An die Teilnehmer des 28. Autoimmunologie-Rundversuches Innsbruck, April 2009

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1 Univ. Klinik für Innere Medizin (Vorstand Univ.-Prof. Dr. J. Patsch) Rheumalabor Leiter: a. Univ.- Prof. DDr. M. Herold Anichstraße 35 A Innsbruck Tel. 0512/ , Fax 0512/ Werner.Klotz@uki.at An die Teilnehmer des 28. Autoimmunologie-Rundversuches Innsbruck, April 2009 Sehr geehrte ÖQUASTA Teilnehmer! Die beiden Proben des 28. Autoimmunologie-Rundversuches stammen von 2 Patienten mit verwandten Grunderkrankungen aber unterschiedlichen Krankheitsbildern. Beide enthalten relative seltene, aber für diese Erkrankungen charakteristische Autoantikörper. Bei Probe 2/B wird das typische Fluoreszenzmuster durch die zum Abnahmezeitpunkt der Rundversuchsprobe kurzzeitig aufgetretenen zusätzlichen Antikörper zum Teil maskiert. Umso erfreulicher ist es, dass die in dieser Probe vorhandenen PM/Scl Antikörper trotzdem von 6 Teilnehmern gefunden und als Zusatzbemerkung gemeldet wurden. Probe 1/A: Die Mitte 60-jährige Patientin sucht wegen akuter Gelenksbeschwerden die Notfallaufnahme der Klinik auf. Zusätzlich zeigt sich eine mäßig gradige Atemnot beim Sprechen. Im durchgeführten Röntgen werden peribronchiale Infiltrationen beschrieben, im nachfolgend durchgeführten CT fibrotisch anmutende Veränderungen der Lunge. Eine autoimmune Genese wird vermutet, die Bestimmung der Autoantikörper angefordert. Diskussion: Auch wenn im vorliegenden Fall die antinukleären Antikörper (ANA) als primärer Screening Parameter beim Verdacht des Vorliegens einer Autoimmunerkrankung negativ sind, weist das typische zytoplasmatische Fluoreszenzmuster auf das Vorliegen eines Antikörpers der anti- Synthetase Gruppe hin. Der spezifische Immunoassay bestätigt Antikörper gegen HistidyltRNA-Synthetase, besser bekannt als Jo-1. Der Antikörpernachweis führt im Einklang mit dem klinischen Bild zur Diagnose eines anti-synthetase Syndroms. Probe 2/B: Bei der ca. 60 jährigen Patientin ist seit vielen Jahren eine calcifizierende Sklerodermie bekannt. Diskussion: Die im Serum der Patientin nachweisbaren Antikörper gegen das PM/Scl (frühere Bezeichnung: PM-1) Antigen werden fast ausschließlich bei Patienten mit idiopathischer Myositis gefunden und wurden erstmals bei einem Krankheitsbild beschrieben, das Charakteristika sowohl der Polymyositis als auch der Sklerodermie beinhaltete (Overlap- Syndrom), daher die Bezeichnung PM/Scl Antikörper. PM/Scl Antikörper werden relativ selten gefunden. Der Nachweis der Antikörper im Serum der Patientin unterstreicht im vorliegenden Fall das markante klinische Bild mit sklerodermiformen Hautveränderungen und Kalkablagerungen in den Weichteilen.

2 Bemerkungen zur ANA Diagnostik auf der HEp-2 Zelle: Von 27 Teilnehmern beurteilten 24 die Probe 1/A richtig als Kern negativ und alle Teilnehmer die Probe 2/B als ANA positiv. Probe 1/A zeigt eine fein granuläre, sich zum Zellkern hin leicht verdichtende zytoplasmatische Fluoreszenz. Dieses Muster ist charakteristisch für Antikörper gegen Histidyl t-rna Synthetase, besser bekannt als Jo-1 Antigen. Anti-Synthetase Antikörper und gelten als typische Myositis Marker und zeigen auf der HEp-2 Zelle ein primär zytoplasmatisches Muster. Positive Seren färben häufig auch den Zellkern mit einem schwachen fein gepunkteten Muster. Es ist unklar ob es sich hier um einen Fixierartefakt (Einwaschen des Antigens in den Zellkern) oder um einen zusätzlich vorliegenden Antikörper handelt. Häufig wird das oft nur sehr schwach aufleuchtende zytoplasmatische Muster beim Screening auf ANA übersehen. Beim Vorliegen klinischer Symptome, die an eine Myositis denken lassen, sollte daher auch bei negativem Screening auf HEp-2 Zellen eine Suche nach Jo-1 Antikörper mittels EIA oder Immunoblot erfolgen. 2 Teilnehmer bezeichneten das zytoplasmatische Fluoreszenzmuster als goldstaubig. Dieser zugegebenerweise anschauliche Ausdruck sollte im Hinblick auf eine nationale und internationale Vereinheitlichung der Musterbezeichnungen nur laborintern verwendet werden. Probe 2/B zeigt ein mittel- bis hochtitriges Mischmuster aus fein granulärer bis homogener Fluoreszenz des Nukleoplasma, homogen bis ringförmig angefärbten Kernkörperchen (Nukleolen) und positiven Metaphasechromosomen. Die Patientin ist an unserer Ambulanz seit 6 Jahren bekannt und zeigte in dieser Zeit durchgehend das für PM-Scl Antikörper typische Mischmuster aus fein granulärer Kernfärbung mit homogen bis ringförmig gefärbten Nukleolen. Nur in einem kurzen Zeitraum aus dem die ausgesandte Probe stammt war im Serum ein weiterer Antikörper, welcher auf den HEp-2 Zellen ein homogenes Fluoreszenzmuster mit positiven Metaphasechromosomen erzeugt, nachzuweisen. Dieser erschwert das Erkennen des für PM-Scl Antikörper typischen Musters deutlich. 8 von 25 Teilnehmer beurteilten für Probe 2 das Zytoplasma der HEp-2 Zellen positiv. Eine niedrigtitrige feingranuläre Anfärbung konnten auch wir auf unseren Zellen beobachten, allerdings scheint uns die Intensität für eine positive Beurteilung zu gering. Da die Mehrheit der Teilnehmer (17) die Probe ebenfalls als negativ beurteilten wird der Zielwert mit negativ festgelegt. R 7 R neg 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:10240 >1:10240 Probe A Probe B R = Ergebnis Referenzlabor Rundversuch ÖQUASTA Autoimmunserologie 28; Ergebnisse HEp-2 Titer 1. Muster

3 Bemerkungen zur dsdna Analytik: Das von vielen Teilnehmern beschriebene homogene Kernmuster und die positiven Metaphasechromosomen auf der HEp-2 Zelle bei Probe 2/B deuten auf Antikörper gegen Chromatinbestandteile oder Antikörper gegen Proteine, die mit Chromatin assoziiert sind. 20 von 31 Teilnehmern fanden mittels EIA auch ein schwach positives oder positives Ergebnis bei dsdna Antikörpern. Diese Antikörper gelten in hohen Titerstufen als weitgehend spezifisch für den SLE. In niedrigen Titerstufen und/oder in nieder avider Form werden sie aber auch bei anderen Erkrankungen gefunden. Verschiedene kommerziell erhältliche ELISA erfassen in unterschiedlichem Ausmaß nieder avide Antikörper. Die diskrepanten ELISA Ergebnisse kommen deshalb nicht unerwartet. Überraschend ist aber, dass mit Testbestecken von zwei Herstellern in verschiedenen Laboratorien trotz Verwendung des gleichen Testbestecks diskrepante Ergebnisse ermittelt wurden. Das klinische Bild der Patientin zeigt keine Hinweise auf das Vorliegen eines SLE und spricht für den negativen Befund, der mit allen Testbestecken erhoben wurde, die nach Angabe der Hersteller nur hoch avide Antikörper erfassen. In Ermangelung einer Referenzmethode und der fehlenden Möglichkeit zur objektiven Beurteilung eines richtigen ELISA Befundes werden sowohl positive als auch negative Ergebnisse als gültig bewertet. Die Crithidia luciliae Methode gilt zwar als relativ wenig sensitiv, dafür aber hoch spezifisch für Ak gg. dsdna, da nur höher avide Antikörper erfasst werden. Es ist verwunderlich, dass 5 von 15 Teilnehmern mit dem dsdna Ak Nachweis mittels iif auf Crithidia luciliae ein positives Resultat bekommen haben. Auf den Flagellaten färbt sich mit Probe 2/B das an der Ansatzstelle der Geissel sitzende Basalkörperchen deutlich an. Neben der möglichen Fehlinterpretation der Fluoreszenz des Basalkörperchens könnte auch die Verwendung unterschiedlicher Konjugate für die diskrepanten Ergebnisse verantwortlich sein. Wir empfehlen für den Nachweis von ANA und dsdna Antikörper mittels Immunfluoreszenz nur monospezifisches anti-human IgG Konjugat zu verwenden. Das Ergebnisse auf anti-nukleosomen Antikörpern zeigt auch in diesen Rundversuchsproben wieder, dass die Ergebnisse stark von der verwendeten Methode und der Antigenpräparation abhängen und nicht labor- bzw. herstellerübergreifend verglichen werden können. Wieder wurden mit identen Testbestecken sowohl positive als auch negative Befunde erhoben. Aufgrund einer fehlenden Referenzmethode und fehlenden Sicherheit, ein richtiges Ergebnis angeben zu können, haben wir beschlossen, vorerst die Testung auf anti-nukleosomen Antikörper nicht zu bewerten. In der Gesamtauswertung werden die eingesandten Ergebnisse aber weiterhin veröffentlicht. Wieder möchten wir an alle Teilnehmer appellieren, die Angaben zur verwendeten Methodik bei jedem Rundversuch zu kontrollieren und gegebenenfalls zu aktualisieren. Nur auf Basis dieser Angaben ist es möglich, den Rundversuch vernünftig auszuwerten. Wie immer hoffen wir, dass wir durch die Auswahl unserer Proben interessante klinische Fälle liefern und die Auswertung Sie dazu stimuliert, an den Rundversuchen mit Freude teilzunehmen und die österreichweite Analytik der Autoantikörper zu optimieren. Anregungen von Seiten der Teilnehmer nehmen wir gerne entgegen. Etwaige Einsprüche gegen die Bewertung Ihres Labors richten Sie bitte innerhalb eines Monats schriftlich oder per an das Büro der ÖQUASTA. Für das gesamte Team des Rheumalabors Innsbruck, das an der Probensammlung, der Befundinterpretation und an der Auswertung beteiligt ist, zeichnen als Verantwortliche Werner Klotz, Autoimmunologie Univ.-Prof. DDr. Manfred Herold, Laborleiter

4 28. Autoimmunologie- Rundversuch ÖQASTA Probe 1/A HEp-2 Zellen: Verdünnung 1:40: Kerne mit schwacher feingranulärer Anfärbung, Zytoplasma feingranulär positiv Granulozyten Ethanol fixiert: keine zytoplasmatische oder perinukleäre Anfärbung Granulozyten Formalin fixiert: Zellkern und Zytoplasma negativ

5 28. Autoimmunologie- Rundversuch ÖQASTA Probe 2/B HEp-2 Zellen: Verdünnung 1:40: Kerne feingranulär bis homogen, Nukleolen ringförmig bis homogen, Metaphasechromosomen positiv, Zytoplasma negativ Granulozyten Ethanol fixiert: Zellkerne schwach positiv, Zytoplasma negativ Granulozyten Formalin fixiert: Zytoplasma negativ

6 28. Autoimmunologie- Rundversuch ÖQASTA Probe 2/B Crithidia luciliae: Verdünnung 1:10: keine Fluoreszenz des Kinetoplasten, Basalkörperchen positiv