Kurzanleitung. DiaMed ID-Micro Typing System Prinzip und Arbeitstechnik Seite 1 von 6

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1 Labor Kurzanleitung Dok.-Nr. KA... Version 01 Gültig ab --- DiaMed ID-Micro Typing System Prinzip und Arbeitstechnik Seite 1 von 6 Prinzip und Arbeitstechnik der Blutgruppenbestimmung mit der Geltechnik (DiaMed ID-Micro Typing System) Unter Blutgruppenbestimmung versteht man im allgemeinen die Bestimmung der erblichen Merkmale des AB0-Systems, den Nachweis des Rhesusmerkmals D, die Aufschlüsselung des gesamten Rh-Phänotyps (C, c, E, e und evtl. C w ) und ggf. den Nachweis/Ausschluss von D weak. Diese Blutgruppen sind Antigene auf der Erythrozytenmembran, die in der Routine serologisch mit klassischen Testreagenzien (spezifischen Antikörpern und Test- Erythrozyten) meist eindeutig bestimmt werden können. Die für die Blutgruppenserologie wichtigsten Antikörper gehören den Immunglobulinklassen IgG und IgM an (seltener IgA Klasse). Je nach Immunglobulinklasse reagieren die Antikörper serologisch verschieden. Die hauptsächliche Methode zum Nachweis von erythrozytären Blutgruppenmerkmalen ist die Hämagglutination in ihren Modifikationen. In geringem Umfang ist auch noch die Beurteilung der Hämolyse beim Nachweis von Blutgruppenantigenen (bzw. Antikörpern) von Bedeutung. Blutgruppen-Antigene können nur mit intakten Antigenen auf Erythrozyten nachgewiesen werden. Eine ausreichende Anzahl von antigenen Epitopen ist ebenfalls erforderlich. Bei zweifelhafter Expression von Blutgruppeneigenschaften (Proteine oder Glykokonjugate) ermöglichen DNA-Techniken den sicheren Nachweis des relevanten Gens. Darüber hinaus kann eine DNA-Untersuchung bei Vorliegen von mehreren Antikörpern in Verbindung mit einem positiven direkten Coombstest hilfreich sein, multiple Antikörperspezifitäten zu identifizieren Hämagglutination Die Hämagglutination ist die sichtbare Verklumpung der Erythrozyten durch Antikörper. Erythrozyten tragen an ihrer Oberfläche einen Überschuss an negativer Ladung und stossen sich gegenseitig ab. Um eine für das Auge sichtbare Verklumpung zu erreichen, ist eine Reaktion des spezifischen Antikörpers mit zwei benachbarten Erythrozyten notwendig. In der Regel sind nur IgM Moleküle aufgrund ihres grösseren Durchmessers (grösser als IgG Moleküle) in der Lage die durch die negative Ladung bedingte Distanz der benachbarten Erythrozyten zu überbrücken und somit ohne zusätzliche Hilfsmittel eine sichtbare Aggluti- Geschützte Warennamen (Warenzeichen) werden nicht besonders kenntlich gemacht. Aus dem Fehlen eines solchen Hinweises kann nicht geschlossen werden, dass es sich um einen freien Warennamen handelt. Name Abteilung Datum Unterschrift erstellt geprüft freigegeben Prof. Dr. W.D. Kuhlmann QM-Stelle

2 nation zu erzielen (komplette Antikörper). Man nennt sie auch NaCl wirksame Antikörper, da sie in physiologischer Kochsalzlösung reagieren. ihr Reaktionsoptimum liegt in der Regel bei Raumtemperatur oder darunter, im Extremfall bei 0C. Antikörpermoleküle der IgG Klasse reagieren zwar mit den individuellen Erythrozyten, sie können aber aufgrund der geringeren Molekülgrösse den Abstand zwischen benachbarten Erythrozyten nicht ohne weitere Hilfsmittel überbrücken. Durch Zugabe von Supplementen (Albumin, Dextran) oder Enzymen (Bromelin, Papain etc.) wird die Distanz reduziert, so dass ein IgG Molekül nun auch in der Lage ist, mit Antigenen von benachbarten Erythrozyten zu reagieren, um eine sichtbare Agglutination auszulösen (inkomplette Antikörper. Diese inkompletten Antikörper haben ihr Reaktionsoptimum bei einer Temperatur von 37C. Die wichtigsten Methoden und Systeme zum Nachweis von Agglutinationsreaktionen sind die (a) Röhrchen-Agglutinations-Methode, (b) die Säulen-Agglutinations-Methode (Geltechnik) und (c) die Solid-Screen und Capture-Tests (Mikrotiter-Streifen/Plattentests). Coombstest Der Antihumanglobulin (AHG)- bzw. Coombs-Test ist eine weitere Form der Hämagglutination zum Nachweis von inkompletten Antikörpern. Abhängig von der Indikation wird der AHG-Test als indirekter Coombstest (ICT) oder als direkter Coombstest (DCT) durchgeführt. Indirekter Coombs-Test (in der Geltechnik, s.u.): der ICT dient der Sichtbarmachung einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Er wird als Mehrstufentest durchgeführt. Serum wird mit Testerythrozyten versetzt, bei 37C kommt es zur Bindung der Antikörper an das komplementäre Antigen. Anschliessend erfolgt die Zentrifugation. Die beladenen Erythrozyten agglutinieren mittels AHG (das sich in dem Gelröhrchen befindet). Je nach Antikörperstärke findet eine mehr oder weniger ausgeprägte Agglutinationsreaktion statt. Direkter Coombs-Test: der DCT dient dem Nachweis von Antikörpern und/oder Komplementfaktoren, die sich in vivo an die Erythrozyten gebunden haben. Es entfällt die Inkubation bei 37C. Die Erythrozyten werden einmal mit Waschlösung gewaschen. Der DCT kommt zur Anwendung: a) bei Verdacht auf eine autoimmunhämolytische Anämie, b) zum Nachweis einer Bindung von Alloantikörpern an transfundierte Erythrozyten, c) bei Neugeborenen zur Diagnose eines M.h.n. durch mütterliche IgG Antikörper Hämolyse Abhängig von der Immunglobulinklasse des Antikörpers und der Antigendichte am Erythrozyten können Antigen-Antikörper-Komplexe das Komplementsystem (falls frische komplementaktive Sera verwendet werden) aktivieren und eine Zerstörung der Erythrozytenmembran mit Freisetzung von Hämoglobin bewirken. AB0-System

3 Das AB0-System ist das wichtigste Blutgruppensystem für die Bluttransfusion und besteht aus den vier Blutgruppen A, B, AB und 0. Das Probanden-Serum enthält reguläre Antikörper gegen diejenigen AB0-Antigene, die nicht auf der Oberfläche der eigenen Erythrozyten vorhanden sind. Es handelt sich vorwiegend um komplette Antikörper (IgM Klasse), die erst im Verlauf der ersten Lebensmonate gebildet werden. Die Bestimmung der AB0-Blutgruppe wird als Doppelbestimmung durchgeführt. Für die Untersuchung der Erythrozytenmerkmale kommen monoklonale Testreagenzien Anti-A und Anti-B zur Anwendung. Zur Bestätigung werden die Serumeigenschaften (Anti-A und Anti-B) mit Testerythrozyten A 1, A 2 und B nachgewiesen. Rhesus-System (Rh-System) Das Rhesus-System ist ein weiteres wichtiges und vom AB0-System unabhängiges Blutgruppensystem. Als Rh-positiv werden alle Personen bezeichnet, bei denen das Merkmal D nach-weisbar ist. Ein Antikörper gegen d konnte bisher nicht nachgewiesen werden, deshalb wird jede Person als Rh-negativ (dd) bezeichnet, bei der das Merkmal D nicht feststellbar ist. Etwa 85% der mitteleuropäischen Bevölkerung sind Rh-positiv. Im Fall einer Transfusion muss insbesondere das Merkmal D aufgrund seiner starken Immunogenität beachtet werden. Auf der Oberfläche eines D-positiven Erythrozyten befinden sich ca Rh-D Antigenmoleküle. Das einzelne D-Antigen setzt sich wie ein Mosaik aus verschiedenen Epitopen zusammen. Bei den sog. schwachen D-Antigenen ist entweder die Anzahl der D-Antigene (alle Epitope vorhanden) auf der Erythrozytenoberfläche vermindert oder es fehlen einige Epitope. D weak (früher meistens als D u bezeichnet): alle Epitope sind vollständig vorhanden, die Anzahl der D-Antigene ist jedoch verringert (< ). Beim Positionseffekt (Ceppelini- Effekt) ist das D-Merkmal durch ein C-Gen in Transposition unterdrückt (z.b. CCDee). Diese Personen können kein Anti-D bilden und werden als Rh-positiv befundet (Schwangere erhalten keine Anti-D-Prophylaxe) Kategorie-D (= D partial, D variant): die Anzahl der D-Antigenmoleküle auf den Erythrozyten ist meist verringert (kann aber auch wie bei einem normalen D-positiven Probanden im Normbereich liegen). Bei den D-Antigenen der D-Kategorie sind bestimmte Epitope nicht vorhanden. Bei der sog. Kategorie D VI sind nicht alle Epitope vorhanden und zusätzlich ist die Anzahl der D-Antigene vermindert. Diese Personen können Anti-D Antikörper bilden und müssen als Rh-negativ befundet werden. Neben dem Merkmal D (das den Rh-Faktor bestimmt) gehören noch die Antigene C, c, E, e und deren Varianten zum Rh-System. Das Serum enthält in der Regel keine natürlich gebildeten Antikörper gegen Rh-Antigene. Antikörper gegen Rh-Antigene werden vorwiegend im Verlauf von Rh-Untergruppen ungleichen Transfusionen oder während einer Schwangerschaft gebildet. Dabei handelt es sich überwiegend um IgG Antikörper (seltener um IgM oder in Ausnahmen auch um IgA Antikörper) Weitere Blutgruppen-Systeme Ausserhalb des Rh-Systems besitzt noch das Merkmal Kell eine starke Immunogenität. Bei Frauen im gebärfähigen Alter und bei Patienten mit einer voraussehbar langzeitigen Transfu-

4 sionsbehandlung wird daher neben der Rh-Formel auch das Merkmal Kell bei der Hämotherapie berücksichtigt. Darüber hinaus gibt es ca. 300 weitere Antigene, die nicht routinemässig untersucht werden. Bei der Vielzahl der möglichen Kombinationen können im Fall einer Transfusion alle diese Antigene im Sinne einer identischen Übertragung keine Berücksichtigung finden. Sie werden aber beim Antikörpersuchtest über den Ausschluss irregulärer Antikörper und durch Kompati-bilitätsprüfung bei der serologischen Verträglichkeitsprobe (Kreuzprobe) berücksichtigt. Blutgruppenbestimmung mit der DiaMed Geltechnik Eine weit verbreitete Methode für die Blutgruppenbestimmung in der immunhämatologischen Routine ist das Diamed ID-Micro Typing System. Bei diesem Nachweissystem handelt es sich um eine Agglutinationstechnik, die speziell für diesen Zweck entwickelt wurde. Das Prinzip basiert auf dem Nachweis von agglutinierten Erythrozyten in einem mit Gelkügelchen befüllten Röhrchen (Geltechnik). Im Mittelpunkt der Geltechnik stehen mit Gelkügelchen (Dextran) befüllte Mikroröhrchen. In einer Plastikkarte sind schlanke Mikroröhrchen eingearbeitet, die mit Sephadex-Gelkügelchen (Dextran) gefüllt sind. Über jeder Gelsäule befindet sich eine Reaktionskammer für Reagenzien und Untersuchungmaterial (Probenmaterial). Methodisch handelt es sich um eine Kombination von Agglutinationsreaktion (Antigen-Antikörper-Reaktion) und Zentrifugation des Testansatzes in dem Gelröhrchen. Zunächst werden Erythrozyten und Serum in den nach oben erweiterten Bereich des Röhrchens (= Reaktionskammer) eingefüllt und inkubiert. Anschliessend werden die Mikroröhrchen unter definierten Bedingungen zentrifugiert. Bei negativem Reaktionsausfall sedimentieren die Erythrozyten bis zum Röhrchenboden; bei positivem Reaktionsausfall werden die aggluti-nierten Erythrozyten im Gel aufgehalten. Die Methode der Säulen-Agglutinations-Methode basiert auf der Sichtbarmachung von Agglutinaten in Gel-Säulen. Das Gel erfüllt drei verschiedene Funktionen: zu Beginn der Zentrifugation werden die Erythrozyten aufgrund ihres Gewichtes vom Serum getrennt, danach treffen sie auf das Reagenz und werden schliesslich aufgrund der entstandenen Komplexe (= Antigen-Antikörper-Reaktion, i.e. agglutinierte Erythrozyten) im Gel aufgehalten oder die Erythrozyten passieren die Gelmatrix (= nicht agglutinierte Erythrozyten). Abbildungen aus der Fortbildungssoftware der Fa DiaMed AG.

5 Das Ableseprinzip der Reaktionen in der DiaMed Geltechnik ist in nachfolgendem Schema dargestellt. Positive Reaktion: eine positive Reaktion ist als rote Linie auf dem Gel sichtbar. Schwach positive Reaktion: bei schwach positiven Reaktionen sind die Agglutinate im Gel verteilt. Negative Reaktionen: bei negativen Reaktionen sind die Erythrozyten am Boden der Röhrchen als roter Knopf sichtbar. Abbildungen aus DiaMed-ID Micro Typing System: Blutgruppenserologie und Produktkatalog (2006). Die Inkubations- und Ablesetechnik ist einfach und sicher durchzuführen. In der Reaktionskammer erfolgt nach dem Einbringen von LISS, Erythrozyten und Serum bei 20C (AB0 und Rh-System) bzw. bei 37C im Wärmeblock (AKS und Kreuzproben) die Antigen-Antikörper- Reaktion. Während der Zentrifugation bei fest eingestellter g-zahl und Zentrifugationszeit sedimentieren die Erythrozyten in Abhängigkeit von der Agglutinationsstärke. Grosse Agglutinate bleiben oben in der Säule hängen; je feiner die Agglutinate sind desto tiefer senken sie sich. Bei Verwendung von Mikroröhrchen mit AHG-Reagenz werden die nicht an Erythrozyten gebundenen Gammaglobuline durch eine hochmolekulare Flüssigkeit in der Reaktionskammer gehindert, das in der Säule befindliche Coombs Serum zu neutralisieren. Beim Diamed-ID-System kommen verschiedene Varianten der Geltechnik zum Einsatz. Blutgruppen Bestimmungskarten: Testreagenzien sind in den Reaktionskammern enthalten. Rh-Untergruppen (plus Kell) Bestätigungskarten: Testreagenzien sind in den Reaktionskammern enthalten.

6 Blutgruppen Bestätigungskarten: Testreagenzien befinden sich in den Reaktionskammern enthalten. Gelkarten für NaCl-, Enzymtest und Kälteagglutinine: s. Neutral-Gel (NaCl) Karten Neutral-Gel (NaCl) Karten: Mikroröhrchen enthalten nur Gelkugeln (Dextran) in Suspensionsflüssigkeit. LISS/Coombs Karten: oberhalb der Gelmatrix befindet sich eine hochmolekulare Flüssigkeit; die Gelmatrix enthält Antihumanglobulin Antikörper. Blutgruppen- und Rh-Faktorbestimmung werden in der Regel immer zusammen angesetzt. Das Diamed-ID-System zur Blutgruppenbestimmung bietet in einem Ansatz ein vollständiges Profil für die Bestimmung von AB0 und RhD einschliesslich des Antihumanglobulintests (für den Antikörpersuchtest). Die zwei Anti-D Antikörper in den Gelkarten sind negativ für die Vari-ante D VI. Die Serumgegenprobe erfolgt mit A 1 -, A 2 -, B- und 0-Erythrozyten. Prof. Dr. W. D. Kuhlmann, Koblenz