Modul: Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen

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1 Modul: Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen WS 2009/2010 Lehrstuhl Pflanzenphysiologie Aufgabe Transport und Photosynthese Induktion eines Hexosetransportsystems in Chlorella kessleri Einleitung 1 Versuchsdurchführung 4 Anhang 10 Messung der Hill-Reaktion der Photosynthese Einleitung 20 Versuchsdurchführung 23 Anhang 30 1

2 Modul Bioenergetik Transport Teilversuch I Induktion eines Hexosetransportsystems in Chlorella kessleri 1. Einleitung Der Versuch dient mehreren Zwecken. Zum einen soll die Bedeutung von Transportprozessen in Pflanzen und deren Energetik exemplarisch vertieft werden, zum anderen führt das Experiment in den Umgang mit radioaktiven Substanzen ein. Das Versuchsobjekt ist die einzellige Grünalge Chlorella (Abb. 1). Die Gattung Chlorella wird als Sammelgattung bezeichnet weil in ihr bedingt durch die geringe Zahl morphologischer Merkmale nicht näher miteinander verwandte Arten in einer Gattung vereinigt sind. Molekularbiologische Methoden legen nahe, dass die Vertreter von Chlorella in mindestens 2 Klassen der Chlorophyta verteilt sind. Man findet Chlorella als frei lebende Algen im Süßwasser und an feuchten Oberflächen, aber auch als Endosymbionten in Paramaecium, Hydra, Strudelwürmern und einigen Flechten. Chlorella besitzt einen einzigen, napfförmigen Chloroplasten und keine Zentralvakuole (Abb. 1B). Die Vermehrung geschieht ausschließlich asexuell. Der Protoplast der Zelle teilt sich mehrmals und bildet innerhalb der Zellwand der Mutterzelle 4, 8 oder 16 Tochterzellen mit deren jeweilig eigenen Zellwand. Schließlich platzt die Zellwand der Mutterzelle auf und entlässt die Tochterzellen, die dann wieder zu ihrer typischen Größe heranwachsen. Die Zellwand der Mutterzelle bleibt als Leiche zurück. Die frei lebende Form von Chlorella lässt sich relativ rasch auf anorganischem Medium photoautotroph mit einer Verdopplungszeit von ca. 1 Tag anziehen. Sie hat als pipettierbare Pflanze eine große Bedeutung in der Pflanzenphysiologie erlangt. An ihr wurden beispielsweise der Calvin-Zyklus aufgeklärt, der Mineralstofftransport und die Mineralstoffassimilation erforscht und schließlich wurde an Chlorella zum ersten Mal ein pflanzliches Zuckertransportsystem charakterisiert und kloniert. A B 5 µm Abb. 1 Chlorella sp. A: Lichtmikroskopische Aufnahme B: Schematischer Aufbau 1

3 Modul Bioenergetik Transport Teilversuch I Physiologie des Zuckertransports bei Chlorella Wird autotroph gewachsene Chlorella kessleri in ein Medium mit Glukose (oder einem Glukoseanalog) überführt, ist die Aufnahmegeschwindigkeit von Glukose gering. Nach Minuten Inkubation in Glukose steigt jedoch die Geschwindigkeit der Aufnahme stark an, denn es wird ein Glukosetransportsystem induziert. Die aufgenommene Glukose wird sofort metabolisiert, hauptsächlich zu Saccharose und Stärke. Lässt man Chlorella jedoch ein nicht-verstoffwechselbares Glukoseanalog wie 3-O-Methylglukose oder 6- Desoxyglukose aufnehmen, wird das Glukoseanalog in den Zellen akkumuliert, d.h. Chlorella ist in der Lage, Hexosen gegen einen Konzentrationsgradienten aus dem Medium aufzunehmen, ein Hinweis darauf, dass es sich bei der Aufnahme um einen aktiven Transportprozess handelt. (Das Enzym Hexokinase kann die obigen Glukose-Analoge nicht phosphorylieren, sodass damit jeder weitere Weg im Stoffwechsel verhindert ist.) Die Frage, wo die Energie für diesen aktiven Transportprozess herkommt, konnte durch den Befund geklärt werden, dass Glukose nicht allein sondern gemeinsam mit einem Proton aufgenommen wird (Glukose-H + Symport). Über die Plasmamembran besteht ein elektrochemischer Gradient von Protonen (zusammengesetzt aus einem Protonengradienten, ΔpH, innen alkalisch, und einem Membranpotential, innen negativ, außen positiv), der von einer H + -transportierenden ATPase aufgebaut wird (primär aktiver Transport von Protonen). Dieser Gradient liefert die Energie für den (sekundär) aktiven Transport der Glukose. H ph 6,5 H Glukose 120 mv ATP ADP + P ph 7,5 Plasmalemma Abb. 2 Schema des Glucose-H + Symports und des protonmotiven Potentials am Plasmalemma Molekularbiologie Die molekulare Grundlage der Induktion des Hexosetransportsystems in Chlorella sind der verstärkte Einbau von Zuckertransportproteinen in die Plasmamembranen dieser Zellen. Dieser verstärkte Einbau ist direkt auf die vermehrte Expression der entsprechenden Gene zurückzuführen. Es sind aus Chlorella kessleri z.zt. drei Hexosecarrier-Gene bekannt, die HUP1, HUP2 und HUP3 bezeichnet werden (HUP steht für hexose uptake). Obwohl wahrscheinlich alle drei Genprodukte an der Glukoseaufnahme beteiligt sind, ist die Aktivität von HUP1 am stärksten, deshalb beschränkt sich dieses Praktikum auf die molekularbiologische Analyse von HUP1 (siehe Aufgabe Transcriptanalyse). Wird zu Chlorella-Zellen Glukose gegeben, so führt dies über eine noch nicht genauer bekannte Signalkette zur verstärkten Expression bestimmter Gene, u. a. des HUP1-Gens. Die Expression eines Gens lässt sich grob in zwei Schritte zerlegen. Im ersten Schritt wird der kodierende Strang des Gens in RNA umgeschrieben (Transkription), die im Kern prozessiert wird und als sog. mrna in das Cytosol transportiert wird. Dort wird im zweiten Schritt die RNA-Sequenzinformation in eine Aminosäuresequenz übersetzt 2

4 Modul Bioenergetik Transport Teilversuch I (Translation). Das neu synthetisierte Protein wird dann in die Plasmamembran transportiert, die Signalsequenz die zu dieser Lokalisierung führt ist nicht bekannt. Literatur: - Tanner, W. (1985) Ionenströme und Substratflüsse, BIUZ, 15; Sauer, N., Tanner, W. (1993) Molecular biology of sugar transporters in plants. Bot. Acta 106; Stadler, R., Wolf, K., Hilgarth, C., Tanner, W., Sauer, N. (1995) Subcellular localization of the inducible Chlorella HUP1 monosaccaride-h + symporter and cloning of a co-induced galactose-h + symporter. Plant Physiol. 107;33-41 Programm: A) Induktion des Hexosetransportsystems 1) Herstellung einer Algensuspension mit normierter Dichte 2) Induktionsansätze 3) Zuckerbestimmung nach Folin-Wu B) Aufnahme von ( 14 C)3-O-Methylglukose durch induzierte bzw. nicht-induzierte Algen 1) Aufnahme von ( 14 C)-3-O-Methylglukose Zeitplan: Vormittag Nachmittag 1. Tag Vorbesprechung, Strahlenschutz Ansetzen der Puffer 2. Tag Ernte der Algen, Induktionsansatz Aufnahmeversuch, Messung der Radioaktivität 3. Tag Auswertung, Nachbesprechung 3

5 Modul Bioenergetik Transport Teilversuch I 2. Versuchsdurchführung 2.1 Induktion des Hexosetransportsystems Es soll das Hexosetransportsystem in Chlorella durch Glukose induziert werden. Die Induktion soll durch einen Zuckertest (Abschn ) in 15-min Abstand und anschließend durch die Messung der mrna eines Monosaccharid-Carrier-Gens bei 0, 15 und 60 min (HUP1, Abschn. 2.4) gezeigt werden. Versuchsvorbereitung: Schüttelwasserbad auf 27 C vorheizen; 1,5ml-Reagier-Gefäße in Eis vorkühlen Wichtig: Bei allen Arbeiten mit Algen, hier und in den folgenden Abschnitten, unbedingt die Suspension gut schütteln, bevor die Proben entnommen werden, denn die Algen setzen sich verhältnismäßig schnell ab und werden u. U. anaerob. Herstellung einer Algensuspension mit normierter Dichte Die 3-4 Tage in anorganischem Medium im Licht bei Belüftung mit Pressluft und 1% Kohlendioxid angezogenen Algen (in dieser Form werden sie gestellt) werden in einer Erntezentrifuge 5 min bei Upm abzentrifugiert. Die sedimentierten Algen werden in insgesamt 30 ml dest. H 2 O aufgeschwemmt und in einen Messzylinder überführt (in Eis aufbewahren). Zur Bestimmung des Zellvolumens der Algen werden 1 ml Algensuspension in ein Hämatokrit -Zentrifugenglas (mit 100-µl-Markierung) pipettiert und 10 min bei Upm zentrifugiert. Die im Kapillaransatz sedimentierten Algen lassen sich mit der Markierung in µl gepackte Zellen (packed cells = p.c.) bestimmen. Die Algensuspension wird nun mit dest. H 2 O so eingestellt, dass die Algendichte (50 µl p.c./ml) beträgt. Zur Berechnung der Aufnahmegeschwindigkeit und des Akkumulatonsfaktors (siehe Auswertung) muss bedacht werden, dass 30% Zwischenzellwasser abgezogen werden muss um das tatsächliche Zellvolumen zu erhalten. Induktionsansätze Folgende Volumina werden jeweils in 50 ml Erlenmeyerkolben zusammen pipettiert und in einem Schüttelwasserbad bei 27 C geschüttelt: A-1) B-1) 10 ml Algen (50 µl p.c /ml) 5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer ph 6,0 4 ml dest. H 2 O 10 ml Algen (50 µl p.c./ml) 5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer ph 6,0 5 ml dest. H 2 O Nach 10 min wird die Induktion in Ansatz A-1 durch Zugabe von 1 ml 140 mm Glukoselösung gestartet. Aus diesem Ansatz werden sofort 0,5 ml Algen entnommen, in ein gekühltes 1,5 ml-reagier-gefäß gegeben und 1 min bei maximaler Umdrehung zentrifugiert. Vom Überstand werden 0,1 ml in ein 1,5 ml-reagier-gefäß gegeben und auf Eis aufbewahrt. In gleicher Weise werden Proben aus Ansatz A-1 jede weitere Viertelstunde für insgesamt 120 min entnommen und aufgearbeitet. Mit diesen Proben wird sodann die Zuckerbestimmung (2.1.3) durchgeführt. Ist anhand des Zuckertestes die Induktion positiv verlaufen, kann mit Abschn. 2.2 weitergemacht werden (Ansätze nicht verwerfen!). Zuckerbestimmung nach Folin-Wu 4

6 Modul Bioenergetik Transport Teilversuch I Der Nachweis von Glukose beruht auf der folgenden Reaktion von zweiwertigem Kupfer mit Aldehydgruppen: Folin-Wu A mit Zucker: Ox: R-CHO + 2 OH - R-COOH + 2 e - + H 2 O Red: 2 Cu e OH - Cu 2 O ( rot) + H 2 O RedOx: R-CHO + 2 Cu OH - R-COOH + Cu 2 O ( rot) + 2 H 2 O Folin-Wu B mit einwertigem Kupfer: Ox: Cu(I) Cu(II) Red: MoO 3 + xh MoO 3-x (OH) x Es entsteht eine tiefblaue kolloidale Lösung von Mischoxiden des vier- (x = 2) bis sechswertigen (x = 0) Molybdäns. Zur quantitativen Auswertung muss eine Eichkurve erstellt werden. Dazu werden 0,01 / 0,025 / 0,05 / 0,075 / 0,1 und 0,2 µmol Glukose und eine Wasserprobe (Nullwert) dem Test in gleicher Weise unterzogen, d.h. in 10-µl-Mengen eingesetzt. Mit Hilfe folgender Tabelle, in der die stark-umrandeten Felder von Ihnen ergänzt werden sollen, können aus einer 20 mm Glukoselösung die entsprechend konzentrierten Testlösungen hergestellt werden. Testkonz. (µmol in µl) 0,2 in 10 µl 0,1 in 10 µl 0,075 in 10 µl 0,05 in 10 µl 0,025 in 10 µl 0,01 in 10 µl 0 in 10 µl entspricht einer Konzentration von (mm) 1 ml Testlösung besteht aus x µl x µl 20 mm Glukose Wasser Die Proben von 10 µl (klarer Überstand aus Induktionsansatz sowie Testlösungen) werden mit dest. H 2 O auf 100 µl aufgefüllt; dann wird 100 µl Lösung Folin-Wu A zugegeben, gemischt, und bei 100 C 7 min lang gekocht. Anschließend werden die Proben 3 min in kaltem Wasser gekühlt (Reagiergefäßständer ins Waschbecken stellen), und sodann 100 µl Lösung Folin-Wu B zugegeben, gut durchmischt und nach 10 min mit 1 ml dest H 2 O aufgefüllt. Nach 40 min wird die Extinktion bei 650 nm in Halbmikroküvetten gemessen. Bitte beachten Sie die Gefahrstoffhinweise am Ende dieser Versuchsbeschreibung! Auswertung - Die in den Proben enthaltenen Zuckermenge (µmol Glucose / ml Medium) wird gegen die Zeit (h) aufgetragen. - Berechnen Sie die Aufnahmerate zu Beginn der Induktion und im Zustand der Induktion in [µmol / (h ml p.c.)]. - Diskutieren Sie die Ergebnisse. 5

7 Modul Bioenergetik Transport Teilversuch I 2.2 Aufnahme von ( 14 C) 3-O-Methyl-Glukose durch induzierte und durch nichtinduzierte Algen Vor der Durchführung des Versuches muss unbedingt das Kapitel über radioaktive Isotopen (Abschn. 3) gelesen werden. Dort finden Sie einige grundlegende Informationen zur Quantifizierung und zum Strahlenschutz. In diesem Versuchsteil sollen die Aufnahmekinetik und die Akkumulation eines nicht metabolisierbaren Glukoseanalogs in Chlorella bestimmt werden. Aufnahmeansatz Mit den beiden Algensuspensionen aus Abschn werden nun folgende Aufnahmeansätze hergestellt: A-2) 9,8 ml Ansatz A-1 (induzierte Algen) 0,2 ml 14 C-markiertes Substrat bestehend aus: 0,1 ml 20 mm 3-O-Methylglukose 0,1 ml 1 µci/ml ( 14 C) 3-O-Methylglukose, (38,3 mci/mmol) B-2) 9,8 ml Ansatz B-1 (Kontrolle) 0,2 ml 14 C-markiertes Substrat bestehend aus: 0,1 ml 20 mm 3-O-Methylglukose 0,1 ml 1 µci/ml ( 14 C) 3-O-Methylglukose, (38,3 mci/mmol) Von diesen Aufnahmeansätzen werden Proben auf Membranfilter abfiltriert (die Membranfilter vorher mit H 2 O anfeuchten). Dazu werden 0,5 ml auf den Filter in der Absaugbank pipettiert und einmal mit etwa 5 ml eiskaltem Phosphatpuffer (25 mm, ph 6,0) gewaschen (zwischen den Waschschritten den Hahn schließen). Die Filter werden mit einer Pinzette vorsichtig in Szintillationsgläschen überführt und am Ende des Versuches mit 10 ml Szintillationslösung versetzt. Proben werden zu folgenden Zeiten entnommen: 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120 min. Außerdem wird etwa nach 20 und 110 min je ein Gesamtwert entnommen, d.h. 0,5 ml des Aufnahmeansatzes werden ohne Filtration direkt in die Szintillationsgläschen pipettiert. Auswertung Die Radioaktivität in den einzelnen Proben wird gegen die Zeit (h) aufgetragen. Berechnen Sie die anfänglichen Aufnahmeraten [µmol / (h ml p.c.)] bei induzierten und bei nicht induzierten Algen. Benutzen Sie dazu entweder eine Tangente zum anfänglichen Kurvenverlauf, oder Tabellenkalkulationsprogramme (MS Excel oder SigmaPlot), die Trendlinien (Regressionskurve) berechnen, die Sie zur Bestimmung der anfänglichen Aufnahmerate hernehmen können. Berechnen Sie die Anreicherung der 3-O-Methylglukose in den Algenzellen gegenüber dem Außenmedium am Ende der Inkubation (120 min). Beachten Sie, dass die in die Chlorella-Zellen bereits aufgenommene Zuckermenge natürlich nicht mehr im Medium vorhanden ist. 6

8 Modul Bioenergetik Transport Teilversuch I Berechnen von Geschwindigkeit, Akkumulationsfaktor und Energiebetrachtung. Berechnen von Aufnahmegeschwindigkeit aus der Aufnahmerate von radioaktiv markiertem Zucker: Man geht davon aus, dass Enzyme und Transportproteine nicht unterscheiden können, ob ein Zuckermolekül an irgendeiner Stelle ein 12 C- oder ein 14 C-Atom trägt (es gibt auch Hinweise für diese Annahme). Somit steht die Aufnahme radioaktiv markierten Zuckers repräsentativ für die Aufnahme auch des nicht markierten Zuckers und man kann aus der Radioaktivitätsaufnahme die Zuckeraufnahme errechnen. Beispiel: Die Zellen (10 µl gepacktes Volumen) haben in 5 min 3000 cpm Radioaktivität aufgenommen, d.h. die Aufnahmegeschwindigkeit betrug 600 cpm/min. Im Versuchsansatz liegen 1 mm (= 1 µmol/ml) Zucker vor und zugleich cpm/ml. Da die Zuckermenge praktisch ausschließlich durch den nicht-radioaktiven Zucker bestimmt wird (die Menge an nicht-radioaktiv markiertem Zucker überwiegt bei weitem die geringe Menge an radioaktiv markiertem Zucker; siehe Hinweis unten), repräsentieren cpm folglich 1 µmol Zucker. 600 cpm repräsentieren demnach 60 nmol, und die Aufnahmegeschwindigkeit ist 60 nmol/min und 10 µl gepackte Zellen. So einfach! Hinweis: Die sog. spezifische Radioaktivität gibt den Anteil einer markierten Substanz an der Gesamtmenge dieser Substanz an. Die in Abschnitt verwendete 3-O- Methylglukose-Stammlösung hat folgende Spezifikation: Spez. Aktivität: 38,1 mci/mmol (= 1410 MBq/mMol) Konzentration: 0,1 µci/ml (= 3,7 kbq/ml) Daraus kann der Anteil markierten Zuckers am Gesamtzucker im Aufnahmeansatz berechnet werden (Umrechnungsfaktoren: 1 mci = 37 MBq; 1 Bq = 60 dpm) Der Akkumulationsfaktor: Unter Akkumulation versteht man in unserem Fall den Faktor, mit dem eine Konzentration in der Zelle höher ist als im umgebenden Medium. Man errechnet also zum Zeitpunkt des stationären Zustands (wenn die Konzentrationen in der Zelle und im Medium konstant bleiben) die Zuckerkonzentration in den Zellen und die Zuckerkonzentration im Medium und bildet den Quotienten. Im Fall unseres Versuchs könnte man alleine mit der Radioaktivität rechnen, denn diese steht repräsentativ für den Zucker. Beispiel: Die Zellen in 1 ml Aufnahmeansatz haben 8000 cpm aufgenommen, im Medium waren zu Beginn cpm/ml. Die Zelldichte im Aufnahmeansatz war 10 µl gepacktes Volumen pro ml. Im gepackten Zellvolumen sind 30% Zwischenzellwasser enthalten (= dichte Kugelpackung), d.h. reines Zellvolumen ist 6,67 µl/ml. Die (Radioaktivitäts-)Konzentration in den Zellen ist folglich 8000 cpm/6,67 µl, im Medium 2000 cpm/993,3 µl (die Summe der von den Zellen aufgenommenen sowie der im Medium verbliebenen Radioaktivität muss ja cpm sein!). Der Akkumulationsfaktor (Zelle/Medium) ist dann 8000cpm 993,3μl = 596 (ohne Benennung!) 6,67μl 2000cpm 7

9 Modul Bioenergetik Transport Teilversuch I Die Energiebetrachtung: Die Akkumulation einer Substanz muss durch einen metabolischen Energieeinsatz ermöglicht werden. Im konkreten Fall des Zuckertransports ist es auf Grund des H + - Cotransports die protonmotive force, d.h. die osmotische Energie im Protonengradienten (ΔpH) plus die elektrische Energie im Membranpotential (ΔE). Wie stark können nun Chlorella-Zellen Zucker akkumulieren, wenn realistische Protonengradienten (z.b. ΔpH = 1,5) und Membranpotentiale (z.b. 120 mv) zugrunde gelegt werden? Folgende Gleichungen helfen uns dazu: Einerseits lässt sich aus einem bekannten Konzentrationsunterschied der dafür notwendige Energiebetrag berechnen: a) Die erforderliche Energie für akkumulierte Teilchen ist: K innen ΔG = RT ln oder K innen ΔG = RTα log K außen K außen K ist der Akkumulationsfaktor, genauer die Gleichgewichtskonstante des betrachteten Prozesses, d.h. Zuckerkonz. innen /Zuckerkonz. außen. Zur Vereinfachung wurde ln in log umgewandelt und die Formel mit einem Korrekturfaktor α versehen. Die Konstanten R, T und α ergeben 1,3 kcal/mol oder 5,5 kj/mol Fazit: Ein Transport gegen eine 100fache Akkumulation benötigt 11 kj/mol transportierte Substanz. Andererseits lässt sich aus der Energie die protonmotive force bei bekanntem Transportmechanismus eine maximale Akkumulation abschätzen: b) Die Energie im Protonengradienten (ΔpH) ist: + H außen Δ G = RT ln + H innen Bildet man aus dem Quotienten der Protonenkonzentrationen den dekadischen Logarithmus (log) und korrigiert mit einer Konstante α, so ergibt sich: ΔG = RTα ΔpH ΔpH ist wie log (K i /K a ) der dekadische Logarithmus eines Konzentrations-verhältnis, nämlich H + außen/h + innen). Fazit: ΔpH sei 1,5; die Energie dieses ph-gradienten ist also: Δ G ph = 1,5 5,5kJ / Mol = 8,25kJ / Mol c) Die Energie im Membranpotential (ΔE) ist: Δ G = nf ΔE wobei n die Stöchiometrie ist (Ladung pro transportiertem Teilchen, oft = 1), F = e N = 96,5 kj / (V Mol) Fazit: Ein Membranpotential von 120 mv entspricht also einem Energiebetrag von: Δ G = 1 96,5 kj / V Mol 0,12 V = 11 kj / ( ) Mol Faustregel: Unter physiologischen Bedingungen (ca 25, 1 bar) bedeutet ein Konzentrationsgleichgewicht von 10 etwa 5,5 kj oder 60 mv. Achtung: Die Gleichgewichtsfunktion ist logarithmisch! 8

10 Modul Bioenergetik Transport Teilversuch I Materialliste für Versuch Hexosetransport Lösungen: (von Studenten herzustellen) Menge - 0,1 M Natriumphosphatpuffer ph 6,0 1 Liter 800 ml 0,1 M NaH 2 PO ml 0,1 M Na 2 HPO 4 ph-wert durch Zugabe von etwas Na 2 HPO 4 zu NaH 2 PO 4 einstellen (diese Menge reicht auch, um den untenstehenden 25 mm Puffer anzusetzen; den Rest aber nicht verwerfen) 25 mm Natruimphosphatpuffer ph 6,0 2 Liter aus 0,1 M Natruimphosphatpuffer ph 6,0 verdünnen 140 mm Glukose 50 ml (diese Menge reicht auch, um die untenstehenden 20 mm Glukoselösung anzusetzen; den Rest aber nicht verwerfen) 20 mm Glukose 5 ml aus 140 mm Glukosekösung verdünnen Lösungen, die gestellt werden: Folin-Wu A: 40 g Natriumcarbonat (wasserfrei) in 400 ml H 2 O lösen + 7,5 g Weinsäure + 4,5 g CuSO 4 * 5H 2 O H 2 O ad 1000 ml Folin-Wu B: 35 g Molybdänsäureanhydrid in 400 ml 5% NaOH 30 min kochen nach dem Abkühlen 125 ml 85% Phosphorsäure zugeben H 2 O ad 500 ml 9

11 Modul Bioenergetik Transport Teilversuch I Gefahrstoffe: Bitte beachten Sie die in der Anleitung angegebenen Gefahrhinweise! Aceton: Chloroform Kupfer(II)-Sulfat x 5 H 2 O Ethanol Kaliumpermanganat Methanol Molybdän(VI)-Oxid Natronlauge (2-5%) Natronlauge (>5%) Natriumcarbonat Phenol Gefahrenhinweise: F - Leichtentzündlich R-Sätze: 11 S-Sätze: Gefahrenhinweise: Xn - Mindergiftig (gesundheitsschädlich) R-Sätze: 20/ S-Sätze: 36/37-53 Gefahrenhinweise: Xn - Mindergiftig (gesundheitsschädlich R-Sätze: 22-36/38 S-Sätze: 22 Gefahrenhinweise: F - Leichtentzündlich R-Sätze: 11 S-Sätze: 7-16 Gefahrenhinweise: Xn - Mindergiftig (gesundheitsschädlich), O - Brandfördernd R-Sätze: 8-22 S-Sätze: 2 Gefahrenhinweise: T - Giftig, F - Leichtentzündlich R-Sätze: 11-23/25 S-Sätze: Gefahrenhinweise: T - Giftig R-Sätze: 25 S-Sätze: Gefahrenhinweise: Xi - Reizend R-Sätze: 34 S-Sätze: /39 Gefahrenhinweise: C - Ätzend R-Sätze: 35 S-Sätze: /39-45 Gefahrenhinweise: Xi - Reizend R-Sätze: 36 S-Sätze: Gefahrenhinweise: T Giftig 10

12 Modul Bioenergetik Transport Teilversuch I R-Sätze: 24/25-34 S-Sätze: Phosphorsäure Gefahrenhinweise: C - Ätzend R-Sätze: 34 S-Sätze: 26 Weitere Internetadressen zu diesem Thema: - Universität Bayreuth, Gefahrstoffe und Umweltschutz - Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV); - FU Berlin; 11

13 Modul Bioenergetik Transkriptanalyse 12

14 Modul Bioenergetik Transkriptanalyse Messung der Hill-Reaktion der Photosynthese 1. Einleitung Ziel dieser Aufgabe ist es, den photosynthetischen Elektronentransport und, indirekt, die Photophosphorylierung zu untersuchen. Thylakoidmembranen (Abb. 3) werden aus Chloroplasten isoliert, mit entsprechenden Elektronenakzeptoren und Substraten für die ATP-Synthese inkubiert und belichtet. Die Wirkung von verschiedenen Hemmstoffen als auch das stöchiometrische Verhältnis zwischen Elektronentransport und der ATP-Synthese werden untersucht. Das pflanzliche Objekt sind Thylakoide aus Spinatblättern. An Spinatchloroplasten wurden viele Photosyntheseenzyme isoliert und charakterisiert. In der Regel synthetisieren Pflanzen eine Vielzahl von Abwehrstoffen als Fraßschutz, Stoffe die Enzyme inaktivieren, Membranen angreifen und diese Pflanzen auch als menschliche Nahrung ungenießbar machen. Nur die vom Menschen durch Züchtung entschärften Pflanzen wie beispielsweise Spinat haben einen geringen Anteil dieser Stoffe, sodass aus diesen Pflanzen am ehesten funktionell intakte Organelle und Enzyme extrahiert werden können. Abb. 3: Schema des Chloroplasten einer Höheren Pflanze und der Thylakoidmembranen. Der photosynthetische Elektronentransport Die photosynthetische Elektronentransportkette der Höheren Pflanzen besteht aus drei, die Membran überspannenden Multiproteinkomplexen: (a) dem Wasserspaltungs-Komplex und dem Photosystem 2, (b) dem Cytochrom b 6 /f-komplex und (c) dem Photosystem 1. Zwei mobile Carrier übertragen die Redoxäquivalente auf den jeweils folgenden Multiproteinkomplex. Ubichinone leiten die Redoxäquivalente von PS2 zum Cytochrom b6/f-komplex; Plastocyanin vermittelt zwischen dem Cytochrom b 6 /f-komplex und Photosystem 1. Der hauptsächliche Endakzeptor für Elektronen ist NADP+ (Abb. 4). Redoxäquivalente können aber auch für Stickstoff- oder Schwefelreduktion verwendet werden. Ebenso können Redoxäquivalente auf O 2 übertragen werden ("Mehler"- Reaktion), vor allem wenn andere Akzeptoren fehlen. Jedes Redoxäquivalent, das von H 2 O auf NADP + übertragen wird, muss beide Photosysteme durchlaufen. Daher sind mindestens zwei Photonen nötig, um ein Redoxäquivalent durch dieses sog. "Z-Schema" zu schleusen. (Bei eventuell auftretender 13

15 Modul Bioenergetik Transkriptanalyse Energiedissipation bzw. -ineffizienz werden mehr Photonen benötigt.) Photosyntheseraten werden üblicherweise in µmol O 2 x mg Chl -1 x Stunde -1 angegeben (1 O 2 entspricht 4 Elektronen). Ein Spinatblatt kann Photosyntheseraten von µmol O 2 x mg Chl -1 x Stunde -1 erreichen. Manchmal werden andere Einheiten verwendet. Zum Beispiel werden bei Betrachtung der ATP-Synthese (siehe unten) oft 2 Elektronen (entsprechen 1/2 O 2 bzw. 1 NADPH) als Bezugsgröße gewählt, in Anlehnung an den Gebrauch bei der oxidativen Phosphorylierung in Mitochondrien. Abb. 4: Schema des Ablaufs des Elektronentransports in der Thylakoidmembran und der Kopplung zur ATP-Synthese. Die "Hill"-Reaktion Bei der Isolierung der Thylakoide gehen das wasserlösliche Komponenten der Photosynthese verloren, darunter das Protein Ferredoxin, wodurch die Reduktion des natürlichen Akzeptors NADP+ unterbunden wird. Unter der Hill-Reaktion der Photosynthese (benannt nach R. Hill, Cambridge, der diese Reaktion 1940 erstmals nachgewiesen hat) versteht man die Reduktion eines zugesetzten ("künstlichen") Elektronenakzeptors bei Belichtung von isolierten Chloroplastenfragmenten. Dabei wird O 2 aus Wasser freigesetzt, und Kaliumferricyanid (der "Hill"-Akzeptor) wird reduziert. Die Elektronen werden in der Nähe des Ferredoxins auf Kaliumferricyanid übertragen. Die Hill-Reaktion kann entweder photometrisch durch die Reduktion von Fe 3+, oder über die O 2 -Entwicklung, wie in diesem Kurs, gemessen werden. 4 K 3 [Fe(CN) 6 ] + 2H 2 O + 4 K + 4 K 4 [Fe(CN) 6 ] + 4H + + O 2 14

16 Modul Bioenergetik Transkriptanalyse Elektronen- und Protonenverschiebung Die Schritte des Elektronentransports führen entweder zu einer Ladungstrennung über die Membran oder zu einer Protonenverlagerung über die Membran. In Chloroplasten besteht die daraus resultierende "Proton Motive Force" (PMF) zum großen Teil aus einem ph- Gradienten (ΔpH = 3-4), das Membranpotential (ΔE ) ist relativ klein (+60 mv). In Mitochondrien hingegen besteht die PMF vor allem aus dem Membranpotential (ΔE = 120 mv, ΔpH = 1). Relevant für energieabhängige Prozesse ist die Summe der beiden Komponenten. Dabei muss man sich erinnern, dass ein ph-gradient von 1,0 und ein Membranpotential von ca. 60 mv energetisch äquivalent sind. Aus dem Aufbau der Elektronentransportkette lässt sich ableiten, dass die Übertragung von2 Elektronen von H 2 O auf NADP + (bzw. Kaliumferricyanid) mit einem Transport von 4 H + in den Thylakoidinnenraum verbunden ist (4H + /2e - ). Die tatsächliche Protonenausbeute könnte noch höher liegen, wenn auch der Cytochrom b 6 /f-komplex in der Lage ist, Protonen über die Membran zu befördern ('Q-cycle'). Photophosphorylierung (ATP-Synthese) Der aufgebaute ph-gradient dient vor allem der Synthese von ATP aus ADP und Pi. Die chloroplastidäre ATP-Synthase, die diese Reaktion katalysiert, zeigt eine enge Verwandtschaft mit dem entsprechenden Protein aus Mitochondrien. Beide setzen sich zusammen aus einem membranüberspannenden Protonenkanal (CF o bzw. F o ) und einem "Kopf" (CF 1 bzw. F 1, siehe Abb. 4). Die CF o und CF 1 -Strukturen bestehen wiederum aus vielen, zum Teil verschiedenen Untereinheiten. Drei bis vier Protonen müssen den Kanal durchqueren um 1 Molekül ATP zu synthetisieren (4-5 H + /ATP). Der Elektronentransport und die Synthese von ATP sind eng gekoppelt. Auf der einen Seite wird der für die ATP-Synthese benötigte ph-gradient mittels des Elektronentransports aufgebaut. Andererseits steigt der ph-gradient an, wenn keine ATP-Synthese stattfindet (z.b. bei ADP-Mangel) und wirkt schließlich hemmend auf den Elektronentransport (Rückstau). Die entsprechenden "ph-empfindlichen" Schritte sind höchstwahrscheinlich die Reaktionen zwischen reduziertem PQH 2 und dem Cytochrom b 6 /f-komplex. Es ist auch wahrscheinlich, dass steigende [H + ] im Thylakoidinnenraum zu erhöhter Energiedissipation im Photosystem 2 führt, obwohl die Mechanismen noch nicht geklärt worden sind. Auch wenn keine ATP-Synthese möglich ist, findet man immer eine basale Elektronentransportrate in Thylakoiden. Diese basale Rate ist auf "Protonenlecks" in der Thylakoidmembran zurückzuführen, die verschiedene Ursachen haben. Zum Beispiel können einige ATP-Synthaseeinheiten im Laufe der Isolierung geschädigt werden. Fettsäuren, die durch Aktivität von Lipasen in dem Homogenat entstehen, können als "Entkoppler" (siehe unten) wirken. Ebenso Spuren von Detergenz, Seife und anderen Verunreinigungen. Verschiedene Klassen von Hemmstoffen Drei verschiedene Klassen von Hemmstoffen können zu einer Hemmung der ATP- Synthese führen: (a) Elektronentransporthemmstoffe: Diese Verbindungen hemmen die Elektronenübertragung. Infolgedessen können auch keine Protonen transportiert werden, und ein ΔpH kann sich nicht ausbilden (z.b. Dichlorophenyl-dimethylharnstoff: DCMU). 15

17 Modul Bioenergetik Transkriptanalyse Q A DCMU Q B PQH 2 H 2 O P 680 Abb. 5: DCMU bindet an der Q B Bindungstelle des Photosystems 2 und hemmt die Weiterleitung von Elektronen von Q A auf Plastochinon. (b) Entkoppler: Substanzen, die die Thylakoide für Protonen durchlässig machen oder selbst Protonen durch die Membran transportieren, nennt man Entkoppler. Solche Substanzen hemmen die ATP-Synthese, da der dafür notwendige H + -Gradient nicht aufgebaut werden kann. Gleichzeitig kommt es zu einer Stimulierung der Elektronentransportrate, da die ph- Kontrolle entfällt. NH 4 Cl z.b. wirkt ähnlich wie ein Entkoppler, weil es als Protonenpuffer Protonen in den Thylakoiden bindet und somit den ph-gradienten erniedrigt. Da in den Thylakoiden die "Proton Motive Force" hauptsächlich durch einen ph-gradienten gebildet wird ist somit die ATP-Synthese verhindert. NH 4 + NH 3 NH 3 NH 4 + H + H + Abb. 6: Wirkung von Ammoniumionen in Thylakoiden. Elektronentransport (c) Hemmstoffe der ATP-Synthase: Diese Inhibitoren binden direkt an die ATP-Synthase, z. B. Dicyclohexyl-carbodiimid (DCCD). Zeitplan: Vormittag Nachmittag 1. Tag Vorbesprechung, Ansetzen der Lösungen 2. Tag Präparation der Chloroplasten und Thylakoide Messung der Sauerstoffentwicklung 3. Tag Auswertung, Nachbesprechung 16

18 Modul Bioenergetik Transkriptanalyse 2. Versuchsdurchführung Lösungen Lösungen zur Isolierung der Thylakoide 300 ml Puffer A (Aufschlussmedium für die Chloroplastenisolierung) 0,4 M Saccharose 20 mm Tricin 10 mm NaCl Mit 1 N NaOH auf ph 8.0 einstellen 200 ml Puffer B (Medium zum Aufbrechen der Chloroplasten) 10 mm NaCl 1 mm MgCl 2 1 mm Tricin Mit 1 N NaOH auf ph 8.0 einstellen 10 ml Puffer C (zum Suspendieren der Thylakoide bzw. zur Messung der Hillreaktion) Puffer A plus 1 mm MgCl % (w/w) Rinderserumalbumin (BSA) Lösungen zum Messen der Hill-Reaktion: 1. Puffer C (siehe oben) ml MgCl 2 50 mm 3. 1 ml K-Ferri-Cyanid 1 M 4. 5 ml NH 4 Cl 0.9 M 5. 5 ml K 2 HPO 4 50 mm (mit HCl auf ph 8 einstellen) ml ADP 10 mm (50 mm ADP wird gestellt, Gefrierschrank) 7. DCMU in DMSO 1 mm (wird gestellt, Kühlraum) Zur Chlorophyll-Bestimmung 70 ml 80% Aceton 17

19 Modul Bioenergetik Transkriptanalyse 2.1 Herstellung der Thylakoide Prinzip: Die Spinatblätter werden in isotonischer Lösung homogenisiert und die Chloroplasten durch differentielle Zentrifugation gewonnen. Durch das darauf folgende Suspendieren der Chloroplasten in stark verdünnter Lösung zerplatzen die Chloroplasten und die Chloroplastenbruchstücke (Thylakoide) können durch hochtourige Zentrifugation gesammelt werden. Die Membranen enthalten Chlorophyll und die meisten Enzyme des Elektronentransports. Die wasserlöslichen Substanzen des Chloroplasteninnenraums (Substrate wie ATP, ADP, Mg usw., als auch die Enzyme der CO 2 -Fixierung) gehen dabei in den Überstand. Durchführung: Von 50 g gewaschenen kalten Spinatblättern werden Stiele und die gröbsten Mittelrippen entfernt, die Blätter schnell in schmale Streifen geschnitten und zusammen mit 250 ml Puffer A für 3 bis 5 sec im Mixer bei voller Tourenzahl zerkleinert. Das Homogenat wird durch 6 Lagen Verbandsmull über einen kalten Trichter in einen kalten Erlenmeyerkolben abgepresst. Der Presssaft wird auf gekühlte Zentrifugenbecher verteilt, schnell austariert und in der gekühlten Zentrifuge 2 min bei 4000 U/min (bei r = 10,8 cm = 1800 g) zentrifugiert. Der grüne Überstand, der Chloroplastenfragmente, Mitochondrien, etc., enthält, wird abgegossen und verworfen. Das Sediment enthält ganze Chloroplasten, die durch portionsweise Zugabe von ca. 80 ml Puffer B (eiskalt) und durch Schwenken des Bechers aufgeschwemmt und osmotisch aufgebrochen werden. Die Suspension wird in zwei eiskalte Zentrifugenbecher dekantiert, die Becher exakt austariert und 2 min bei U/min (bei r = 10,8 cm = g) zentrifugiert. Der gelbliche Überstand (= Chloroplastenextrakt mit wasserlöslichen Enzymen) wird abgegossen und verworfen. Das grüne Sediment der Zentrifugenbecher wird durch vorsichtiges Aufschwemmen (so dass keine Klumpen entstehen) mit einer Mikroliterpipette in 0.5 ml eiskaltem Puffer C suspendiert (Schwenken und auf- und abziehen mit einer Pasteurpipette) und in ein eiskaltes, graduiertes Reagenzglas (10 ml) gegeben. 2.2 Bestimmung des Chlorophyllgehalts Die erhaltene Suspension soll nun auf einen Chlorophyllgehalt von 2 mg/ml eingestellt werden. Die Chlorophyllkonzentration wird wie folgt bestimmt (Triplikate) : 10µl der Suspension werden in ein Reagenzglas mit 20 ml 80% Aceton einpipettiert, geschüttelt und mit Papierfilter abfiltriert (das Filtrat muss klar sein!). Die Extinktion wird bei 645 und 663 nm in einem Spektralphotometer gemessen. 20,2 E ,02 E x = mg Chlorophyll / ml Suspension Die Thylakoidsuspension muss dann entsprechend mit Puffer C verdünnt werden. Thylakoidfragmente bleiben bei 0 C im Dunkeln einige Stunden aktiv. 18

20 Modul Bioenergetik Transkriptanalyse 2.3 Messung der Hill-Reaktion Die Messung der Hill-Reaktion erfolgt durch die Registrierung von gebildetem Sauerstoff mittels polarographischer Messung mit einer Sauerstoff-Elektrode. Eine allgemeine Anleitung zu diesem Verfahren finden Sie im Anhang. Vorbereitungen (rechtzeitig treffen:) - Die Sauerstoffelektrode einschalten (mindestens eine Stunde vor der Messung in der "Standby"-Stellung laufen lassen). - Die Messküvette auf ca. 17 C temperieren (Wasserbad und Kühlung anschalten!). - Aqua bidest. in einem 100 ml Gefäß auf 17 C temperieren und mit Pressluft durchspülen (zur Eichung). - Papiergeschwindigkeitsregler auf 1 cm/min stellen. - Lampen in Position bringen, aber noch nicht anschalten - Bevor und zwischen Messungen die Küvette unbedingt mit Aqua bidest. beschicken (Austrocknungsgefahr!). Vorversuch als Übung - Messküvette leersaugen und mit 1,5 ml Aqua bidest beschicken; Messkammer nicht verschließen. - Magnetrührer zur Umwälzung des Küvetteninhalts und Schreiber anschalten. - Mit N 2 begasen: Schreiberbewegung verfolgen, bis eine Basislinie erreicht ist (= Null O 2 ). Schreiber so einstellen, dass die Basislinie knapp über dem unteren Rande des Schreiberpapiers liegt. - N 2 -Begasung bei geöffneter Küvette einstellen, 1-2 Min. warten. Messkammer verschließen, 1 Min. warten. 25 µl luftgesättigtes Wasser mit einer 25 µl Hamilton-Spritze einspritzen, 1 Min. warten. Schreiberbewegung jeweils beobachten. Hierbei wird die Handhabung der Messkammer, der N 2 -Begasung, des Schreibers und der Hamilton-Spritze vertraut gemacht, und die Reaktion der Elektrode auf O 2 demonstriert. Es wird auch festgestellt, welcher Druck für eine wirkungsvolle Begasung notwendig ist. Spülvorgang (sehr wichtig!) Die Hill-Reaktion und ihre Abhängigkeit von und Beeinflussung durch verschiedener Parameter werden in Messreihen untersucht (s. Folgendes). Dabei ist zu beachten: - Die Küvette sollte zwischen den einzelnen Messreihen mindestens 5 x mit Aqua bidest gespült werden; der Verschlussdeckel und die Belüftungshahn müssen ebenfalls gespült werden. Die Hamiltonspritze muss 5 x sofort nach jeder Verwendung mit Aqua bidest gespült werden. - Nach Verwendung von DCMU sollte die Küvette, der Deckel, der Hahn und die Spritze jeweils zuerst mit Äthanol gespült werden, und anschließend mindestens 6 x mit Aqua bidest. - wenn die nächste Messreihe nicht sofort angesetzt wird, muss die Küvette mit Aqua bidest. gefüllt stehen gelassen werden! 19

21 Modul Bioenergetik Transkriptanalyse Die Messreihen Die Hill-Reaktion, ihre Abhängigkeit von Licht und Elektronenakzeptoren, und ihre Beeinflussung durch die Photophosphorylierung, NH 4 Cl und DCMU werden in 4 Messreihen untersucht. Dabei werden Änderungen in der O 2 -Konzentration der Küvettenflüssigkeit durch Aufzeichnungen mittels eines Schreibers laufend festgehalten (die Relation des Schreiberausschlags zu der O 2 -Konzentration wird anschließend bei der "Eichung der O 2 -Elektrode" ermittelt). Die Schreiberaufzeichnungen sind die Messergebnisse der Versuche im unmittelbaren Sinne, aus denen alle O 2 -Entwicklungsphänomene ersichtlich werden, und sie stellen die Grundlage für alle Berechnungen von O 2 -Entwicklungsraten dar. Als solche müssen sie zur Wiedergabe im Versuchs-Protokoll aufgehoben und vollständig beschriftet werden. Bei den Arbeiten zu den verschiedenen Messreihen sollen mit Bleistift am laufenden Schreiberpapier die Zeitpunkte und wesentliche Informationen zu den verschiedenen Behandlungen markiert werden. Nach Beendung der Messungen sollen diese vorläufige Markierungen sauber, vollständig und gut leserlich auf dem Schreiberpapier nachgearbeitet werden. Messreihe 1 1. Küvette leersaugen und mit Mikroliterpipetten beschicken mit: Aqua bidest: 1,12 ml Puffer C: 0,2 ml MgCl 2 : 0,05 ml Kalium-Ferricyanid: 0,01 ml 2. Mit N 2 begasen: bis die Basislinie (fast) erreicht ist (wie in dem "Vorversuch") µl Thylakoidsuspension mit einer Mikroliterpipette zugeben, Messkammer möglichst zügig verschließen und abdunkeln. Warten, bis sich ein konstant verlaufendes Messsignal sich einstellt (1-2 Min.). 4. Lampen anschalten: Die Reaktion (die Veränderung des Messsignals) verfolgen, bis sie eindeutig konstant ist (der Schreiber soll auf ca. 1/3 der Höhe des Schreiberpapiers steigen). 5. Licht ausschalten für 2 Min., 6. danach erneut belichten: Die Reaktion verfolgen, bis der Schreiber auf ca. 2/3 der Höhe des Schreiberpapiers gestiegen ist µl NH4Cl mit der Hamilton-Spritze einspritzen: Die Reaktion verfolgen, bis der Schreiber bis ans Ende des Schreiberpapiers gelangt. 8. Küvette leersaugen und spülen (s. "Spülvorgang"). Messreihe 2 1. Küvette leersaugen und mit Mikroliterpipetten beschicken mit: Aqua bidest: 1,12 ml Puffer C: 0,2 ml MgCl 2 : 0,05 ml 2. Mit N 2 begasen: bis die Basislinie (fast) erreicht ist. 20

22 Modul Bioenergetik Transkriptanalyse µl Thylakoidsuspension mit einer Mikroliterpipette zugeben, Messkammer nach 15 Sek. verschließen und abdunkeln, Warten, bis sich ein konstant verlaufendes Messsignal einstellt (1-2 Min.). 4. Lampen anschalten: Die Reaktion verfolgen, bis sie eindeutig konstant ist. Die konstant verlaufende Reaktion soll ca. 2 Min. anhalten µl Kalium-Ferricyanid-Lösung mit der Hamilton-Spritze einspritzen: Die Reaktion verfolgen, bis sie eindeutig konstant ist (der Schreiber soll auf ca. 1/3 der Höhe des Schreiberpapiers steigen). 6. Licht ausschalten für 2 Min., danach erneut belichten: Die Reaktion verfolgen, bis der Schreiber auf ca. 2/3 der Höhe des Schreiberpapiers gestiegen ist µl NH 4 Cl mit der Hamilton-Spritze zugeben: Die Reaktion verfolgen, bis der Schreiber ans Ende des Schreiberpapiers gelangt. 8. Küvette leersaugen und spülen. Messreihe 3 1. Küvette leersaugen und mit Mikroliterpipetten beschicken mit: Aqua bidest: 1,12 ml Puffer C: 0,2 ml MgCl 2 : 0,05 ml Kalium-Ferricyanid: 0,01 ml K 2 HPO 4 0,05 ml ADP (10 mm) 2,5 µl 2. Mit N 2 begasen: bis die Basislinie (fast) erreicht ist µl Thylakoidsuspension mit einer Mikroliterpipette zugeben, Messkammer verschließen und abdunkeln, Warten, bis ein konstant verlaufendes Messsignal sich einstellt (1-2 Min.). 4. Lampen anschalten: Eine konstant verlaufende Reaktion stellt sich ein: nach kurzer Zeit ändert sich die Stärke des Signals, das dann einen neuen, konstant verlaufenden Wert annimmt. Warten, bis der zweite konstante Wert sich eindeutig eingestellt hat, und der Schreiber auf ca. 1/3 der Höhe des Schreiberpapiers erreicht hat. 5. 2,5 µl ADP (10 mm) mit der Hamilton-Spritze einspritzen: Wie bei 4. stellen sich hintereinander zwei konstant verlaufenden Reaktionen ein. Warten, bis der zweite konstante Wert sich eindeutig eingestellt hat, und der Schreiber sich auf ca. 2/3 der Höhe des Schreiberpapiers befindet µl NH4Cl mit der Hamilton-Spritze zugeben: Reaktion verfolgen, bis der Schreiber ans Ende des Schreiberpapiers gelangt. 7. Küvette leersaugen und spülen. Messreihe 4 1. Küvette leersaugen und mit Mikroliterpipetten beschicken mit: Aqua bidest: 1,12 ml Puffer C: 0,2 ml MgCl 2 : 0,05 ml Kalium-Ferricyanid: 0,01 ml 2. Mit N 2 begasen: 21

23 Modul Bioenergetik Transkriptanalyse bis die Basislinie (fast) erreicht ist µl Thylakoidsuspension mit einer Mikroliterpipette zugeben, Messkammer zügig verschließen und abdunkeln, Warten, bis ein konstant verlaufender Messsignal sich einstellt (1-2 Min.). 4. Lampen anschalten: Die Reaktion verfolgen, bis sie eindeutig konstant ist (der Schreiber soll auf ca. 1/3 der Höhe des Schreiberpapiers steigen) µl NH 4 Cl mit der Hamilton-Spritze zugeben: Die Reaktion verfolgen, bis der Schreiber auf ca. 2/3 der Höhe des Schreiberpapiers gelangt µl DCMU mit der Hamilton-Spritze zugeben: Die nachfolgende, mehrphasige Reaktion verfolgen, bis während eines Zeitraums von mindestens 2 Min. keine Änderung im Verlauf des Messsignals mehr erfolgt. 7. Küvette leersaugen und spülen: Beachten, dass nach DCMU-Zugabe die Küvette und die Hamilton-Spritze auch mit Ethanol gespült werden müssen (s. "Spülvorgang"). Die Eichung der Sauerstoff-Elektrode 1. Küvette leersaugen und mit einer Mikroliterpipette mit 1,4 ml Aqua bidest beschicken. 2. Mit N 2 begasen: bis die Basislinie (fast) erreicht ist. 3. Messkammer verschließen: Warten, bis das Messsignal konstant bleibt µl luftgesättigtes Wasser (17 o C) mit einer 250 µl Hamilton-Spritze einspritzen: Das Messsignal verstärkt sich: warten, bis es wieder einen konstanten Wert angenommen hat (1-2 Min.). Anschließend erneut 2 x je 100 µl des luftgesättigten Wassers einspritzen: Jeweils wieder warten, bis das sich verstärkende Signal einen konstanten Wert angenommen hat. Die Aufzeichnung des Signals während der Eichung sieht somit folgendermaßen aus: 22

24 Modul Bioenergetik Transkriptanalyse 1 ml luftgesättigtes Wasser enthält bei 17 o C und 1 atm 0,29 µmol O 2. Der Schreiberausschlag ist proportional der Konzentrationsänderung in der Küvette. Berechnung von O2-Entwicklungsraten Auf den fertig beschrifteten Schreiberpapieren werden alle konstant verlaufenden O 2 - Reaktionen durch das Anliegen eines Lineals nachgezeichnet. Entsprechend diesen Geraden werden dann die jeweiligen Steigungen ermittelt (Skalenanteile des Schreiberpapiers oder Millimeter pro Zeiteinheit). Anhand der Steigungswerte und des ermittelten Faktors für die Relation Schreiberausschlag/O 2 -Konzentration wird die O 2 -Entwicklung in der Küvette als µmol O 2 entwickelt (bzw. verbraucht) pro Minute und ml Küvettenvolumen berechnet. Unter Berücksichtigung der Konzentration an Chlorophyll in der Küvette wird schließlich die O 2 - Entwicklungsrate als µmol O 2. mg Chlorophyll -1. Stunde -1 ausgedrückt. Anfertigung des Versuchsprotokolls Die Darlegung der Fragestellungen zu dem Versuch, eine übersichtsmäßige Beschreibung der angewandten Methoden und die Präsentation und die Diskussion der Messergebnisse werden in einem Versuchsprotokoll dokumentiert. Eine Anleitung zur Anfertigung des Protokolls ist in einer gesonderten Anlage zu finden. 23