Indirekte Immunfluoreszenz in der Diagnostik von Autoantikörpern Grundkurs

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1 Indirekte Immunfluoreszenz in der Diagnostik von Autoantikörpern Grundkurs 14. Autoimmuntage Bernau Dr. med. Adrianna Jagiello

2 Übersicht I. Indirekter Immunfluoreszenztest (= IFT) Stellenwert Methodisches Prinzip IFT-Substrate II. III. Mikroskopieren IFT bei Kollagenosen IFT bei autoimmunen Hepatitiden IFT bei Vaskulitiden Zukunft - Automatisierung des IFT

3 Stellenwert der IFT Kollagenosen? Vaskulitiden? Chronisch entzündliche Lebererkrankungen? Screening-Test: Indirekte Immunfluoreszenz Differenzierung der AK-Spezifitäten mittels eines monospezifischen Testes: ELISA, Westerblot, Linienblot

4 IFT Methodisches Prinzip 1. Schritt: Nachzuweisende Autoantikörper (Patientenserum) binden an das in der Festphase fixierte Antigen. 2. Schritt: Fluorescein-markierte Antikörper binden an antigengebundene Antikörper. 3. Schritt: Kurzwelliges Licht wird absorbiert und langwelliges anschließend emittiert. 4. Schritt: Betrachtung im Fluoreszenzmikroskop.

5 IFT-Substrate 1. Hep2-Zellen: Diagnostik von Kollagenosen Nachweis von ANA, aber auch AMA, SMA 2. Crithidia luciliae: Diagnostik von SLE Nachweis von dsdna-ak 3. Gewebeschnitte (Leber, Niere, Magen): Diagnostik von chron. entzündlichen Leberkrankungen Nachweis von AMA, SMA, LKM-AK 4. Fixierte Granulozyten: Diagnostik von Vaskulitiden Nachweis von ANCA (p, c)

6 IFT bei Kollagenosen ANA-Diagnostik mittels Hep2-Zellen (Antikörper gegen Zellkernantigene)

7 Hep2-Zellen ANA-Diagnostik Hep2-Zellen dienen als Substrat für das ANA-Screening: Antinukleäre Antikörper = ANA umfassen alle Autoantikörper gegen nukleäre Antigene in der Zelle. Zytoplasmatische Fluoreszenzmuster auf der Hep2-Zelle sind Nebenbefunde und keine ANA, z. B. AMA, SMA. Hep2-Zellen haben eine hohe Sensitivität, jedoch niedrige Spezifität.

8 Hep2-Zellen ANA-Diagnostik Zellzyklusphasen einer Hep2-Zelle: Mitose a) Prophase b) Metaphase c) Anaphase d) Frühe Telophase e) Späte Telophase f) Interphase - G1-Phase - Synthese-Phase - G2-Phase Quelle: Werner Klotz, Uni-Klinik f. Innere Med. Innsbruck

9 ANA Mikroskopieren Negativ 1. Raum vollständig abdunkeln 2. Optische Qualität des Objektträgers? 3. Positiv-/Negativkontrolle? 4. Musterbeurteilung: - Interphasezellen (Zellkerne, Nucleoli, Zytoplasma) - Mitosezellen (Chromosomale Region +/-) 5. Titration

10 ANA Muster Feingranuläres Muster Antikörper: SS-A/B-AK (Nucleoli teilweise pos.), Ku-AK (Nucleoli teilweise pos.), Mi-2-AK (Nucleoli neg.) Erkrankungen: Sjögren-SD, SLE, SCLE, NLE, RA, Sklerodermie, Poly-, Dermatomyositis, Myositis, Overlap-SD

11 ANA Muster Grobgranuläres Muster (Nucleoli negativ) Antikörper: Sm-AK (Granula ungleichmäßiger groß), U1-RNP-AK Erkrankungen: SLE, MCTD, Sklerodermie

12 ANA Muster Homogenes Muster (Chromosomen positiv) Antikörper: dsdna-ak, Histon-AK, Nukleosomen-AK Erkrankungen: SLE

13 Crithidia luciliae Einzeller besitzt ein Polkörperchen, einen Kern und ein randständiges Riesenmitochondrium (= Kinetoplast) in dem sich dsdna befindet. Negativ Positiver Kinetoplast Nachweis von dsdna-ak (niedrige Sensitivität, jedoch hohe Spezifität für SLE). Positiv

14 ANA Muster Nukleoläres Muster Antikörper: - Topoisomerase I-AK (ehemals Scl 70) (Nucleoli pos. + Zytoplasma diffus fluoreszierend, fast schon homogen), - Pm-Scl Fibrillarin (Nucleoli pos.+ granuliertes Zytoplasma) - RNS-Polymerase (Nucleoli fleckig pos.) Erkrankungen: Systemische Sklerodermie

15 ANA Muster Zentromeres Muster Antikörper: CENP-A/B/C/D-AK Erkrankungen: CREST-Syndrom, Sklerodermie (Diagnose-, Prognose-, Risikomarker), PBC

16 ANA Muster Multiple nuclear dots (5-20) Antikörper: Sp100 Erkrankungen: PBC

17 ANA Muster Membranöses Muster (Chromosomen negativ) Antikörper: AK gegen Lamine A/B/C, AK gegen Kernporen (gp210) Erkrankungen: PBC, autoimmune Hepatitiden

18 ANA Muster Spindelfaserapparat Assoziation mit verschiedenen Kollagenosen und Malignomen.

19 IFT bei Kollagenosen ANA-Diagnostik mittels Hep2-Zellen (Antikörper gegen Zytoplasma NEBENBEFUNDE!)

20 ANA Nebenbefund Anti-Jo-1: Granuläre Fluoreszenz im Zytoplasma, teilweise im Kern. Erkrankungen: Polymyositis (25-35%), die häufig mit anderen Autoimmunerkrankungen assoziiert ist.

21 ANA Nebenbefund Ribosomale-P-Protein-AK: Dichte, feingranuläre, teilweise wolkige Fluoreszenz im Zytoplasma. Bei hochtitrigen AK werden auch die Nucleoli homogen angefärbt. Erkrankungen: SLE (10-20%), Lupus-bedingte Psychose

22 ANA Nebenbefund Antimitochondriale AK (AMA): Grobgranuläre oft perlschnurartig angeordnete Fluoreszenz des Zytoplasmas Erkrankungen: Primär biliäre Zirrhose (PBC), Overlap-Syndrom PBC/autoimmune Hepatitis weitere Abklärung mittels Gewebesubstraten

23 ANA Nebenbefund AK gegen glatte Muskulatur (SMA): Spinnwebenartige Fluoreszenz im Zytoplasma weitere Abklärung mittels Gewebesubstraten

24 IFT bei autoimmuner Hepatitis Diagnostik mittels Gewebe, Hep2-Zellen (Antikörper gegen Zytoplasma Nebenbefund)

25 AIH Basisdiagnostik Klinischer Verdacht auf Autoimmunhepatitis 1. IFT: Hep2-Zellen und Gewebe (Rattenleber, -magen, -niere) ANA, AMA, SMA, LKM-Antikörper? 2. Spezifische Immunoassays (ELISA, Linedot, Immunoassay) LKM-, Aktin-,SLP/LP-Antikörper? 3. Eventuell weitere Untersuchungen

26 ANA Nebenbefund Antimitochondriale AK (AMA): Grobgranuläre oft perlschnurartig angeordnete Fluoreszenz des Zytoplasmas Erkrankungen: Primär biliäre Zirrhose (PBC), Overlap-Syndrom PBC/autoimmune Hepatitis weitere Abklärung mittels Gewebesubstraten

27 AMA Gewebe ) Magen: Fluoreszenz der Belegzellen. 2) Niere: Fluoreszenz der Nierentubuli mit Betonung der distalen Abschnitte. 3) Leber: Fluoreszenz der Hepatozyten. Bei positivem Ergebnis schließt sich die Suche nach AMA-M2 an! Diagnostischer Marker für PBC (Primär biliäre Zirrhose)

28 ANA Nebenbefund AK gegen glatte Muskulatur (SMA): Spinnwebenartige Fluoreszenz im Zytoplasma weitere Abklärung mittels Gewebesubstraten

29 SMA (Aktintyp) Gewebe = smooth muscle antibodies (alt: ASMA) 1) Magen: Fluoreszenz der glatten Muskulatur der Gefäße und der Magenwand. 2) Niere: Fluoreszenz der glatten Muskulatur der Gefäße. 3) Leber: Fluoreszenz der glatten Muskulatur der Gefäße, der Gallengänge. Erkrankungen: Autoimmunhepatitis (70%)

30 SMA (Nicht-Aktintyp) Gewebe Nicht-Aktintyp Aktintyp Beim SMA Nicht-Aktintyp werden Aktinfilamente (hier Niere) nicht angefärbt! Eine AIH ist unwahrscheinlich, der SMA Nicht-Aktintyp ist mit viralen Infektionen (Mononukleose, HCV), rheumatischen oder neoplastischen Erkrankungen assoziiert.

31 LKM Gewebe = Liver kidney microsomal antibodies 1) Leber: Fluoreszenz der Hepatozyten. 2) Niere: Proximale Tubuli stark fluoreszierend, distale schwach. 3) Magen: Parietalzellen negativ. Erkrankungen: Autoimmunhepatitis (5 %), Virushepatitis, medikamentös toxische Hepatitis

32 IFT bei Vaskulitis ANCA Bestimmung mittels Granulocyten-Substrat

33 Vaskulitis Basisdiagnostik Klinischer Verdacht auf systemische Vaskulitis 1. IFT: canca, panca 2. Spezifische Immunoassays: PR3, MPO 3. Eventuell weitere Untersuchungen

34 Granulozyten-Substrat Ethanolfixierte G. Ethanolfixiert panca (perinukleäre Anti-Neutrophile Cytoplasmatische Autoantikörper) perinukleäre Granula Zielantigen: Myeloperoxidase (MPO) Erkrankungen: Vaskulitiden (mikroskopische Polyangitis, Churg-Strauss- Syndrom), Kollagenosen, chronisch entzündliche Formalinfixiert Formalinfixierte Darmerkrankungen, G. autoimmune Hepatitiden

35 Granulozyten-Substrat Ethanolfixierte G. Ethanolfixiert canca (cytoplasmatische Anti- Neutrophile cytoplasmatische Autoantikörper) zytoplasmatische Granula Zielantigene: Proteinase 3 (PR3), Bakterizidie/Permeabilität erhöhendes Protein (BPI-AK) Erkrankungen: Wegener-Granulomatose Formalinfixierte G.

36 Zukunft Automatisierung IFT Mehrere IFT-Geräte auf dem Markt Folgendes wird bewertet: Negativ/positiv Muster Titer Die Zuverlässigkeit von Mustererkennung und Titern muss im Einzelfall geprüft werden. Ein Vorteil ist die digitale Archivierung der Bilder.

37 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!

38 Literatur 1. L. Thomas, Labor und Diagnose, 7. Auflage 2. K. Conrad, W. Schößler, F. Hiepe, Autoantikörper bei systemischen Autoimmungerkrankungen Ein diagnostischer Leitfaden, Pabst Science Publishers A. R. Krapf, C. A. von Mühlen, Atlas of Immunfluorescent Autoantibodies, Urban&Schwarzenberg R. G. Hughes, M. J. Surmacz, A. R. Karim, A. R. Bradwell, Atlas of Tissue Autoantibodies, Third Edition 2008, The Binding Site GmbH 5. A. R. Bradwell, R. P. Stokes, G. P. Mead, Advanced Atlas of Autoantibody Patterns, Third Edition, AR Bradwell K. Conrad, W. Schößler, F. Hiepe, M. J. Fritzler, Autoantibodies in Organ Specific Autoimmune Diseases A diagnostic Reference, Pabst Science Publishers, Volume

39 Bilder 1. images07/im a.jpg 2. images/xerostomia.jpg 3. CD015/550px/img0008.jpg 4. jpg/ jpg 5. photos/52822/ jpg 6. mm/mm018/raynaud-phaen zentrale-deutscher-kliniken.de/ lexikon-deu/im