Immunzytochemie/Apoptose PRAKTIKUM BIOCHEMIE III/BIOLOGEN-F. Induktion von Apoptose Zellkultur Durchflußzytometrie Immunpräzipitation

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1 Immunzytochemie/Apoptose PRAKTIKUM BIOCHEMIE III/BIOLOGEN-F Induktion von Apoptose Zellkultur Durchflußzytometrie Immunpräzipitation Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Fachbereich Chemie Universität Hamburg 2001

2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Apoptose Tumor-Nekrose Faktor (TNF) Ziel des Praktikums 5 2. Versuche Zellzählung und durchflußzytometrischer Nachweis von TNFRI und TNFRII auf U937-Zellen Zellzahlbestimmung Durchflußzytometrie Immunzytometrie Induktion von Apoptose durch TNF Kultivierung von U937-Zellen unter Zusatz von TNFα und Cycloheximid Zellfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Hoechst Annexin V-FITC zur Detektion apoptotischer Zellen Nachweis einer DNA-Leiter Isolierung der DNA Detektion der DNA-Leiter im Agarosegel Isolierung des TNFRI mittels Immunpräzipitation Herstellung von U937-Zellextrakten Immunpräzipitation Überprüfung der Reinheit des isolierten Membranrezeptors durch SDS-PAGE Grundlagen der SDS-Polyacrylamid Gelelktrophorese Multi-Cast -Gießstand Zusammenbau des Gießstandes Gießen der Gele Elektrophorese Färben mit Silbernitrat Trocknen von Gelen Western-Blot und Immunodetektion Elektrophorese Elektrophoretischer Transfer Färben mit Amidoschwarz Immunprinting der Membran mit einem spezifischen Antikörper gegen TNFRI Anzusetzende Lösungen und deren spätere Entsorgung Arbeitsplan 39 2

3 1. Einleitung 1.1. Apoptose In höheren Organismen kann der Zelltod in zwei prinzipiell unterschiedlichen Formen auftreten: Apoptose und Nekrose. Bei der Apoptose, die auch als programmierter Zelltod bezeichnet wird, wird von der Zelle selbst ein genetisches Programm aktiviert. Dieses führt über eine bestimmte Folge von Ereignissen zum Tod der Zelle. Dabei treten charakteristische morphologische und biochemische Veränderungen auf wie die Kondensation des Zellkerns und des Cytoplasmas sowie die Ausstülpung und Abschnürung von Bläschen an der Cytoplasmamembran, sog. apoptotic bodies, in die die Zelle schließlich zerfällt (siehe Abbildung). Die Fragmente werden dann von Makrophagen oder benachbarten Zellen phagozytiert, so daß Entzündungsreaktionen verhindert werden. Derartige Entzündungsprozesse sind typisch für das pathologisch bedingte Absterben von Zellen, der Nekrose. Bei der Nekrose gehen Gewebe infolge einer mechanischen Verletzung oder einer anderen irreperablen Schädigung zugrunde. Dem Zusammenbruch der Membranintegrität und Ionenhomöostase bei der Nekrose steht bei der Apoptose als typisches Ereignis die enzymatische Fragmentierung der nukleären DNA durch calciumabhängige Endonukleasen gegenüber (siehe 2.5). Die Apoptose geht mit charakteristischen Veränderungen wie Chromatinkondensation und Bläschenbildung einher. Die Apoptose ist ein normaler physiologischer Vorgang, der bei vielen biologischen Prozessen, wie z. B. der Embryogenese, in stark zell-erneuernden Organen aber auch 3

4 bei zytotoxisch, immunologischen Reaktionen eine fundamentale Rolle spielt. Disregulationen der Apoptose können in eine Reihe unterschiedlichster Krankheitsbilder münden. Krankheiten, bei denen eine gesteigerte Apoptose auftritt sind z.b. AIDS, neurodegenerative Erkrankungen und ischämische Erkrankungen. Krankheiten, bei denen eine Hemmung der Apoptose eine Rolle spielt, sind z.b. Krebs, Autoimmunerkrankungen und Virusinfektionen. Die Apoptoseanschaltung einer Zelle resultiert aus einem komplexen Wechselspiel von apoptose-induzierenden und apoptose-supprimierenden intrazellulären Signalen. Dabei kristallisiert sich immer mehr heraus, daß im Anschluß an das Auftreten eines apoptoseinduzierenden Signals meist erst noch mehrere Apoptose checkpoints durchlaufen werden müssen, an denen der programmierte Zelltod noch unterdrückt werden kann (siehe Abbildung). INDUKTION DNA Damage Zellulärer Stress Granzymes Bcl-2/Bax Bcl-X L p53 Bax/Bax Bcl-X S Rezeptoren (z.b. TNF-R, Fas) Glucocorticoide, Ceramid EXEKUTION Caspasen (Asp-spez. Proteasen) PARP Topoisomerase I Endonuclease Homo- und Heteroaktivierung Signal Sensor Chromatin Kondensation DNA Degradierung Zelltod Regulator Transducer Überblick über die genetischen und biochemischen Kaskaden der Apoptose-Induktion und -Suppression (nach Abastado, J.-P. 1996). 4

5 1.2. Tumor-Nekrose Faktor (TNF) Initiale Schritte auf dem Weg zur Apoptose können die Stimulation von bekannten Membran- und Kernrezeptoren oder der Entzug von Liganden sein, deren kontinuierliche Rezeptorstimulation erst das Überleben davon abhängiger Zellen sichert. Bekannte Rezeptoren, über die Apoptose induziert werden kann, sind der APO-1/ Fas/CD95- Rezeptor und der TNF-Rezeptor. Die Induktion erfolgt hier durch den Fas-Liganden bzw. durch TNFα. Der Tumor-Nekrose-Faktor gehört zu einer Familie von sog. Cytokinen, einer Gruppe von Polypeptid-Mediatoren, die als Mittlersubstanzen Signale von einer Zelle zur anderen übertragen. Die biologische Aktivität von TNFα wird über einen Rezeptor vermittelt, an den auch TNFβ bindet. Zwei Rezeptoren existieren für TNF: einer, TNFRI (TNF-R55) findet sich auf einer Vielzahl von Zellen, der andere TNFRII (TNF-R75) ist auf lymphoide und myeloide Zellen beschränkt. Neben den membranständigen Rezeptoren konnten im Plasma und im Urin gelöste TNF-bindende Proteine nachgewiesen werden, die wahrscheinlich die Aktivität von TNFα modulieren. Literatur: Wyllie, A.H. et al. (1980). Cell death: the significance of apoptosis. Int. Rev. Cytol. 68, Abastado, J.-P. (1996). Apoptosis: function and regulation of cell death. Res. Immunol. 147, Ziel des Praktikums Im Rahmen dieses zweiwöchigen Praktikums werden zellbiologische wie auch proteinbiochemische Techniken vermittelt. Hauptthema ist die Apoptose, der sogenannte programmierte Zelltod. Die TNF-vermittelte Apoptose dient hierbei als Modellsystem. In dem proteinbiochemischen Teil wird der TNF-Rezeptor aus Zellextrakten durch Immunpräzipitation isoliert. Der Nachweis erfolgt durch SDS-PAGE und im Immunoblot mittels spezifischer Antikörper. 5

6 2. Versuche 2.1. Zellzählung und durchflußzytometrischer Nachweis von TNFRI und TNFRII auf U937-Zellen Im folgenden Versuch sollen die TNF-Rezeptoren I+II auf der Oberfläche von U937- Zellen nachgewiesen werden. Die U937-Zellinie entstammt einem histiocytischen Lymphom und zeigt monozytenähnliche Charakteristika. Warnung! Obwohl für den Umgang mit der Tumorzellinie U937 keine besonderen Sicherheitsrisiken bekannt sind, sollte beim Umgang mit biologischen Materialien immer besonders sorgfältig und mit ausreichender Schutzausstattung (Handschuhe, Kittel) gearbeitet werden! Anzusetzende Lösungen DPBS-PUFFER (5x) 1000 ml ( = isotonischer Phosphatpuffer nach Dulbecco) 137 mm NaCl 2,7 mm KCl 6,5 mm Na 2 PO 4 1,5 mm KH 2 PO 4, ph 7,4 Die Molaritäten beziehen sich auf DPBS (1x), der durch Verdünnung des 5fach konzentrierten DPBS hergestellt wird. 40,07 g NaCl 1,01 g KCl 5,80 g Na 2 HPO 4 _2 H 2 O 1,02 g KH 2 PO 4 In 1000 ml H 2 O lösen. Der ph-wert sollte ohne Korrektur bei 7,4 liegen! GDPBS-Puffer DPBS (1x) mit 0,1% (w/v) Gelatine Die Gelatine wird unter vorsichtigem Erhitzen gelöst. Hinweis!! Alle Lösungen und Puffer werden jeweils nur einmal in der angegebenen Menge für die ganze Gruppe hergestellt! 6

7 Zellzahlbestimmung Vom Praktikumsbetreuer wird eine Zellsuspension der U937-Zellinie zur Verfügung gestellt. Die Zellzahl wird durch Zellzählung in einer Neubauer-Zählkammer ermittelt und die Zellzahl auf eine Konzentration von 1 x 10 7 Zellen/ml eingestellt. Durch Zugabe von Trypanblau läßt sich zusätzlich die Vitalität der Zellen abschätzen. Trypanblau ist ein Farbstoff, der die Plasmamembran lebender Zellen nicht durchqueren kann, jedoch das Cytoplasma toter Zellen blau färbt. Die Oberfläche der Zählkammer ist durch eingravierte Linien in ein feines Raster unterteilt (siehe Abbildung). Legt man auf diese zentrale Fläche ein Deckglas, so beträgt der Abstand zwischen der Unterseite dieses Glases und der Oberfläche des Objekträgers genau 0,1 mm. Jedes der fünf Quadrate (in den vier Ecken und im Zentrum des Rasters) hat eine Fläche von 1 mm 2. Es berechnet sich ein Volumen von 0,1 µl über jedem dieser Quadrate. a) Das Raster einer Zählkammer nach Neubauer. b) Vergrößerung eines der 25 zentralen, kleinen Quadrate. Man erkennt, welche Zellen gezählt (o) und welche ignoriert ( ) werden sollen. (aus Kultur tierischer Zellen, Spektrum-Verlag 1994). Durchführung: Es werden 10 µl der Zellsuspension mit 10 µl einer 0,5% (w/v) Trypanblaulösung gemischt und kurz bei Raumtemperatur inkubiert. 10 µl dieser Mischung werden mit einer Pipette vorsichtig am Rand des Deckglases auf den zentralen, die Zählkammer umfassenden Teil des Objektträgers aufgebracht. Kapillarkräfte ziehen dann die Probe sofort in den Spalt. 7

8 Die Zellzahl wird in den vier Großquadraten (A-D) ermittelt und je Milliliter nach folgender Formel berechnet: (Zellzahl : 4) x 2 (bei Trypanblaufärbung) x 10 4 Der Anteil der blau gefärbten Zellen wird gesondert gezählt und der Prozentsatz der toten Zellen bestimmt. Die Zellsupension soll nun auf eine Konzentration von 1 x 10 7 Zellen/ml eingestellt werden. Dazu wird die Gesamtmenge der Zellsuspension bei 1000 U/min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet mit der berechneten Menge an GDPBS-Puffer supendiert Durchflußzytometrie Die Durchflußzytometrie ist eine Methode zur Analyse von Einzelzellen in Suspension auf der Grundlage von Fluoreszenz- und Streulichteigenschaften. Ein Durchflußzytometer erlaubt die simultane Messung der relativen Zellgröße, der Granularität sowie zwei bis drei verschiedener Fluoreszenzfarben für mehrere tausend Einzelzellen in wenigen Sekunden. Zur Analyse wird die in einem Probenröhrchen vorgegebene Zellsuspension über eine Stahlkapillare durch Überdruck in die Meßküvette eingeführt. Beim Eintreten in die Meßkammer werden die Zellen durch die sie umgebende Trägerflüssigkeit (isotone Salzlösung) stark beschleunigt, es kommt zur Auftrennung von kleineren Zellaggregaten und zur Hintereinanderreihung der Zellen (hydrodynamische Fokussierung). Am Analysepunkt trifft der fokussierte Lichtstrahl (Laser) für den Bruchteil einer Sekunde auf die durchströmende Zelle, und die entstehenden Streulicht- und Fluoreszenzsignale werden mittels Spiegel- und Filtersysteme auf die verschiedenen Fotoverstärker geleitet. Für die Messungen steht ein FACScan der Firma Becton Dickinson zur Verfügung. Die Anregungswellenlänge des luftgekühlten Argon-Lasers beträgt 488 nm. Durchführung: 500 µl der Zellsuspension (5 x 10 6 Zellen) werden 5 min zentrifugiert (2500 U/min) und das Pellet mit 500 µl eiskaltem Methanol suspendiert. Die Inkubation erfolgt für 15 min im Eisbad. Die Zellsuspension wird anschließend zentrifugiert (5 min, 2500 U/min, 500xg Eppendorfzentrifuge) und das Pellet wird wiederum in 500 µl GDPBS suspendiert. 8

9 Es werden vier Eppendorf-Tubes beschriftet und mit je 100 µl Zellsuspension (5 x 10 5 Zellen) gefüllt. Nachfolgend werden die Antikörper-Lösungen hinzupipettiert. Pipettierschema: 1) 5x10 5 Zellen/100 µl + 10 µl GDPBS-Puffer 2) 5x10 5 Zellen/100 µl + 10 µl anti-tnfri (Ziege anti Human) 3) 5x10 5 Zellen/100 µl + 10 µl GDPBS-Puffer 4) 5x10 5 Zellen/100 µl + 10 µl anti-tnfrii (Ratte anti Human), 1:10 verdünnt mit GDPBS Es wird anschließend für 30 min im Eisbad inkubiert. Die Zellen werden durch Zugabe von 500 µl GDPBS-Puffer gewaschen und 5 min bei 2500 U/min in der Eppendorfzentrifuge zentrifugiert. Die Überstände werden abpipettiert und die Zellpellets in den jeweiligen Verdünnungen der sekundären Antikörper suspendiert. 1) µl anti-ziege FITC, 1:50 verdünnt mit GDPBS 2) µl anti-ziege FITC, 1:50 verdünnt mit GDPBS 3) µl anti-ratte FITC, 1:50 verdünnt mit GDPBS 4) µl anti-ratte FITC, 1:50 verdünnt mit GDPBS Es wird anschließend für 30 min im Eisbad inkubiert. Die Zellen werden durch Zugabe von 500 µl GDPBS-Puffer gewaschen und 5 min bei 2500 U/min zentrifugiert. Die Überstände werden verworfen, die Zellpellets in 500 µl GDPBS-Puffer suspendiert und in die FACScan Probenröhrchen überführt. Die Proben können nun am Durchflußzytometer analysiert werden. 9

10 2.2. Immunzytometrie In diesem Versuch soll der TNFRI an immobilisierten U937-Zellen nachgewiesen werden. Die Auswertung der gefärbten Zellen wird am Fluoreszenzmikroskop durchgeführt. Durchführung: Jede Gruppe erhält zwei Objektträger mit bereits immobilisierten und fixierten U937- Zellen. Die Objektträger werden in ein Becherglas oder eine Küvette mit DPBS- Puffer gestellt und 5 min rehydriert. Die Objektträger sollen anschließend kurz auf Filterpapier abtropfen, sie dürfen aber nicht austrocknen! Auf beiden Objektträgern sind kreisförmige Areale mit einem Silikonstift begrenzt worden. Auf diese Areale wird nun der Puffer (bei der Kontrolle) bzw. die Antikörper- Lösung pipettiert. Die Objektträger werden entsprechend beschriftet! 1) µl GDPBS-Puffer 2) µl anti-tnfri (Ziege anti Human) 1:5 verdünnt mit GDPBS-Puffer Die Inkubation erfolgt in einer feuchten Kammer für 60 min bei Raumtemperatur. Die Objektträger werden anschließend dreimal mit DPBS-Puffer gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt sollen sie wiederum kurz abtropfen. Beide Objektträger werden nun mit je 100 µl der 1:50 verdünnten Lösung des sekundären Antikörpers, anti-ziege FITC-konjugiert, inkubiert. Die Inkubation erfolgt in einer feuchten Kammer für 60 min bei Raumtemperatur. Die feuchte Kammer sollte im Dunkeln stehen, um den Fluoreszenzfarbstoff vor Lichteinstrahlung zu schützen. Nach dreimaligem Waschen mit DPBS-Puffer werden die Objektträger zum Trocknen gestellt und mit einem Eindeckmittel (Permafluor) überschichtet. Nach dem Trocknen werden die Präparate im Fluoreszenzmikroskop betrachtet und die Beobachtungen dokumentiert. 10

11 2.3. Induktion von Apoptose durch TNF Ziel dieses Versuches ist die Induktion der Apoptose durch TNFα über TNFRI. Die Induktion der Apoptose wird durch gleichzeitige Inkubation mit Cycloheximid beschleunigt und verstärkt. Cycloheximid ist ein Antibiotikum aus Streptomyces griseus, das die Proteinsynthese der 80S-Ribosomen eukaryotischer Zellen hemmt. Literatur: Galea-Lauri, J. et al. (1996). Increased heat shock protein 90 (hsp90) expression leads to increased apoptosis in the monoblastoid cell line U937 following induction with TNFα and cycloheximide. J. Immunol. 157, Kultivierung von U937-Zellen unter Zusatz von TNF und Cycloheximid Achtung! Für diese Versuche steht keine sterile Werkbank zur Verfügung! Sorgfältiges Arbeiten und die Verwendung steriler Gefäße und Pipettenspitzen ist dringend erforderlich! Zwei kleine Petrischalen werden bereitgestellt und mit je 1 ml RPMI-1640 Medium gefüllt. Anschließend werden 100 µl der ausgeteilten Zellsuspension (1x10 7 Zellen/ml) hinzupipettiert. Die Zellsuspension in einer Petrischale wird mit 2 µl TNFα (= 20 ng) und 2 µl Cycloheximid (2 µg) versetzt. Die andere Petrischale bleibt als Kontrolle ohne Zusatz. Die Zellen werden mindestens zwei Stunden bei 37 C inkubiert. Die morphologischen Veränderungen werden unter dem Mikroskop beobachtet Zellfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Hoechst Apoptotisch bedingte Chromatinverdichtungen und -fragmentationen können durch Anfärbung mit Fluoreszenzfarbstoffen nachgewiesen werden. Besonders geeignet ist der Bisbenzimidazol-Farbstoff Hoechst Er lagert sich selektiv in die kleine Gruppe A/T-reicher Regionen von B-DNA ein. Es findet jedoch keine Interkalation in die DNA- Doppelhelix statt. Der Farbstoff führt zu einer blauen Fluoreszenz und kann sowohl aktiv wie auch passiv in die Zelle aufgenommen werden. Propidiumjodid ist hingegen ein Farbstoff, der passiv durch geschädigte Membranen in die Zelle dringt und in die DNA interkaliert. 11

12 Durchführung: Jede Gruppe erhält vom Assistenten zwei kleine Petrischalen. In der einen Schale befinden sich unbehandelte U937-Zellen als Kontrolle, die andere enthält deutlich apoptotische U937-Zellen nach dreistündiger Inkubation mit TNFα. Die Zellsuspensionen werden in je ein Eppendorftube überführt und 5 min bei 2500 U/min in einer Eppendorfzentrifuge abzentrifugiert. Die Zellpellets werden in 500 µl DPBS-Puffer suspendiert und erneut unter gleichen Bedingungen zentrifugiert. Eine 5 mm Stammlösung des Hoechst Farbstoffes wird vom Assistenten zur Verfügung gestellt. Es werden 250 µl einer 1:10 mit DPBS-Puffer verdünnten Lösung hergestellt. Die Überstände werden nach der Zentrifugation verworfen und die Zellpellets in je 200 µl DPBS-Puffer suspendiert. Je 100 µl werden in je ein neues Tube überführt (Beschriftung nicht vergessen!) und auf Eis gestellt. Die restlichen 100 µl der Proben werden mit je 100 µl der verdünnten Farbstofflösung versetzt und 10 min auf Eis inkubiert. Durch Zugabe von 500 µl DPBS-Puffer und nachfolgende Zentrifugation (s.o.) werden die Zellen gewaschen. Die Pellets werden nachfolgend wiederum in 100 µl DPBS-Puffer suspendiert. Sowohl die ungefärbten als auch die Hoechst-gefärbten Zellen werden unter dem Mikroskop (Hellfeld- bzw. Fluoreszenz-Mikroskopie) betrachtet. Die Morphologie der Zellen wie auch die unterschiedlichen Stadien der Chromatinverdichtung sollen durch Skizzen dokumentiert werden. 12

13 2.4. Annexin V-FITC zur Detektion apoptotischer Zellen Veränderungen in der Plasmamembran sind eines der ersten Anzeichen apoptotischer Prozesse. Dabei kommt es zur Translokation des Phospholipids Phosphatidylserin vom inneren zum äußeren Layer (siehe Abbildung). Annexin V ist ein Ca 2+- abhängiges, phopsholipid-bindendes Protein mit einer hohen Affinität zu Phosphatidylserin. Darum ist Annexin V besonders gut geeignet, um apoptotische Zellen zu identifizieren, die bereits Phopshatidylserin an der äußeren Membran präsentieren. Unter Verwendung von Propidiumjodid und FITC-konjugiertem Annexin V können apoptotische Zellen (propidiumjodid-negativ) von nekrotischen bzw. bereits toten Zellen (propidiumjodid-positiv) unterschieden werden. Da Phosphatidylserin schon externalisiert wird, bevor DNA- Strangbrüche entstehen, ist Annexin V-FITC ein hervorragender Marker, um frühe Stadien der Apoptose zu erfassen. Literatur: Vermes, I. et al. (1995). A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phopshatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol Meth. 184, Annexin V-FITC Konjugat Plasma Membran Apoptose Translokation von Phosphatidylserin Cytoplasma Cytoplasma Darstellung des Prinzips des Annexin V Apoptose Assays. Detektion von Phosphatidylserin an der äußeren Plasmamembran nach Apoptose-Induktion. 13

14 Anzusetzende Lösungen Bindungs-Puffer (1x) 500 ml 10 mm HEPES ph 7,4 (ph-wert mit NaOH einstellen) 150 mm NaCl 5 mm KCl 1 mm MgCl 2 1,8 mm CaCl 2 1,19 g HEPES 4,35 g NaCl 0,19 g KCl 0,05 g MgCl 2 0,10 g CaCl 2 Die Substanzen lösen, den ph-wert auf 7,4 einstellen und auf 500 ml mit dh 2 O auffüllen. Durchführung: Jede Gruppe erhält vom Assistenten drei kleine Petrischalen mit je 1 x 10 6 Zellen. In der einen Schale befinden sich unbehandelte U937-Zellen als Kontrolle, die anderen enthalten behandelte U937-Zellen. a) 2 µl TNFα (= 20 ng) und 2 µl Cycloheximid (2 µg), 2 Stunden Inkubation b) 2 µl TNFα (= 20 ng) und 2 µl Cycloheximid (2 µg), 4 Stunden Inkubation Die Zellsuspensionen werden in je ein Eppendorftube überführt und 5 min bei 2500 U/min in einer Eppendorfzentrifuge abzentrifugiert. Die Zellen werden zweimal mit je 500 µl eiskaltem DPBS-Puffer gewaschen und die Zellpellets anschließend in 1 ml Bindungs-Puffer suspendiert. Es werden 6 Eppendorf-Tubes bereitgestellt, beschriftet und die Zellen nach folgendem Schema pipettiert. Die Reagenzien entstammen einem Kit der Firma Genzyme ( ). Pipettierschema: 1) 100 µl Kontroll-Zellen (ungefärbt) 2) 100 µl Kontroll-Zellen + 5 µl Annexin V-FITC + 3) 100 µl Kontroll-Zellen + 10 µl PI* 4) 100 µl Kontroll-Zellen + 5 µl Annexin V-FITC + 10 µl PI 5) 100 µl U937 (nach 2h Inkubation) + 5 µl Annexin V-FITC + 10 µl PI 6) 100 µl U937 (nach 4 h Inkubation) + 5 µl Annexin V-FITC + 10 µl PI *PI = Propidiumjodid-Stammlösung (50 µg/ml); wird zur Verfügung gestellt. 14

15 Warnung! Propidiumjodid ist hochgiftig! Beim Arbeiten mit Propidiumjodid sind immer Schutzhandschuhe und eine geeignete Schutzkleidung (Kittel) zu tragen! Die Zellen werden 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Es werden je 300 µl Bindungs-Puffer zugegeben und die Proben innerhalb von 1 Stunde im Durchflußzytometer analysiert Nachweis einer DNA-Leiter Charakteristisch für die meisten apoptotischen Prozesse ist auch die mit der Chromatinveränderung einhergehende Degradierung der DNA durch eine oder mehrere zelluläre, calcium-abhängige Endonukleasen. Die DNA wird dabei in den Linker-Regionen zwischen den Nucleosomen gespalten. Dadurch entstehen charakteristische, ca. 200bp lange Fragmente aus DNA und Histon-Proteinen. Diese oligonucleosomalen Fragmente werden nach Auftrennung im Agarosegel in der Regel als typische DNA-Leiter sichtbar (siehe Abbildung). Zeitabhängige Entstehung einer DNA-Leiter nach Inkubation mit anti-fas Antikörper. Die DNA- Extraktion erfolgte nach 15, 30 und 60 min. (Abbildung aus Enari et al., 1995) Literatur: Enari, M. et al. (1995). Apoptosis by a cytosolic extract from Fas-activated cells. EMBO J.14,

16 Rosl, F. A simple and rapid method for detection of apoptosis in human cells (1992). Nucleic Acid Research 20, Oberhammer, F. et al. (1993). Apoptotic death in epithelial cells: cleavage of DNA to 300 and /or 50 kb fragments prior to or in the absence of internucleosomal fragmentation. EMBO J. 12, Anzusetzende Lösungen Digestion-Puffer (1x) 10 ml 100mM NaCl 10 mm Tris-HCl 25 mm EDTA, ph 8,0 0,5% (w/v) SDS TAE-Puffer (50x) 200 ml 2 M Tris/Acetate, ph 8,5 50 mm EDTA 48,4 g Tris basisch 11,4 ml Eisessig 20,0 ml 0,5 M EDTA (ph 8,0) Nach dem Lösen der Substanzen wird die Puffermenge auf 200 ml mit dh 2 O aufgefüllt. Die angesetzten Puffer werden dem Assistenten zum Autoklavieren übergeben Isolierung der DNA Durchführung: 1x107 Zellen werden über Nacht in FKS-haltigem Medium mit 2 µl TNF-alpha und 2 µl Cycloheximid in kleinen Petrischalen inkubiert. Die Kontrollzellen bleiben ohne Zusatz. Die Zellen werden in Eppendorf-Tubes überführt, die Schalen müssen gründlich mit kaltem DPBS ausgespült werden. 16

17 Die Zellen werden dann bei U/min bei 4 C für 5 min abzentrifugiert. Die Pellets werden in 750 µl kaltem DPBS resuspendiert, in 2 ml-eppendorftubes vereinigt und erneut zentrifugiert. Der Überstand wird abpipettiert und die Pellets in 500 µl Digestion Puffer aufgenommen und über Nacht bei 50 C auf dem Thermoschüttler resuspendiert. Chloroform-Phenol Extraktion (unter dem Abzug!) Chloroform (Vorsicht tropft!) und Phenol werden 1:1 gemischt (für jede Probe 2 x 600 µl einplanen), bei U/min zentrifugiert und überstehendes Wasser abgenommen. Die Zellsuspension wird mit Chloroform/Phenol versetzt, 1-2 mal vorsichtig invertiert und für 10 min bei U/min bei 4 C zentrifugiert. Die obere klare Phase enthält die DNA, sie wird in ein neues Tube überführt. Die Extraktion wird mit 1 mal mit Chloroform/Phenol, dann 1 mal mit Chloroform wiederholt. Beim letzten Abnehmen der klaren Phase wird die Flüssigkeitsmenge bestimmt Ethanol-Fällung Es wird _ Volumen Natriumacetat 3M, ph 5,2 (oder Ammoniumacetat 7,5M) zugegeben und 1-2 mal vorsichtig invertiert Danach wird ein Gesamtvolumen eiskalten abs. Ethanols in ca. 5 Einzelschritten zupipettiert und dabei wieder jeweils 1-2 mal vorsichtig invertiert. Die Fällung erfolgt über Nacht bei 20 C (mindestens 3 h). Waschen und Resuspendieren der DNA Die DNA wird 10 min bei U/min bei 4 C abzentrifugiert und das Pellet mit 500 µl eiskaltem Ethanol 70% aufgespült. Nach erneuter Zentrifugation muß das Pellet gut trocknen (Überstand vollständig abnehmen und über den Kopf stellen). Das Pellet wird dann in 100 µl ddh 2 O aufgespült und auf dem Thermoschüttler bei 37 C für ca. 4h resuspendiert. 17

18 Detektion der DNA-Leiter im Agarosegel Durchführung: Für die Auftrennung der DNA wird ein 1,5% Agarosegel (w/v) verwendet. Dazu werden 0,75 g Agarose in 50 ml TAE (1x) suspendiert und in der Mikrowelle so lange erhitzt, bis keine Partikel mehr in dem geschmolzenen Gel sichtbar sind. Wenn die Agaroselösung auf ca. 50 C abgekühlt ist, werden 10 µl Ethidiumbromid-Lösung (1 mg/ml) hinzupipettiert. Nach Durchmischung wird die Agarose in die vorbereitete Gießkammer gefüllt und der Kamm eingesetzt (10 oder 15 Taschen). Pro Gruppe werden 4 Taschen benötigt. Es sollten sich immer zwei Gruppen zusammenschließen und ein Gel mit den jeweiligen Proben beschicken. Achtung! Ethidiumbromid ist ein starkes Mutagen und gilt als hoch krebserregend. Ethidiumbromid-Einbau in zelluläre DNA führt im natürlichen Licht zu DNA- Einzelstrangbrüchen. Handschuhe, Kittel und Schutzbrille sind unbedingt zu tragen! Nach dem Erstarren wird das Gel in die Elektrophoresekammer eingesetzt. Die Kammer wird mit TAE-Puffer (1x) gefüllt bis das Gel leicht mit Puffer bedeckt ist. Der Kamm wird nun vorsichtig herausgezogen. Probenvorbereitung: Zur Quantifizierung der resuspendierten DNA werden 5 µl in 995 µl ddh 2 O verdünnt. Die Extinktionen werden gegen Wasser bei 260 nm gemessen und die Konzentration berechnet: Konzentration (µg/µl) = O.D.260 x 9,88 Durch die zusätzliche Messung bei 280 nm kann die Qualität der DNA-Extraktion bestimmt werden. Der Quotient beträgt für reine DNA 1,8. Es sollen pro Tasche etwa 4µg DNA geladen werden. Die Proben werden gegebenenfalls mit DNAse-freiem Wasser verdünnt und mit dem entsprechenden Volumen Probenpuffer (6fach, d.h. 5 Teile Probe + 1 Teil Probenpuffer) versetzt. z.b. : c = 0,2 µg/µl Verdünnung von 5 µl DNA mit 5 µl DNase-freiem Wasser, Zugabe von 2 µl Probenpuffer. Nun werden die Proben nach folgendem Schema in die Taschen pipettiert. 18

19 Pipettierschema: 1) Lamda DNA/Eco130I Standard* 6 µl 2) DNA der Kontroll-Zellen 12 µl 3) DNA nach Apoptose 12 µl 4) DNA vom Assistenten 12 µl * Der Standard setzt sich aus 11 Fragmenten mit folgenden Größen zusammen: bp, 7743 bp, 6223 bp, 4254 bp, 3472 bp, 2690 bp, 1882 bp, 1489 bp, 925 bp, 421 bp, 74 bp. Der Sicherheitsdeckel der Elektrophoresekammer wird geschlossen und eine Spannung von 100 V angelegt. Wenn der schnellere Markerfarbstoff (Bromphenolblau) das Gelende erreicht hat, wird die Elektrophorese gestoppt. Das Gel wird vorsichtig herausgenommen und auf einen UV-Transilluminator (302 nm) gelegt. Der Gesichtsschutz wird angelegt, das UV-Licht angeschaltet und das Gel dokumentiert. 19

20 2.6. Isolierung des TNFRI mittels Immunpräzipitation Herstellung von U937-Zellextrakten Um Membranproteine zu reinigen oder zu untersuchen, sollten diese zuerst in Lösung gebracht werden. Man unterscheidet zwischen integralen Membranproteinen, welche die Membran mit Transmembranhelices durchziehen und peripheren bzw. assoziierten Membranproteinen, die lose an die Membranoberfläche gebunden sind. Membranproteine sind gewöhnlich in Wasser unlöslich und neigen zur Aggregation. Sie können nur durch Detergentien in Lösung gebracht werden. Detergentien bestehen aus einem hydrophilen und einem hydrophoben Teil (siehe Abbildung). Der hydrophobe Teil besteht aus Phenylderivaten (Triton X-100), aliphatischen Ketten (Octylglucosid, Lubrol PX) oder Steroidgerüsten (Cholat, Deoxycholat, Chaps, Digitonin). Den hydrophilen Anteil bilden ionisierte Gruppen (Cholat, Deoxycholat, Chaps, SDS), Zucker (Octylglucosid, Digitonin), Hydroxylgruppen (Cholat, Deoxycholat) oder Polyethylenoxide (Triton X- 100). Die Detergentien bilden Micellen, die die hydrophoben Bereiche des Proteins gegen Wasser abschirmen (siehe Abbildung). große sphärische Mizellen Aggregationszahl 140 hydrophober Teil hydrophiler Teil schematisiert Struktur und Mizellen von Triton X-100 (aus Der Experimentator, Gustav Fischer Verlag, 1996) Detergens intakte Membran solubilisierte Proteine Detergens Solubilisierung integraler Membranproteine durch Detergenszugabe (aus L.Stryer, Spektrum-Verlag, 1990) 20

21 Anzusetzende Lösungen Extraktionspuffer 100 ml 20 mm Tris-HCl, ph 8,3 150 mm NaCl 5 mm EDTA 1% Triton X 100 0,48 g Tris 1,76 g NaCl 0,38 g EDTA In ca. 50 ml lösen, ph-wert mit HCl auf 8,3 einstellen, auffüllen auf 100 ml und Zugabe von 1 ml Triton X-100. Durchführung: Vom Praktikumsbetreuer wird eine Zellsuspension der U937-Zellinie mit einer Konzentration von 1 x 10 7 Zellen/ml ausgeteilt. Achtung! Alle Arbeitsschritte werden im Eisbad durchgeführt. Lediglich die Zentrifugationen erfolgen bei Raumtemperatur. 1 x 10 7 Zellen werden in ein Eppendorf-Tube überführt und bei 2500 U/min abzentrifugiert. Das Zellpellet wird anschließend in 500 µl kaltem DPBS-Puffer resuspendiert und wiederum zentrifugiert. Das Zellpellet wird nun in 250 µl Extraktionspuffer gründlich durch kräftiges Vortexen solubilisiert. Die unlöslichen Bestandteile werden bei 8000 U/min abzentrifugiert und der Überstand abpipettiert Immunpräzipitation Die Immunpräzipitation isoliert ein bestimmtes Antigen aus der Vielzahl der Antigene einer Lösung. Im Präzipitat bestimmt man das Antigen entweder über eine Funktion (z.b. Ligandenbindung, Enzymaktivität) oder über das Molekulargewicht in der SDS- Gelelektrophorese. Häufig wird das Antigen vor der Immunpräzipitation radioaktiv markiert und anschließend durch Autoradiographie identifiziert. Die Antigen-Antikörperkomplexe werden in der Regel mit Protein-A-Sepharose oder Protein-G-Sepharose ausgefällt. Das Präzipitat enthält Antigen, Antikörper, Protein-A- Sepharose (oder Protein-G-Sepharose) und unspezifisch adsorbiertes Protein. Der Anteil an unspezifisch adsorbiertem Protein kann verringert werden, indem bei hoher 21

22 Ionenstärke (0,15-0,4 M NaCl) oder in Gegenwart von Detergentien (z.b. 1-2% Triton X-100 oder NP-40 ) präzipitiert wird. Durchführung: 100 µl U937-Zellextrakt werden mit 100 µl Extraktionspuffer versetzt. Anschließend werden 25 µl des anti-tnfri Antikörpers hinzupipettiert und 2 Stunden auf Eis inkubiert. Als Kontrolle werden 100 µl U937-Zellextrakt mit 125 µl Extraktionspuffer versetzt und ebenfalls 2 Stunden auf Eis inkubiert. Beide Proben werden mit je 50 µl Protein A-Agarose versetzt und möglichst 12 Stunden unter leichter Rotation bei 4 C inkubiert. Die Agarose wird abzentrifugiert (Eppendorfzentrifuge, 5 min, 6000 U/min) und jeweils dreimal mit 200 µl DPBS-Puffer gewaschen. Die pelletierte Agarose wird in je 30 µl nicht reduzierenden Probenpuffer aufgenommen und 10 min auf Eis gestellt. Die Proben werden erneut bei 6000 U/min für 5 min zentrifugiert und die Überstände abpipettiert Überprüfung der Reinheit des isolierten Membranrezeptors durch SDS-PAGE Grundlagen der SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS- PAGE) Das Anfertigen von Gelelektrophoresen gehört mit zu den wichtigsten Arbeitsmethoden in der Biochemie. Mit ihrer Hilfe können Nucleinsäuren und Proteine in Abhängigkeit von Masse und Ladung aufgetrennt und nachgewiesen werden. Da die getrennten Stoffe aus dem Trenngel mobilisiert werden können, sind weitere Untersuchungen wie z.b. deren Sequenzierung oder spezifische Immunreaktionen mit den Proteinen im Anschluß an die Elektrophorese möglich und erweitern das Anwendungsspektrum dieses Verfahrens. Bei Elektrophorese-Prozessen in Polyacrylamidgelen hängt die Mobilität eines Proteins primär von seiner Größe und Gesamtladung ab. Die SDS-PAGE stellt eine Variante der einfachen Elektrophorese dar. Als Detergens denaturiert SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) die Proteine und kann über seinen unpolaren Molekülteil mit unpolaren Seitenketten der 22

23 Proteine in Wechselwirkung treten. Die assoziierten SDS-Moleküle verleihen allen Proteinen soviel Ladung, daß deren Wanderungsgeschwindigkeit und damit ihre Trennung von der Eigenladung unabhängig und ausschließlich eine Funktion der Molekülgröße wird. Eine weitere Optimierung des Systems wird durch Elektrophorese mit diskontinuierlichem ph-wert (Disk-Elektrophorese) erreicht. Eine ph-differenz zwischen Trenngel, bzw. Tankpuffer und Sammelgel um zwei Einheiten bewirkt, in Abhängigkeit der Laufeigenschaften des eingesetzten Glycinats und der in Sammelgel- und Trenngel enthaltenen Chlorid-Ionen, eine Fokussierung der Proteine im Sammelgel. Die SDS-PAGE wird gemäß der Originalmethode von Laemmli in einer Minigel- Aparatur der Firma Pharmacia (System LKB 2050 Midget Elektrophoresis System) durchgeführt. Anzusetzende Lösungen Trenngel-Puffer (4x) 100 ml 1,5 M Tris-HCl, ph 8,8 0,4 % SDS 18,15 g Tris (basisch) 0,40 g SDS In ca. 50 ml H 2 O lösen, ph-wert mit 1 N HCl einstellen, mit H 2 O auf 100 ml auffüllen, bei 4 C aufbewahren. Sammelgel-Puffer (4x) 100 ml 0,5 M Tris-HCl, ph 6,8 0,4 % SDS 6,05 g Tris (basisch) 0,40 g SDS In ca. 40 ml H 2 O lösen, ph-wert mit 1 N HCl einstellen, mit H 2 O auf 100 ml auffüllen, bei 4 C aufbewahren. TANKPUFFER (5x) 500 ml 23

24 0,125 M Tris 0,96 M Glycin 0,5 % SDS, ph 8,3 7,5 g Tris (basisch) 36,0 g Glycin 2,5 g SDS In 500 ml H 2 O lösen. Der ph-wert soll nicht mehr eingestellt werden! Proben-Puffer (2x) 25 ml 125 mm Tris-HCl 4,0 % SDS 20 % Glycerin 0,002 % Bromphenolblau, ph 6,8 0,379 g Tris (basisch) 1,0 g SDS 5,0 ml Glycerin 200 _ l Bromphenolblau (einer 0,2 % Stocklösung/20 mg in 10 ml H 2 O) Tris und SDS in ca. 10 ml H 2 O lösen, ph-wert einstellen. Zugabe von Glycerin und Bromphenolblau, mit H 2 O auf 25 ml auffüllen Der "Multi-Cast"-Gießstand In diesem Gießstand können mehrere Gele (maximal 5) derselben Konzentration in einer Dicke von 0,75 mm gleichzeitig gegossen werden. Beim Gießen einer geringeren Anzahl von Gelen wird das übrige Volumen der Kammer mit Kunststoffplatten gefüllt. Die drei roten Gummieinsätze (ein großes dreieckiges und zwei kleine halbrunde) müssen unten in die Kammer eingesetzt werden. Da durch den Spalt im großen Gummieinsatz eine Verbindung innerhalb der gesamten Kammer besteht, werden dadurch alle Gele gleichzeitig gegossen Der Zusammenbau des Gießstandes Bei allen folgenden Arbeitsschritten ist mit Handschuhen zu arbeiten! Die Glasplatten, Spacer und Aluminiumplatten werden mit 70% Ethanol entfettet. Die offene Gießkammer wird horizontal gelegt und zuerst mit den Platten zum Auffüllen des Restvolumens versehen. Anschließend werden die "Sandwiches", bestehend aus einer Aluminium- Platte, zwei Spacern und einer Glasplatte, eingesetzt. Bei den Spacern ist darauf zu achten, daß die Noppen außen liegen. Werden mehrere Sandwiches gepackt, so legt man zwischen diese Wachs-Papier, um die fertig gegossenen Gele nachher besser 24

25 voneinander trennen zu können. Ganz zum Schluß wird dann der Deckel mit 4 Klammern seitlich fixiert. Stellt man den Gießstand auf den Kopf (vorsichtig! Hand darunter halten!), so sollten die Platten nicht verrutschen Das Gießen der Gele Der Gießstand wird mit der Öffnung nach oben auf eine ebene Fläche gestellt. Zwischen die Platten wird nun ein Kamm gesteckt, die Glasplatte ca. 0,5 cm unterhalb des Kammes mit Filzstift markiert und der Kamm wieder herausgezogen. Jetzt werden die Lösungen für das Trenngel zusammenpipettiert. Zusammensetzung eines 9 % Trenngels: 9,0 ml Acrylamid-Lösung 7,5 ml Trenngel-Puffer (4x), ph 8,8 13,35 ml H 2 O 150 _ l Ammonium-Persulfat (10 %, 100 mg lösen in 1 ml H 2 O) 15 _ l TEMED (N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin) Die angegebenen Mengen sind ausreichend für 5 Gele, d.h. maximal für einen Gießstand. Achtung!! Acrylamid-Lösung ist hochgiftig! Hautkontakt sollte unbedingt vermieden werden! Beim Arbeiten mit Acrylamid ist daher immer auf geeignete Kleidung und Handschuhe zu achten! Nach der Zugabe von Persulfat und TEMED setzt die Polymerisation ein, und der Trenngel-Ansatz muß schnell mit einer Pipette (10 ml Glaspipette) bis zur Markierung in die Kammer gefüllt werden. Jedes Gel wird nun einzeln mit ca. 1 ml Wasser überschichtet, um eine glatte Oberfläche zu erhalten. Wenn das Trenngel nach ungefähr 1 Stunde auspolymerisiert ist, wird der Überstand dekantiert. Die restliche Flüssigkeit wird evtl. mit Filterpapier aufgesogen. Zusammensetzung eines 4 % Sammelgels: 25

26 2,6 ml Acrylamid-Lösung 5,0 ml Sammelgelpuffer (4x) ph 6,8 12,4 ml H 2 O 120 _ l Ammonium-Persulfat (10 %) 12 _ l TEMED Die angegebenen Mengen sind ausreichend für maximal fünf Gele. Das Sammelgel wird bis zum oberen Rand der Aluminiumoxidplatte auf das Trenngel gegeben und die entfetteten Kämme dann bis zum Anschlag in das noch flüssige Gel eingesetzt. Dabei sind Luftblasen zu vermeiden. Nach spätestens 2 Stunden ist das Sammelgel auspolymerisiert und die Kämme können vorsichtig herausgezogen werden. Die Sandwiches werden sehr vorsichtig mit einem Skalpell voneinander getrennt und anschließend gründlich von Gelresten befreit. Die sauberen Gele werden mit Wasser überschichtet und in Frischhaltefolie eingewickelt. Sie sind so mehrere Tage im Kühlschrank haltbar Die Elektrophorese Der 5fach-konzentrierte Tankpuffer wird 1:5 mit H 2 O verdünnt. Für eine Laufkammer werden 250 ml Tankpuffer (1x) benötigt. Die Taschen der Gele werden mit Tankpuffer gespült und mit Filterpapier von der restlichen Flüssigkeit befreit. Sie können nun in die Laufkammer eingesetzt werden. Jedes Sandwich wird mit 2 Klammern und der Aluminiumoxid-Platte nach hinten in der Pufferkammer befestigt. Pro Kammer können zwei Gele gleichzeitig laufengelassen werden; wird nur ein Gel benötigt, so wird auf der anderen Seite statt des Gels eine Glasplatte eingesetzt. Die Kammern werden nun mit Tankpuffer (1x) gefüllt. Die beiden oberen Kammern werden bis zum Rand der Sandwiches, die untere halbvoll mit Puffer gefüllt. Die Gele sind nun für das Auftragen der Proben vorbereitet. Je 5 _ l der verdünnten Antikörper-Lösung (anti-tnfri) wird mit 5 µl Probenpuffer (2x) versetzt. Es muß darauf geachtet werden, daß evtl. ausgefallenes SDS in dem Proben-Puffer zuvor durch leichtes Erwärmen wieder in Lösung gebracht wird. Die angesetzten Proben werden dann 5 min in einem kochenden Wasserbad behandelt. Der Standard (Bio-Rad, broad range) muß nicht vorbehandelt werden, er wird in der angegebenen Menge direkt in die Taschen des Gele pipettiert. Die Gele können nun mit den Proben beschickt werden. Zum besseren Erkennen der Taschen wird eine Schablone auf die Glasplatte aufgelegt. 26

27 Pipettierschema: Bahn 1: Bahn 2: Bahn 3: Bahn 4: Bahn 5: 5 µl broad range Standard für Silberfärbung bleibt leer 5 µl anti TNFRI-Antikörper 10 µl Immunpräzipitat Kontrolle 10 µl Immunpräzipitat Nun kann der Deckel auf die Laufkammer aufgesetzt werden und die Spannungsquelle angeschlossen werden. Die Trennung wird bei einer Spannung von 170 V und einer Stromstärke, die 15 ma pro 0,75 mm dickem Gel nicht überschreitet, durchgeführt. Achtung!! Elektrophoresen werden mit Gleichspannung durchgeführt, die noch gefährlicher ist als Wechselspannung. 170 V Gleichstrom sind absolut lebensgefährlich! Sind daher während der Elektrophorese irgendwelche Arbeiten an der Apparatur notwendig, so ist unbedingt darauf zu achten, daß die Spannungsquelle abgeschaltet ist. Die Elektrophorese ist beendet, wenn der als Referenz zugesetzte Farbstoff Bromphenolblau das untere Ende des Gels erreicht hat (60-90 min). Um die Elektrophorese zu beenden, wird zunächst die Spannungsquelle abgeschaltet! Erst wenn dies geschehen ist, kann die Elektrophoresekammer geöffnet werden. Die Klammern werden nun gelöst und die Sandwiches vorsichtig von dem Dichtungsgummi abgehoben. Die Platten werden vorsichtig voneinander getrennt, indem ein Spacer etwas herausgezogen wird und als "Hebel" eingesetzt wird. Das weitmaschige Sammelgel wird mit einem Plastikspatel (keine Metallspatel einsetzen, da die Aluminiumplatten sehr leicht verschrammen!!) entfernt. An dieser Stelle empfiehlt es sich, die Orientierung des Gels durch Abschneiden einer kleinen Ecke zu markieren. Das Gel wird nun mit einem Plastikspatel vorsichtig von der Aluminiumoxid-Platte abgezogen und in die Fixier-Lösung der Silberfärbung überführt. 27

28 Zusammensetzung des Standards (Bio-Rad broad range): Myosin d β-galaktosidase d Phosphorylase B d BSA d Ovalbumin d Carbonic anhydrase d Trypsin Inhibitor (Soja) d 2.8. Färben mit Silbernitrat Bei der Silberfärbung bildet das Ag + -Ion Komplexe mit den Glu-, Asp- und Cys-Resten der Proteine. Alkalisches Formaldehyd reduziert das Ag + der Komplexe zu Ag. Die Feinheiten dieser Reaktion sind unbekannt. Bei der Silberfärbung handelt es sich um eine sehr empfindliche Färbemethode, die sich besonders zur Darstellung kleiner Proteinmengen eignet (5-30 ng). Die Silberfärbung ist jedoch nicht quantifizierbar, da sich verschiedene Proteine mit unterschiedlicher Intensität färben Anzusetzende Lösungen Inkubationslösung ml 34,02 g Na-Acetat 3 H 2 O (= 20,52 g Na-Acetat wasserfrei) ml Ethanol, auffüllen auf 500 ml mit dh 2 O. Färbelösung 500 ml 0,5 g AgNO 3 lösen in 500 ml dh 2 O. Entwickler 500 ml 12,5 g Na 2 CO 3 in ca. 400 ml dh 2 O lösen, ph 11,5 einstellen mit Na 2 CO 3 bzw. NaHCO 3, mit dh 2 O auf 500 ml auffüllen. Stop- und Aufbewahrungslösung 500 ml 9,3 g Na 2 -EDTA in 500 ml dh 2 O lösen. 28

29 Durchführung: Die Färbungen werden von jeder Gruppe in kleinen Glas-Petrischalen durchgeführt. Fixierung (1/2 Std.): 12 ml Ethanol + 6 ml Eisessig + 22 ml bidest.wasser immer frisch ansetzen, da relativ schnell Essigsäureethylester gebildet wird! Inkubation (1-12 Std.): 40 ml der Inkubationslösung + 0,08 g Na 2 S 2 O 3 (= 0,12 g Pentahydrat) µl Glutardialdehyd 25 %. Waschen (30 min): 3 x 10 min mit H 2 O dest. Färben (30 min): 40 ml der Färbelösung + 12 _ l Formaldehyd 37 % Kurz in Wasser spülen Entwickeln (Sichtprobe): 40 ml der Entwickler-Lösung + 12 _ l Formaldehyd 37 % Das Gel wird solange entwickelt, bis die Proteinbanden zu erkennen sind. Dies kann unter Umständen sehr schnell gehen (Sichtprobe). Zur Beendigung des Entwicklungsvorganges wird das Gel in die Stoplösung gelegt und dort bis zum Trocknen aufbewahrt. Achtung!! Formaldehyd ist giftig und reizt Augen und Schleimhäute. Alle Arbeiten mit Formaldehyd sind stets unter dem Abzug durchzuführen! Trocknen von Gelen Die Gele werden für 1 Stunde in eine Lösung von 35 % Ethanol und 2 % Glycerol in Wasser gelegt, um ein Reißen während der Trocknung zu verhindern. Sie werden dann zwischen zwei Zellophanfolien in einem Geltrockner (SE 1200 Easy Breeze Air Gel Dryer, Hoefer Scientific Instruments) mindestens 15 Stunden getrocknet. 29

30 2.9. Western-Blot und Immunodetektion Um ein Protein spezifischen, immunochemischen Reaktionen zu unterziehen, muß dieses nach einer Elektrophorese aus dem Gel heraus mobilisiert werden. Dies kann auf verschiedenen Wegen erfolgen. In Anlehnung an ein aus der Molekularbiologie bekanntes Verfahren können die Proteine z.b. mit Hilfe eines elektrischen Feldes aus dem Gel auf eine Membran transferiert werden. Diese Membran besteht aus Nitrocellulose oder Polyvinyldifluorid (PVDF, Immobilonmembran). Man bezeichnet diese Methode als Western-Blot (werden DNA-Fragmente geblottet, so bezeichnet man dieses Verfahren als Southern-Blot, bei RNA-Fragmenten spricht man von Northern-Blot). Das Gel wird zu diesem Zweck auf die Trägermembran gelegt und senkrecht zu der Auflagefläche eine Spannung angelegt. Nach einigen Stunden ist das Protein bzw. das DNA- oder RNA- Fragment aus dem Gel heraus auf der Oberfläche der Membran fixiert und kann dort entweder angefärbt oder weiteren immunochemischen bzw. molekularbiologischen Verfahren unterworfen werden. Die Behandlung der geblotteten Proteine mit spezifischen Antikörpern erlaubt deren Identifizierung. Dieses Verfahren bezeichnet man als Immunprinting oder Immunoblotting. Die Membran wird dazu mit einem Antikörper behandelt, der ganz spezifisch mit nur einem der geblotteten Proteine eine Antigen-Antikörper-Reaktion eingeht. Um eine unspezifische Bindung des Antikörpers an die Membran selbst zu verhindern, müssen freie Bindungsstellen der Membran vor der Antikörperbehandlung blockiert werden. Dies kann durch Vorbehandlung mit einer Proteinlösung (z.b. Milch) erreicht werden. Der Antikörper wird nur an den Stellen gebunden, an denen das Antigen also das Protein auf der Membran gebunden ist. Der Nachweis der Antikörperbindung kann mit Hilfe einer Farbreaktion durchgeführt werden (siehe Schema). Anti-TNFRI aus Ziege Blocking Proteine Phosphatase Anti-Ziege Phosphatase Konjugat Phosphatase + NBT + BCIP Phosphatase Dunkel-violettes Präzipitat Markierung des Proteins auf der Membran durch einen spezifischen Antikörper und Nachweis der Bindung mit NBT und BCIP. 30

31 Zu diesem Zweck wird an den aus Ziege stammenden primären Antikörper ein Konjugat aus einem Anti-Ziege-Antikörper und einer alkalischen Phosphatase (sekun-därer Antikörper) gebunden. Die Detektion erfolgt nach Zugabe der Farbstoffe NBT (Nitro-Blau- Tetrazoliumchlorid) und BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoylphosphat). Die Reaktionsbedingungen werden dabei so gewählt, daß die alkalische Phosphatase den Phosphatrest vom BCIP abspalten kann. Das entstehende Produkt kann vom NBT zu einem blauschwarzen Indigofarbstoff oxidiert werden, der auf der Membran präzipitiert. Das NBT wird seinerseits zu einem grauschwarzen Diformazan reduziert, das den Farbeffekt auf der Membran verstärkt. Soll keine Antikörperreaktion auf der Membran durchgeführt werden, so können Proteine auf der Membran z.b. mit Hilfe von Amidoschwarz angefärbt werden. Inhalt dieses Versuches ist der elektrochemische Transfer (Western Blot) von Proteinen auf eine Immobilonmembran. Mit den geblotteten Proteinen soll dann zum einen eine Amidoschwarz-Färbung durchgeführt werden, zum anderen soll eine selektive Anfärbung des isolierten TNFRI mit Hilfe eines Immunprintings erfolgen. Anzusetzende Lösungen Transfer-Puffer, ph 8, ml 25 mm Tris-HCl 192 mm Glycin 20 % (v/v) Methanol 6,07 g Tris (basisch) und 28,8 g Glycin werden in 1600 ml Wasser gelöst und anschließend mit 400 ml Methanol auf 2000 ml aufgefüllt. Der ph-wert wird nicht eingestellt, er soll bei ungefähr ph 8,3 liegen. TBS-Puffer, ph 7, ml 20 mm Tris-HCl 500 mm NaCl 4,86 g Tris (basisch) und 58,4 g NaCl werden in ca.1500 ml H 2 O gelöst. Der ph- Wert wird mit HCl auf 7,5 eingestellt und dann mit H 2 O auf 2000 ml aufgefüllt. 31

32 Die Elektrophorese Die Elektrophorese wird, wie unter beschrieben, durchgeführt. Pipettierschema: Bahn 1: 5 _ l Standard Bahn 2: bleibt leer Bahn 3: 20 _ l U937-Zellextrakt (siehe 2.6.1) Bahn 4: bleibt leer Bahn 5: 5 _ l broad range Standard, prestained* Bahn 6: 20 _ l U937-Zellextrakt vom Assistenten Bahn 7: 20 _ l U937-Zellextrakt (siehe 2.6.1) Bahn 8: 20 _ l Immunpräzipitat Bahn 9: 20 _ l Immunpräzipitat Kontrolle *Zusammensetzung des Standards (Bio-Rad broad range, prestained): Myosin d β-galaktosidase d BSA d Ovalbumin d Carbonic anhydrase d Trypsin Inhibitor (Soja) d Es handelt sich um einen vorgefärbten Standard, der die Eigenschaft hat, nach dem Transfer auf die Membran sichtbar zu erscheinen. So kann der Erfolg des Transfers optimal überprüft werden. Weiterhin ist es möglich, die Membran entlang des Standards zu zerschneiden. Durch die Anlagerung des Farbstoffes kommt es zu einer Zunahme der Molekulargewichte der Standardproteine (Vergleich ) Der elektrophoretische Transfer Durchführung: Die Immobilon-Membran wird gesondert vorbehandelt: Sie wird 2 s in Methanol getaucht, 5 min in dh 2 O und anschließend für 15 min in Transfer- Puffer inkubiert. Der elektrochemische Transfer der Proteine auf eine Immobilon-Membran erfolgt horizontal mit Hilfe einer Semi-Dry Blot-Apparatur. Mit Transfer-Puffer angefeuchtetes Filterpapier (ca. 5 Lagen) wird luftblasenfrei auf die Platinelektrode (Anode) gelegt (siehe 32

33 Skizze). Auf die Filterpapiere werden die vorbehandelten PVDF-Membranen orientiert (bis zu 4 Stück) und darauf die äquilibrierten Gele (siehe Abbildung). Die Membran muß zur Anode zeigen!! Da auch die Membran im Anschluß an das Blotting geteilt werden soll, sollte ihre Lage zum Gel markiert werden. Die Gele werden mit einer erneuten Lage angefeuchtetem Filterpapier (ca. 5 Lagen) bedeckt, die Kathode wird vorsichtig aufgesetzt und die Blot- Apparatur mit dem Deckel geschlossen. Deckel Katode Filterpapier Gel Membran Filterpapier Anode Basis Schematische Darstellung der Semidry-Blot-Apparatur (aus Gerätebeschreibung, Bio Rad) Der Transfer wird bei einer konstanten Spannung von 15 V durchgeführt und ist nach 30 Minuten beendet. Zur Beendigung des Blottings wird zuerst die Spannungsquelle abgeschaltet. Erst jetzt darf die Semi-Dry Blotter geöffnet werden. Die geblotteten Membranen werden entnommen und sofort in den TBS-Puffer ph 7,5 gelegt, um ein Austrocknen zu verhindern. Da ein vorgefärbter Standard mitgeblottet wurde, kann der erfolgreiche Transfer kontrolliert werden. 33

34 Wird der Western-Blot ohne einen vorgefärbten Standard durchgeführt, so kann das Gel nach dem Transfer gegengefärbt werden, um den Grad des Blottings zu quantifizieren. In diesem Versuch soll die Membran nun zwischen den Bahnen 4 und 5 geteilt werden und die eine Hälfte mit Amidoschwarz angefärbt, die andere mit einem spezifischen Antikörper gegen TNFRI behandelt werden Färben mit Amidoschwarz Anzusetzende Lösungen Amidoschwarz-Färbelösung 250 ml 0,1 % (w/v) Amidoschwarz in 45 % Methanol - 10 % Eisessig 0,25 g Amidoschwarz lösen in 112,5 ml Methanol + 25 ml Eisessig + 112,5 ml H 2 O Entfärbelösung 250 ml 90 % Methanol 2 % Essigsäure 8 % H 2 O Durchführung: Nachdem die Membran für etwa 15 min in dem TBS-Puffer gewaschen wurde, wird sie für min in die Färbelösung gegeben. Anschließend wird die Membran in dem Entfärber entfärbt. Die geblotteten Proteine sind als blauschwarze Banden zu erkennen. Die Membran wird kurz in Wasser gespült und kann dann zwischen Filterpapier getrocknet werden. 34