Ruhr-Universität Bochum

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1 RuhrUniversität Bochum Medizinische Fakultät Praktikum der Biologie für Mediziner Physiologie PH2 Thema: Membranpotenzial Ort: Praktikumsraum der Physiologie (MAFOSüd, Ebene 0, Raum 224) Zeit: 14:15 17:00 Uhr (gemäß GruppenVerteilungsplan)

2 2 STICHWORTLISTE (Zu diesen Stichworten sollen Sie sich vor dem Praktikum belesen) Entstehen des Membranpotenzials Funktionen des Membranpotenzials Diffusionspotenzial Gleichgewichtspotenzial Aktionspotenzial Refraktärperiode Ruhepotenzial Depolarisation Hyperpolarisation chemische Triebkraft elektrische Triebkraft NernstGleichung Leitfähigkeit/Permeabilität GoldmannHodgkinKatzGleichung Na K ATPase Ionenkanäle Spannungsabhängigkeit von Ionenkanälen Kotransport/Antiport intra/extrazelluläre Ionenverteilung aktiver Transport sekundäraktiver Transport passiver Transport BENÖTIGTE MATERIALIEN Bitte bringen Sie einen logarithmusfähigen Taschenrechner mit. Aus den Teilnehmern an einem Praktikumstag werden Teilnehmergruppen gebildet, von denen jede Gruppe (i.d.r. 4 Personen) einen Taschenrechner benötigt.

3 3 EINLEITUNG Jede lebende tierische Zelle hat ein Membranpotenzial. Es ist Voraussetzung für viele physiologische Prozesse in den verschiedenen Zelltypen. Sehr offensichtlich ist seine Bedeutung für die Signalübertragung im Nervensystem oder für die Erregung der Skelettmuskulatur. Aber auch die Funktion der Darmepithel oder Nierenepithelzellen (Resorption, Sekretion) ist von deren Membranpotenzial abhängig. Ebenso wird die Sekretion des Pankreashormons Insulin über das Membranpotenzial der ßZellen gesteuert. (Zur Therapie des Diabetes mellitus eingesetzte Pharmaka beeinflussen dementsprechend das Membranpotenzial der ßZellen.) Umgekehrt können Störungen der Prozesse, die am Entstehen und Regulieren des Membranpotenzials beteiligt sind, zu schweren Krankheitsbildern führen. Ohne auf Details einzugehen, seien folgende Beispiele genannt: Herzrhythmusstörungen, Myasthenia gravis (Störung der neuromuskulären Erregungsübertragung), Epilepsie, Myotonien (Muskelerkrankungen, denen Fehlfunktionen von Natriumkanälen in Skelettmuskelzellen zugrunde liegen), Mukoviszidose (= Zystische Fibrose; häufigste Erbkrankheit, bei der ein defekter Chloridkanal in Epithelzellen u.a. zu schwersten Lungenfunktionsstörungen führt), Diarrhoe (Aktivierung der Chloridleitfähigkeit im Darmepithel). Darüber hinaus wirken viele Pharmaka und natürlich vorkommende Gifte spezifisch auf Ionenkanäle (Lokalanästhetika, CalciumAntagonisten; BotulinusToxin; Curare).

4 4 Im Rahmen dieses Praktikums wollen wir uns mit den theoretischen Grundlagen der Entstehung des Membranpotenzials beschäftigen: I) Eine K Elektrode wird als Modell für eine Zelle und ihr Membranpotenzial angenommen, und es wird die Entstehung eines Diffusionspotenzials erklärt. II) In einem Demonstrationsversuch wird das Membranpotenzial einer lebenden Froscheizelle gemessen. I. ENTSTEHUNG EINES DIFFUSIONSPOTENZIALS Theoretische Grundlagen Um ein Diffusionspotenzial zu erzeugen, genügt es, zwei Salzlösungen durch eine selektiv permeable Membran zu trennen. Wir stellen uns folgenden Modellversuch vor: undurchlässige Membran _ K selektive Membran A B A B K = Cl = Abb. 1: Modellversuch zur Entstehung eines Diffusionspotenzials über einer K selektiven Membran

5 5 Eine Kammer ist in zwei Kompartimente unterteilt. In Kompartiment A befindet sich eine Lösung mit 100 mmol/l KCl und in Kompartiment B eine mit 10 mmol/l KCl. Positiv geladene K und negativ geladene Cl Ionen sind in den Lösungen völlig ungeordnet, solange beide Kompartimente durch die undurchlässige Trennwand voneinander abgeteilt sind. Es kann keine Potenzialdifferenz gemessen werden (Abb. 1, links). Das ändert sich, wenn die Trennwand durch eine K selektive Membran ersetzt wird (Abb. 1, rechts). Der Konzentrationsgradient liefert jetzt die chemische Triebkraft für die Diffusion der K Ionen. Diese diffundieren entlang des Konzentrationsgradienten (= chemischer Gradient) durch die Membran. Allerdings wird die Diffusion wegen der elektrischen Ladung der K Ionen bald limitiert. Das erste K Ion erfährt nur die Triebkraft des chemischen Gradienten. Es lässt jedoch ein negativ geladenes Cl Ion zurück, so dass bereits eine gewisse Ladungstrennung eintritt und dadurch eine elektrische Triebkraft entsteht, die der chemischen entgegengesetzt ist. Das zweite K Ion erfährt zwar die chemische Triebkraft wie Nr. 1, es muss aber die elektrische Anziehungskraft des vorher zurückgebliebenen Cl Ions überwinden und kann deshalb die Membran nicht mehr so leicht passieren wie Nr. 1. Nachdem einige K Ionen nach B diffundiert sind, üben die zurückgebliebenen Cl Ionen eine so starke Anziehungskraft aus, bzw. ist die elektrische Triebkraft so groß, dass keine weiteren K Ionen das Kompartiment A verlassen können. Chemische und elektrische Triebkraft halten sich die Waage, wir haben das Gleichgewicht erreicht. Entsprechend misst man jetzt das Gleichgewichtspotenzial. Da sich das Gleichgewichtspotenzial auf Grund der Diffusion der K Ionen von A nach B aufgebaut hat, handelt es sich hierbei um ein Diffusionspotenzial. (Das Diffusionspotenzial ist übrigens immer so gerichtet, dass es die Diffusion des besser permeablen Ions, hier K, verlangsamt.) Wichtig ist, dass sich die K Konzentrationen in A und B im Gleichgewichtszustand nicht messbar von denen im Ausgangszustand unterscheiden, und es zu keinem Konzentrationsausgleich für K Ionen kommt. Es kommt also nur zu einer Ladungstrennung in unmittelbarer Nähe der Membran, so dass die Membran als eine Art Plattenkondensator aufgefasst werden kann, dessen Platten ihre an die Kompartimente A und B grenzenden Flächen sind. Da diese Membran sehr dünn ist, genügen schon geringe Ladungsunterschiede, um eine Spannung aufzubauen.

6 6 Die chemische Triebkraft wird in einem solchen System in Abhängigkeit von den KaliumKonzentrationen der vorliegenden Lösungen (c i innen und c a außen) wie folgt beschrieben: W K R * T * ln c c a i Für die elektrische Triebkraft in einem solchen System in Abhängigkeit von den Potentialen bei den vorliegenden Lösungen (E i innen und E a außen) gilt: E Wel ( Ei Ea ) * F * z Befindet sich das System in einem Gleichgewichtszustand, sind beide Triebkräfte gleich groß. Daher können die Formeln für die Triebkräfte gleichgesetzt werden. Dadurch wird die NernstGleichung erhalten, die den Zusammenhang zwischen der Größe des Diffusionspotentials und den Ionenkonzentrationen in den Lösungen beschreibt: R * T ca E * ln z * F c i Es bedeuten: E = Gleichgewichtspotenzial [mv] T = absolute Temperatur; 310 K(elvin) bei Körpertemperatur, 293 K bei 20 C F = FaradayKonstante = 9, A s mol 1 R = allgemeine Gaskonstante = 8,31 J K 1 mol 1 z = Wertigkeit des Ions c a = Konzentration Außenlösung c i = Konzentration Innenlösung Für einwertige Ionen kann für R * T unter Einbeziehung einer Umwandlung vom natürlichenz * F (ln) zum dekadischen Logarithmus (lg) eine Konstante 61 mv eingesetzt werden. Für unser Beispiel ergibt sich demnach bei 37 C ein Diffusionspotenzial von: 100mmol / l E 61mV *lg 61mV 10mmol / l

7 7 Das Diffusionspotenzial hängt also ausschließlich von der Größe des Konzentrationsgradienten für das betreffende Ion ab, in unserem Beispiel für K. Diese theoretischen Überlegungen sollen nun experimentell mit einer K selektiven Elektrode nachvollzogen werden (siehe Abb. 2). Referenz KElektrode Elektrode chlorierter Silberdraht Cl Na K Cl K Cl Cl Na K Cl K Cl Na Cl K selektive Membran Abb. 2: Schematischer Aufbau einer K selektiven Elektrode Das Kernstück dieser Elektrode ist eine Membran, die ausschließlich für K Ionen permeabel ist. Gefüllt ist das Innere der Elektrode mit einer 3 M KClLösung, in der ein chlorierter Silberdraht steckt, der die Verbindung zum Verstärker herstellt. Taucht man die Elektrode nun in KClhaltige Lösungen, hat man die gleiche Situation wie im oben beschriebenen Modellversuch. Entlang des chemischen Gradienten für K über der K selektiven Membran der Elektrode baut sich ein Diffusionspotenzial auf, das von der Größe des Konzentrationsgradienten abhängt.

8 8 Versuch Ziel dieses Versuchs ist es, das Diffusionspotenzial für K zu bestimmen, das sich zwischen RingerLösungen mit unterschiedlichen K Konzentrationen ausbildet. Dazu sind Ihnen eine Modellösung für das Zytoplasma ( Innen ) und fünf verschieden konzentrierte Modellösungen für den Extrazellulärraum ( Außen, Lösungen A bis E) vorgegeben. 1. Aufgabe: Bestimmung des Antwortverhalten der Elektrode (Eichung der Elektrode) Praktischer Versuchsablauf: Wie in Abb. 2 schematisch gezeigt, tauchen Sie K Elektrode und Referenzelektrode in ein Becherglas, das zunächst die Außenlösung Lösung E mit 5 mmol/1 K enthält, bis Sie ein stabiles Potenzial am Verstärker ablesen können (E außen ). Anschließend wiederholen Sie diese Messung mit der Innenlösung (E innen ), die eine Konzentration von 120 mmol/l K aufweist. Bei angenommener konstanter Temperatur kann die NernstGleichung vereinfacht werden, indem die vor dem Logarithmus stehenden Faktoren zu einem Faktor (slope) zusammengefasst werden, außerdem kann der natürliche Logarithmus (ln) zur einfacheren Berechung in den 10erLogarithmus (log) umgewandelt werden, wobei der Umrechnungsfaktor mit in den slope eingeht. Setzen Sie die Konzentrationen und Potentiale der Lösungen in die vereinfachte NernstGleichung ein, um den slope zu erhalten. R* T slope * z * F 2,3 ln log E E i a c slope* log c a i Ergebnis für slope mv Der slope gibt das Antwortverhalten der K Elektrode wieder. Unter idealen Bedingungen beträgt er (bei Raumtemperatur) 59 mv, wenn die Konzentration des Messions (hier K ) um den Faktor 10 verändert wird. Warum? 2. Aufgabe: Bestimmung der K Konzentrationen der verbleibenden Außenlösungen. Messen Sie analog zu Aufgabe 1 die Potentiale der übrigen Außenlösungen. Mit Hilfe des berechneten slopes und den bekannten Werten für die Innenlösungen (E i gemessen, c i 120 mm K ) kann durch Einsetzen des gemessenen Potentiale der Außenlösungen in die vereinfachte NernstGleichung die K Konzentration der Außenlösungen bestimmt werden. Ergebnisse Lösung E 1. Messung [mv] E 2. Messung [mv] E Durchschnitt [mv] c K [mm] A B C D E 5 innen 120

9 9 Tragen Sie Ihre Werte auch in folgendes Diagramm (halblogarithmisch) ein. Was für eine Kurve erwarten Sie? Warum? E [mv] K Konzentration [mm] Abb. 3 zeigt die Abhängigkeit der Ruhemembranpotenziale einer Herzmuskelzelle von der extrazellulären K Konzentration [K ] a. Dabei wurde mit einer Mikroelektrode (s.u.) in die Zelle eingestochen und schrittweise die [K ] a variiert. Membranpotential (mv) Meßwerte Nernstbeziehung für [K ] K Außenkonzentration (mmol/l) Abb. 3: Ruhemembranpotenziale einer Herzmuskelzelle Vergleichen Sie Ihre Kurve mit der aus Abb. 3! Wieso ist der Kurvenverlauf bei Herzmuskelzellen nicht linear?

10 10 Fragen Wie sind die intra und extrazellularen Konzentrationen von K, Na, Cl, Ca 2 in mmol/l? Berechnen Sie die jeweiligen Gleichgewichtspotenziale! Vergleichen Sie diese Gleichgewichtspotenziale mit dem Ruhemembranpotenzial einer Nervenzelle von 80 mv! Wie groß sind die Triebkräfte für die jeweiligen Ionen über die Zellmembran? Wie kann eine Zelle den großen elektrochemischen Gradienten für Na und Ca 2 aufrechterhalten? Was ist der grundlegende Unterschied zwischen der Diffusion geladener Teilchen wie z.b. K Ionen und der Diffusion ungeladener Teilchen wie z.b. Harnstoff?

11 11 II. Demonstrationsversuch Im ersten Teil des Praktikums wurden am Beispiel einer K Elektrode die theoretischen Grundlagen des Membranpotenzials besprochen. In diesem Demonstrationsversuch soll das Membranpotenzial einer lebenden Zelle, nämlich einer Froschoozyte, gemessen werden. Auf Grund ihrer enormen Größe (Durchmesser ca. 1,2 mm; vergleiche Erythrozyt: 0,007 mm) sind Froschoozyten sehr gut für solche Messungen geeignet. Bei der Besprechung des Diffusionspotenzials hatten Sie die NernstGleichung kennengelernt. Mit ihr lassen sich Diffusionspotentiale für jeweils eine Ionenart berechnen. Wie bereits erwähnt, wird das Membranpotenzial jedoch nicht nur durch eine Ionenart, sondern durch mehrere bestimmt. Zur Berechnung des Membranpotenzials E m einer Zelle wurde die NernstGleichung daher zur GoldmannHodgkinKatz Gleichung erweitert: RT P K [K ] i P Na [Na ] i P Cl [Cl ] a E = ln F P K [K ] a P Na [Na ] a P Cl [ Cl ] i P = Permeabilität der Zellmembran jeweils für Kalium, Natrium oder Chlorid Indices a und i = Bezeichnung für Extra und Intrazellulärraum Die Aussage dieser Gleichung ist, dass das Membranpotenzial einer Zelle vom Konzentrationsgradienten und der Leitfähigkeit der K, Na und Cl Ionen abhängt. Wäre z.b. eine Zellmembran für Cl impermeabel, also P Cl = 0, so werden die Produkte P Cl [Cl ] i und P Cl [Cl ] a in der GoldmannHodgkinKatzGleichung ebenfalls Null. Die intra und extrazellulären Chloridkonzentrationen hätten daher in diesem Beispiel keinen Einfluss auf das Membranpotenzial. Umgekehrt wirken sich Änderungen des Konzentrationsgradienten eines Ions umso stärker auf das Membranpotenzial aus, je höher seine Permeabilität ist. In dem Demonstrationsversuch sollen diese Überlegungen am Beispiel von K Ionen veranschaulicht werden. Wir untersuchen die Abhängigkeit des Membranpotenzials von Froschoozyten vom Konzentrationsgradienten für Kaliumionen und von der Permeabilität der Zellmembran für Kaliumionen. Den Konzentrationsgradienten für K Ionen verändern wir, indem wir die K Konzentration im Extrazellulärraum anheben (Hyperkaliämie). Die K Permeabilität der Oozytenmembran verändern wir durch die Gabe eines K Kanalblockers. Wir verwenden hier Barium als wirksamen K Kanalblocker.

12 12 Versuchsaufbau Der Versuchsaufbau ist schematisch in Abb. 4 gezeigt. Verstärker Ringerlösung Mikroelektrode Referenzelektrode Oozyt Abb. 4: Versuchsaufbau zum Messen des Membranpotenzials von Froschoozyten Die Oozyten liegen in Vertiefungen in einer Experimentierkammer und werden kontinuierlich mit RingerLösung überströmt. Ihr Membranpotenzial wird mit Mikroelektroden gemessen. Mikroelektroden sind fein ausgezogene Glaskapillaren, deren Öffnungen an der Spitze einen Durchmesser von < 1 µm haben und mit denen man durch die Zellmembran ins Zytoplasma der Oozyten sticht. Eine ElektrolytLösung im Innern der Mikroelektroden sorgt für die elektrische Verbindung zwischen Zytoplasma und Verstärker. Obwohl Oozyten im Vergleich zu anderen Zellen riesige Ausmaße haben (s.o.), sind sie immer noch zu klein, um sie ohne Hilfsmittel mit einer Mikroelektrode zu punktieren. Daher werden alle Experimente unter einem Stereomikroskop (max. 160fache Vergrößerung) durchgeführt, und die Mikroelektrode wird mit einem Mikromanipulator bewegt. Das Membranpotenzial der Oozyten wird unter vier verschiedenen Bedingungen gemessen: E m (mv) 1) Kontrolle ([K ] a = 3 mmol/l) 2) Leichte Hyperkaliämie ([K ] a = 6 mmol/l) 3) Schwere Hyperkaliämie ([K ] a = 30 mmol/l) 4) Blockade der K Kanäle mit Bariumionen

13 13 Fragen Erklären Sie die beobachteten Veränderungen des Membranpotenzials! Erwarten Sie außer für K noch Permeabilitäten für andere Ionen, z.b. Na, Cl? Warum? Wieviel mv Spannungsänderung beim Wechsel von 3 auf 30 mmol/l K hätten Sie mit einer K Elektrode gemessen? Was erwarten Sie, wenn [Cl ] a erniedrigt wird? Was erwarten Sie bei einer Gabe von Na Kanalblockern? Wozu braucht die Zelle ein Membranpotenzial? Was hält das Membranpotenzial aufrecht? Was ist ein Gleichgewichtspotenzial?