niedrige Expression von CD22 auf B- Zellen der Huki CD22 Mäuse Es sollte nun getestet werden, in wieweit sich die geringe Verschiebung positiver Populationen nach Färbung mit einem anti-hcd22 Antikörper dadurch erklären lässt, dass dieser Antikörper allgemein nicht gut färbt. Hierzu wurden Lymphozyten über einen Ficoll- Gradienten aus menschlichem Blut aufgereinigt. Murines Blut wurde zweimal mit Gey s solution behandelt, um die Erythrozyten zu depletieren. Die murinen Zellen wurden mit dem B-Zell-Marker B220 gefärbt und humane Zellen mit einem anti-cd20 Antikörper. Alle Proben wurden zudem mit einem anti-hcd22-pe Antikörper in verschiedenen Konzentrationen gefärbt. Abbildung 24: Vergleich der hcd22-expression auf B-Zellen in humanem Blut und im Blut der Huki CD22 Mäuse zeigt niedrige Expression von CD22 auf B-Zellen der Huki CD22 Mäuse Färbung humaner CD20-positiver Zellen aus menschlichem Blut und Huki CD22 B220-positiver- Zellen des Blutes mit einem anti-hcd22 Antikörper. Bei gleicher anti-hcd22 Antikörperkonzentration zeigen die B-Zellen des humanen Blutes eine ca. 30-stärkere Färbung, als die Zellen aus dem Blut der Huki CD22 Mäuse. Dies zeigt, dass der anti-hcd22 Antikörper Zellen mit humanem CD22 auf der Oberfläche sehr gut färben kann. Wahrscheinlich exprimieren die Huki CD22 Mäuse also wenig hcd22 auf der Oberfläche der B-Zellen B-Zellpopulationen in Knochenmark und Milz der Huki CD22 Mäuse sind signifikant verändert Zur Analyse verschiedener Zellpopulationen der Huki CD22 Mäuse wurden Knochenmark und Milz dieser Mäuse, von Wildtypmäusen und von CD22 knockout (-/-) Mäusen 93

105 Ergebnisse entnommen und die Zellen vereinzelt. Nachdem die Erythrozyten depletiert wurden, wurden ca. 1x 10 6 Zellen für die durchflusszytometrische Analyse gefärbt und gemessen. Abbildung 25: B-Zellpopulationen im Knochenmark der Huki CD22 Mäuse sind signifikant verändert Durchflusszytometrische Analyse verschiedener B-Zellpopulationen im Knochenmark von Wildtyp, CD22-/- und Huki CD22 Mäusen; links: Beispiel für Färbungen; rechts: Zusammenfassung von 8 Experimenten, ** p<0,01, * p<0,05 Bei Analyse der verschiedenen B-Zell Populationen im Knochenmark (Abbildung 25) zeigten die Huki CD22 Mäuse einen verringerten Anteil reifer B-Zellen. Dieser Phänotyp entspricht dem der CD22-/- Maus. Bei den Populationen der unreifen B-Zellen und der transitorischen B-Zellen konnten keine signifikanten Unterschiede der Huki CD22 Mäuse zum Wildtyp festgestellt werden ( Tabelle 6). Abbildung 26: B-Zellpopulationen in der Milz der Huki CD22 Mäuse sind signifikant verändert Durchflusszytometrische Analyse verschiedener B-Zellpopulationen in der Milz von Wildtyp-, CD22-/- und Huki CD22 Mäusen; links: Beispiel für Färbungen; rechts: Zusammenfassung von 5 Experimenten, MZ: Marginalzonen B-Zellen, FO: follikuläre B-Zellen, M: reife B-Zellen, ** p<0,01, * p<0,05 94

106 Ergebnisse Bei der durchflusszytometrischen Analyse verschiedener B-Zell Populationen in der Milz (Abbildung 26) konnten signifikante Unterschiede der Huki CD22 Mäuse zu den Wildtypmäusen festgestellt werden. So gleichen die Populationen der Marginalzonen B- Zellen (MZ-Zellen), der reifen B-Zellen und der T1- und T2-Zellen eher denen der CD22-/- Mäuse, als denen der Wildtypmäuse. Knochenmark WT CD22-/- Huki CD22 Unreife B-Zellen (B220 med, IgM med/hoch ) 3,9 ± 1,9 6,5 ± 3,9 4,9 ± 2,8 Transitionelle B-Zellen (B220 hoch, IgM med/hoch ) 1,2 ± 0,8 0,5 ± 0,4 * 0,6 ± 0,5 Reife B-Zellen (B220 hoch, IgD hoch ) 2,5 ± 1,4 1,2 ± 0,4 ** 1,2 ± 0,8 * Milz T1/MZ Zellen (IgM hoch, IgD med ) 4,4 ± 1,2 2,3 ± 0,5 ** 1,7 ± 0,8 ** T2 Zellen (IgM hoch, IgD hoch ) 1,3 ± 0,8 0,3 ± 0,3 * 0,2 ± 0,1 * Reife B-Zellen (IgM med, IgD med/hoch ) 8,5 ± 2,9 12,6 ± 3,5 7,8 ± 4,9 Marginalzonen B-Zellen (CD1d hoch, B220 hoch ) 1,4 ± 0,6 0,35 ± 0,1 ** 0,34 ± 0,2 ** Follikuläre B-Zellen (CD1d niedrig, B220 hoch ) 19,5 ± 7,5 17,5 ± 6,1 10,8 ± 7,2 MHCII expression auf B-Zellen (mfi) 71,3 ± 22,1 95,4 ± 22 92,1 ± 33,5 Peritoneum B1a Zellen (IgM hoch, CD5 med ) 0,9 ± 0,3 1,8 ± 0,8 0,8 ± 0,7 B2/B1b Zellen (IgM hoch, CD5 niedrig ) 1,1 ± 0,4 1,4 ± 0,7 0,6 ± 0,3 * T-Zellen (IgM neg, CD5 hoch ) 1,0 ± 0,3 1,6 ± 0,9 0,6 ± 0,4 Tabelle 6: B-Zellpopulationen in Knochenmark, Milz und Peritoneum der Huki CD22 Mäuse sind signifikant verändert Knochenmark: x10 5, n=8; Milz: x 10 6, n=5; Peritoneum: x 10 5, n=5; mfi: mean flourescence intensity, n=5; signifikante Unterschiede zu WT Populationen sind durch * p<0,05 und ** p<0,01 gezeigt. Neben den oben beschriebenen Veränderungen in der Zahl einzelner B-Zell-Populationen war die Zahl der B2/B1b-Zellen im Peritoneum der Huki CD22 Mäuse ebenfalls signifikant reduziert ( Tabelle 6). Die CD22-/- Mäuse zeigen diesen Phänotyp jedoch nicht. Die durchflusszytometrische Analyse der MHCII Expression ( 95

107 Ergebnisse Tabelle 6) auf den B-Zellen der Milz ergab, dass die Huki CD22 Maus, genau wie die CD22- /- Maus, eine leicht erhöhte Expression von MHCII hat, die aber nicht signifikant war. Die Huki CD22 Mäuse zeigen also signifikante Veränderungen in den B-Zellpopulationen von Knochenmark, Milz und Peritoneum Veränderte Zellzahlen in Knochenmark und Milz der heterozygoten Huki CD22 Mäuse Die Zellzahlen verschiedener B-Zell-Populationen der +/Huki CD22 Mäuse wurde ebenfalls untersucht und mit den oben gezeigten Ergebnissen verglichen. Abbildung 27: Veränderte Zellzahlen in Knochenmark und Milz der heterozygoten Huki CD22 Mäuse Durchflusszytometrische Analyse mit den gleichen Färbungen wie in 4.2.4; verschiedener B- Zellpopulationen in Knochenmark und Milz von Wildtyp-, CD22-/-, Huki CD22 und +/Huki CD22 Mäusen. MZ: Marginalzonen B-Zellen, FO: follikuläre B-Zellen; +/Huki CD22: n=3 Die Analyse der Zellzahlen der verschiedenen B-Zellpopulationen (Abbildung 27) zeigte, dass die heterozygoten Huki CD22 Mäuse ebenfalls reduzierte Populationen von MZ B- Zellen haben. Da in dem analysierten Gate T1/MZ sowohl T1, als auch MZ Zellen liegen und die Zahl der MZ Zellen in der spezifischen Färbung reduziert sind, ist die Zahl der T1 Zellen vermutlich unverändert. Die Zahl der reifen B-Zellen im Knochenmark ist ebenfalls reduziert, wenn auch nicht so stark wie in den CD22-/- und Huki CD22 Mäusen. Die Zahl der anderen analysierten B-Zellpopulationen in der Milz ist nicht verändert. 96

108 Ergebnisse Signifikant reduziertes Homing der rezirkulierenden B-Zellen der Huki CD22 Mäuse ins Knochenmark Da die Zahl der reifen B-Zellen im Knochenmark, aber nicht in der Milz in den Huki CD22 Mäusen reduziert war, wurde nun untersucht, ob ein Defekt im Homing der rezirkulierenden B-Zellen ins Knochenmark vorliegt. Hierzu wurden einer ausreichenden Anzahl Spendermäuse (hier 6 Tiere für 10 Empfängermäuse) die Milzen entnommen. Die vereinzelten Zellen wurden einer Erythrozyten- und anschließenden T-Zelllyse unterzogen und mit CFSE gefärbt. Pro Empfängertier wurden 1x 10 7 Zellen intravenös injiziert. Die Empfängertiere wurden am folgenden Tag getötet und Milz und Knochenmark wurden entnommen. Nach erfolgter Vereinzelung und Erythrozytenlyse wurden die Zellen mit dem B-Zellmarker B220 und anti-igd gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Abbildung 28: Signifikant reduziertes Homing der rezirkulierenden B-Zellen der Huki CD22 Mäuse ins Knochenmark Durchflusszytometrische Analyse der Milz- und Knochenmarkszellen der Empfängertiere 24 Stunden nach i.v. Injektion CFSE markierter Knochenmarkszellen von Huki CD22- oder Wildtyp-Mäusen; links: Beispielbild einer Maus, der gelabelte Wildtypzellen und einer, der gelabelte Huki CD22 Zellen injiziert wurde, die Prozentangaben bezeichnen den Anteil der CFSE-positiven Zellen (kleines Rechteck) an den IgD-positiven (großes Rechteck), es werden nur B220-positive gezeigt; rechts: Anteil der CFSE-positiven Zellen an den B220, IgD-positiven Zellen aller analysierten Mäuse, je 20 Empfängertiere pro Gruppe Die durchflusszytometrische Analyse des Anteils der CFSE markierten Zellen an den reifen B-Zellen der Milz und des Knochenmarks der Empfängermäuse (Abbildung 28) ergab einen signifikant erhöhten Anteil der von den Huki CD22 Mäuse stammenden Zellen im Vergleich mit dem Anteil der aus den Wildtypmäusen stammenden Zellen. Im Knochenmark ist dieses Verhältnis umgekehrt, die reifen B-Zellen der Huki CD22 Mäuse wandern also weniger stark ins Knochenmark, als die Zellen der Wildtypmäuse. 97

109 Ergebnisse Erhöhter Calciumeinstrom nach Stimulation des BZR in Milzzellen der Huki CD22 Mäuse Da die CD22-/- Mäuse einen stark erhöhten Calciumeinstrom nach Stimulation des BZR zeigen, sollte nun untersucht werden, ob dies für die Huki CD22 Mäuse auch zutrifft. Für die Messung des Calciumeinstroms wurden Huki CD22 Mäusen zunächst die Milzen entnommen und die Erythrozyten wurden depletiert. Anschließend wurden die Zellen mit Indo-1AM beladen und mit Hilfe des Geräts LSR2 wurde der Calciumeinstrom gemessen. Die Fluoreszenz der Zellen wurde hierzu 50 Sekunden lang aufgenommen, dann wurden die Zellen durch Zugabe verschiedener Mengen des F(ab) 2 Fragments B7.6 über den BZR stimuliert. Abbildung 29: Erhöhter Calciumeinstrom nach Stimulation des BZR in Milzzellen der Huki CD22 Mäuse Messung des Calciumsignals der B-Zellen von Wildtyp, CD22-/- und Huki CD22 Mäusen nach Stimulation des BZR mit verschiedenen Mengen B7.6, n=7 98

110 Ergebnisse Die Messung des Calciumsignals der B-Zellen zeigte, wie in Abbildung 29 zu erkennen, ein stark erhöhtes Calciumsignal der Zellen der CD22-/- Mäuse im Vergleich zu denen der Wildtypmäuse. Die Zellen der Huki CD22 Mäuse zeigten ein Calciumsignal, das zwischen dem der beiden anderen Mauslinien lag, also gegenüber den WT B-Zellen ebenfalls erhöht war CD22 auf B-Zellen der Huki CD22 Maus wird nach Stimulation des BZR phosphoryliert und SHP-1 wird rekrutiert Da die Huki CD22 Mäuse ähnliche Phänotypen wie die CD22-/- Mäuse zeigen, sollte untersucht werden, ob hcd22 auf B-Zellen der Huki CD22 Mäuse nach Stimulation des BZR phosphoryliert wird und ob SHP-1 rekrutiert wird. Huki CD22 Mäusen wurde für diesen Versuch die Milz entnommen. Die Zellen wurden vereinzelt, die Erythrozyten und T-Zellen wurden lysiert und die verbliebenen Zellen wurden stimuliert. Daudi-Zellen wurden als Kontrolle ebenfalls stimuliert. Hierzu wurden 10 µl F(ab) 2 zu den ca. 1x 10 7 Zellen in 500 µl B-Zell-Medium gegeben. Für die Daudi-Zellen wurde anti-humanes IgM verwendet, für die Huki Zellen wurde anti-murines IgM verwendet. Stimuliert wurde zu den Zeitpunkten 0, 2, 5 und 10 Minuten. Die Zellen wurden anschließend mit Brij-Lysepuffer lysiert und die Lysate wurden mit über Nacht mit Sepharose G und 4 µg des Maus anti-hcd22 Antikörpers inkubiert. Abbildung 30: CD22 auf B-Zellen der Huki CD22 Maus wird nach Stimulation des BZR phosphoryliert und SHP-1 wird rekrutiert Immunpräzipitation von CD22 und Co-Immunpräzipitation von SHP-1 in Huki CD22 B-Zellen oder Daudi B-Zellen. Die Zellen wurden entweder mit anti-murinem oder mit anti-humanem F(ab) 2 stimuliert und anschließend lysiert. CD22 wurde mit anti-humancd22 Antikörper präzipitiert. Nach erfolgter SDS Gelelektrophorese und Blotten, wurden die Membranen mit Antikörpern gegen Phosphotyrosin, SHP-1 und CD22 (auf einem separat gelaufenen Gel, das mit Aliquots derselben Lysate beladen war) gefärbt. 99

111 Ergebnisse Betrachtet man die Bandenstärke des Anti-Phosphotyrosin Westernblots, so ist auf der Seite der Daudi-Zellen eine Zunahme der Bandenstärke nach Stimulation der Zellen zu sehen. Das CD22 auf den Huki CD22 B-Zellen scheint ebenfalls nach 2,5 Minuten stärker phosphoryliert zu werden. Auch nach 5 Minuten war die Bandenstärke noch deutlich erhöht im Vergleich zu den unstimulierten Zellen. Nach 10 Minuten ist bei den Huki CD22 und den Daudi Zellen die Stimulation im Phosphotyrosinblot nicht mehr zu sehen. Betrachtet man den anti-shp-1 Western Blot, so erkennt man die Bande auf der Seite der Daudi-Zellen bei 65 kda. Diese wird nach der Stimulation der Zellen stärker. Bei den Huki-Zelllysaten ist die Bande ebenfalls gut zu erkennen. Nach Stimulation der Zellen nimmt die Bandenstärke zu. CD22 wird auf den Huki CD22 B-Zellen also nach Stimulation des BZR noch phosphoryliert und SHP-1 wird rekrutiert. Ob dies im gleichen Maße wie bei murinem CD22 auf WT Zellen geschieht, ist jedoch nicht zu sagen CD22 auf B-Zellen der Huki CD22 Mäuse wird nach Antikörperbindung endozytiert Da die gegen CD22 gerichteten Immunotoxine endozytiert werden müssen, um die B-Zellen zu töten, ist es eine essentielle Voraussetzung für die Nutzung der Huki CD22 Mäuse als entsprechendes Mausmodell, dass das hcd22 noch immer endozytiert wird. Um dies zu überprüfen, wurden Huki CD22 Mäusen die Milz entnommen, die Erythrozyten wurden depletiert und die B-Zellen durch MACSen mit CD19 microbeats isoliert. Die Zellen wurden nun für eine Stunde auf Eis mit einem anti-cd22 Antikörper inkubiert und die Endozytose durch Erwärmung der Zellen auf 37 C induziert. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden Zellen entnommen, diesen wurde der außen gebundene anti-cd22 Antikörper mit Glycin ph2,5 abgewaschen, sie wurden fixiert und durchflusszytometrisch analysiert. 100

112 Ergebnisse Abbildung 31: CD22 auf B-Zellen der Huki CD22 Mäuse wird nach Antikörperbindung endozytiert Endozytose des CD22 auf B-Zellen der Huki CD22 Mäuse nach anti-hcd22-antikörperbindung (rechts), bzw. auf Wildtyp B-Zellen nach anti-mcd22-antikörperbindung (links). Der geo mean der CD22-Färbung wurde bei extrazelluläre Färbung, also nach 0 Minuten ohne Glycinbehandlung der Zellen, als 100 % gesetzt und alle anderen Messungen wurden in Relation dazu gesetzt; n=3, hiervon wurde ein Versuch mit Triplikaten durchgeführt Die Analyse der Endozytose zeigte, wie in Abbildung 31 zu sehen, dass sowohl das murine, als auch das humane CD22 auf den murinen B-Zellen nach Antikörperbindung endozytiert werden. Bei den Wildtypzellen wurde das Maximum der Endozytose nach 60 Minuten erreicht, bei den Huki CD22 Zellen nach 10 Minuten Unveränderte natürliche Antikörperlevel verschiedener Antikörper- Isoformen in Huki CD22 Mäusen Es sollten nun die Antikörperlevel unimmunisierter Mäuse untersucht werden. Hierzu wurden Huki CD22 Mäusen Blut entnommen und die Seren wurden in verschiedenen ELISAs getestet. Es wurden die natürlichen Antikörpertiter von IgM, IgA, IgG1, IgG2b und IgG3 getestet (Abbildung 32). 101

113 Ergebnisse Abbildung 32: Unveränderte natürliche Antikörperlevel verschiedener Antikörper-Isoformen in Huki CD22 Mäusen ELISA Messung der verschiedenen Klassen der Antikörper im Serum der Huki CD22 und Wildtyp Mäuse Die Huki CD22 Mäuse zeigten keine signifikanten Unterschiede zu den Wildtypkontrollen, bei der Analyse der verschiedenen Klassen der Antikörper im Serum Unveränderte Immunantwort der Huki CD22 Mäuse nach Immunisierung mit einem Thymus-unabhängigen Antigen CD22-/- Mäuse zeigen reduzierte Antikörperantworten nach Immunisierung mit TNP-Ficoll. Es sollte nun überprüft werden, ob dies bei Huki CD22 Mäusen auch der Fall ist. Huki CD22 Mäuse und dazu passende Wildtypkontrollen wurden an Tag 0 mit TNP-Ficoll intraperitoneal immunisiert. Es wurde an den Tagen 0, 5, 7, 11 und 14 Blut per Schwanzanritzen entnommen und die daraus gewonnenen Seren wurden auf -20 C gesammelt. Es wurden nun ELISAs zur Detektion spezifischer IgM und IgG3 Antikörper durchgeführt. Die ELISA-Platten wurden hierzu mit TNP-BSA gecoated. Die Seren und der Standard aus gepoolten Seren von Tag 14 wurden 1:20 verdünnt eingesetzt. 102

114 Ergebnisse Abbildung 33: Unveränderte Immunantwort der Huki CD22 Mäuse nach Immunisierung mit einem Thymus-unabhängigen Antigen TNP-Ficoll Immunisierung von Huki CD22 und Wildtypmäusen an Tag 0. Anti-TNP IgM (links) und IgG3 (rechts) Antikörperantworten wurde mittels ELISA bestimmt; AU: relative Einheiten Die Huki CD22 Mäuse zeigten, wie in Abbildung 33 zu erkennen, keine Unterschiede zu den Wildtyptieren in der spezifischen Antikörperantwort bei Immunisierung mit dem Thymusunabhängigen Antigen TNP-Ficoll Unveränderte Immunantwort der Huki CD22 Mäuse nach Immunisierung mit einem Thymus-abhängigen Antigen Im folgenden Experiment sollte die Antikörperantwort der Huki CD22 Mäuse nach Immunisierung mit einem Thymus-abhängigen Antigen untersucht werden. CD22-/- Mäuse zeigen bei dieser Art der Immunisierung keinen Unterschied zu WT Tieren. Huki CD22 Mäuse und dazu passende Wildtypkontrollen wurden an Tag 0 und 21 mit NP-KLH intraperitoneal immunisiert. Es wurde an den Tagen 0, 7, 14, 21, 28 und 35 Blut per Schwanzanritzen abgenommen und die daraus gewonnenen Seren wurden auf -20 C gesammelt. Es wurden nun ELISAs zur Detektion spezifischer IgM und IgG1 Antikörper durchgeführt. Die ELISA-Platten wurden hierzu mit NP-BSA gecoated. Die Seren bis Tag 14 wurden 1:20 und die späteren Seren und der Standard aus gepoolten Seren von Tag 35 wurden 1:200 verdünnt eingesetzt. 103

115 Ergebnisse Abbildung 34: Unveränderte Immunantwort der Huki CD22 Mäuse nach Immunisierung mit einem Thymus-abhängigen Antigen NP-KLH Immunisierung von Huki CD22 und Wildtypmäusen an Tag 0 und 21. Anti-NP IgM (links) und IgG1 (rechts) Antikörperantworten wurde mittels ELISA bestimmt; AU: relative Einheiten Die Huki CD22 Mäuse zeigten, wie in Abbildung 34 zu erkennen, praktisch keine Unterschiede zu den Wildtyptieren in der spezifischen Antikörperantwort bei Immunisierung mit dem Thymus-abhängigen Antigen NP-KLH. Lediglich an Tag 7 nach der Immunisierung ist eine leicht erhöhte IgM-Antwort der Huki CD22 Mäusen nachweisbar. 4.3 Analyse der knockin Mäuse mit mutierten Ligandenbindungs- und Signalleitungs-Domänen von CD22 Ingrid Obermeier begann während ihrer Doktorarbeit mit der Analyse der CD22 R130E (Mutation in der Ligandenbindungsdomäne), der CD22 Y5,6F (Mutationen in zwei der drei ITIMs) und der CD22 Y2,5,6F (Mutationen in den drei ITIMs) Mäuse. Diese sollte nun fortgeführt werden. Hierbei sollte untersucht werden, wie die Mauslinien auf Immunisierungen reagieren, ob das Homing-Verhalten der B-Zellen dieser Mäuse ins Knochenmark verändert ist und wie die mutierten CD22 auf den B-Zellen der CD22 R130E Mäuse mit dem BZR interagieren CD22 R130E und CD22 Y2,5,6F Mäuse zeigen signifikant veränderte Serum-Antikörperlevel Zunächst wurden die Antikörperlevel unimmunisierten Mäusen untersucht. Hierzu wurde Mäusen der verschiedenen Mauslinien Blut entnommen und die Seren wurden per ELISA 104

116 Ergebnisse analysiert. Hierbei wurden die natürlichen Antikörper der Isoformen IgM, IgA, IgG1, IgG2b und IgG3 bestimmt (Abbildung 35). Abbildung 35: CD22 R130E und CD22 Y2,5,6F Mäuse zeigen signifikant veränderte Serum- Antikörperlevel Bestimmung der Antikörperlevel unimmunisierter CD22 R130E-, CD22 Y5,6F- und CD22 Y2,5,6F- Mäuse mittels ELISA Die Mäuse der Linie CD22 Y5,6F zeigten keine signifikanten Unterschiede bei der Analyse der natürlichen Antikörper (Abbildung 35). Die Mäuse der Linie CD22 Y2,5,6F hingegen haben signifikant erhöhte Level von IgG1 und IgM Antikörpern. Der auffälligste Phänotyp wurde hier bei den CD22 R130E-Mäusen gefunden. Diese Mäuse zeigen signifikant erhöhte Level an IgG1 und IgG2b Antikörpern und signifikant weniger Antikörper des Typs IgA Veränderte Antikörperantworten bei Thymus-unabhängiger Immunisierung der CD22 R130E, CD22 Y5,6F und CD22 Y2,5,6F Mäuse CD22-/- Mäuse zeigen reduzierte Antikörperlevel nach Immunisierung mit dem Thymusunabhängigen Antigen TNP-Ficoll. Im folgenden Experiment sollten die Antikörperantworten der CD22 knockin Mauslinien untersucht werden. Die Mäuse wurden an Tag 0 mit dem Thymus-unabhängigen Antigen TNP-Ficoll intraperitoneal immunisiert. An Tag 0, 5, 7,

117 Ergebnisse und 14 wurde den Mäusen Blut durch Schwanzanritzen abgenommen und das Serum wurde bei -20 C aufbewahrt. Die ELISA-Platten wurden mit TNP-BSA gecoated und die spezifischen Antikörper gegen IgM und IgG3 analysiert. Die Seren wurden 1:20 verdünnt eingesetzt und als Standard wurden Seren von Tag 14 gepoolt. Abbildung 36: Veränderte Antikörperantworten bei Thymus-unabhängiger Immunisierung der CD22 R130E, CD22 Y5,6F und CD22 Y2,5,6F Mäuse Antikörperantwort nach Immunisierung an Tag 0 mit TNP-Ficoll, das eine Thymus-unabhängige Immunantwort auslöst. Anti-TNP IgM (links) und IgG3 (rechts) Antikörperantworten wurde mittels ELISA bestimmt; AU: relative Einheiten Die CD22 R130E Mäuse zeigten, wie in Abbildung 36 zu sehen, eine erhöhte Antikörperantwort des Typs IgM 7 und 11 Tage nach Immunisierung mit TNP-Ficoll. Die CD22 Y5,6F Mäuse zeigen eine signifikant reduzierte Antikörperantwort an Tag 11. Die CD22 Y2,5,6F Mäuse verhalten sich hier wie die Wildtypmäuse. Analysiert man die Antikörperantwort des Isotyps IgG3, so sind keine signifikanten Unterschiede zwischen den vier Mauslinien nachweisbar Veränderte Antikörperantworten bei Thymus-abhängiger Immunisierung der CD22 R130E, CD22 Y5,6F und CD22 Y2,5,6F Mäuse Im folgenden Experiment sollten die Antikörperantworten der CD22 knockin Mäuse nach Immunisierung mit dem Thymus-abhängigen Antigen NP-KLH untersucht werden. Die CD22-/- Mäuse zeigen hier keinen Phänotyp. Die Mäuse wurden an Tag 0 und 21 mit NP- KLH, das eine Thymus-abhängige Immunantwort auslöst, intraperitoneal immunisiert. An Tag 0, 7, 14, 21, 28 und 35 wurden den Tiere durch Schwanzritzen Blut abgenommen und die 106

118 Ergebnisse Seren wurden bei -20 C aufbewahrt. Die Tiere konnten nach 2 Monaten erneut immunisiert werden. Es wurde dann an Tag 0, 7 und 14 Blut entnommen. Die ELISA-Platten wurden mit NP17-BSA gecoated und die spezifischen Antikörper gegen IgM, IgG1 und IgG2b wurden analysiert. Die Seren der Tage 0 bis 14 wurden 1:20 verdünnt eingesetzt. Die Seren der späteren Tage wurde 1:200 verdünnt. Als Standard dienten gepoolte Seren der Tage 14 bis 35. Abbildung 37: Veränderte Antikörperantworten bei Thymus-abhängiger Immunisierung der CD22 R130E, CD22 Y5,6F und CD22 Y2,5,6F Mäuse Antikörperantwort nach Immunisierung an den Tagen 0, 21 und 100 mit NP-KLH, das eine Thymusabhängige Immunantwort auslöst. Anti-NP IgM (oben) und IgG1 (unten) Antikörperantworten wurde mittels ELISA bestimmt; AU: relative Einheiten 107

119 Ergebnisse Bei der Immunisierung der verschiedenen Mauslinien mit dem Antigen NP-KLH, das eine Thymus-abhängige Immunantwort auslöst, konnten signifikante Unterschiede in der Antikörperantwort der CD22 knockin Mäuse im Vergleich zu den Wildtyptieren festgestellt werden (Abbildung 37). 7 und 14 Tage nach der ersten Immunisierung zeigte die Linie CD22 Y2,5,6F eine signifikant erhöhte Antwort des Isotyps IgM. Die IgM-Antwort der CD22 R130E Mäuse fiel bei 14 Tagen ebenfalls erhöht aus. Betrachtet man den Isotyp IgG1, so zeigten die CD22 Y2,5,6F Mäuse eine erhöhte Antwort an Tag 7, genau wie die CD22 Y5,6F Mäuse. Die Antikörperlevel glichen sich anschließend wieder an, bis zum Zeitpunkt der zweiten Immunisierung. Erneut zeigten die CD22 Y2,5,6F Mäuse 7 Tage nach der Immunisierung eine signifikant erhöhte Antwort. Diese blieb auch an Tag 35 erhöht. Bei der dritten Immunisierung 2 Monate nach Tag 35 war der Antikörpertiter des Isotyps IgG1 dieser Mäuse signifikant niedriger, als der der Wildtyptiere. 7 Tage nach erneuter Immunisierung zeigten die CD22 Y2,5,6F Mäuse erneut eine signifikant erhöhte Antikörperantwort des Typs IgG1 verglichen mit den Wildtypmäusen. Diese war auch an Tag 14 nach der dritten Immunisierung noch signifikant erhöht. Bei Betrachtung des Isotyps IgG1 fallen die CD22 R130E Mäuse nur an Tag 28, also 7 Tage nach der zweiten Immunisierung auf, da sie hier eine signifikant erhöhte Antwort zeigten. Zu allen anderen Zeitpunkten verhielten diese Mäuse sich wie die Wildtyptiere Signifikante Veränderung im Homing der rezirkulierenden B-Zellen der CD22 Y2,5,6F Mäuse ins Knochenmark Da bei den CD22 Y5,6F und CD22 Y2,5,6F Mäusen die Zahl der rezirkulierenden B-Zellen im Knochenmark reduziert ist, sollte untersucht werden, ob die CD22 knockin Mäuse einen Defekt im Homing der rezirkulierenden B-Zellen ins Knochenmark haben. Die CD22-/- Mäuse zeigen diesen Defekt. Einer ausreichenden Anzahl Spendermäuse (hier 6 Tiere pro 10 Empfängermäuse) wurden für diesen Versuch die Milzen entnommen. Die vereinzelten Zellen wurden einer Erythrozyten- und anschließenden T-Zelllyse unterzogen und mit CFSE gefärbt. Pro Empfängertier wurden 1x 10 7 Zellen intravenös injiziert. Die Empfängertiere wurden nach 24 Stunden getötet und Milz und Knochenmark wurde entnommen. Nach erfolgter Vereinzelung und Erythrozytenlyse wurden die Zellen auf den B-Zellmarker B220 gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. 108

120 Ergebnisse Abbildung 38: Signifikante Veränderung im Homing der rezirkulierenden B-Zellen der CD22 Y2,5,6F Mäuse ins Knochenmark Durchflusszytometrische Analyse der Milz- und Knochenmarkszellen der Empfängertiere 24 Stunden nach Injektion CFSE markierter Knochenmarkszellen von CD22 R130E, CD22 Y5,6F, CD22 Y2,5,6F oder Wildtyp-Mäusen; links: Beispiel einer Knochenmarksfärbung einer Maus, der Wildtypzellen injiziert wurde und einer, der CD22 Y2,5,6F Zellen injiziert wurde, die angegebenen Prozentzahlen beziehen sich auf den Anteil der CFSE gelabelten Zellen an den B220-positiven Zellen; rechts: Anteil der CFSE-positiven Zellen an den B220-positiven Zellen aller Mauslinien in Milz und Knochenmark, n= WT:28, CD22 R130E: 14; CD22 Y5,6F: 12, CD22 Y2,5,6F: 15 Die durchflusszytometrische Analyse des Anteils der CFSE gelabelten Zellen an den Zellen der Milz und des Knochenmarks der Empfängermäuse ergab keine signifikanten Unterschiede im Anteil der CFSE gelabelten Zellen an den B220 positiven Lymphozyten der Milzen der Empfängertiere (Abbildung 38). Betrachtet man das Knochenmark der Empfängertiere, so zeigte sich ein signifikanter Unterschied im Anteil der CFSE gelabelten B-Zellen der Wildtyp und der CD22 Y2,5,6F Spendertiere. Der Anteil der gelabelten B-Zellen der CD22 Y2,5,6F Mäuse scheint auch in der Milz reduziert, wobei dieser Effekt nicht signifikant war Verringerte Assoziation des CD22 auf B-Zellen der CD22 R130E Mäuse mit dem BZR nach Stimulation der Zellen in einem Proximity ligation assay (PLA) Da das Calciumsignal der B-Zellen der CD22 R130E Mäuse nach Stimulation des BZR niedriger als bei Wildtypzellen ist, sollte untersucht werden, ob die Interaktion des CD22 mit dem BZR verändert ist. Bei einem proximity ligation assay wird die Interaktion, also die räumliche Nähe verschiedener Proteine untersucht. 2 Antikörper (PLA-Sonden), die ein kurzes DNA-Stück tragen, binden an ihre Antigene, also die zu untersuchenden Proteine. Es wird nun ein Verbindungs-Oligomer zugegeben, das beide PLA-Sonden binden kann, wenn diese sich in räumlicher Nähe befinden. Dieses dient nun als Template für die enzymatische Ligation der Oligonukleotide, die mit den PLA-Sonden verbunden sind. Das so hergestellte DNA-Molekül dient nun wiederum als Template für eine PCR, bei der das so kreierte Signal 109

121 Ergebnisse amplifiziert wird (Weibrecht et al. 2010). In diesem Fall sollte getestet werden, ob das CD22 der CD22 R130E Maus noch mit dem B-Zell-Rezeptor interagiert. IgM- CD22 IgD- CD22 C57BL/6 CD22 R130E C57BL/6 CD22 R130E PBS µ- CD22 µ- CD22 - CD22 - CD22 Pv 5mM µ- CD22 µ- CD22 - CD22 - CD22 Lat 1mM µ- CD22 µ- CD22 - CD22 - CD22 Abbildung 39: Verringerte Assoziation des CD22 auf B-Zellen der CD22 R130E Mäuse mit dem BZR nach Stimulation der Zellen in einem Proximity ligation assay PLA mit Zellen der Wildtyp- und der CD22 R130E Mäuse, Pv: Pervanadat, Lat: Latrunculin; A: IgM- CD22 Interaktion; B: IgD-CD22 Interaktion; unten: Auswertung des Zahl der PLA-Signale bei Analyse der Interaktion von CD22 und IgM; In Zusammenarbeit mit Palash Maity und Michael Reth von der Universität Freiburg 110

122 Ergebnisse Betrachtet man die Interaktion von CD22 und dem BZR in einem PLA (Abbildung 39), so erkennt man auf Zellen der CD22 R130E Maus eine erhöhte Interaktion ohne Stimulation der Zellen. Stimuliert man die Zellen mit Pervanadat, so zeigen Wildtypzellen eine erhöhte Interaktion von CD22 mit IgM. Bei Zellen der CD22 R130E Maus bleibt die Zahl der Interaktionen trotz Stimulation gleich. Die Interaktion von CD22 mit IgD ist bei diesem Experiment nur schwach erkennbar nach Stimulation der CD22 R130E Zellen mit Pervanadat. Latrunculinbehandlung dient als Kontrolle und führt wahrscheinlich dazu, dass das CD22, das normalerweise von IgD und IgM räumlich getrennt vorliegt, nun verfügbar für Interaktionen sowohl mit IgM, als auch mit IgD ist. Die Interaktion von CD22 mit dem BZR ist ohne Stimulation in den CD22 R130E Mäuse also erhöht, da das CD22 der CD22 R130E Zellen wahrscheinlich keine Homomultimere mehr bilden kann und so für Interaktionen mit dem BZR zur Verfügung steht. Nach der Stimulation verändert sich an der Zahl der Interaktionen auf der Zelle jedoch nichts. 4.4 Analyse des Immunotoxins BPC-Neu5Ac-Dimer-ETA Unser Ziel war es, ein Immunotoxin herzustellen, mit dem CD22-positive Zellen effektiv getötet werden können. Hierzu wollten wir synthetische Sialinsäurederivate herstellen, die als hochaffine Liganden an humanes CD22 binden. Unser hochaffines BPC-Neu5Ac-Dimer- Derivat (Abbildung 7) wurde an ETA (Abbildung 6) gekoppelt (Dimer-ETA ) und in verschiedenen Zytotoxizitätsexperimenten getestet. Die Dimer-ETA -Konstrukte wurden zunächst titriert (Wöhner 2009). Eine Immunotoxinkonzentration von 1,5 µg/ml wurde als ideal bestimmt, da hier die CD22-positiven Zelllinien effektiv getötet wurden, aber die CD22- negativen Zelllinien überlebten. Mit dieser Konzentration wurden die folgenden Zytotoxizitätsexperimente durchgeführt Leichte unspezifische Toxizität des linker-eta Zunächst wurde untersucht, in wieweit der Tötungseffekt des Dimer-ETA spezifisch ist. Hierzu wurden Zytotoxizitätstests durchgeführt, in denen die Wirkung des Dimer-ETA mit der eines ETA vergleichen wurde, bei dem die freien Lysine des Spacers abgesättigt wurden, um Wechselwirkungen der geladenen Aminosäuren des Spacer mit der Membran von Zellen zu verhindern (Abbildung 40). 111

123 Ergebnisse Abbildung 40: Leichte unspezifische Toxizität des linker-eta Zytotoxizitätstest mit dem Dimer-ETA und linker-eta. HL60: CD22-negative AML Zelllinie, Nalm6: CD22-positive B-lymphoblastic leukaemia, prä-b-zell Linie; Ansätze in Triplikaten Wurden die CD22-negativen HL60 Zellen mit dem Dimer-ETA oder dem linker-eta in der Konzentration 1,5 µg/ml behandelt, so zeigte sich kein Unterschied im Überleben der Zellen verglichen mit dem der unbehandelten Zellen, wie in Abbildung 40 zu erkennen. Behandelt man jedoch die CD22-positiven Nalm6 Zellen, so zeigte das linker-eta einen deutlichen Effekt auf das Überleben der Zellen, der jedoch nicht so stark war, wie die Wirkung des Dimer-ETA. Die unspezifische toxische Wirkung des linker-eta schwankte jedoch stark zwischen verschiedenen Zytotoxizitätsexperimenten. Das Dimer-ETA tötet die Nalm6-Zellen effektiv und spezifisch Keine unspezifische Toxizität des BPC-Neu5Ac-Dimer In weiteren Experimenten sollte untersucht werden, ob auch das Sialinsäurederivat BPC- Neu5Ac-Dimer ohne ETA eine Wirkung auf das Überleben der Zellen zeigt. Die Zellen wurden hierzu mit 1,5 µg/ml Dimer-ETA bzw. Dimer behandelt (Abbildung 41). 112

124 Ergebnisse Abbildung 41: Keine unspezifische Toxizität des BPC-Neu5Ac-Dimers Zytotoxizitätstest mit dem Dimer-ETA und dem Dimer. HL60: CD22-negative AML Zelllinie, Nalm6: CD22-positive B-lymphoblastic leukaemia, prä-b-zell Linie, Ansätze in Triplikaten Auch hier zeigte keine der Substanzen einen Effekt auf das Überleben der HL60 Zellen, wie in Abbildung 41 zu sehen. Bei der Zelllinie Nalm6 ist ein sehr deutlicher Effekt des Dimer- ETA auf das Überleben zu erkennen. So waren 48 Stunden nach Behandlung der Zellen mit dem Immunotoxin nur noch 4 % der Zellen AnnexinV und PI negativ. Das Dimer ohne ETA zeigte jedoch keinen Einfluss auf das Überleben der Zellen Eine zweite Behandlung mit dem Dimer-ETA reduziert den Anteil der lebenden Zellen weiter Es sollte nun untersucht werde, ob eine mehrmalige Verabreichung des Immunotoxins die Zellen der CD22-positiven Linie Nalm6 zu 100 % töten kann. Das Dimer-ETA und das ETA mit abgesättigtem Linker wurden hierzu zu den Zeitpunkten 0 und 48 Stunden in der Konzentration 1,5 µg/ml zu den Zellen pipettiert (Abbildung 42). 113

125 Ergebnisse Abbildung 42: Eine zweite Behandlung mit dem Dimer-ETA reduziert den Anteil der lebenden Zellen weiter Zytotoxizitätstest mit zweimaliger Gabe des Dimer-ETA und des ETA. Nalm6: CD22-positive B- lymphoblastic leukaemia, prä-b-zell Linie; Pfeile markieren die Zeitpunkte der Immunotoxinoxingabe; Ansätze in Triplikaten Sowohl das Dimer-ETA, als auch das linker-eta zeigen ab 48 Stunden nach Behandlung der Zellen einen deutlichen Effekt auf das Überleben der Zellen, wie in Abbildung 42 zu erkennen. Der Anteil der AnnexinV und PI negativen Zellen sank bei Behandlung mit dem linker-eta auf ca. 30 % und auch eine erneute Toxingabe hatte nur einen geringen Effekt auf das Überleben der Zellen. Bei der erneuten Behandlung der Nalm6 Zellen mit dem Dimer- ETA sank die Zahl der lebenden Zellen von 17 % nach 48 Stunden auf 5 % nach 72 Stunden. Der Anteil der AnnexinV und PI negativen Zellen sank jedoch auch nach 96 Stunden nicht unter 5 % Nach Dimer-ETA Behandlung sind verschiedene Zellpopulationen in Wildtypmäusen reduziert Das BPC-Neu5Ac-Dimer zeigt keine hohe Affinität gegenüber dem murinen CD22. Es sollte nun jedoch getestet werden, ob CD22-positive murine WT B-Zellen trotzdem getötet werden können und ob andere Zellpopulationen reduziert werden. Wildtypmäusen wurde hierzu je 7 µg Dimer-ETA intravenös gespritzt. Nach 48 Stunden wurde der Anteil verschiedener Zellen an verschiedenen Organen im Vergleich zu unbehandelten Mäusen untersucht. Hierzu wurden Blut und Milz entnommen, die Erythrozyten wurden depletiert, die Zellen wurden gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Die Zellen wurden hierzu mit den Antikörpern CD5, B220 und IgM zur Bestimmung der B- und T-Zellen und mit den Antikörpern B220, CD62L, Gr1 und CD11b zur Unterscheidung der Lymphozyten, der NK-Zellen, der residenten und der inflammatorischen Monozyten gefärbt. 114

126 Ergebnisse Abbildung 43: Nach Dimer-ETA Behandlung sind verschiedene Zellpopulationen in Wildtypmäusen reduziert Analyse verschiedener Zellpopulationen 48 und 72 Stunden nach intravenöser Verabreichung von 7 µg Dimer-ETA ; T-Zellen: CD5 +, B220 - ; B-Zellen: B220 +, IgM + ; NK-Zellen (natürliche Killerzellen): CD62L med, CD11b med, Gr1 - ; residente Monozyten: CD62L -, CD11b hoch, Gr1 - In Blut und Milz stieg der Anteil der T-Zellen und sank der Anteil der B-Zellen nach Immunotoxingabe, wie in Abbildung 43 zu erkennen. In der Milz sank außerdem der Anteil der NK-Zellen an den CD11b positiven Zellen. Der Anteil der residenten Monozyten an dieser Population nahm zu. Da das murine CD22 das BPC-Neu5Ac-Dimer bindet, wenn auch mit geringer Affinität, hatten wir erwartet, dass der Anteil der B-Zellen sinken würde. Dies war zwar der Fall, aber dass der Anteil der NK-Zellen zusätzlich sank, war unerwartet Nach Dimer-ETA Behandlung generieren die Mäuse eine Antikörperantwort des IgG-Isotyps Um zu überprüfen, ob es eine Immunantwort gegen das Immunotoxin gibt, wurden Wildtypmäuse für diesen Versuch entweder mit 7 µg Dimer-ETA oder Dimer-Albumin an Tag 0 und 14 immunisiert. Bei dem Albumin handelte es sich um murines Albumin. Die Tiere wurden an Tag 0, 7, 14 und 21 nach der Immunisierung durch Anritzen der Schwanzvene 115

127 Ergebnisse geblutet und entsprechende Antikörper vom Typ IgG im Serum wurden mit Hilfe eines ELISA nachgewiesen. Abbildung 44: Nach Dimer-ETA Behandlung generieren die Mäuse eine Antikörperantwort des IgG-Isotyps ELISA Untersuchung der Antigenität der Bestandteil des Dimer-ETA, d= Tag, AU= relative Einheiten A: Nachweis der IgG Antikörper gegen das Dimer-ETA nach Dimer-ETA Immunisierung an Tag 0 und 14 B: Nachweis der IgG Antikörper gegen das ETA nach Dimer-ETA Immunisierung an Tag 0 und 14 C: Nachweis der IgG Antikörper gegen das Dimer nach Dimer-ETA Immunisierung an Tag 0 und 14 D: Nachweis der IgG Antikörper gegen das Dimer nach Dimer-Albumin Immunisierung an Tag 0 und 14 Bei der Immunisierung der Mäuse mit Dimer-ETA war, wie in Abbildung 44 zu erkennen, an Tag 21 eine deutliche Immunantwort in Form von IgG-Antikörpern zu erkennen. Coated man die ELISA Platten nun nur mit ETA und analysiert die gleichen Seren, so ist kaum eine Erhöhung der spezifischen IgG Antiköper sichtbar. Beim coaten der Platten mit dem Dimer- Albumin und der Verwendung der gleichen Seren erkennt man erneut einen deutlichen Anstieg der Antikörper vom Typ IgG. Immunisiert man die Mäuse nun mit Dimer-Albumin 116

128 Ergebnisse und verwendet erneut Platten, die mit Dimer-Albumin gecoated sind, so ist keine Antikörperantwort vom Typ IgG zu erkennen. Das bedeutet, dass eine Antikörperantwort des Isotyps IgG nur dann passiert, wenn das ETA als Antigen vorhanden ist. Die Antikörper richten sich aber bei Immunisierung mit dem Dimer-ETA gegen die Dimer-Komponente und nicht gegen das ETA Versuche mit dem Dimer-ETA Immunotoxin in einem Xenotransplantationsmodell Um die Wirksamkeit des Dimer-ETA in vivo zu testen, sollte ein Xenotransplantationsmodell etabliert werden. Für diese Versuche wurde die CD22-positive Zelllinie Nalm6 verwendet. NOD/SCID Mäusen wurden 5x 10 6 Nalm6-Zellen intravenös gespritzt. Nach 4 Tagen bei einmaliger Immunotoxingabe, bzw. an Tag 1 und 4 bei zweimaliger Behandlung wurden unterschiedliche Mengen des Immunotoxins intravenös verabreicht. Die Tiere wurden jeden Tag beobachtet und bei Auftreten starker gesundheitlicher Beschwerden, wie bei beginnender Hinterbeinparalyse, wurden sie getötet. Abbildung 45: Xenotransplantationsversuch 1 Xenotransplantionsversuch mit NOD/SCID Mäusen, Dimer-ETA -Gabe bei 8 µg und 10 µg an Tag 4 nach Nalm6-Injektion, bei 2x 7 µg wurden 7 µg an Tag 1 und 4 i.v. verabreicht; n=20 Mäuse, 5 Tiere pro Gruppe 117

129 Ergebnisse In diesem Einzelexperiment (Abbildung 45) wurden die NOD/SCID Mäuse, die kein Dimer- ETA erhalten hatten, ab Tag 17 krank und musste bis Tag 20 alle getötet werden. Die Mäuse der anderen Gruppen blieben länger gesund. Die Tiere, die an Tag 1 und 4 nach Nalm6 Gabe je 7 µg Dimer-ETA erhalten hatten, lebten über eine Woche länger, als die unbehandelten Tiere. Abbildung 46: Xenotransplantationsversuch 2 Xenotransplantionsversuch mit NOD/SCID Mäusen, Dimer-ETA -Gabe bei 8 µg und 10 µg an Tag 4 nach Nalm6-Injektion, bei 2x 7 µg wurden 7 µg an Tag 1 und 4 i.v. verabreicht; n=32 Mäuse, 8 Tiere pro Gruppe Bei der Wiederholung des Experiments (Abbildung 46) wurden größere Mauszahlen untersucht. Bei der Gabe von 10 µg Dimer-ETA starben jedoch 6 der Tiere dieser Gruppe innerhalb von 48 Stunden nach der Immunotoxingabe. Auch in der Gruppe, die 8 µg Dimer- ETA an Tag 4 nach der Nalm6-Injektion erhalten hatte, starben zwei der Mäuse kurz nach der Immunotoxininjektion. Im Überleben der übrigen Tiere im Vergleich zu den Mäusen, die nur Nalm6-Zellen injiziert bekommen hatten, trat in keiner Gruppe eine Verbesserung auf. Die Mäuse aller Gruppen wurden zwischen Tag 19 und 27 schwer krank und mussten getötet werden. 118

130 Ergebnisse Abbildung 47: Xenotransplantationsversuch 3 Xenotransplantionsversuch mit NOD/SCID Mäusen, Dimer-ETA -Gabe an Tag 1 und 4, i.v.; n=33 Mäuse, 8 Tiere pro Gruppe, bzw. 9 in der Gruppe 2x 5,5 µg In diesem Xenotransplantationsexperiment (Abbildung 47) wurde das Dimer-ETA in geringeren Konzentrationen an Tag 1 und 4 nach Nalm6-Injektion verabreicht, um ein Sterben der Tiere durch zu hohe Immunotoxinmengen zu verhindern. Wie in Abbildung 47 zu erkennen, wurden die Mäuse aller Gruppen zwischen Tag 22 und 29 krank und mussten getötet werden. 3 Tiere der Gruppe, die zweimal 5,5 µg Dimer-ETA erhalten hatten, lebten länger. Eine dieser Mäuse wurde an Tag 45 krank. Die anderen beiden Mäuse blieben bis zum Ende des Experiments an Tag 90 gesund. Bei einer Wiederholung dieses Experiments konnte kein verbessertes Überleben einer Gruppe festgestellt werden und die Xenotransplantationsexperimente wurden eingestellt. Zusammengefasst konnte in den Xenotransplantationsversuchen kein Effekt des Dimer-ETA auf das Überleben der NOD/SCID Mäuse nach Nalm6-Gabe festgestellt werden. Stattdessen wirkte das Dimer-ETA unspezifisch toxisch. 119

131 Ergebnisse 4.5 Rezirkulierenden B-Zellen zeigen keine Veränderung im Homing ins Knochenmark nach Behandlung von Mäusen mit CD22-Liganden Blockiert man die CD22-Liganden im Knochenmark mit löslichem CD22 Fc-Protein, reduziert dies die Zahl der rezirkulierenden B-Zellen im Knochenmark. CD22-defiziente Mäuse zeigen eine verringerte Anzahl von rezirkulierenden B-Zellen im Knochenmark (Nitschke et al. 1997). Es sollte nun getestet werden, ob das Blockieren des CD22 auf der Oberfläche der B-Zellen ebenfalls zu einer Reduktion der rezirkulierenden B-Zellen im Knochenmark führt. C57Bl/6 oder Balb/c Mäusen wurde in diesem Experiment ein für CD22 hochaffines Sialinsäurederivat, gekoppelt an murines Albumin, intravenös gespritzt. Die Tiere wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Sialinsäurederivatgabe getötet und die B- Zellpopulationen in Milz und Knochenmark wurden durchflusszytometrisch analysiert. Abbildung 48: Rezirkulierenden B-Zellen zeigen keine Veränderung im Homing ins Knochenmark nach Behandlung von Mäusen mit CD22-Liganden Versuch zum Homing der rezirkulierenden B-Zellen ins Knochenmark nach Behandlung mit CD22- Liganden. Links: Beispielbilder für die Färbung, rechts: Zusammenfassung von je drei Mäusen pro Gruppe; Oben: nach Verabreichung von 20 µg Dimer-Albumin, unten: nach Behandlung mit 20 µg BPAc-Neu5Gc-Monomer-Albumin Wie in Abbildung 48 zu sehen, zeigten beide Sialinsäurederivate keinen Effekt auf die rezirkulierenden B-Zellen des Knochenmarks. 120