INAUGURAL - DISSERTATION

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1 Aus der Zentrumsabteilung für Chemische Analytik und Endokrinologie im Zentrum für Lebensmittelwissenschaften der Tierärztlichen Hochschule Hannover Entwicklung eines ACTH-Bioassays; möglicher Einsatz in der Diagnostik des Caninen Cushing-Syndroms INAUGURAL - DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Sonja Küster aus Delmenhorst Hannover 2003

2 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H.-O. Hoppen 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Hoppen 2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Parvizi Tag der mündlichen Prüfung:

3 meiner Familie

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5 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Seite Inhaltsverzeichnis... I Abbildungsverzeichnis... IV Tabellenverzeichnis... V Abkürzungsverzeichnis...VII 1. Einleitung Schrifttum Adrenocorticotropes Hormon Struktur, Biosynthese und Sekretion Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenachse Konzentrationsbestimmung Handhabung der Probe Nachweismethoden für ACTH Weitere POMC-Peptide Struktur und Biosynthese Funktion Canines Cushing-Syndrom Ätiologie und Pathogenese Klinische, klinisch-chemische und röntgenologische Befunde Diagnostik Hormonwerte Endokrinologische Funktionstests Therapie Material und Methoden Material und Tiere Vorversuche zur Blutprobenaufbereitung ACTH-Bioassay... 27

6 Inhaltsverzeichnis II Herstellung der Lösungen Präparation der Nebennieren Durchführung des ACTH-Bioassays Verdünnungsreihe zur Erstellung der ACTH-Eichkurve Überprüfung der Funktionsfähigkeit Verdünnung der Blutproben Analysemethoden Cortisol-Radioimmunoassay (Cortisol-RIA) Cortisol- und ACTH-Messung mittels IMMULITE Statistische Methoden Ergebnisse ACTH-Bioassay Entwicklung des ACTH-Bioassays Ermittlung der optimalen Zellkonzentration Erstellung der ACTH-Eichkurve Überprüfung der Funktionsfähigkeit Blutproben-Aufbereitung Beeinflussung durch Serumbestandteile Kontrollserum Cortisol-Radioimmunoassay (Cortisol-RIA) Probemenge Extraktion der Proben Vergleich zwischen der ACTH-Immunreaktivität und der ACTH- Bioaktivität IMMULITE Cortisol- und ACTH-Gehalte der Blutproben ACTH-Bioaktivität der Blutproben Diskussion ACTH-Bioassay Entwicklung des ACTH-Bioassays Ermittlung der optimalen Zellkonzentration Erstellung der ACTH-Eichkurve...53

7 Inhaltsverzeichnis III Überprüfung der Funktionsfähigkeit Blutproben-Aufbereitung Beeinflussung durch Serumbestandteile Kontrollserum Vergleich zwischen der ACTH-Immunreaktivität und der ACTH- Bioaktivität IMMULITE Cortisol- und ACTH-Gehalte der Blutproben ACTH-Bioaktivität der Blutproben Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Tabellenanhang... 81

8 Abbildungsverzeichnis IV Abbildungsverzeichnis Seite Abbildung 1: POMC-Peptidsynthese in der Pars distalis und Pars intermedia... 9 Abbildung 2: Cortisolproduktion bei einer Zellkonzentration von 1,2 x 10 6 Zellen/ml Zellsuspension Abbildung 3: Cortisolproduktion bei niedrigen ACTH-Zugaben Abbildung 4: ACTH-Eichkurven elf verschiedener Bioassays Abbildung 5: Cortisolproduktion bei geringer, moderater und guter Produktivität der Zellen Abbildung 6: ACTH-Eichkurve des Bioassays Nr Abbildung 7: Cortisolproduktion mit und ohne vorheriger Extraktion der Proben... 46

9 Tabellenverzeichnis V Tabellenverzeichnis Seite Tabelle 1: Klinische Befunde beim caninen Hyperadrenocorticismus Tabelle 2: Klin.-chem. Befunde beim caninen Hyperadrenocorticismus Tabelle 3: Normbereiche von Cortisol beim Hund Tabelle 4: Normbereiche von ACTH beim Hund Tabelle 5: Qualitätskriterien der verwendeten Hormonassays Tabelle 6: Cortisol- und ACTH-Gehalte der humanen und porcinen ACTH Lösungen, gemessen im IMMULITE Tabelle 7: Cortisol- und ACTH-Gehalte vor und nach Einfachextraktion mit verschiedenen Lösungsmitteln Tabelle 8: Cortisol- und ACTH-Gehalte vor und nach Zweifachextraktion mit 1-Butanol und Ethylacetat Tabelle 9: bioacth-werte der Seren zur Überprüfung eines Serumeffektes Tabelle 10: Cortisol- und ACTH-Gehalte der untersuchten Blutproben, gemessen im IMMULITE Tabelle 11: iracth- und bioacth-werte der untersuchten Blutproben... 49

10 Tabellenverzeichnis VI Tabelle A1: Kreuzreaktion des Cortisol-Antikörpers im RIA Tabelle A2: Spezifität des Antiserums zu ACTH-Fragmenten Tabelle A3: Kreuzreaktion des Cortisol-Antikörpers im IMMULITE Tabelle A4: Cortisolproduktion bei 0,4, bis 0,8 x 10 6 Zellen/ml Zellsuspension Tabelle A5: Cortisolproduktion bei 1,2, bis 1,6 x 10 6 Zellen/ml Zellsuspension Tabelle A6: Cortisolproduktion bei unterschiedlichen ACTH-Konzentrationen.. 85 Tabelle A7: Korrelation der ACTH-Eichkurven verschiedener Bioassays Tabelle A8: Cortisolproduktion bei guter, moderater und geringer Produktivität der porcinen Nebennierenrindenzellen Tabelle A9: Cortisolproduktion mit und ohne Extraktion der Zellsuspensionen im RIA... 88

11 Abkürzungsverzeichnis VII Abkürzungsverzeichnis ACTH ADH ALT AP AST AVP bioacth BSA CLIP CRH EDTA END FBS HEPES i.m. iracth i.v. LPH MSH NNR o,p -DDD PBS POMC RIA RPMI Adrenokortikotropes Hormon (Kortikotropin) Antidiuretisches Hormon Alanin-Amino-Transferase Alkalische Phosphatase Aspartat-Amino-Transferase Arginin-Vasopressin ACTH-Bioaktivität Bovines Serumalbumin Corticotropin-like intermediate lobe peptide Corticotropin-Releasing-Hormon Ethylendiamintetraazetat Endorphin Fötales Bovines Serum 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure intramuskulär ACTH-Immunreaktivität intravenös Lipotropes Hormon (Lipotropin) Melanozyten-stimulierendes-Hormon (Melanotropin) Nebennierenrinde ortho-para-dichlordiphenyldichlorethan phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung Pro-Opiomelanocortin Radioimmunoassay Roswell Park Memorial Institute

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13 Einleitung 1 1. Einleitung Das canine Cushing-Syndrom oder caniner Hyperadrenocortizismus ist heutzutage eine der am häufigsten diagnostizierten Endokrinopathien des Hundes. In über 80% der Fälle ist das Cushing-Syndrom beim Hund hypophysär bedingt mit einer übermäßigen Sekretion des adrenocorticotropen Hormons (ACTH). In der Literatur wird zur Unterscheidung zwischen hypophysärem und adrenalem Hyperadrenocorticismus häufig die Bestimmung der basalen ACTH-Konzentration empfohlen. Im hiesigen Labor werden die ACTH-Konzentrationen mit einem Festphasen- Sandwich-Chemilumineszenz-Immunoassay gemessen, der hochspezifisch für intaktes, humanes ACTH 1-39 ist. In der Mehrzahl der Proben, bei denen mittels Low- Dose-Dexamethason Hemmtest ein Hyperadrenocorticismus diagnostiziert wurde, sind jedoch, entgegen der Erwartung, nur minimale ACTH-Konzentrationen zu messen. ROTERMUND (2000) bestätigt dies in ihrer Dissertation, in der lediglich einer von 36 Hunden einen über der Norm befindlichen Basalwert aufweist, und die ACTH- Basalkonzentration von 12 Hunden sogar unterhalb der Nachweisgrenze liegt. Es stellt sich nun die Frage, inwiefern die Ergebnisse des Immunoassays (iracth) auch die ACTH-Bioaktivität (bioacth) zum Ausdruck bringen. Vor diesem Hintergrund hat die vorliegende Studie folgende Zielsetzung: Entwicklung eines ACTH-Bioassays mit porcinen Nebennierenrindenzellen Erstellen einer ACTH-Eichkurve zur Bestimmung des bioacth in caninen Blutproben Vergleich zwischen der ACTH-Immunreaktivität und der ACTH-Bioaktivität in caninen Blutproben

14 Schrifttum 2 2. Schrifttum 2.1. Adrenocorticotropes Hormon Struktur, Biosynthese und Sekretion Struktur ACTH ist ein aus 39 Aminosäuren bestehendes Peptidhormon, dessen N-terminales Ende aus den Aminosäuren 1-18 biologisch aktiv ist (FELDMAN u. NELSON 1996). Peptide mit weniger als 16 Aminosäuren stimulieren die Nebennierenrinde (NNR) nicht mehr, besitzen jedoch eine erhöhte melanotrope Aktivität (LABHARDT u. MÜLLER 1978). Die Aminosäurensequenz ist in den ersten 24 Aminosäuren bei allen bisher untersuchten Spezies identisch. Das canine ACTH unterscheidet sich nur in einer Aminosäure im C-terminalen Ende des Moleküls von dem des Menschen. Beim Menschen befindet sich an der Position 37 die Aminosäure Leucin, während der Hund an dieser Stelle die Aminosäure Valin besitzt (MOL et al. 1991). Biosynthese In der Adenohypophyse wird ACTH aus dem Vorläufermolekül Proopiomelanocortin (POMC) synthetisiert. Neben ACTH werden noch viele weitere POMC-Peptide freigesetzt (Kap.2.2.) (RIJNBERK 1996a). Im Unterschied zum Menschen besitzt die Adenohypophyse des Hundes neben der Pars distalis eine gut ausgebildete Pars intermedia. HALMI et al. (1981) finden in ihren Untersuchungen heraus, dass die Pars intermedia beim Hund aus zwei immunocytochemisch unterschiedlichen Zellarten besteht. Die vorherrschenden A- Zellen sind typische Pars intermedia Zellen (Melanotrope) mit starker Immunoreaktivität für α-melanotropin (α-msh; Melanozyten-stimulierendes-Hormon)

15 Schrifttum 3 und geringer Immunoreaktivität für ACTH. Die in geringerer Zahl vorkommenden B- Zellen gleichen immunocytochemisch den Pars distalis Corticotropen mit hoher Immunoreaktivität für ACTH und β-lipotropin (β-lph), jedoch nicht für α-msh. Sie sind, so vermuten die Autoren, für die hohe ACTH-Bioaktivität der caninen Pars intermedia verantwortlich. Sekretion Die ACTH-Sekretion aus der Adenohypophyse wird durch den Hypothalamus und das Zentrale Nervensystem reguliert über Neurotransmitter, die die hypothalamischen Hormone Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH) und Arginin- Vasopressin (AVP), auch bekannt als Antidiuretisches Hormon (ADH), freisetzen (VAN WIJK et al. 1994). Nach RIJNBERK (1996a) können vier Mechanismen der neuroendokrinen Kontrolle unterschieden werden: 1. die episodische Sekretion 2. Streßreaktionen 3. Feedbackhemmung durch Cortisol 4. immunologische Faktoren Bei der episodischen ACTH-Sekretion, die im Gegensatz zum Menschen jedoch keinen zirkadianen Verlauf aufweist, variieren die Frequenz und Amplitude der Sekretions-Peaks individuell stark und sind im allgemeinen bei Hündinnen häufiger und größer als bei Rüden (KEMPPAINEN u. SARTIN 1984). Streßreaktionen haben ihren Ursprung im Zentralen Nervensystem und führen über eine erhöhte Freisetzung von CRH und AVP zur Stimulation der ACTH-Sekretion. An der Feedbackhemmung durch Glucocorticoide sind zwei verschiedene Rezeptormoleküle beteiligt, die Mineralocorticoidrezeptoren (MR) und die Glucocorticoidrezeptoren (GR). Die Hemmung der ACTH-Sekretion durch Glucocorticoide wird vorwiegend durch die MRs vermittelt. Die GRs spielen vor allem bei der Feedbackhemmung nach Streßreaktionen eine Rolle (RIJNBERK 1996a).

16 Schrifttum 4 Nach REUL et al. (1991) kommt es bei alten Hunden zu einer progressiven Dysfunktion der Hypothalamus-Hypophysen-Nebenierenachse mit erhöhten basalen ACTH- und Cortisolkonzentrationen. Den Grund dafür sehen die Autoren in einer Abnahme der MRs bei alten Hunden um 50-75%. Bei den immunologischen Faktoren sollen vor allem die Cytokine eine Rolle spielen. Dabei handelt es sich um Polypeptide, die von aktivierten Immunzellen freigesetzt werden. Nach BUCKINGHAM et al. (1992) erhöht insbesondere das von aktivierten Makrophagen produzierte Interleukin-1 die ACTH-Freisetzung Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenachse Die Hypothalamus-Hypophysen-Nebenierenachse ist gekennzeichnet durch stimulierende Hormone und negative Feedbackkontrolle. Der paraventrikuläre Nukleus des Hypothalamus synthetisiert CRH und AVP, welche über das hypothalamisch-hypophysäre Portalsystem zum Hypophysenvorderlappen gelangen und dort die Corticotropen zur ACTH-Freisetzung anregen. ACTH stimuliert die Synthese und Sekretion von Cortisol aus den Zellen der Zona fasciculata und Zona reticularis der NNR. Die Glucocorticoide regulieren wiederum die ACTH- Freisetzung durch negativen Feedback sowohl am Hypothalamus als auch an der Hypophyse. ZERBE (1999) weist darauf hin, dass beim Hund nicht nur diese klassisch definierte Achse eine Rolle spielt, sondern auch die Vorgänge an der Pars intermedia beachtet werden müssen. Die Pars intermedia ist weniger gut durchblutet und wird vor allem direkt neuroendokrin durch dopaminerge Hemmung und β-adrenerge bzw. serotinerge Stimulation reguliert (KRIEGER 1983). Des weiteren haben laut KEMPPAINEN et al. (1989) Somatostatin, Norepinephrin und Epinephrin eine hemmende Wirkung. Die ACTH-Sekretion in der Pars intermedia unterliegt nicht der negativen Feedbackkontrolle durch Glucocorticoide (PETERSON et al. 1986; KEMPPAINEN et al. 1989).

17 Schrifttum 5 ACTH reguliert nicht nur die Synthese der corticosteroiden Hormone, sondern ebenso das Wachstum und die Replikation der corticalen Zellen. Ein ACTH-Mangel führt zur Atrophie, ein ACTH-Überschuß zu Hyperplasie und Hypertrophie der NNR (GILL 1972). ORTH u. KOVACS (1998) bezeichnen die Einleitung der Cortisolbiosynthese als akuten ACTH-Effekt, der innerhalb von Minuten seine Wirkung entfaltet, und das Wachstum der NNR-Zellen als chronischen Effekt, welcher Stunden oder Tage benötigt. Die Zona fasciculata bildet eine funktionelle Einheit mit der Zona reticularis. In diesen beiden Zonen der NNR werden Glucocorticoide (Cortisol und Corticosteron) und Androgene produziert. Der äußeren Zona glomerulosa fehlt das Enzym 17α- Hydroxylase, so dass hier keine Glucocorticoide, sondern Mineralocorticoide (vor allem Aldosteron) gebildet werden. ACTH bindet an Rezeptoren, über die in der Zelle aus Lipoproteinen freies Cholesterol freigesetzt wird. Cholesterol ist die Ausgangssubstanz der Steroidbiosynthese und wird über mehrere Zwischenstufen, unter anderem Pregnenolon und Progesteron, zu allen anderen Steroidhormonen umgebildet. Verschiedene Cytochrom P-450 Enzyme katalysieren diese Umwandlungen. Da in den Zellen der NNR kein Cortisol gespeichert werden kann, setzt die Synthese unmittelbar nach der Stimulation ein (RIJNBERK 1996a) Konzentrationsbestimmung Handhabung der Probe Die Handhabung der Probe, von der Blutentnahme über den Versand bis hin zur Lagerung, hat einen großen Einfluß auf die gemessene ACTH-Konzentration. Eine große Bedeutung hat dabei die Halbwertzeit des im Blut zirkulierenden ACTHs, wobei zwischen der biologischen und der immunreaktiven Halbwertzeit unterschieden wird. Die immunreaktive Halbwertzeit ist abhängig von der Aminosäurensequenz, die der jeweilige im Testverfahren eingesetzte Antikörper

18 Schrifttum 6 erkennt. Die biologische Halbwertzeit des ACTHs ist kürzer als die immunreaktive und beträgt nur wenige Minuten. (BESSER et al. 1971). Nach STOUFFER u. LIPSCOMB (1963) bindet ACTH reversibel an Glasoberflächen, woraus falsch niedrig gemessene ACTH-Konzentrationen resultieren. KEMPPAINEN et al. (1994) finden jedoch lediglich unerhebliche Unterschiede im ACTH-Gehalt zwischen Plastik- und Glasröhrchen. DUPPOUY et al. (1985) berichten, dass Heparin die ACTH-Messung beeinflusst. Es bindet entweder direkt an die ACTH-Moleküle und/oder führt zur Aggregation der ACTH-Moleküle. Dies führt zu einer reduzierten Bindung von Antigen und Antikörper und folglich zu falsch hoch gemessenen ACTH-Konzentrationen. HEGSTAD et al. (1990) bestätigen dies und dokumentieren höhere ACTH-Konzentrationen in Heparin-Plasma im Vergleich zu EDTA-Plasma. Proteolytische Enzyme bewirken eine Instabilität von ACTH in Blut und Plasma (REES et al. 1976). In Vollblut ist ACTH weniger stabil als in Plasma (BESSER et al. 1971). Bei dem enzymatischen Zerfall entstehen ACTH-ähnliche Fragmente, die, je nach verwendetem Antikörper, an diesen binden oder nicht. Dies kann zu falsch hohen oder falsch niedrigen ACTH-Konzentrationen führen (DUPOUY et al. 1985). Der enzymatische Abbau des Polypeptids ACTH erfolgt durch Proteasen, den sog. Kallikreinen (MUTSCHLER 1991). Aprotinin ist ein Proteasenhemmer, der die Aktivität von Kallikrein und anderen proteolytischen Enzymen hemmt (GEBHARD et al. 1986). BESSER et al. (1971) berichten, dass Aprotinin sowohl die biologische als auch die immunreaktive Halbwertzeit von ACTH verlängert. KEMPPAINEN et al. (1994) dokumentieren deutliche Konzentrationsunterschiede zwischen zusatzfreien und aprotininversetzten Proben nach eintägiger Lagerung. Nach Meinung von HEGSTAD et al. (1990) macht der Zusatz von Aprotinin jedoch keinen nennenswerten Unterschied. Nach ROTERMUND (2000) ist der Einfluß von Aprotinin auf die ACTH-Konzentration bei Lagertemperaturen von 22 und 6 C unwesentlich. Signifikant wird der Unterschied bei einer Lagerung bei 20 C. Die Lagertemperatur spielt eine wesentliche Rolle für den enzymatischen Zerfall des

19 Schrifttum 7 ACTHs. Daher empfehlen ORTH (1979), PETERSON (1984) und FELDMAN u. NELSON (1996) die Entnahme in gekühlte Röhrchen, Transport auf Eis und Zentrifugation bei 4 C. HEGSTAD et al. (1990) können nach 90 Minuten bei 4 C oder Raumtemperatur (22-25 C) keine signifikanten Unterschiede in der ACTH-Konzentration beobachten. ROTERMUND (2000) fasst in Ihrer Dissertation zusammen: Die Stabilität des ACTH ist bei niedrigen Lagertemperaturen und/oder Aprotininzusatz deutlich höher. Neben dem enzymatischen Abbau können auch Veränderungen der chemischen Struktur des ACTH-Moleküls, z.b. durch Acetylierung oder Oxidation einzelner Aminosäuren, sowohl die biologische als auch die immunreaktive Aktivität verringern (ORTH 1979). HEGSTAD et al. (1990) empfehlen die Entnahme in EDTA-Röhrchen, Zentrifugation innerhalb von 15 bis 90 Minuten und Aufbewahrung in Plastikgefäßen bei 20 C für maximal einen Monat. ROTERMUND (2000) empfiehlt für den Versand, zunächst 500 KIE Aprotinin (Trasylol ) in EDTA-Röhrchen vorzulegen und diese bei 18 C bis zur Blutentnahme aufzubewahren. Nach Zentrifugation innerhalb 90 Minuten sollte der Versand in einem mit Kühlflüssigkeit gefüllten Kühlkontainer erfolgen Nachweismethoden für ACTH a) Immunoassays Immunoassays sind Meßverfahren, welche die spezifische Bindungsreaktion zwischen Antikörpern und dem gesuchten Analyt nutzen. Der in der Literatur am häufigsten beschriebene Immunoassay zum Nachweis von ACTH ist der Radioimmunoassay (RIA) (BERSON u. YALOW 1968; ORTH 1979; GUTKOWSKA et al. 1982). RIAs sind hochempfindliche Nachweisverfahren für Eiweißverbindungen im Piko- oder Nanogrammbereich. Das Grundprinzip besteht in der Konkurrenz zwischen radioaktiv markiertem Hormon und dem unmarkierten nachzuweisenden Hormon der Probe hinsichtlich der spezifischen Bindung an einen

20 Schrifttum 8 im Unterschuß vorliegenden Antikörper. Daher wird der RIA auch häufig als kompetitive Analyse bezeichnet. Mit steigender Hormonkonzentration der Probe verringert sich die gemessene Radioaktivität. Den Vorteil des RIAs im Vergleich zum Bioassay sehen GUTKOWSKA et al. (1982) in der höheren Sensitivität, dem geringeren Zeitaufwand und der Möglichkeit, viele Proben in einem Ansatz messen zu können. Jedoch weisen sie auf die Erkenntnisse von BESSER et al. (1971) hin, dass die biologischen und immunreaktiven Eigenschaften von ACTH mit unterschiedlichen Abschnitten des Moleküls in Zusammenhang stehen. Ein automatisiertes System zur Messung der ACTH-Konzentration bietet der IMMULITE. Dieser von BABSON (1991) beschriebene Festphasen-Sandwich- Chemilumineszenz-Immunoassay (Chemiluminescent Enzyme Immunometric Assay = CEA) stellt ein nichtkompetitives Verfahren dar, welches mit einem Reagenzüberschuß arbeitet. Ein spezifischer Antikörper bildet die Festphase, an die das nachzuweisende Hormon bindet. Ein zweiter, mit einem Enzym markierter Antikörper bindet an eine zweite Bindungsstelle des Hormons. Nun wird ein Chemilumineszenzsubstrat hinzugefügt, welches durch das Enzym zur Lichtemission angeregt wird. Die Stärke der gemessenen Lichtemission ist der gesuchten Hormonkonzentration direkt proportional. b) ACTH-Bioassay Der Begriff Bioassay beschreibt die Untersuchung der Reaktion lebender Versuchsobjekte auf bestimmte dosisabhängige Faktoren. Daraus resultiert eine spezifische Dosis-Wirkungs-Beziehung. Für ACTH wurden zahlreiche biologische Nachweisverfahren entwickelt, die verschiedene biologische Effekte dieses Hormons nutzen. Die ACTH-Aktivität kann anhand lebender Versuchstiere, Nebennieren oder NNR-Zellkulturen untersucht werden mittels Messung der Ascorbinsäurevermindernden oder der corticosteroiden Aktivität (GUTKOWSKA et al. 1982). Die Autoren erwähnen des weiteren Redoxassays, die darauf basieren, dass ACTH in der NNR reduzierende Gruppen vermindert, sowie Radiorezeptorassays, in denen adrenocorticale Zellrezeptoren verwendet werden. Am häufigsten werden in der

21 Schrifttum 9 Literatur zur Messung des bioacth NNR-Zellkulturen beschrieben. Verwendet werden vor allem Zellen von Meerschweinchen (LAMBERT et al. 1983; ROBERTSON u. BIDEY 1990; O`CONNELL et al. 1992) oder Ratten (GASSON 1979; BATEMAN 1986; SZALAY 1993), seltener von Schafen und Rindern (CATHIARD et al. 1985) oder Menschen (EGGENS et al. 1987). Gemessen wird die ACTH-Bioaktivität in diesen Studien anhand der Cortisolproduktion Weitere POMC-Peptide Struktur und Biosynthese Die POMC-Peptide werden alle aus dem gemeinsamen Vorläufermolekül Proopiomelanocortin (POMC) freigesetzt, welches sowohl in der Pars distalis als auch in der Pars intermedia der caninen Adenohypophyse synthetisiert wird. Nach RIJNBERK (1996a) werden ACTH und β-lph in den A-Zellen der Pars intermedia weiter prozessiert zu α-msh (ACTH 1-13 ) und CLIP (corticotropin-like intermediate lobe peptide, ACTH ) bzw γ-lph und β-end (β-endorphin): Pars distalis N-POMC 1-76 J Peptid ACTH 1-39 β-lph Pars intermedia N-POMC 1-48 γ 3 -MSH J Peptid α-msh CLIP γ-lph β-end Abb.1: POMC-Peptidsynthese in der Pars distalis und Pars intermedia (modifiziert nach RIJNBERK 1996a) FELDMAN u. NELSON (1996) berichten, dass sowohl β-lph als auch β-end die gleiche Sekretionsdynamik aufweisen wie ACTH. Das aus den Aminosäuren 1-76 bestehende N-terminale Ende des POMC-Moleküls

22 Schrifttum 10 wird in der Literatur zum Teil bezeichnet als 16k-Fragment (PEDERSEN et al. 1980; PHAM-HUU-TRUNG et al. 1986) oder als pro-γ-msh (LOH u. LORIAUX 1982; LOWRY et al. 1987) und wird in der Pars intermedia weiter prozessiert, wobei unter anderem γ 3 -MSH entsteht. α-msh, das bei allen bisher untersuchten Spezies identisch ist, besteht aus 13 Aminosäuren, die mit den ersten 13 Aminosäuren von ACTH übereinstimmen. β-msh, das aus einem weiteren Abbau von γ-lph entsteht, besteht bei den meisten Tieren aus 18 Aminosäuren (LABHARDT u. MÜLLER 1978) Funktion Die physiologische Funktion der meisten POMC-Peptide ist nicht bekannt (RIJNBERK 1996a). Lediglich einigen MSH-Arten und dem β-end können bestimmte Eigenschaften zugeordnet werden: Nach ORTH u. KOVACS (1998) sind α-, β-, und -γ-msh melanocytenstimulierende Hormone, welche diese Zellen zur Melaninsythese anregen LOWRY et al. (1987) beschreiben einen mitogenen Effekt des pro-γ-msh auf die NNR. Des weiteren potenziert es laut PEDERSEN et al. (1980) die ACTH-Wirkung auf die Steroidbiosynthese. β-end spielt eine wichtige Rolle als endogenes Peptid mit opioiden Eigenschaften (MOL et al. 1991) Canines Cushing-Syndrom Das canine Cushing-Syndrom oder caniner Hyperadrenocorticismus, entsteht durch die exzessive endogene Produktion oder die exogene Zuführung von Glucocorticoiden und ist eine der am häufigsten diagnostizierten Endokrinopathien des Hundes (HERRTAGE 1996).

23 Schrifttum Ätiologie und Pathogenese Die unterschiedlichen Ursachen des caninen Cushing-Syndroms werden in der Literatur folgendermaßen klassifiziert (FELDMAN 2000): 1. hypophysäres Cushing-Syndrom verursacht entweder durch einen Tumor der Hypophyse (Morbus Cushing) oder durch eine Hypothalamus-Fehlfunktion mit gesteigerter CRH-Sekretion und nachfolgender Hyperplasie der Hypophyse. In beiden Fällen führt die exzessive ACTH-Sekretion zu einer sekundären Hyperplasie der NNR. 2. adrenales Cushing-Syndrom infolge einer primären NNR-Erkrankung mit gesteigerter Cortisolproduktion. 3. iatrogene Ursachen durch überhöhte ACTH- (selten) oder Glucocorticoid-Medikation (häufig). Eine ektopische ACTH-Produktion, wie beim Menschen beschrieben, ist beim Hund bisher nicht dokumentiert worden. Sehr selten treten Tumore der Hypophyse und der NNR gemeinsam auf. PETERSON (1984) hält es für möglich, dass sich ein adrenaler Tumor unter bestimmten Umständen sekundär aufgrund der anhaltend vermehrten Stimulation durch ACTH entwickelt. MEIJER (1980) fand in seinen Untersuchungen heraus, dass etwa 80% der spontanen Erkrankungen hypophysär bedingt sind, wobei in 20% dieser Fälle ein Hypophysentumor entdeckt wurde. Es können sowohl Tumore der Pars distalis als auch der Pars intermedia zugrunde liegen. PETERSON et al. (1982a) finden bei 21 am Cushing-Syndrom erkrankten Hunden 15 (71%) mit Tumoren der Pars distalis und sechs (29%) mit Tumoren der Pars intermedia. Dabei können die Tumore der Pars intermedia sowohl von den A-Zellen als auch von den B-Zellen ausgehen (PETERSON et al. 1986). Es können alle Rassen betroffen sein, prädisponiert sind Toy-Pudel, Dackel und Boxer. Laut HERRTAGE (1996) sind auch kleine Terrier, Yorkshire- und Jack Russel-Terrier sowie Staffordshire Bullterrier häufiger betroffen. Der hypophysäre Morbus Cushing ist eine Erkrankung der mittelalten und alten Hunde, wobei das durchschnittliche Alter bei Diagnosestellung sieben Jahre beträgt. Weibliche Tiere

24 Schrifttum 12 scheinen häufiger betroffen zu sein als männliche (MEIJER 1980). PETERSON et al. (1982a) konnten in einer Untersuchung mit immuncytochemischer Färbung bei 80% der Hunde mit hypophysärem Cushing-Syndrom Hypophysenadenome nachweisen. Dabei handelt es sich für gewöhnlich um < 1cm große Mikroadenome. Makroadenome mit einem größeren Durchmesser zeigen häufig ein langsames Wachstum und führen nur in wenigen Fällen zu neurologischen Symptomen. Maligne Hypophysentumore sind selten (HERRTAGE 1998). Die restlichen 20% der Erkrankungen beruhen auf in der Regel unilateral auftretenden, gut- oder bösartigen, Tumoren der NNR. Diese Tumore sind häufig autonom, d.h. die Cortisolproduktion erfolgt unabhängig von der hypophysären ACTH-Stimulation. Deutlich wird dies anhand der Atrophie der nicht betroffenen NNR. Beim adrenalen Cushing-Syndrom gibt es keine Rassenpräferenz. Es sind vor allem alte Hunde mit einem durchschnittlichen Alter von 10 bis 11 Jahren betroffen, wobei Hündinnen dreimal häufiger erkranken als Rüden (MEIJER 1980). Tumore der NNR kommen bei großen Hunderassen häufiger vor. Adenome der NNR sind klein und nicht invasiv, während Karzinome meist groß, lokal invasiv, hämorrhagisch und nekrotisch sind. Häufig bilden sich Leber-, Lungen- und Nierenmetastasen. In beiden Fällen kommt es bei etwa 50% der Hunde zu partiellen Verkalkungen (HERRTAGE 1998) Klinische, klinisch-chemische und röntgenologische Befunde Das Cushing-Syndrom entwickelt sich meist schleichend über mehrere Monate oder Jahre und wird von den Besitzern anfangs meist als normaler Alterungsprozeß betrachtet. Die klinischen Symptome sind vielfältig und können auch intermittierend oder progressiv auftreten (PETERSON et al. 1982b). Die klinischen und klinisch-chemischen Befunde (Tabellen 1 und 2) sind das Resultat der metabolischen Effekte eines über längere Zeit andauernden Hypercortisolismus (MEIJER 1980).

25 Schrifttum 13 Tab.1: Klinische Befunde beim caninen Hyperadrenocorticismus (nach MEIJER 1980) Klinische Befunde % der Fälle Vergrößertes Abdomen 95 Hepatomegalie 90 Hautatrophie 90 Polydypsie/Polyurie/Polyphagie 85 Geringe Widerstandskraft gegenüber Anstrengungen 80 Muskelatrophie 70 Vermehrtes Hecheln 70 Lethargie 65 Verfettung 55 Intoleranz gegenüber warmer Umgebung 40 Exophthalmus 30 Anöstrus 85 Hodenatrophie 60 Tab.2: Klin.-chem. Befunde beim caninen Hyperadrenocorticismus (nach MEIJER 1980) Klinisch-chemische Befunde % der Fälle Erhöhte Alkalische Phosphatase (AP) 90 Eosinopenie 90 Lymphopenie 75 Neutrophilie 60 Erhöhte Alanin-Amino-Transferase (ALT) 50 Erhöhte Aspartat-Amino-Transferase (AST) 30 Hyperglycämie 30 Hyperglycämie/Glucosurie 10 Hypokaliämie 5 (hypophysär), 45 (adrenal) Hypernatriämie 30 Erniedrigtes Thyroxin (T 4 ) 50

26 Schrifttum 14 Die Hautveränderungen können mit einer Komedonenbildung durch Verstopfung der Haarfollikel oder, in selteneren Fällen, mit einer Hyperpigmentierung oder Kalzifizierung der Haut (Calcinosis cutis) einhergehen (HERRTAGE 1998). Röntgenologisch werden laut MEIJER (1980) v.a. eine Hepatomegalie mit erhöhter Röntgendichte des Lebergewebes, Osteoporose sowie die Kalzifikation verschiedener Gewebe, insbesondere der Bronchien und der Haut, beobachtet. Laut HERRTAGE (1998) erhöht sich die Alkalische Phosphatase gewöhnlich um das 5-40 fache des Normwertes und ist vermutlich einer der zuverlässigsten Indikatoren eines Cushing-Syndroms Diagnostik Hormonwerte Aufgrund der episodischen Sekretion sowohl des Cortisols als auch des ACTHs hat die Einzelwert-Bestimmung zu einem beliebigen Zeitpunkt keinen diagnostischen Wert, da sich die basalen Hormonwerte von gesunden und am Cushing-Syndrom erkrankten Hunden stark überschneiden. Einige Normwerte von Cortisol und von ACTH beim Hund sind in den Tabellen 3 und 4 angeführt. Die Werte variieren geringfügig entsprechend den angewandten Nachweisverfahren bzw. der verwendeten Antikörper. Cortisol-Normbereiche Tab. 3: Normbereiche von Cortisol beim Hund Autor Cortisol (ng/ml) Anzahl der Hunde KEMPAINEN u. ZERBE (1989) 5-40 Keine Angabe Zentrumsabteilung für Chemische Routinelabor Analytik und Endokrinologie (2003) PETERSON et al. (1986) OWENS u. DRUCKER (1977) FELDMAN (2000) 5-60 Keine Angabe

27 Schrifttum 15 Basale Cortisol-Konzentrationen bei Hunden mit Cushing-Syndrom Die exzessive Cortisolsekretion bei erkrankten Hunden kann nur ungenügend durch die Messung der Basalkonzentration erfasst werden, da die meisten Hunde aufgrund der episodischen Sekretion häufig Cortisolwerte innerhalb des Normbereiches aufweisen. Über den gesamten Tag gesehen wird jedoch vermehrt Cortisol produziert (FELDMAN 2000). PETERSON (1984) bestätigt dies und berichtet ebenfalls, dass die Cortisolbasalkonzentrationen bei Hunden mit Hyperadrenocorticismus häufig innerhalb des Normbereiches liegen. Zudem können auch nicht am Cushing-Syndrom erkrankte Hunde zum Teil erhöhte Cortisolwerte aufweisen. So ist beispielsweise allgemein bekannt, dass Antiepileptika häufig zu einer Erhöhung der Cortisolbasalwerte führen. Des weiteren kann eine Vorbehandlung mit synthetischen Glucocorticoiden wie z.b. Prednisolon oder Prednison aufgrund von Kreuzreaktivitäten mit dem Cortisol-Assay zu falsch hohen Werten führen (KEMPPAINEN u. ZERBE 1989). ACTH-Normbereiche Tab.4: Normbereiche von ACTH beim Hund Autor ACTH (pg/ml) Anzahl der Hunde PETERSON et al. (1986) 10,0 115,0 160 KEMPAINEN u. ZERBE (1989) 10,0 70,0 Keine Angabe HEGSTAD et al. (1990) 10,0 70,0 Keine Angabe VAN WIJK et al. (1994) 20,0 125,0 16 HERRTAGE (1998) 20,0 80,0 Keine Angabe FELDMAN u. NELSON (1996) 10,0 110,0 Keine Angabe Basale ACTH-Konzentrationen bei Hunden mit Cushing-Syndrom Generell sind beim hypophysären Morbus Cushing sowohl die Frequenz als auch die Amplitude der ACTH-Sekretions-Pulse chronisch erhöht (FELDMAN 2000). Allerdings findet man zu den ACTH-Basalkonzentrationen bei erkrankten Hunden in der Literatur sehr vielfältige Angaben. Aufgrund der verschiedenen verwendeten Analyse-Verfahren ist es nahezu unmöglich, die unterschiedlichen Angaben

28 Schrifttum 16 miteinander zu vergleichen. So untersucht FELDMAN (1983) 57 Hunde mit caninem Hyperadrenocorticismus und bestimmt die ACTH-Konzentration im Plasma mittels RIA. Dabei weisen 12 Hunde, die nachweislich einen adrenalen Tumor haben, ACTH-Konzentrationen von <36 pg/ml auf, während die ACTH-Konzentrationen der 45 Hunde mit hypophysärem Cushing-Syndrom zwischen 29 bis 340 pg/ml liegen. Nach FELDMAN und NELSON (1996) besteht bei Konzentrationen <10,0 pg/ml der Verdacht auf einen adrenocorticalen Tumor, während 90% der untersuchten Hunde mit einem hypophysären Cushing-Syndrom ACTH-Werte >45,0 pg/ml aufweisen. Den Autoren zufolge zeigen 35% dieser Tiere Werte >100,0 pg/ml. ORTH et al. (1988) entnehmen bei einem erkrankten Hund innerhalb von 24 Stunden alle 30 Minuten Blut und stellen starke Schwankungen zwischen 10,0 und 250,0 pg/ml fest. PETERSON et al. (1986) dokumentieren ACTH-Konzentrationen, die im Mittel zwar 2,5 bis 5 mal höher sind als in gesunden Hunden, allerdings überschneiden sich viele Einzelwerte beträchtlich mit den Normalwerten. Die Ergebnisse von ORTH et al. (1988) und PETERSON et al. (1986) bringen die Problematik, die sich durch die episodische Sekretion des ACTHs ergibt, deutlich zum Ausdruck. Im Unterschied zu den oben genannten Autoren ermittelt ROTERMUND (2000) in ihrer Dissertationen bei Hunden mit Hyperadrenocorticismus (n=36) eine mittlere Basalkonzentration, die unter jener gesunder Tiere liegt. Sie verwendet in ihrer Arbeit das automatisierte IMMULITE -System, das fast ausschließlich intaktes ACTH 1-39 erfasst. Dabei befinden sich 34% ihrer Werte unter 10,0 pg/ml, 46% zwischen 10,0 und 45,0 pg/ml, 17% über 45,0 pg/ml und nur 3% über 100,0 pg/ml. Cortisol-Creatinin-Ratio im Urin Laut KOLEVSKA und SVOBODA (2000) liegen über 90% des im Blut zirkulierenden Cortisols in gebundener Form vor. Das restliche Cortisol in freier, physiologisch aktiver Form, wird über den Urin ausgeschieden. HERRTAGE (1998) erläutert, dass sich bei erhöhten Cortisolkonzentrationen im Blut auch die Konzentrationen im Urin erhöhen. Indem man die Cortisolkonzentration (in µmol/l) in Relation zur

29 Schrifttum 17 Creatininkonzentration (in µmol/l) angibt, können Unterschiede in der Konzentrierung des Urins korrigiert werden, sofern die Nierenfunktion nicht beeinträchtigt ist. Die Messung des Cortisol-Creatinin-Ratio erfolgt im Morgenurin. Bei Hunden mit Hyperadrenocorticismus liegen die Werte über der Norm (>10 x 10-6 ). Nach FELDMAN (2000) zeichnet sich die Bestimmung des Cortisol-Creatinin-Ratio im Urin durch eine hohe Sensitivität aus, d.h. Hunde mit Hyperadrenocorticismus zeigen abnorm hohe Werte. Allerdings ist sie nicht sehr spezifisch, da viele anderweitig erkrankten Tiere ebenfalls keine normalen Werte aufweisen. Der Autor findet abnorme Werte bei Hunden mit Diabetes mellitus, Diabetes insipidus, Pyometra, Hypercalcämie und Lebererkrankungen Endokrinologische Funktionstests Das klassische Bild des caninen Cushing-Syndroms mit dem typischen cunshingoiden Habitus, wie es die Lehrbücher vermitteln, wird in der Praxis nur selten beobachtet. Oft sind die Symptome unspezifisch und zeigen sich nur vereinzelt. Daher sind endokrinologische Funktionstests zur Abklärung des Vorliegens eines Hyperadrenocorticismus unverzichtbar. Die Differenzierung zwischen hypophysär und adrenal bedingten Erkrankungen ist oftmals schwierig. Empfohlen werden in der Literatur die Durchführung eines High- Dose-Dexamethason Hemmtestes, die Messung der endogenen ACTH- Konzentrationen oder bildgebende Untersuchungsmethoden (Ultraschall, Computertomographie oder Magnetresonanztomographie) der Nebennieren (FELDMAN 1983; PETERSON 1984). ACTH-Stimulationstest Der ACTH-Stimulationstest wird angewandt zur Diagnose des Hyperadrenocorticismus, zur Unterscheidung zwischen spontanem und iatrogenem Cushing- Syndrom, zur Diagnose eines Morbus Addison sowie zur Kontrolle einer Lysodren - Therapie. Durch Zufuhr einer maximal stimulierenden ACTH-Dosis (1,0 ml pro Tier

30 Schrifttum 18 Tetracosapeptid β 1-24, Synacthen -Injektionslösung, Novartis Pharma GmbH, Nürnberg) wird die Sekretionskapazität der NNR-Zellen überprüft. Übersteigt die daraus resultierende Cortisolkonzentration einen bestimmten Wert (abhängig von der jeweiligen Messmethode), bei gleichzeitigem Vorhandensein klinischer Symptome, spricht dies für das Vorliegen eines endogenen Hyperadrenocorticismus. Dabei ist nicht der prozentuale Anstieg zu bewerten, sondern die Absolutwerte. Beim iatrogenen Cushing-Syndrom ist die Antwort auf die Stimulation wie auch beim Morbus Addison und bei der Lysodren -Therapie erniedrigt. Laut HERRTAGE (1996) können mit diesem Test >50% der Hunde mit einem adrenalen und etwa 85% der Tiere mit einem hypophysären Cushing-Syndrom erfaßt werden, jedoch kann der Test nicht zuverlässig zwischen beiden differenzieren. Des weiteren hat der Autor abnormale Reaktionen auf ACTH beim Diabetes mellitus und beim Vorliegen einer Pyometra beobachtet. Schließlich zeigen ca % der Hunde mit Hyperadrenocorticismus eine normale Reaktion auf ACTH (KEMPPAINEN u. ZERBE 1989). FELDMAN (2000) spricht sogar von 30-40% falsch negativen Ergebnissen. Im hiesigen Labor wird von der Durchführung eines ACTH-Stimulationstestes zur Diagnostik eines Hyperadrenocorticismus aufgrund der geringen Zuverlässigkeit abgeraten. Wir empfehlen diesen Test zur Einschätzung des noch vorhandenen stimulierbaren NNR-Gewebes bei Verdacht auf Vorliegen eines Morbus Addison und zur Überprüfung der Lysodren -Therapie. Low-Dose-Dexamethason Hemmtest Dies ist ein weiterer Screening-Test zur Diagnose eines endogenen Hyperadrenocorticismus. Iatrogen bedingte Erkrankungen können durch diesen Test jedoch nicht erfasst werden, da die endogenen Cortisolkonzentrationen bereits durch die über längere Zeit exogen zugeführten Glucocorticoide gedrückt sind. Nach Entnahme einer Basalblutprobe erfolgt die Injektion von 0,02 mg/kg KGW Dexamethason-Natrium-Phosphat i.v. (Dexamethason-Injektionslösung ad us. vet., cp-pharma, Burgdorf). Über die negative Feedbackkontrolle wird dadurch ACTH und nachfolgend das endogene Cortisol supprimiert. Die Diagnose Cushing-Syndrom

31 Schrifttum 19 wird gestellt, wenn die Cortisolkonzentration nach 4 und 8 Stunden nicht ausreichend erniedrigt wird. Im hiesigen Labor erwarten wir bei gesunden Tieren eine Supprimierung auf Werte unterhalb der Nachweisgrenze des Assays (<2,0 ng/ml). Liegen die supprimierten Werte höher, kann bei gleichzeitigem Vorhandensein der entsprechenden Symptomatik von dem Vorliegen eines Hyperadrenocorticismus ausgegangen werden. Dieser Test ist laut HERRTAGE (1996) zuverlässiger als der ACTH-Test, da er in allen Fällen von adrenalem und bei 90-95% der Hunde mit einem hypophysären Hyperadrenocorticismus die Diagnose erbringt. Wenn die Cortisolkonzentration im 4- Stunden-Wert deutlich supprimiert ist, im 8-Stunden-Wert jedoch wieder ansteigt, spricht dies PETERSON (1984) und FELDMAN (2000) zufolge für eine hypophysäre Ursache des Cushing-Syndroms. 20% der Hunde mit hypophysärer Ursache zeigen jedoch wie Hunde mit adrenalen Tumoren keine nennenswerte Suppression. Im hiesigen Labor wird dieser Test zur Diagnostik eines Hyperadrenocorticismus empfohlen. Da jedoch auch andere Grunderkrankungen (z.b. Diabetes mellitus) die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenachse und somit die Ergebnisse dieses Testes beeinflussen können, weisen wir darauf hin, das Testergebnis immer nur im Zusammenhang mit der vorliegenden klinischen Symptomatik zu bewerten. High-Dose-Dexamethason Hemmtest Dieser Test dient der Differenzierung zwischen adrenalem und hypophysärem Cushing-Syndrom. Beim hypophysären Cushing-Syndrom hemmt die hohe Dexamethason-Dosis (0,1 mg/kg) über das negative Feedback die ACTH-Sekretion der Hypophyse und führt zu einem Abfall des Cortisolspiegels. Da Tumore der NNR häufig autonom sind, wird die Cortisolsekretion in diesen Fällen nicht unterdrückt. Jedoch zeigen in den Untersuchungen von KEMPPAINEN u. ZERBE (1989) 20% der Hunde mit hypophysär bedingtem Hyperadrenocorticismus keine Suppression durch hohe Dosen Dexamethason. PETERSON et al. (1986) finden einen signifikanten (p<0,05) Unterschied in der Sensitivität zu hohen Dexamethason-Dosen zwischen Hunden mit Tumoren der Pars distalis und solchen mit Tumoren der Pars intermedia. Bei Tieren mit Adenomen der

32 Schrifttum 20 Pars distalis wird das Plasma-Cortisol fast vollständig supprimiert, bei Adenomen der Pars intermedia jedoch nur moderat. Drei Hunde mit Tumoren der Pars intermedia zeigen keine Reaktion auf das Dexamethason. Hier deuten die Ergebnisse der Autoren auf eine Entartung der A-Zellen hin, während eine Suppression bei vier anderen Hunden auf ein B-Zell-Adenom der Pars intermedia schließen läßt. Die Erfahrungen im hiesigen Labor zeigen, dass dieser Test oftmals nicht das erwartete Ergebnis liefert. Zum einen sind nicht alle NNR-Tumore vollständig autonom, zum anderen scheint es auch durchaus autonome Hypophysenadenome zu geben, so dass sowohl falsch negative als auch falsch positive Resultate zu beobachten sind. FELDMAN (2000) warnt generell davor, einen Hund allein aufgrund eines positiven Testergebnisses zu therapieren, da bei allen Testverfahren falsch positive Ergebnisse vorkommen Therapie Das Mittel der Wahl zur Behandlung des hypophysär bedingten Morbus Cushing ist die cytotoxische Verbindung Mitotane (Lysodren, Bristol Myers Oncology, Princeton, NJ). Hinter dem Trivialnamen Mitotane steht das o,p`ddd (1,1-dichloro-2-(pchlorophenyl)ethan), eine aus dem Insektizid DDT (Dichlordiphenyl-trichlorethan) abgeleitete Substanz. Mitotane führt zur selektiven Nekrose und Atrophie der adrenocorticalen Zona fasciculata und Zona reticularis (PETERSON 1983). Laut FELDMAN (2000) sind die einzigen darüber hinaus beobachteten Effekte eine moderate fettige Degeneration der Leber, centrolobuläre Atrophie und Kongestion. Weiterhin berichtet der Autor, dass Hunde mit adrenaler Hyperplasie empfindlicher auf Mitotane reagieren als gesunde Hunde. Sie sprechen zu 85% innerhalb von fünf bis neun Tagen auf die Therapie an und zeigen häufig Anzeichen eines Hypoadrenocorticismus. Empfohlen wird eine initiale Dosierung von 50 mg/kg pro Tag. FELDMAN (2000) empfiehlt, diese Dosis auf eine zweimal tägliche Verabreichung zu verteilen.

33 Schrifttum 21 Während HERRTAGE (1998) und FELDMAN (2000) eine gleichzeitige Glucocorticoidgabe nicht für nötig erachten, befürwortet PETERSON (2001) die Supplementation mit Prednison oder Prednisolon, um während der Initialphase Nebenwirkungen durch rapide sinkende Cortisolkonzentrationen zu vermindern. Bei gleichzeitig vorliegendem insulin-resistenten Diabetes mellitus empfiehlt es sich laut PETERSON u. KINTZER (1994) die initiale Mitotane-Dosis auf die Hälfte zu reduzieren und die Glucocorticoidgabe auf das Doppelte zu erhöhen. Dadurch soll verhindert werden, dass die täglich benötigte Insulin-Dosis während der Erhaltungsphase zu stark schwankt. Mitotane sollte aufgrund seiner fettlöslichen Natur zusammen mit dem Futter verabreicht werden. HERRTAGE (1998) betont, dass jeder Hund individuell reagiert und dementsprechend therapiert werden muß. Bei Anzeichen eines (iatrogenen) Morbus Addison oder spätestens nach 10 Tagen (PETERSON 2001) wird vor Einleitung der Erhaltungsdosis und nachfolgend in regelmäßigen Abständen zur Überprüfung der Therapie die Stimulationsfähigkeit der NNR mittels ACTH-Stimulationstest untersucht. Das Ziel ist ein Cortisolbasalwert im unteren Normbereich und keine oder nur geringe Stimulation nach ACTH-Gabe (PETERSON 2001). Die Erhaltungsdosis beträgt 50 mg/kg pro Woche. HERRTAGE (1998) berichtet, dass es häufig zu Rückfällen oder Phasen mit Überdosierungserscheinungen kommt, und die Dosis daher individuell erhöht oder gesenkt bzw. die Dosierungsintervalle verlängert oder verkürzt werden müssen. Er stellt bei 5-17% der behandelten Tiere einen Hypoadrenocorticismus mit Gluco- und Mineralocorticoidmangel fest, der vorwiegend innerhalb des ersten Therapiejahres auftritt. KINTZER u. PETERSON (1994) führen die Mitotane-Therapie an 32 Hunden durch, die an einem adrenocorticalen Tumor leiden. Sie berichten, dass Mitotane auch bei diesen Tieren eine effektive und akzeptable Behandlungsalternative darstellt. Im Durchschnitt ist die benötigte Dosis jedoch sowohl in der Einleitungs- als auch in der Erhaltungsphase höher als bei Hunden mit hypophysärer Ursache der Erkrankung. HERRTAGE (1998) warnt aufgrund der starken Wirkung eindringlich vor einer empirischen Anwendung von Mitotane.

34 Schrifttum 22 Eine weitere Therapieform stellt die chirurgische Entfernung des betroffenen Organs dar. Während die Hypophysektomie noch recht selten durchgeführt wird, da sie technisch sehr schwierig und mit hoher Morbidität und Mortalität verbunden ist (HERRTAGE 1998), ist die Adrenalektomie das Mittel der Wahl bei Hunden mit unilateralen adrenalen Tumoren (RIJNBERK 1996a). Zahlreiche weitere medikamentelle Behandlungsmöglichkeiten, deren Effizienz in der Literatur zur Zeit kontrovers diskutiert wird, stehen zur Verfügung. In den Fachbüchern werden vor allem die Steroidbiosynthese-Hemmer Ketokonazol und Trilostane sowie der Dopaminagonist L-Deprenyl angeführt. Ketokonazol (Nizoral, Jannsen Pharmaceutica Inc, Piscataway, NJ) ist ein Antimykotikum, welches die Steroidgenese hemmt. Die initiale Dosierung beträgt 5 mg/kg zweimal täglich über einen Zeitraum von sieben Tagen. Treten keine Nebenwirkungen auf (Anorexie, Erbrechen, Durchfall, Hepatopathie), wird die Dosis auf 10 mg/kg für 14 Tage erhöht. Der Erfolg der Therapie wird durch einen ACTH- Stimulationstest überprüft. Ist die erzielte Suppression nicht ausreichend, wird eine Dosis von 15 mg/kg verabreicht, in seltenen Fällen sind 20 mg/kg erforderlich (HERRTAGE 1998). FELDMAN u. NELSON (1996) berichten von positiven Behandlungsergebnissen (in 80% der Fälle sinken die Cortisolkonzentrationen rapide) und sehen den Vorteil in der geringen Toxizität und der reversiblen Wirkungsweise. Jedoch ist das Medikament teuer und in 25% der Fälle nicht effektiv (HERRTAGE 1998). Auch PETERSON (2001) führt die geringeren Nebenwirkungen im Vergleich zu Mitotane als Vorteil an. In seinen Studien zeigt sich Ketokonazol jedoch in einem Drittel bis der Hälfte aller Hunde nicht effektiv. Einen weiteren Nachteil sieht der Autor in der Notwendigkeit, das Medikament zweimal täglich zu verabreichen. Trilostane (Modrenal, Wanskerne Limited, Cornwall, England) unterdrückt als kompetitiver Hemmer der 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase reversibel die Steroidbiosynthese. RUCKSTUHL et al. (2002) untersuchen in ihrer Studie den Effekt einer Trilostane Therapie an 11 Hunden mit hypophysärem Cushing-Syndom.

35 Schrifttum 23 Sie verabreichen Hunden mit einem Gewicht unter fünf kg 30 mg pro Tag und Hunden mit einem Gewicht über fünf kg 60 mg pro Tag. Die Autoren stellen bei neun Tieren (82%) eine deutliche Besserung der klinischen Symptomatik sowie bei allen Hunden signifikant niedrigere Cortisolkonzentrationen nach ACTH-Stimulation fest. Sie berichten von geringen Nebenwirkungen (Lethargie und Anorexie in jeweils einem Hund) und schätzen Trilostane als sichere und effektive Alternative zu Mitotane ein. NEIGER et al. (2002), die 78 Hunde mit Trilostane behandeln, schließen sich dieser Meinung an. Sie verwenden das gleiche Dosierungsschema wie RUCKSTUHL et al. (2002) für Hunde mit einem Gewicht unter und über fünf kg, führen jedoch eine weitere Stufe hinzu, indem Sie Hunden über 20 kg 120 mg Trilostane täglich verabreichen. Nur zwei Hunde entwickelten einen iatrogenen Morbus Addison. Allerdings starben auch zwei Hunde zwei Tage nach Beginn der Behandlung, wobei unklar ist, ob die Trilostane-Therapie als Ursache dieser Todesfälle anzusehen ist. Sowohl RUCKSTUHL et al. (2002) als auch NEIGER et al. (2002) weisen darauf hin, dass die Dosierung von Trilostane, vergleichbar mit der Mitotane Therapie, je nach klinischer Symptomatik und Ergebnis des ACTH-Stimulationstests individuell angepasst wird. L-Deprenyl (Selegilin-Hydrochlorid) vermindert die ACTH-Sekretion, indem es die endogenen Dopaminkonzentrationen erhöht. Die initiale tägliche Dosierung beträgt 1 mg/kg. Zeigt sich nach zwei Monaten keine adäquate Besserung der Symptomatik, wird die Dosis auf das Doppelte erhöht (HERRTAGE 1998). Allerdings dokumentieren REUSCH et al. (1999) in der Mehrzahl der behandelten Hunde (80%) keine Besserung der Cushing-Symptome. PETERSON (1999) sieht jedoch den großen Vorteil dieses Medikamentes in den äußerst geringen Nebenwirkungen. Er hält es für sinnvoll, einen möglichen Effekt von L-Deprenyl in leichten Fällen mit geringer Progressivität zunächst zu testen, bevor Mitotane angewandt wird.

36 Material und Methoden Material und Methoden 3.1. Material und Tiere Die für den ACTH-Bioassay verwendeten Nebennieren stammten von Schlachtschweinen des Schlachthofes Hannover. Zur Untersuchung einer möglichen Beeinflussung des ACTH-Bioassays durch Serumbestandteile wurden die Seren von vier Pferden und einem Hund untersucht, bei denen ein Dexamethason-Suppressionstest durchgeführt wurde. Für den Vergleich zwischen der immunreaktiven und der biologischen Aktivität des endogenen ACTHs wurden 3 Versuchsgruppen mit jeweils 5 Hunden untersucht: Gruppe 1: gesunde Hunde Gruppe 2: am Cushing-Syndrom erkrankte Hunde Gruppe 3: mit Lysodren therapierte Hunde Alle Blutproben wurden zu diagnostischen Zwecken an das hiesige Labor eingesandt. Gruppe 1: gesunde Hunde Hierbei handelte es sich um Serumproben von klinisch gesunden Hündinnen, welche aus dem Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Kontrolle des Progesteronwertes (Kontrolle des Zyklusstandes) eingesandt wurden. Die Hündinnen waren zwischen drei und neun Jahre alt und gehörten den Rassen Deutscher Schäferhund (n=2), Großpudel (n=1), Irish Setter (n=1) und Kangal (n=1) an. Gruppe 2: am Cushing-Syndrom erkrankte Hunde Die hier untersuchten Serumproben stammten von Patienten der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover, die unabhängig von Rasse,

37 Material und Methoden 25 Geschlecht und Alter zusammengestellt wurden. Die Hunde waren zwischen sieben und 11 Jahre alt und gehörten den Rassen Mischling (n=1), Australian Shepherd (n=1), Rauhhaarteckel (n=1), Cocker Spaniel (n=1) und West Highland White Terrier (n=1) an. Drei Hunde waren weiblich, zwei männlich. Zwei der Hündinnen und einer der Rüden waren kastriert. Zur Auswahl kamen ausschließlich Hunde, die nicht mit Glucocorticoiden vorbehandelt wurden und die klinische Symptomatik eines Hyperadrenocortizismus (u.a. Polyurie/Polydipsie, Stammfettsucht, erhöhte AP- Werte, Alopezie) aufwiesen. Die NNR-Funktion wurde mit Hilfe des Low-Dose- Dexamethason Hemmtestes überprüft. Nach Entnahme der Basalblutprobe erfolgte die Injektion von 0,02 mg/kg KGW Dexamethason-Natrium-Phosphat i.v. (Dexamethason-Injektionslösung ad us. vet., cp-pharma, Burgdorf). Vier und acht Stunden später wurden weitere Blutproben entnommen. Bei allen Hunden wurde aufgrund der unzureichenden Suppression im 4- und 8-Stunden-Wert das Vorliegen eines Hyperadrenocortizismus diagnostiziert. Im Bioassay wurden lediglich die Basalblutproben analysiert. Gruppe 3: mit Lysodren therapierte Hunde Diese Proben stammten von Patienten verschiedener umliegender Kliniken, die ebenfalls unabhängig von Rasse, Geschlecht und Alter zusammengestellt wurden. Die Tiere waren zwischen sieben und 15 Jahre alt und gehörten den Rassen Yorkshire Terrier (n=3), Berner Sennhund (n=1) und Pinscher (n=1) an. Drei Hunde waren männlich, zwei weiblich. Keines dieser Tiere war kastriert. Die Patienten wiesen einen mittels Low-Dose-Dexamethason Hemmtest diagnostizierten Hyperadrenocorticismus auf, der mit Lysodren therapiert wurde. Die eingesandten Blutproben stammten aus ACTH-Stimulationstests, welche zur Therapiekontrolle durchgeführt wurden. Nach Entnahme einer Basalblutprobe erfolgte die Injektion von 1,0 ml Tetracosactid β 1-24 (Synacthen -Injektionslösung, Novartis Pharma GmbH, Nürnberg) pro Tier. Eine weitere Blutprobe wurde eine Stunde später entnommen (RIJNBERK 1996b). Die Proben 3.1 und 3.2 waren Lithium-Heparinplasma, die Probe 3.3 Serum. Bei den Proben handelte es sich um EDTA-Plasma, welches mit Aprotinin (500 KIE/ml