Der Rotationsmechanismus und die elastische Kopplung der F-ATP-Synthase

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1 Der Rotationsmechanismus und die elastische Kopplung der F-ATP-Synthase Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften von Hrik Sielaff vorgelegt dem Fachbereich Biologie/Chemie der Osnabrück, im August 2007

2 Hauptberichterstatter: Prof. Dr. Wolfgang Junge Berichterstatter: apl. Prof. Dr. Siegfried Engelbrecht Datum der Prüfung:

3 Der Kampf gegen Gipfel vermag ein Menschenherz auszufüllen. Wir müssen uns Sisyphos als einen glücklichen Menschen vorstellen. ALBERT CAMUS

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5 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Struktur der F-ATP-Synthase Architektur des F 1 -Teils Architektur des F O -Teils 1.2 Funktionsmechanismus der F-ATP-Synthase Funktionsmechanismus des F 1 -Teils Funktionsmechanismus des F O -Teils 1.3 Elastische Kopplung der beiden Motoren 1.3 Zielsetzung 2 Materialien und Methoden 2.1 Materialien Chemikalien und Geräte Genetische Arbeiten Biochemische Arbeiten Rotationsassay Puffer, Lösungen und Medien Stämme und Plasmide DH5α DK pbluescript II SK (+) pse pgh11, pgh14, pgh18, pgh pkh7 2.2 Methoden Gentechnische Methoden Herstellung kompetenter Zellen Transformation mit Plasmid-DNS Isolierung von DNS Agarose-Gelelektrophorese Restriktionsanalyse von Plasmid-DNS Präparative Restriktionsschnittansätze Ligation von DNS-Fragmenten Mutagenese mittels Polymerasekettenreaktion

6 Inhaltsverzeichnis Sequenzierung von DNS-Sequenzen Komplementationstest Biochemische Methoden Zellanzucht von DK8-Zellen Präparation von EF O F 1 -Komplexen Bestimmung von Proteinkonzentrationen Bestimmung von ATP-Hydrolyseaktivitäten SDS-Polyacrylgelelektrophorese Immunoblot Präparation von farbstoffmarkiertem F-Actin Erstellung eines Homologiemodells für EF Rotationsassay Aufreinigung von Magnetpartikeln Herstellung von Durchflussküvetten Beladung von Durchflussküvetten Fluoreszenzvideomikroskopie Digitalisierung von Videosequenzen Auswertung von Einzelbildsequenzen Software 56 3 Ergebnisse Kontrollexperimente Periodizität und Verweilzeiten Verankerung des Enzymkomplex auf der Oberfläche Behinderung des Actinfilaments durch Kontakt mit der Oberfläche Reversibilität der ADP-Inhibierung Reversibilität der Disulfidbrückenbildung Korrelation des absoluten mit dem relativen Koordinatensystem der F-ATP-Synthase Insertion von Cysteinen in F Korrelation der Rotorpositionen im ADP-inhibierten und oxidierten Enzym Bestimmung der ATP- und der katalytischen Wartepositionen Korrelation aller vier Haltepositionen Energieprofil des aktiven und gehemmten Enzyms Elastizität des Rotors der F-ATP-Synthase Insertion von Cysteinen in F O Bestimmung der Elastizität der Untereinheiten c und γ 79 4 Diskussion Modell für einen Mechanismus der F-ATP-Synthase Die elastische Kopplung der F-ATP-Synthase Ausblick 93 6

7 Inhaltsverzeichnis 5 Zusammenfassung 5.1 Die Teilschritte des aktiven Enzyms geeicht auf das molekulare Koordinatensystem 5.2 Die inneren Elastizitätsparameter des Enzyms 6 Literaturverzeichnis 7 Anhang 7.1 DNS- und Aminosäuresequenz von pse1 7.2 Matlab - Routinen Programm: Kreuzkorrelation Programm: Motorkontrolle Programm: Rotationsanalys Funktion: expo_dwell_time Funktion: gaussfit Script: auswertpixel Script: flaeche Script: mittelpunktfestlegung Script: shift Danksagung

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9 Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abb. 1.1: Strukturformel von Adenosintriphosphat Abb. 1.2: Prinzip der chemiosmotischen Theorie nach P. Mitchell Abb. 1.3: Struktur der F-ATP-Synthase aus E. coli Abb. 1.4: Der binding change Mechanismus der ATP-Synthese nach P. D. BOYER Abb. 1.5: Drei Experimente zum Nachweis der Rotation der γ-untereinheit in F 1 Abb. 1.6: Mechanismen der ATP-Hydrolyse währ eines Schritts von γ Abb. 1.7: Modell der Protonentranslokation durch die a- und c-untereinheiten von F O nach W. JUNGE Abb. 1.8: Simulation des winkelabhängigen freien Enthalpieprofils eines C3- symmetrischen, rotieren Motors mit einer elastischen Kraftübertragung für verschiedene Elastizitätsmoduln Abb. 2.1: pse1 Abb. 2.2: Sequenzvergleich der Untereinheiten α und γ von MF 1 und EF 1 47 Abb. 2.3: Komplexierung von His-tags mit der Ni-NTA-HRP 49 Abb. 2.4: Aufbau des Rotationsassays 50 Abb. 2.5: Transmissionsspektrum des Filterkubus U-MWIG 52 Abb. 2.6: Strukturformel von TMR 52 Abb. 2.7: Strahlengang im inversen Fluoreszenzmikroskop 53 Abb. 2.8: Gemittelte Bilder von Einzelbildsequenzen rotierer Actinfilamente 55 Abb. 2.9: Auswertung von Einzelbildern 55 Abb. 3.1: Bildsequenz eines Actinfilamentes Abb. 3.2: Auswertung eines sich irregulär und eines sich deutlich schrittweise drehen Actinfilaments Abb. 3.3: Histogramme der winkelabhängigen Aufenthaltswahrscheinlichkeiten und Verweilzeiten von schrittweise rotieren Actinfilamenten bei verschiedenen ATP-Konzentrationen Abb. 3.4: Histogramme der gemittelte Werte der sechs Einzelmessungen Abb. 3.5: Histogramm schrittweise rotierer Actinfilamente unter dem Einfluss von Scherkräften Abb. 3.6: Gaußverteilungen blockierter Filamente Abb. 3.7: Reversibilität der ADP-Inhibierung Abb. 3.8: Reversibilität der Disulfidbrückenbildung durch Oxidation und Reduktion Abb. 3.9: SDS-Gel und Immunoblot einer SE1-Präperation Abb. 3.10: SDS-Gele der Mutanten GH11, GH14 und GH18 Abb. 3.11: Immunoblots der Mutanten GH11, GH14 und GH18 Abb. 3.12: Positionen der inhibierten Enzyme der Mutanten GH14 und GH18 Abb. 3.13: Katalytische und oxidierte Wartezustände der Mutanten GH14, GH18 und GH11 und deren Homologiemodelle Abb. 3.14: Trajektorien und Histogramme von in 80 /40 -Unterschritten rotieren Actinfilamenten

10 Abbildungsverzeichnis Abb. 3.15: Histogramme der ATP- und der katalytischen Wartezustände bei 50 µm bzw. 5 mm ATP Abb. 3.16: Aufenthaltswahrscheinlichkeiten und Energieprofile der vier Haltepositionen des Enzyms Abb. 3.17: Aufenthaltswahrscheinlichkeiten und Profile der freien Enthalpie des reduzierten und oxidierten Enzyms für verschiedene Zeiträume Abb. 3.18: SDS-Gel und Immunoblot der Mutante GH33 Abb. 3.19: Seitenansicht des Homologiemodells von EF O F 1 mit inserierten Cysteinen Abb. 3.20: Histogramm der winkelabhängigen Aufenthaltswahrscheinlichkeit der Mutante GH33 im oxidierten Zustand Abb. 3.21: Gaußverteilungen der winkelabhängigen Aufenthaltswahrscheinlichkeiten der EF O F 1 -Mutanten SE1, GH11, GH14, GH18 und GH33 in verschiedenen Zuständen Abb. 4.1: Schritte und Pausen währ der Rotation von EF O F 1 Abb. 4.2: Der katalytische Schritt im Modell von A. E. SENIOR und J. WEBER und im Modell von R. I. MENZ et al. Abb. 4.3: Modell für den Mechanismus der ATP-Hydrolyse nach J. WEBER, modifiziert Abb. 4.4: Kombination zweier Stäbe mit unterschiedlich elastischen Eigenschaften Abb. 4.5: Modell der Rotoruntereinheiten mit gemessenen und berechneten Torsions-Federkonstanten

11 Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tab. 1.1: Molmassen und Gene der Untereinheiten von EF O F 1 17 Tab. 2.1: PCR-Programm Tab. 2.2: Sequenzierungs-Programm Tab. 2.3: Beladungsschema der Durchflussküvetten Tab. 3.1: Torsions-Federkonstanten der EF O F 1 -Mutanten SE1, GH11, GH14, GH18 und GH33 in den verschiedenen Zuständen 79 11

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13 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 4-AB 4-Aminobenzamidin Dihydrochlorid 6-AHS 6-Aminohexansäure A x Absorption bei einer Wellenlänge von x nm ADP Adenosindiphosphat ADPγS Adenosin-5 -[γ-thio]triphosphat AMPPNP β,γ-imidoadenosin-5 -triphosphat ATP Adenosintriphosphat Biotin-PEAC5- Maleimid 6-{N -[2-(N-Maleimido)ethyl]-N-piperazinylamido}hexyl-D-biotinamid bp Basenpaar(e) BSA bovines Serumalbumin C Torsionssteifigkeit CIAP alkaline Phosphatase aus Kälberdärmen (calf intestine alkaline phophatase) CMOS komplementärer Metall-Oxid-Halbleiter (complementary metal oxide semiconductor) ddntp Didesoxynukleotide G freie Enthalpie G 0 biochemische Standardenthalpie DMSO Dimethylsulfoxid DNS Desoxyribonukleinsäure dntp Desoxynukleotide DTNB 5,5 -Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure) DTT Dithiothreitol E elastische Energie E. coli Escherichia coli EDTA Ethyliamintetraessigsäure EF O F 1 F-ATP-Synthase aus Escherichia coli EGTA Ethylengycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N,N -tetraessigsäure E. hirae Enterococcus hirae EM Elastizitätsmodul F Faraday-Konstante F O hydrophober, membranintegrierter Teilkomplex der F-ATP-Synthase F 1 hydrophiler, katalytisch aktiver Teilkomplex der F-ATP-Synthase F-Actin filamentöses Actin FRET Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (fluorescence resonance energy transfer) g Erdbeschleunigung G-Actin globuläres Actin HRP Meerrettich-Peroxidase (horse radish peroxidase) I. tartaricus Ilyobacter tartaricus κ Torsions-Federkonstante K Torsions-Kraft k B Boltzmann-Konstante l Länge 13

14 Abkürzungsverzeichnis LB-Medium Medium nach GIUSEPPE BERTANI (lysogeny broth) µ 0 Standardpotential M Drehmoment MSC Multiklonierungsstelle (multiple cloning site) MF O F 1 F-ATP-Synthase aus Mitochondrien MOPS 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure NMR kernmagnetische Resonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance spectroscopy) NTA Nitrilotriessigsäure OD x optische Dichte bei einer Wellenlänge von x nm OG N-octyl-β-D-glycopyranosid ox oxidiert φ Auslenkungswinkel PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PARAP polarisierte Absorptionsrelaxation nach Photobleichung (polarized absorption relaxation after photo-bleaching) pbsk pbluescript II SK (+) Vektor PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction) Pfu Pyrococcus furiosus P i anorganisches Orthophosphat pmf protonenmotorische Kraft (protonmotive force) PTMR Phalloidin-Tetramethylrhodamin-B-isothiocyanat PVDF Polyvinylidiflouridmembran r Radius R universelle Gaskonstante red reduziert RT Raumtemperatur σ Standardabweichung SDS Natriumlaurylsulfat (sodium dodecyl sulfate) t Relaxationszeit T Temperatur in Kelvin TBE TRIS-Borat-EDTA-Puffer TEMED N,N,N,N-Tetramethylethyliamin TES 2-{[2-Hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl]amino}-ethansulfonsäure TF O F 1 F-ATP-Synthase aus dem termophilen Bacillus PS3 TIRFM Fluoreszenzmikroskopie basier auf der internen Totalreflektion (total internal reflection fluorescence microscopy) TRIS Tris(hydroxymethyl)aminomethan U enzymatische Aktivität (units) ün über Nacht upm Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett (v/v) Volumenanteil (w/v) Gewichtsanteil (bezogen auf das Volumen einer Lösung) 14

15 Einleitung 1 Einleitung Adenosintriphosphat (ATP) ist der universelle Energieträger in allen Lebensformen und spielt eine zentrale Rolle im Energiestoffwechsel der Zelle (Kalckar, 1937; Lipmann, 1947). ATP ist ein Nukleotid und setzt sich aus der Base Adenin, dem Zucker Ribose und drei Phosphatresten zusammen (Abb. 1.1). Die Triphosphateinheit enthält zwei Phosphorsäureanhydridbindungen, die ein hohes, für die Energiebereitstellung wichtiges Phosphorylgruppenübertragungspotential besitzen. Abb. 1.1: Strukturformel von Adenosintriphosphat. Bei der Hydrolyse wird ATP in Adenosindiphosphat (ADP) und ein anorganisches Orthophosphat (P i ) gespalten. ATP + H 2 O ADP + P i Gl. 1.1 Die freie Enthalpie dieser Reaktion unter biochemischen Standardbedingungen ( G 0 ) beträgt -30,5 kj/mol. Die Konzentrationen der an der Reaktion beteiligten Substanzen in der Zelle entsprechen jedoch nicht den Standardbedingungen. In einer Bakterienzelle von Escherichia coli (E. coli) liegen ATP, ADP und P i in Konzentrationen von 3 mm, 0,4 mm und 6 mm vor (Kashket, 1982). G = G0 ATPdADP + 2, 3 $ RT $ log [ADP]$[P i] [ATP] Gl. 1.2 Damit hat die Hydrolyse von ATP unter zellulären Bedingungen eine freie Enthalpie von etwa G = -43 kj/mol. Diese Energie wird von der Zelle für ergone Prozesse genutzt, z.b. für den Anabolismus von Makromolekülen, den aktiven Transport von Ionen und Molekülen, die Reizweiterleitung oder die Muskelkontraktion. Dabei setzen die Zellen große Mengen an ATP um. So verbraucht der Mensch täglich etwa 75 kg an ATP. Da der menschliche Körper aber nur etwa 35 g an ATP besitzt, muss ATP konsequenterweise wieder aus seinen Hydrolyseprodukten regeneriert werden (Neumüller, 1979). Neben der Substratkettenphosphorylierung in exergonen Stoffwechselwegen wird dies hauptsächlich durch den Enzymkomplex der ATP-Synthase in der oxidativen Phophorylierung oder der Photophosphorylierung verwirklicht. Die ATP-Synthase nutzt dabei die elektrochemische Energie eines transmembranen Ionengradientens zur Synthese von ATP aus ADP und P i. 15

16 Einleitung Die Funktionsweise dieses Mechanismus wurde erstmals 1961 von P. MITCHELL in seiner chemiosmotische Hypothese beschrieben (Mitchell, 1961) (Abb. 1.2). Abb. 1.2: Prinzip der chemiosmotischen Theorie nach P. MITCHELL. Die in einem transmembranen Protonengradienten gespeicherte Energie wird von der F OF 1-ATP- Synthase zur Synthese von ATP aus ADP und P i genutzt. Der Protonengradient wird durch eine Protonenpumpe aufrechterhalten. Er postulierte eine Kompartiment umschließe Membran, die für Protonen und andere Ionen impermeabel ist. Solche Membranen sind z.b. die Thylakoidmembran in Chloroplasten, die innere Mitochondrienmembran oder die prokaryotische Plasmamembran. Durch das Wirken einer exergonen Elektronentransportkette, z.b. in der Photosynthese oder in der Atmungskette, werden Protonen über die Membran gepumpt. Die daraus resultieren, unterschiedlichen Protonenkonzentrationen beiderseits der Membran erzeugen einen elek-trischen ( φ) und einen chemischen ( ph) Gradienten über die Membran. Diese elektrochemische Potentialdifferenz des Protons konserviert somit die Energie, die durch den Elektronenfluss frei wird und wurde von P. MITCHELL protonenmotorische Kraft (protonmotive force, pmf) genannt. Unter isothermen und isobaren Bedingungen beschreibt die pmf die maximal nutzbare Arbeit, die aus dem Fluss von einem Mol Protonen über die Membran gewonnen werden kann. pmf = 0 2, 3RT ph + F Gl. 1.3 Hierbei ist R die universelle Gaskonstante, T die Temperatur, F die Faraday-Konstante und µ 0 die Differenz der Standardpotentiale. Haben die wässrigen Phasen beiderseits der Membran die selben Eigenschaften, heben sich die Standardpotentiale aus ( µ 0 = 0). Unter isothermen und isobaren Bedingungen beschreibt die pmf die maximal nutzbare Arbeit, die aus der Translokation von einem Mol Protonen über die Membran gewonnen werden kann. Die protonenmotorische Kraft wird von der ATP-Synthase zur Synthese von ATP genutzt, indem Protonen von der sauren und elektrisch positiv geladenen Seite der Membran (H + P) zur alkalischen und negativ geladenen Seite (H + N) durch den Enzymkomplex strömen und als Antrieb für die nachfolge Reaktion der ATP-Synthese dienen. Zusätzlich zu diesen vektoriellen Protonen wird bei der Reaktion noch ein skalares Proton (H +# ) freigesetzt. Das Verhältnis von synthetisiertem ATP-Molekülen zu über die Membran geförderten Protonen (m) ist für verschiedene ATP-Synthasen unterschiedlich. Für die Synthese von ATP ergibt sich die folge Reaktionsgleichung: ADP 3- N + P i 2- N + H +# N + mh + P ATP 4- N + H 2 O N + mh + N Gl

17 Einleitung Im Gleichgewicht entspricht die freie Reaktionsenthalpie der elektrochemischen Potentialdifferenz. G0 ADPdATP + 2, 3RTlog [ATP]$[H+# ] [ADP]$[P i ] = m$ ( 2, 3RT ph + F ) Gl. 1.5 In Abhängigkeit von den jeweiligen Bedingungen kann die ATP-Synthase auch in umgekehrter Richtung arbeiten, dabei wird die Hydrolyseenergie des ATPs genutzt, um einen Ionengradienten aufzubauen. Im diesem Modus wird der ATP-hydrolysiere Teil des Enzyms auch als ATPase bezeichnet. Man unterscheidet drei Hauptklassen von ionengetriebenen ATPasen (Pedersen und Carafoli, 1987). (i) P-Typ-ATPasen, wie z.b. die Na/K-ATPase, bilden in ihrem katalytischen Zyklus ein kovalent phosphoryliertes Intermediat. (ii) V-Typ-ATPasen sind H + -transportiere ATPasen, die in Membranen von Vakuolen vorkommen und kein phosphoryliertes Intermediat bilden. (iii) F-Typ-ATPasen sind H + -getriebene ATP-Synthasen aus Plastiden, Mitochondrien und Bakterien. In dieser Arbeit habe ich mich mit der F-ATP-Synthase aus E. coli (EF O F 1 ) beschäftigt. Sie zählt zu den am besten untersuchten F-ATP-Synthasen. Aufgrund der genetischen und funktionellen Homologie der F-ATP-Synthasen aus unterschiedlichen Organismen (s.u.) und der Tatsache, dass sich Chimären mit Bestandteilen aus verschiedenen Spezies konstruieren lassen (Richter et al., 1986; Lill et al., 1993; Kaim und Dimroth, 1995; Claggett et al., 2007), ist der Schluss gerechtfertigt, dass sich aus allen vorliegen Daten ein universelles Modell der F-ATP-Synthase konstruieren lässt. 1.1 Struktur der F-ATP-Synthase Die F-ATP-Synthase aus E. coli besteht aus acht verschiedenen Untereinheiten in der Zusammensetzung α 3 β 3 γδεab 2 c 10. Strukturell unterteilt man die F-ATP-Synthase in einen F O - und einen F 1 -Teil. Der membranintegrierte, hydrophobe und Protonen leite F O -Teil (Oligomycin sensitiver Faktor) besteht aus den Untereinheiten ab 2 c 10, währ die Untereinheiten α 3 β 3 γδε den hydrophilen, ATP synthetisieren bzw. hydrolysieren F 1 -Teil (Faktor 1) bilden. Mechanisch kann man die F-ATP-Synthase auch als ein Motorprotein betrachten, in dem die Untereinheiten ab 2 α 3 β 3 δ den Stator und die Untereinheiten γεc 10 den Rotor bilden. In E. coli wird die F-ATP-Synthase chromosomal durch das ca. 7 kb große atp-operon codiert (Walker et al., 1984). Es enthält neun Gene, acht für die verschiedenen Untereinheiten und ein neuntes (atpi) mit bisher unbekannter Funktion. Das Molmasse des Enzymkomplexes beträgt 530,3 kda. Die Molmassen der einzelnen Untereinheiten und deren Gene sind in Tab. 1.1 angegeben. Tab. 1.1: Molmassen und Gene der Untereinheiten von EF O F 1. Untereinheit Molmassen / kda Gen α 55,3 atpa β 50,3 atpd F 1 γ 31,6 atpg δ 19,3 atph ε 14,9 atpc a 30,3 atpb F O b 17,2 atpf c 8,3 atpe 17

18 Einleitung Die Struktur der F-ATP-Synthase wurde im wesentlichen durch die Röntgenstrukturanalyse an Kristallen des mitochondrialen Enzymkomplexes (MF O F 1 ) bestimmt. Der mitochondriale Enzymkomplex ist zu dem von E. coli homolog. Die Homologie zwischen den beiden Komplexen reicht von 21% für die c-untereinheit bis zu 70% für die β-untereinheit (Walker et al., 1984). Ein Modell von EF O F 1 ist in Abb. 1.3 gezeigt. Abb. 1.3: Struktur der F-ATP-Synthase aus E. coli (Weber und Senior, 2003). Hochauflöse Strukturen liegen für alle Untereinheiten vor, außer für Teile von δ und b und für die a-untereinheit, von der ein Modell gezeigt ist. Die Anzahl der c-untereinheiten variiert in verschiedenen Species zwischen 10-14, in E. coli findet man eine Stöchiometrie von 10 c-untereinheiten. Unterschiede zwischen MF O F 1 und EF O F 1 gibt es in der Benennung der Untereinheiten. Die mitochondriale Untereinheit OSCP entspricht der bakteriellen δ-untereinheit, währ die δ-untereinheit aus Mitochondrien der ε-untereinheit des E. coli Enzyms entspricht (Walker et al., 1984). Die beiden letzteren sind zu 60% homolog (Gibbons et al., 2000). Mitochondriales ε hat keine Entsprechung in EF 1. Des Weiteren besteht der MF O -Teil zusätzlich aus den Untereinheiten d, e, f, g, F 6 und A6L (Collinson et al., 1994a; Collinson et al., 1994b; Collinson et al., 1996). Alle weiteren bakteriellen Untereinheiten haben in Mitochondrien die selbe Bezeichnung. 18

19 Struktur der F-ATP-Synthase Architektur des F 1 -Teils Der Aufbau von F 1 wurde zum ersten Mal in der Arbeitsgruppe von J. E. WALKER anhand der Beugung von Röntgenstrahlen durch einen Kristall besteh aus mitochondrialem F 1 aus Rinderherzen mit einer Auflösung von 0,28 nm beschrieben (Abrahams et al., 1994). Diese Struktur, die im Folgen als originale Kristallstruktur bezeichnet wird, wurde später durch weitere Röntgenstrukturanalysen am gleichen Enzymkomplex bestätigt (Abrahams et al., 1994; Abrahams et al., 1996; van Raaij et al., 1996; Orriss et al., 1998; Braig et al., 2000; Gibbons et al., 2000; Menz et al., 2001b; Kagawa et al., 2004; Kabaleeswaran et al., 2006; Bowler et al., 2007). Der F 1 -Teil mit einer Höhe von 8 nm und einem Durchmesser von 10 nm setzt sich demnach hauptsächlich aus den jeweils drei alternier angeordneten α- und β-untereinheiten, die zu 20% homolog sind. Eine α- und eine β-untereinheit bilden zusammen ein Paar. Drei solcher αβ-paare ((αβ) 3 ) bilden zusammen einen hexagonalen Ring um die zentrale γ-untereinheit. Jedes Paar besitzt ein katalytisch aktives Zentrum mit einer Nukleotidbindungstasche, wobei β den Hauptteil hierzu beiträgt. Deshalb wird β als die katalytische Untereinheit bezeichnet. Die α-untereinheiten besitzen zwar auch Nukleotidbindungstasche, die allerdings katalytisch inaktiv sind. Die α- und β-untereinheiten bestehen am Membran abgewandten, N-terminalen Ende aus einer fassartigen Struktur aus sechs β-faltblättern (β-barrel) und am Membran zugewandten, C-terminalen Ende aus sieben bzw. sechs α-helices. Die zentrale, Nukleotid binde Domäne besteht aus neun β-faltblättern und neun assoziierten α-helices. In dieser Domäne liegt auch die wichtige P-Schleife, die in β unter anderem von den Aminosäureresten β gebildet wird. Sie enthält das konservierte Nucleotidbindungsmotiv GXXXXGKT/S, das man in vielen Nukleotid binden Enzymen findet und mit der Phosphorylgruppe des ATPs in Wechselwirkung tritt. Die Aminosäuren βe188 und αr373 spielen eine wichtige Rolle bei dem nukleophilen Angriff auf das γ-phosphat und somit bei der Spaltung von ATP. In der α-untereinheit ist das Glutamat durch ein Glutamin an der Position 208 ersetzt, welches wesentlich die Inaktivität der α-untereinheiten verursacht. Ein weiterer wichtiger Bestandteil der β-untereinheit ist die DELSEED-Sequenz (β ) in einer Schleife zwischen der ersten und zweiten C-terminalen α-helices. Dieser Abschnitt interagiert mit der konvexen, superspiralisierten α-helix der γ-untereinheit, dessen räumliche Stellung relativ zu (αβ) 3 wesentlich den Öffnungszustand der drei Bindungstaschen bestimmt. Im mechanischen Sinne ist die DELSEED-Sequenz ein Hebel, der von der konvexen γ-untereinheit aufgestoßen wird. Der Innenraum des (αβ) 3 -Komplexes wird durch die γ-untereinheit ausgefüllt. Das C-terminale Ende von γ (γ ) besteht aus einer α-helix, die von der Membranseite bis zu 6,5 nm in das (αβ) 3 -Hexagon hineinragt. Die untere Hälfte dieser α-helix bildet zusammen mit der N-terminalen α-helix eine antiparallele, superspiralisierte (coiled coil) Struktur. Sie ist asymmetrisch konvex gebogen und zeigt in der originalen Kristallstruktur auf die leere und offene Nukleotidbindungstasche. Die Sequenz zwischen den beiden terminalen α-helices wird von einem fünfsträngigem β-faltblatt und sechs α-helices dominiert (Gibbons et al., 2000). Sie bildet den Fuß der γ-untereinheit unterhalb des (αβ) 3 -Hexagons. Die Struktur der δ-untereinheit aus MF 1 wurde mittels Röntgenkristallographie (Gibbons et al., 2000) und die Struktur der homologen ε-untereinheit aus EF 1 wurde mittels kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance spektroscopy, NMR) (Wilkens et al., 1995) aufgeklärt. Die N-terminale Domäne besteht aus einem 19

20 Einleitung zehnsträngigem β-faltblatt, dass eine β-sandwich-struktur bildet. Die C-terminale Domäne besteht aus zwei α-helices. Sie liegen an der Außenseite von γ und interagieren mit der DELSEED-Sequenz der β-untereinheit (Zhang und Fillingame, 1995). Die N-terminale Domäne der ε-untereinheit in EF 1 (in MF 1 die Untereinheiten δ und ε) bildet zusammen mit dem Fuß der γ-untereinheit den 4,7 nm hohen, zentralen Verbindungsstiel, der den F 1 -Teil des Enzymkomplexes mit den c-untereinheiten des F O -Teils verbindet (Gibbons et al., 2000; Rodgers und Wilce, 2000). Experimente mit F 1 aus Chloroplasten (CF 1 ) haben gezeigt, dass die ε-untereinheit das Enzym inhibieren kann, und γ dann die selbe Orientierung wie bei der Inhibierung durch ADP einnimmt (Konno et al., 2006). Der Aufbau der δ-untereinheit aus E. coli wurde von S. WILKENS et al. ebenfalls durch NMR-Spektroskopie aufgeklärt (Wilkens et al., 1997). Das Protein besteht aus zwei Domänen. Die etwa 100 N-terminalen Aminosäuren bilden sechs α-helices. Die C-terminale Domäne, besteh aus den letzten 70 Aminosäureresten, ist durch sieben α-helices charakterisiert. Beide Domänen sind durch eine Schleife voneinander getrennt. Die Autoren und auch H. LILL et al. (Lill et al., 1996) konnten zeigen, dass die N-terminale Domäne am oberen Ende der F-ATP-Synthase sitzt und mit dem N-terminalen Ende der α-untereinheit interagiert, währ die C-terminale Domäne mit den b-untereinheiten des F O -Teils wechselwirkt Architektur des F O -Teils Wichtigster Bestandteil von F O sind die Protonen leiten und membrandurchspannen c-untereinheiten. Mittels NMR wurde die Struktur eines c-monomers aus E. coli bestimmt (Girvin et al., 1998). Das Monomer besteht aus zwei hydrophoben, membrandurchspannen α-helices, die eine Haarnadelstruktur innerhalb einer ringförmigen Struktur bilden. In dieser liegt die N-terminale Helix jedes Monomers auf der Innenseite und die C-terminale Helix auf der Außenseite des Rings. Eine polare Schleife, die in Richtung des F 1 -Teils zeigt, verbindet die beiden Helices. Sie interagieren mit den Untereinheiten γ und ε in F 1 (Watts et al., 1995; Hermolin et al., 1999). Die C-terminale Helix besitzt aufgrund des Aminosäurerests P64 einen Knick von etwa 30. Mehrere c-monomere bilden ein ringförmiges Oligomer (Proteolipid) mit einem äußeren Durchmesser von ca. 4,2 nm bis 5,5 nm und einen inneren Durchmesser von ca. 1,7 nm bis 2,7 nm in Mitochondrien (Stock et al., 1999). Die Höhe des Proteolipids beträgt 0,73 nm. Die Anzahl der c-monomere im Proteolipid variiert je nach Organismus. In Mitochondrien (Stock et al., 1999) und in dem thermophilen Bacillus PS3 (TF O F 1 ) (Mitome et al., 2004) besteht der c-ring aus 10 Untereinheiten, währ er in Ilyobacter tartaricus aus 11 (Stahlberg et al., 2001) und in Chloroplasten aus 14 Untereinheiten (Seelert et al., 2000; Seelert et al., 2003) besteht. In E. coli beträgt die bevorzugte Stöchiometrie 10 Untereinheiten (Jiang et al., 2001). Essentiell für die Protonenleitung ist das Aspartat an der Position 61 in der C-terminalen α-helix (Zhang und Fillingame, 1994). Durch die Punktmutation cd61g verliert F O F 1 seine Protonenleitfähigkeit. Sie kann aber durch horizontale Verschiebung wiederhergestellt werden, indem man das Alanin an der Position 24 in der N-terminaler Helix durch ein Aspartat ersetzt (Miller et al., 1990). Ebenso wie das Proteolipid liegt auch die hydrophobe a-untereinheit in der Membran. Nach dem Modell von S. B. VIK et al. (Long et al., 1998; Wada et al., 1999) und F. I. VALIYAVEETIL und R. H. FILLINGAME (Valiyaveetil und Fillingame, 1998) besteht a aus fünf transmembranen α-helices, die durch extramembrane Schleifen verbunden sind. Das 20

21 Struktur der F-ATP-Synthase C-terminale Ende befindet sich auf der dem F 1 -Teil zugewandten Seite der Membran. Im Zusammenhang mit dem Aminosäurerest cd61 spielt auch ar210 in der vierten transmembranen Helix eine kritische Rolle für die Protonenleitung (Valiyaveetil und Fillingame, 1997) (s.u.). Durch eine vertikale Verschiebung dieses Restes verliert das Protein seine Protonenleitfähigkeit (Langemeyer und Engelbrecht, 2007). Die beiden b-untereinheiten bilden ein Dimer (McLachlin und Dunn, 1997; Fillingame et al., 1998). Die 33 N-terminalen, hydrophoben Aminosäurereste durchspannen die Membran, ihre Struktur konnte durch NMR aufgeklärt werden (Dmitriev et al., 1999). Das α-helicale, C-terminale Ende von b ist dagegen sehr hydrophil und umspannt von der Membran aus den gesamten F 1 -Teil bis zur δ-untereinheit (Rodgers und Capaldi, 1998). Verschiedene Experimente legen nahe, dass die hydrophilen α-helices der beiden b-untereinheiten zusammen eine parallele, coiled coil Struktur ausbilden (Revington et al., 2002; Steigmiller et al., 2005). Die Untereinheiten a und b liegen an der Außenseite des c-rings (Birkenhäger et al., 1995; Singh et al., 1996) und bilden zusammen mit der δ-untereinheit den zweiten, peripheren Verbindungsstiel, der den c-ring in F O mit dem (αβ) 3 -Hexagon in F 1 verbindet. 1.2 Funktionsmechanismus der F-ATP-Synthase Die F-ATP-Synthase ist ein Motorenzym, das elektrochemische in mechanische und anschließ in chemische Energie umwandelt. Sie ist einer der kleinsten in der Natur vorkommen Nanomotoren. Wie oben beschrieben, nutzt sie die protonenmotorische Kraft zur Synthese von ATP. In Bakterien, wie z.b. dem gram-negativen E. coli, ist die F-ATP-Synthase in der Cytoplasmamembran lokalisiert, wobei der F 1 -Teil in das Cytoplasma ragt. Die Membran enthält eine Reihe von Membranproteinkomplexen, die Redox-Reaktionen katalysieren. NADH, das in katabolen Stoffwechselwegen, wie z.b. der Glykolyse, entsteht, dient als Elektrononor und wird zu NAD + oxidiert. Die Elektronen werden mittels Reduktion/Oxidation von einem Proteinkomplex zum Nächsten entsprech ihrer Reduktionspotentiale weitergereicht und schließlich auf molekularen Sauerstoff übertragen. Dabei werden Protonen über die Cytoplasmamembran aus dem Cytoplasma heraus transportiert. Da die Membran für Protonen impermeabel ist, sinkt außen der ph-wert. Die daraus resultiere elektrochemische Potentialdifferenz wird von der F-ATP-Synthase genutzt. Die Protonen fließen über den F O -Teil zurück in das Cytoplasma und treiben dadurch die ATP-Synthese im F 1 -Teil an. In E. coli, dessen Proteolipid aus zehn c-untereinheiten besteht, werden 3 ATP pro 10 H + synthetisiert. Da der F O - und der F 1 -Teil elastisch gekoppelt sind (Kap. 1.3), ist ein ganzzahliges ATP zu H + -Verhältnis nicht zwing erforderlich. Im Prinzip lässt sich die Reaktion auch umkehren, d.h. die F-ATP-Synthase kann ATP hydrolysieren, um Protonen zu pumpen. Es hängt von der Gewichtung der beiden Triebkräfte und damit von den jeweiligen Umweltbedingungen ab, welche Reaktionsrichtung in der Zelle verwirklicht wird. Unter aeroben Wachstumsbedingungen betreibt das Enzym die Synthese von ATP. Unter anaerober Fermentation dient die F-ATP-Synthase dagegen als Protonenpumpe. Der Protonenrückfluss in die Zelle wird an Transportprozesse gekoppelt oder zum Betrieb des Flagellenmotors benutzt. ATP wird in diesem Zustand nur über Substratkettenphosphorylierung produziert. 21

22 Einleitung Als Substrat für die F-ATP-Synthase dienen entweder MgATP 2- oder MgADP - und P i (Senior et al., 1992); im Folgem der Einfachheit halber nur als ATP oder ADP geschrieben. Ohne Magnesium ist das Enzym inaktiv. Mg 2+ neutralisiert einen Teil der negativen Ladungen der Polyphosphatkette. Dadurch stabilisiert es das ATP und verringert die ionischen Wechselwirkungen zwischen dem Enzym und dem Nukleotid. Außerdem halten die Wechselwirkungen, die zwischen dem Magnesiumion und dem Sauerstoffatomen der Phosphorylgruppe bestehen, das Nukleotid in einer definierten Konformation fest, die das Enzym binden kann. Des Weiteren liefert das Magnesiumion zusätzliche Kontaktstellen für das Enzym, so dass sich die Bindungsenergie erhöht Funktionsmechanismus des F 1 -Teils Einen Mechanismus für die Synthese von ATP entwickelte P. D. BOYER (Boyer, 1993) (Abb. 1.4). Grundlage seines binding change -Mechanismus sind zwei Merkmale. (i) Die Energie für die ATP-Synthese wird für die Freisetzung von fest gebundenem ATP und die Bindung von ADP und P i in einer Art, die die Bildung von ATP ermöglich, benötigt. Dagegen erfolgt die Bildung von ATP aus ADP und P i in der Bindungstasche spontan. (ii) Währ der Bildung von ATP arbeiten alle drei katalytische Zentren der F-ATP-Synthase positiv kooperativ zusammen. Alle drei katalytischen Untereinheiten durchlaufen phasenverschoben den selben Zyklus, währ dessen ATP synthetisiert wird. Die verschiedenen Zustände der katalytischen Zentren sind dadurch charakterisiert, dass sie ATP fest (tight, T) oder lose (loose, L) binden, oder offen (open, O) sind. Die Zustände werden im ATP synthetisieren Enzym in der Reihenfolge O L T O durchlaufen, moduliert durch eine rotiere Bewegung der zentralen, asymmetrischen Untereinheiten γ. Abb. 1.4: Der binding change Mechanismus der ATP-Synthese nach P. D. BOYER (Cross, 1981). Im Ausgangszustand hat die T-Bindungstasche ATP gebunden, währ die beiden anderen Bindungstaschen leer sind. ADP und P i binden an die L-Bindungstaschen. Unter Energiezufuhr öffnet sich die T-Bindungstasche (T O), die daraufhin ATP freisetzt. Gleichzeitig schließen sich die O- und die L-Bindungstasche weiter (O L, L T). Im nächsten Schritt wird in der letzteren ATP synthetisiert. Jetzt ist wieder der um 120 gedreht Ausgangszustand erreicht und der Zyklus beginnt von neuem. Die originale Kristallstruktur bestätigte den zweiten Punkt von P. D. BOYERs Mechanismus. Sie zeigte die drei katalytischen Zentren in β entweder leer (empty), mit AMPPNP, einem nicht-hydrolysierbaren ATP-Analogon, oder mit ADP besetzt. Dementsprech wurden die α/β-untereinheiten mit α E /β E, α TP /β TP bzw. α DP /β DP bezeichnet und den Zuständen O, L bzw. T zugeordnet. Die zentrale γ-untereinheit zeigte mit ihrer konvexen Seite auf β E. Somit werden die drei im Prinzip symmetrischen αβ-paare durch die unterschiedliche Belegung mit Nukleotiden und die Orientierung von γ jeweils in andere Stellungen gezwungen, die bestimmte Zustände im Reaktionszyklus des Enzyms repräsentieren. Das aktive Enzym liegt daher immer in einer asymmetrischen Struktur vor. 22

23 Funktionsmechanismus der F-ATP-Synthase Die Rotationsbewegung der zentralen γ-untereinheit gegenüber (αβ) 3 wurde schließlich von drei Arbeitsgruppen durch verschiedene Experimente belegt (Abb. 1.5). (i) Die Gruppe von L. A. CROSS benutzte eine Mutante, in der eine Disulfidbrücke zwischen je einem Cystein in γ und β geschlossen werden konnte. Sie konnten zeigen, dass das aktive, ATP hydrolysiere Enzym Disulfidbrücken zwischen dem Cystein in γ und den Cysteinen in allen drei β-untereinheiten gleichermaßen ausbildet, währ im inaktiven Zustand γ nur mit einer β-untereinheit eine Disulfidbrücke bildet (Duncan et al., 1995). In einem weiteren Versuch zeigten sie dies auch für F O F 1 (Zhou et al., 1996). Mit dem Experiment konnte jedoch nicht zwischen einer gerichteten oder zufälligen Bewegung unterschieden werden. (ii) In dem Labor von W. JUNGE wurde die Rotation von γ relativ zum immobilisierten (αβ) 3 -Komplex anhand des an γ kovalent gebundenen Fluoreszenzfarbstoffs Eosin in Echtzeit mit Hilfe der Technik PARAP (polarized absorption relaxation after photobleaching) gemessen (Sabbert et al., 1996; Sabbert und Junge 1997; Sabbert et al., 1997). Ein Hinweis für die Rotation war die Relaxation der Absorptionsanisotropy unter ATP-Hydrolyse-Bedingungen. Diese Relaxation konnte wie erwartet im AMPPNP-gehemmten Enzym nicht gemessen werden. Die rotationsbedingte Relaxationszeit von etwa 100 ms stimmte mit der katalytischen Umsatzrate unter diesen Bedingungen von ca. 70 ms gut überein. Es wurde eine Rotation über einen Winkel von mindestens 280 gemessen. Insgesamt deuteten die Ergebnisse auf eine unidirektionale, aus drei Schritten bestehe Bewegung hin. (iii) Einen direkten optischen Nachweis der Rotationsbewegung erbrachten M. YOSHIDA, K. KINOSITA Jr. und ihre Kollegen durch Experimente an Einzelmolekülen (Noji et al., 1997). Für ihre Versuche benutzten sie die ATPase aus dem thermophilen Bacillus PS3 (TF 1 ). Ein fluoreszieres und biotinyliertes Actinfilament wurde über eine Streptavidin/Biotin- Bindung an ein Cystein in der frei beweglichen γ-untereinheit gekoppelt, währ das (αβ) 3 -Hexagon über einen His-tag in β auf einem mit Ni 2+ -Nitrilotriessigsäure-Meerrettich-Peroxidase (Ni-NTA-HRP) beschichteten Objektträger immobilisiert wurde. Jede Bewegung von γ konnte durch die Bewegung des Actinfilaments im Fluoreszenzmikroskop detektiert und videographisch erfasst werden. Unter Zugabe von ATP rotierte γ, von der Membranseite des Enzyms aus betrachtet, gegen den Uhrzeigersinn. Dieser Rotationsassay entwickelte sich zu einem wichtigen Instrument der ATPase-Forschung. Das Actinfilament kann statt an γ auch über einen Strep-tag an den c-ring gekoppelt werden und die Actinfilamente können durch Gold- (Yasuda et al., 2001; Ueno et al., 2005) oder Magnetpartikel (Itoh et al., 2004; Rondelez et al., 2005) ersetzt werden. Der Assay wurde auch an der F-ATP-Synthase aus E. coli in Kombination mit Actinfilamenten (Sambongi et al., 1999; Pänke et al., 2000; Sielaff, 2002; Müller, 2004; Winkler, 2006) und Magnetpartikeln (Rennekamp, 2006; Xie, 2006; Hilbers, 2007) angewandt. Mit dem Rotationsassay konnte gezeigt werden, dass sowohl in TF 1 (Yasuda et al., 1998) als auch in TF O F 1 (Ueno et al., 2005) die Untereinheit γ währ einer vollen 360 -Umdrehung drei 120 -Schritte macht, entsprech jeweils der Hydrolyse von einem Molekül ATP in einer der drei katalytischen Zentren. In weiteren Experimenten wurde gezeigt, dass jeder 120 -Schritt in einen 80 - und einen darauf folgen 40 -Unterschritt unterteilt werden kann. Die Halteposition vor dem 80 -Unterschritt wurde dem Wartezustand des Enzyms auf die Bindung des nächsten ATPs an eine geöffnete und leere Bindungstasche zugeordnet. Demnach ist die Geschwindigkeit dieses Schritts ausschließlich von der Substratkonzentration, bzw. von der Diffusion von ATP in die Bindungstasche abhängig. Im nachfolgen katalytischen Wartezustand und mindestens 1 ms vor dem 40 -Unterschritt erfolgt die Hydrolyse von ATP. Der nachfolge 40 -Unterschritt ist mit der Freisetzung 23

24 Einleitung von P i und/oder der Freisetzung von ADP assoziiert. Diese beiden Reaktionsschritte waren zunächst ununterscheidbar (Yasuda et al., 2001; Shimabukuro et al., 2003; Nishizaka et al., 2004). Abb. 1.5: Drei Experimente zum Nachweis der Rotation der γ-untereinheit in F 1 (Junge et al., 1997). A) Die Zeichnung zeigt die Spaltung und Neuformation einer Disulfidbrücke zwischen zwei künstlich eingebrachten Cysteinen in β und γ. Unter ATP-Hydrolyse-Bedingungen bildeten sich neue Disulfidbrücken, ein Hinweis auf die Rotationsbewegung. B) Immobilisiertes F 1 ist an γ mit einer Eosin-Sonde markiert. Mittels PARAP wurde die Relaxation der Absorptionsanisotropie von Eosin beobachtet. Unter ATP-Hydrolyse-Bedingungen konnte eine Rotation von mindestens 280 nachgewiesen werden. C) F 1 wurde auf einem Objektträger immobilisiert und die γ-untereinheit mit einem fluoreszierem Actinfilament versehen. Unter Zugabe von ATP konnte die unidirektionale Rotation des Filaments im Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden. Auf den Grundlagen dieser Experimente wurden mehrere Modelle für die Funktionsweise der ATPase entwickelt. Diese beschreiben vorrangig die ATP-Hydrolyse, sie lassen sich im Prinzip aber auch in Syntheserichtung lesen. Die Modelle haben gemeinsam, dass die ATP-Hydrolyse im Prinzip in vier Schritten abläuft. Diese Schritte sind die (i) Bindung von ATP an eine leere Bindungsstelle, (ii) hydrolytische Spaltung von ATP in ADP und P i, (iii) Freisetzung von P i und (iv) Freisetzung von ADP, wobei die Abfolge der letzten beiden Schritte auch vertauscht sein kann. Die Modelle unterscheiden sich in der Menge der Nukleotidbindungstaschen, die entweder ATP oder ADP gebunden haben, und in der Anzahl der aktiven katalytischen Zentren. L. A. CROSS veröffentlichte einen so genannten bi-site Mechanismus, in dem, je nach Reaktionsschritt, entweder nur eine oder maximal zwei Nukleotidbindungstaschen mit Nukleotiden besetzt sind (Cross, 1981). Auf diesen Mechanismus berufen sich auch J. P. ABRAHAMS et al., um ihre Kristallstruktur des Enzyms zu erklären (Abrahams, et al., 1994). In einem anderen Modell von R. I. MENZ et al. (Menz et al., 2001) (Abb. 1.6A), das den Boyer schen Mechanismus weiterentwickelt, sind dagegen im zeitlichen Mittel alle drei katalytischen Zentren mit Nukleotiden besetzt (tri-site Mechanismus). Nur nach der Freisetzung von ADP, währ das Enzym auf das nächste ATP Molekül wartet, ist eine Nukleotidbindungstasche unbesetzt. Die originale Kristallstruktur mit zwei besetzten und einer leeren Bindungstasche konnte also nicht zwischen diesen beiden Mechanismen unterscheiden, da diese Konformation in beiden Modellen vorkommt. 24

25 Funktionsmechanismus der F-ATP-Synthase Für den tri-site Mechanismus sprechen im wesentlichen drei Befunde. (i) A. E. SENIOR und J. WEBER haben Mutanten von EF 1 erzeugt, die Tryptophane in den katalytischen Zentren besaßen. Anhand der Fluoreszenz der Tryptophane konnten sie unterscheiden, ob ein katalytisches Zentrum unbesetzt, mit ADP oder mit ATP besetzt war. Die Ergebnisse zeigten, dass im ATP-hydrolysieren Enzym nach der Zugabe von millimolaren Konzentrationen an ATP im Mittel alle drei Zentren mit Nukleotiden besetzt waren. Die Belegung mit ADP oder ATP entsprach einem Verhältnis von 2:1 (Weber et al., 1996). (ii) In der Kristallstruktur von R. I. MENZ et al. (Menz, et al., 2001) sind alle Nukleotidbindungstaschen besetzt. Die β TP - und die β DP -Bindungstasche sind mit ADP-Fluoroaluminat (ADP.AlF 4- ) besetzt, einem ATP-Analogon, dass einen Übergangszustand repräsentiert. Die β E -Bindungstasche ist halb geöffnet und mit ADP und einem Sulfat besetzt. Die Autoren interpretieren diese Struktur als einen Zustand im Reaktionszyklus, in dem alle drei katalytischen Zentren mit Nukleotiden besetzt sind. Die originale Kristallstruktur entspricht in ihrem Modell dem ATP-Wartezustand. (iii) Die Arbeitsgruppe von M. YOSHIDA und K. KINOSITA Jr. verfolgte die Bewegung der γ-untereinheit von TF 1 mittels eines gekoppelten Mikropartikels per Hellfeldmikroskopie. Simultan konnte die Bindung eines fluoreszenzmarkierten ATPs (Cy3-ATP) an das Enzym mittels TIRFM (total internal reflection fluorescence microscopy) beobachten werden. Als Anregungslichtquelle für den Fluoreszenzfarbstoff wurde ein rotierer und polarisierter Laserstrahl benutzt. Damit konnte unterscheiden werden, an welcher der drei Bindungstaschen das Cy3-ATP gebunden hatte. Die Messungen an Einzelmolekülen ergaben, dass das Cy3-ATP mindestens währ einer 240 -Drehung von γ an das Enzym gebunden bleibt (Nishizaka et al., 2004). Dagegen würde man in einem bi-site Mechanismus erwarten, dass das Nukleotid schon vorher freigesetzt wird. A. E. SENIOR und J. WEBER haben einen erweiterten, katalytischen tri-site Mechanismus entworfen (Weber et al., 1996; Senior et al., 2002; Weber, und Senior, 2003) (Abb. 1.6B). Er unterscheidet sich von dem Mechanismus von R. I. MENZ et al. (Menz et al., 2001) dadurch, dass währ des katalytischen Schritts nicht nur alle drei katalytischen Zentren mit Nukleotiden besetzt, sondern diese auch alle aktiv sind. In dem Modell nach R. I. MENZ et al. sind dagegen immer nur zwei Zentren aktiv. Obwohl es sich also strukturell um eine tri-site Mechanismus handelt, da alle drei Zentren besetzt sind, handelt es sich funktionell betrachtet nur um einen bi-site Mechanismus. Des Weiteren sind im Mittel zwei ATP und ein ADP gebunden, im Gegensatz zu den Befunden und dem Modell von A. E. SENIOR und J. WEBER, in dem die Bindungstaschen im Mittel mit zwei ADP und einem ATP besetzt sind. Ein weiterer Unterschied betrifft die Freisetzung der Produkt. Währ in dem MENZ-Modell ADP und P i aus der selben Bindungstasche entlassen werden, geschieht dies in dem SENIOR/WEBER-Model aus unterschiedlichen Bindungstaschen. Daraus resultieren in den beiden Modellen auch die entgegengesetzten Richtungen, in denen die katalytischen Zentren jeweils den geöffneten (O) Zustand (und auch die anderen Zustände) annehmen (Abb. 1.6). A. E. SENIOR und J. WEBER bezeichnen in ihrem Model die Zustände der katalytischen Zentren aufgrund ihrer Affinität zu ATP mit H (highest), M (medium) und L (lowest). Daneben gibt es noch einen weiteren, offenen Zustand O (open). Währ der Hydrolyse von ATP durchlaufen die Zentren die Zustände in der Reihenfolge O L H M L O. Die in E. coli gemessenen K D -Werte der entsprechen Zustände liegen bei etwa 1 nm, 1 µm, 30 µm und >10 mm (Weber et al., 1993). Das Enzym zeigt also eine negative Kooperativität bezüglich der Substratbindung. Die niedrige Affinität des O-Zustandes für ATP erklärt, warum eine Bindetasche in diesem Zustand praktisch immer leer ist. 25

26 Einleitung Abb. 1.6: Mechanismen der ATP-Hydrolyse währ eines Schritts von γ. A) Modell nach R. I. MENZ et al. (Menz et al., 2001). 1) Im Ausgangszustand ist die β E-Bindungstasche leer und offen (O), währ die β TP- (L) und die β DP-Bindungstasche (T) mit ATP besetzt sind. Dieser Zustand repräsentiert die originale Kristallstruktur. 2) Ausgelöst durch die Bindung von ATP an die O-Bindungstasche wird ATP in der β DP-Bindungstasche hydrolysiert. Beide Bindungstaschen ändern in diesem katalytischen Schritt ihre Affinität bzw. ihren Öffnungszustand (O L, T T*). Dieser Zustand ist bisher noch nicht kristallisiert. 3) In dem darauf folgen, nicht-katalytischen Schritt nehmen alle drei Bindungstaschen eine neue Konformationen ein (L L, T* L, L T), entsprech der Kristallstruktur von R. I. MENZ et al. Die L -Bindungstasche ist halb geöffnet. 4) Im letzten Schritt des Reaktionszyklus werden ADP und P i aus der β DP-Bindungstasche freigesetzt, die dadurch zur β E-Bindungstasche wird (L O). Damit ist der um 120 gedrehte Ausgangszustand erreicht. Die katalytischen Bindungstaschen durchlaufen zyklisch die Zustände O L L Τ T* L O. B) Modell nach A. E. SENIOR und J. WEBER (Weber und Senior, 2003). 1) Im ATP-Wartezustand sind zwei Bindungstaschen mit ADP (M) bzw. ATP (H) besetzt, währ die dritte leer und offen ist (O). 2) ATP bindet an die offene Tasche, die dadurch zur L-Bindungstasche wird (O L). 3) Ausgelöst durch eine 80 -Rotation der γ-untereinheit (roter Pfeil) kommt es im katalytischen Schritt zur Spaltung von ATP in ADP und P i in der H-Bindungstasche. Dieser ist an einen Zustandswechsel aller Bindungstaschen (L H, H M, M L) und den Fluss von n Protonen durch F O gekoppelt. 4) Dieser Zustand wird durch die Freisetzung von P i aus der M-Bindungstasche erreicht. 5) Anschließ wird ADP aus der L-Bindungstasche freigesetzt, die damit in den O-Zustand wechselt (L O). Damit ist wieder der um 120 gedrehte Ausgangszustand erreicht. Die katalytischen Bindungstaschen durchlaufen zyklisch die Zustände O L Η M L O. Neben diesen Modellen gibt es noch einen langsam arbeiten unisite Mechanismus, bei dem immer nur eine Bindetasche aktiv ist (Grubmeyer et al., 1982; Kozlov et al., 1985; Cunningham und Cross, 1988; Penefsky, 1988). Er tritt aber nur bei sehr niedrigen (< µm) Substratkonzentrationen auf und ist daher physiologisch nicht relevant. Bei physiologischen, millimolaren ATP-Konzentrationen sind aufgrund der oben genannten Befunde und der Tatsache, dass die KD-Werte deutlich kleiner als die ATP-Konzentration sind, 26

27 Funktionsmechanismus der F-ATP-Synthase höchstwahrscheinlich alle drei Bindungstaschen mit Nukleotiden besetzt. Der lösliche F 1 -Teil kann mit einer Umsatzrate von bis zu V max = 300 s -1 arbeiten, das entspricht 100 Umdrehungen pro Sekunde Funktionsmechanismus des F O -Teils Die Aufgabe von F O in der F-ATP-Synthase besteht darin, das Drehmoment zu generieren, welches in F 1 für die Synthese von ATP benötigt wird. Das Proteolipid bildet zusammen mit a den Teil von F O, der diese Aufgabe übernimmt. Dazu wird eine über die Membran anliege elektrochemische Potentialdifferenz genutzt. Währ der c-ring mechanistisch zum Rotor gehört, sind die Untereinheiten a und b 2 Teile des Stators, wobei b 2 den F O -Teil mit dem F 1 -Teil verbindet. Ein Mechanismus für die Funktion von F O wurde von W. JUNGE entworfen und beschrieben (Junge et al., 1997). Dem Modell nach (Abb. 1.7) befinden sich zwischen den Untereinheiten a und c zwei versetzt angeordnete Halbkanäle, die jeweils nur zu einer Seite der Membran geöffnet sind und diese zur Hälfte durchspannen. Jede c-untereinheit im Proteolipid trägt mittig eine Carboxylgruppe (cd61). Im protonierten, elektrisch neutralen Zustand zeigt diese Gruppe in die umgebe Lipidmembran, währ sie im deprotonierten, negativ geladenen Zustand der Untereinheit a zugewandt ist. Stöße durch die umgebenen Wasser- und Lipidmoleküle verursachen eine ungerichtete, rotiere Brown sche Fluktuationsbewegung des c-rings relativ zu a. Wenn sich eine geladene c-untereinheit von a in das Lipid dreht, wird sie aufgrund der elektrostatischen Beschränkung wieder zurück zum Protein reflektiert. Nur wenn die Ladung durch die stochastische Bindung eines Protons, das durch einen Halbkanal diffundiert, neutralisiert wird, kann sich der c-ring eine Untereinheit weit in die Membran drehen. Gleichzeitig dreht sich auf der anderen Seite ein protoniertes c in Richtung der Kontaktfläche mit der a-untereinheit und gibt dort sein Proton über den zweiten Halbkanal an die andere Seite der Membran ab, d.h. es wurde ein Protonen über die Membran transportiert. Die Dissoziation der Protonen wird durch die positiv geladene Aminosäure R210 in a begünstigt. Den Zugang für die Protonen zum cd61 bilden die beiden Halbkanäle in a (Angevine et al., 2003). Werden die Halbkanäle verlängert oder verkürzt, indem man diesen Aminosäurereste vertikal verschiebt, kommt es zu einer Beeinträchtigung bis zu einem völligem Erliegen der Protonenleitung (Langemeyer und Engelbrecht, 2007). Die Drehrichtung des c-rings wird allein durch die ph-werte beiderseits der Membran bestimmt. Je niedriger der ph-wert, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein Proton in den Kanal eintritt und eine c-untereinheit protoniert. Bei hohen ph-werten werden die c-untereinheit dagegen eher deprotoniert. Die hochauflösen Kristallstrukturen der entsprechen Proteolipide aus I. tartaricus mit einer Auflösung von 0,24 nm (Meier et al., 2005) und Enterococcus hirae mit einer Auflösung von 0,21 nm (Murata et al., 2005) unterstützen dieses Modell, das auch als Brownian Ratchet bezeichnet wird (Junge und Nelson, 2005). Der c-ring der Natrium- transportieren F-ATP-Synthase aus I. tartaricus besteht aus 11 Monomeren, die jeweils einen Glutamat an der Position 65 besitzen. In dem Proteolipid der Natrium-transportieren V-ATP-Synthase aus E. hirae befindet sich ein Glutamat an der Position 165. Diese beiden Glutamatreste erfüllen die gleiche Funktion wie das cd61. Auch weisen die Strukturen auf die Existenz zweier Halbkanäle zwischen dem Proteolipid und dem Stator hin. 27