B 2 Osmotische Resistenz, Blutgruppen und Blutgerinnung

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1 B 2 Osmotische Resistenz, Blutgruppen und Blutgerinnung Vorgehensweise bei der Blutentnahme Bei der Blutentnahme aus der Fingerbeere ist folgende Arbeitsweise streng zu beachten: 1. Hände waschen, abtrocknen, Einmalhandschuhe überziehen. 2. Fingerbeere des zu Untersuchenden mit Alkohol (80% v/v) oder einem anderen Antiseptikum desinfizieren. 3. Bei der Blutentnahme ausschließlich sterile Einweglanzetten verwenden. 4. Beherzt seitlich in die Fingerbeere des Mittel- oder Ringfingers der weniger gebrauchten Hand stechen. 5. Einwegmaterialien sofort nach der Blutentnahme in vorgesehenen Abwurfbehälter geben. 6. Ggf. Wunde mit Pflaster abkleben. Beachtung der Betriebsanweisung ist bei Umgang mit Körperflüssigkeiten/Blut absolute Pflicht! B2-20

2 GK 1.1 Stoffmenge und Konzentration 1.2 Osmose 1.3 Stofftransport 2.1 Blut 2.2 Erythrozyten 2.4 Hämostase und Fibrinolyse 2.5 Abwehrsysteme und zelluläre Integrität Vorbereitung: Arbeiten Sie dieses Skript sorgfältig durch! Die Kenntnis des Versuchsablaufes ist notwendig für eine korrekte Durchführung. Überlegen Sie sich für jeden Versuch, warum er in dieser Form durchgeführt wird. Bereiten Sie die Theorie in Lehrbüchern vor, indem Sie zu jedem einzelnen Versuch die entsprechenden Kapitel lesen. Beispielsweise: Schmidt/Lang/Thews (29. Aufl.), Kap. 1 Grundlagen der Zellphysiologie Kap. 23 Blut Kap. 30 Wasser- und Elektrolythaushalt Kap. 34 Atemgastransport Kap. 35 Säure-Basen-Haushalt Klinke/Pape/Silbernagl (5. Aufl.), Kap. 1 Wer liest schon Einleitungen? Kap. 2 Die Zelle als Grundbaustein Kap. 9 Blut: Ein Flüssiges Organsystem Deetjen/Speckmann/Hescheler (4. Aufl.), Kap. 2.1 Ruhemembranpotential Kap. 6 Blut Kap. 9.5 Atemgastransport Golenhofen (4. Aufl.), Kap. 3 Fundamentale Zellfunktionen Kap. 7 Blut und Immunsystem Kap Gastransport zwischen Lunge und Gewebe Vorbereitung online/links: Blutgruppenspiel (Englisch) HemoSurf - Interaktiver Hämatologieatlas (nur auf dem Uni-Server!!) B2-21

3 Hausaufgaben: Zur Vorbereitung auf den Praktikumstag arbeiten Sie bitte die angegebenen Kapitel in den Lehrbüchern und die Vorlesungsmaterialien durch und beantworten sie folgende Fragen: 1. Welche Antikörperklassen gibt es? Zeichnen Sie schematisch ein IgM, eine IgG und ein IgA- Molekül! IgM IgG IgA 2. Welche Unterschiede gibt es zwischen den Blutgruppenantigenen des AB0 und des Rhesussystems? 3. Warum findet man in der Regel Antikörper gegen Blutgruppen-ungleiches Blut (Ausnahme AB) für Komponenten des AB0-Systems, nicht aber für das Rhesus-System? 4. Was versteht man unter einer anti-d-prophylaxe? 5. Welchen Verlauf nimmt die primäre Hämostase? Welche wesentlichen Moleküle sind beteiligt? 6. Zeichnen Sie schematisch den Verlauf der Antikörper-Titer für IgM und IgG bei einem Erstkontakt und einen Zweitkontakt mit einem Antigen! 7. Was versteht man unter aktiver bzw. passiver Immunisierung? B2-22

4 8. Zeichen und beschriften Sie die einzelnen Elemente eines Blutgruppenantigens der Gruppe A und der Gruppe B! Wie sehen die Antigene von Blutgruppe 0 und Blutgruppe AB aus? 9. Was versteht man unter der großen und der kleinen Kreuzprobe? 10. Nennen Sie verschiedene Verfahren zur Gerinnungshemmung in vivo und in vitro! 11. Welche Funktionen besitzt Thrombin? 12. Welche Teile der Gerinnungskaskade sind bei Hämophilie A und B gestört? Welchem System sind diese zuzuordnen? 13. Erläutern Sie die Grundlagen des PTT und des Quick-Tests! Welche Informationen kann man aus diesen Tests ziehen? 14. Welche Bedeutung hat die Untersuchung der osmotischen Resistenz von Erythrozyten im Hinblick auf die Diagnose einer Anämie? B2a) Zusammenfassung Osmotische Resistenz Wie alle Zellen besitzen die roten Blutkörperchen, die Erythrozyten, eine Zellmembran, die einerseits das Zellinnere schützend umschließt, andererseits einen selektiven Stoffaustausch zwischen Zellinnerem und Zelläußerem ermöglicht. Auf diese Weise besitzt das Zellinnere im Vergleich zum Zelläußeren einen eigenen Lebensraum, ein intrazelluläres Milieu. Dieses intrazelluläre Milieu muss in engen Grenzen konstant gehalten werden um einen regulären Ablauf aller zellulärer Lebensvorgänge zu ermöglichen. Schäden in der Struktur der Zellmembran führen zu Veränderungen des intrazellulären Milieus oder gar zum Zelltod. Gleiches gilt, wenn extrazelluläre Einflüsse die Regulationsfähigkeit der Zelle übersteigen. Wird den Erythrozyten Wasser entzogen, (z.b. in einer hypertonen Lösung, die einen gegenüber dem Zellinneren höheren osmotischen Druck aufweist), so schrumpfen sie zu Stechapfelzellen (Echinozyten); bei anhaltendem Wassereinstrom (z.b. in einer hypotonen Lösung, niedrigerer osmotischer Druck) schwellen die Erythrozyten zu Kugelzellen (Sphärozyten) an und zerplatzen schließlich (Hämolyse). Führen Membrandefekte zum Untergang der Erythrozyten, so zeigen sich Erkrankungen, die zum Formenkreis der hämolytischen Anämien zählen. Die Bestimmung der osmotischen Resistenz ist ein Verfahren, das die Stabilität der Erythrozytenmembran testet. B2-23

5 Fallbeispiel Während der empfohlenen Vorsorgeuntersuchung eines 4jährigen Jungen fällt dessen blassgelbe Hautfarbe auf. Die Mutter berichtet, ihr Sohn sei nie ernsthaft krank gewesen, so dass sie keinen Anlass gesehen habe, die für frühere Zeitpunkte vorgesehenen Vorsorgeuntersuchungen durchführen zu lassen. Der blassgelben Hautfarbe habe sie keine Bedeutung beigemessen, zumal das Kind sich offensichtlich wohlfühle. Allerdings habe sie schon seit längerem beobachtet, dass der Stuhl des Kindes eher dunkel verfärbt sei. Körperliche Untersuchung: Kein Hinweis auf körperliche oder geistige Entwicklungsverzögerung, allerdings auffallend ausgeprägte Wangenknochen. Verdachtdiagnose: Hämolytische Anämie Als Anämie bezeichnet man einen Zustand, bei dem der Hämoglobin-Gehalt des Blutes erniedrigt ist. Wenn die Anämie auf eine Auflösung der Erythrozyten im Blut zurückzuführen ist, liegt eine hämolytische Anämie vor. Bei Verdacht auf eine Hämolyse müssen zunächst labordiagnostisch Zeichen des gesteigerten Erythrozytenabbaus gesichert werden. Ferner sind Zeichen der kompensatorisch gesteigerten Erythropoese nachzuweisen. Da einer hämolytischen Anämie mehrere Ursachen zugrunde liegen können, sind weitere diagnostische Maßnahmen notwendig. Finden sich bei der mikroskopischen Untersuchung des Blutes viele kugelförmig deformierte Erythrozyten, ist die Prüfung der osmotischen Resistenz angezeigt. Im Fallbeispiel lag bei dem Kind eine normochrome Anämie vor (s. B1). Ferner sprachen drei Laborwerte der Blutuntersuchungen für einen gesteigerten Erythrozytenabbau: mäßige Erhöhung des indirekten Bilirubins, Erhöhung der Lactatdehydrogenase (LDH) und deutliche Erniedrigung des Haptoglobins. Bei der mikroskopischen Untersuchung des Blutes fanden sich unterschiedlich große Erythrozyten (Anisozytose) und zahlreiche junge Erythrozytenformen (Retikulozyten), aber auch viele Kugelzellen (Sphärozyten), so dass eine Bestimmung der osmotischen Resistenz durchgeführt wurde. Aufgabe 1: Versuche zur Hämolyse Physiologisches Kernwissen Die Zellmembran ist selektiv permeabel und bietet Wasser nur einen geringen Widerstand (Aquaporine, Wasserkanäle), während sie für Ionen und höhermolekulare Substanzen kaum permeabel ist. Über Transportproteine in der Membran werden spezifisch für die Zelle nötige Stoffe durch die Membran transportiert. Der Transport kann mit dem Konzentrationsgefälle (erleichterte Diffusion, z.b. Na + -Kanal) oder unter Verbrauch von Stoffwechselenergie gegen den Konzentrationsgradienten stattfinden. Im letzteren Fall kann dabei von dem Transportprotein direkt ATP verbraucht werden (Pumpen, z.b. Na + -K + -ATPase, Ca 2+ -Pumpe, H + -Pumpe) oder der Transportvorgang an einen anderen Energie-liefernden Transportvorgang gekoppelt sein (Anti- oder Co-Transporter, z.b. Na + -Ca 2+ -Austauscher, Na + -Glukose-Transporter). Eine Diffusion über eine semipermeable Membran wird Osmose genannt. Hierbei ist bei Zellen vor allem die Diffusion von Wasser über die Membran gemeint. Nimmt die Zelle Wasser auf, schwillt sie an, gibt sie Wasser ab, schrumpft sie. Die Kraft, die eine Wasserbewegung und damit Volumenveränderung der Zelle hervorruft wird osmotischer Druck (π) genannt und durch die Van t Hoff sche Gleichung beschrieben: n π = = V R T C R T B2-24

6 wobei n die Molzahl der gelösten Teilchen, V das Volumen des Lösungsmittels (in l), C die Osmolarität der Lösung (in mosmol/l), R die allgemeine Gaskonstante und T die absolute Temperatur bedeuten. Für zwei Lösungen, die durch eine semipermeable Membran voneinander getrennt sind, gilt, dass Wasser sich zum Ort eines höheren osmotischen Druckes bewegt. Der osmotische Druck des Plasmas beträgt rund 745 kpa. Ist der osmotische Druck einer Lösung niedriger als der einer anderen Lösung, so wird diese Lösung hypoosmolar, ist der osmotische Druck höher, so wird diese Lösung hyperosmolar genannt. Da Zellmembranen jedoch nur für bestimmte Stoffe semipermeabel sind, während andere Stoffe aufgrund der oben beschriebenen Transportvorgänge die Zellmembran permeieren können, wurde folgende Definition zusätzlich eingeführt: Eine Lösung, die eine Zelle weder schrumpfen noch schwellen lässt, wird isoton genannt. Eine hypoosmolare Lösung ist auf jeden Fall hypoton und lässt Wasser dem osmotischen Druck folgend in die Zelle einströmen. Eine hyperosmolare Lösung ist auf jeden Fall hyperton und lässt Wasser aus der Zelle austreten. Dagegen ist es möglich, dass eine isoosmolare Lösung durch spezifische Eigenschaften der Zellmembran nicht isoton ist. Durchführung der Hämolyseversuche 1. Vier Petrischalen werden auf ein Blatt kariertes Papier gelegt und mit a) Aqua dest., b) physiologische Kochsalzlösung, c) isoosmolare Harnstofflösung und d) physiologische Kochsalzlösung + Saponin beschriftet. 2. Die entsprechenden Lösungen werden in die Petrischalen geschüttet, so dass der Boden der Schalen gut bedeckt ist. 3. Die Kursbetreuung gibt heparinisiertes Blut dazu. 4. Die Schalen werden auf dem Blatt Papier vorsichtig geschwenkt, so dass Blut und die Lösungsmittel gut durchmischt sind (Handschuhe anziehen). Auswertung und Interpretation Die Schrift unter den jeweiligen Petrischalen wird begutachtet. Ist die Schrift deutlich zu lesen, ist die Erythrozytensuspension hämolysiert, das Hämoglobin also kolloidal gelöst (lackfarben). Ist die Schrift nicht deutlich zu lesen, sind die Erythrozyten weiterhin intakt und es hat keine Hämolyse stattgefunden (deckfarben). Notieren Sie, bei welchen Lösungsmitteln Hämolyse und bei welchen keine Hämolyse stattgefunden hat. Überlegen Sie sich die Gründe für das Verhalten der Erythrozyten anhand der oben kurz dargestellten Grundlagen zur Osmose. Eine Diskussion Ihrer Interpretationen findet in der Nachbesprechung statt. Für die Interpretation sind folgende Fakten wichtig: Die Erythrozyten-Membran ist für Harnstoff permeabel, Saponin ist eine Seife und macht in der hier verwendeten Konzentration die Membran für niedermolekulare Stoffe permeabel. B2-25

7 Aufgabe 2: Osmotische Resistenz Physiologisches Kernwissen Einige Anämieformen entstehen infolge eines beschleunigten Abbaus von Erythrozyten. Ursachen dieser Hämolyse sind entweder erythrozytenspezifische Defekte oder schädigende Einflüsse auf die Erythrozyten. Die erythrozytenspezifischen Defekte betreffen entweder die Erythrozytenmembran oder das Innere des Erythrozyten. Ein Verfahren, das erythrozytenspezifische Defekte diagnostiziert, ist der Nachweis der osmotischen Resistenz. Gibt man Erythrozyten in eine hypoosmolare Lösung, schwellen sie an (s. vorherige Aufgabe). Als osmotische Resistenz bezeichnet man die Fähigkeit der Erythrozytenmembran, den Einfluss dieser osmotischen Veränderung zwischen Zellinnerem und Zelläußerem Widerstand entgegenzusetzen. Im allgemeinen beginnt die Hämolyse bei etwa 150 mosmol/l (ca %ige NaCl-Lösung). Je weiter die Osmolarität im Extrazellulärraum sinkt, desto mehr nimmt die Hämolyse zu. Bei etwa 100 mosmol/l (ca %ige NaCl-Lösung) sind nahezu alle Erythrozyten hämolysiert. Der Bereich zwischen diesen beiden Werten wird Resistenzbreite genannt. Methode Die Prüfung der osmotischen Resistenz erfolgt in einer absteigenden Verdünnungsreihe von 0,7 bis auf 0,3 % NaCl-Lösung in 0,02 %igen Abstufungen. In diesen hypoosmolaren Lösungen strömt Wasser in die Erythrozyten ein (s. vorherige Aufgabe), die zunächst zu Kugelzellen (Sphärozyten) anschwellen und bei Überschreiten des kritischen Volumens zerplatzen: Das Hämoglobin wird kolloidal gelöst. Im Vergleich zu jüngeren Erythrozyten ist die osmotische Resistenz älterer oder geschädigter Erythrozyten geringer. Da das Blut ein Gemisch aus Erythrozyten aller Altersstufen ist, gibt es eine Resistenzbreite: Zuerst hämolysieren die älteren oder geschädigten Erythrozyten (partielle Hämolyse) und erst bei stärkerem osmotischen Stress hämolysieren auch die jüngeren Erythrozyten (dann vollständige Hämolyse). Durchführung 1. Pipettieren Sie in das erste Reagenzglas (beschriftet mit 0,7 %) 0,7 ml 1 %ige NaCl- Lösung. In das nächste Reagenzglas werden dann 0,68 ml 1 %ige NaCl-Lösung pipettiert, in das dritte 0,66 ml und so weiter. In das letzte Reagenzglas werden 0,3 ml NaCl-Lösung pipettiert. In das erste Reagenzglas werden dann 0,3 ml Aqua dest. zugegeben, in das folgende 0,32 ml, in das dritte 0,34 ml und so weiter. Achten Sie sehr genau darauf, dass die Volumina exakt stimmen, da der Test sehr genau ist und schon geringfügige Fehler sofort in der Auswertung zu sehen sind. 2. Schütteln Sie den Ständer mit den Reagenzgläsern vorsichtig und mischen Sie dadurch die Lösungen. 3. Geben Sie mit einer Pasteurpipette jeweils einen Tropfen Blut in jedes Reagenzglas. B2-26

8 4. Schütteln Sie den Ständer nochmals, so dass das Blut in den Lösungen verteilt ist. 5. Stellen Sie den Reagenzglas-Ständer auf die Fensterbank und merken Sie sich, an welchem Platz der Ständer steht. 6. Nach mindestens 2 Stunden Wartezeit kann die osmotische Resistenz ausgewertet werden. Die Kursbetreuung gibt Ihnen Bescheid, wann die Auswertung stattfinden soll. Auswertung und Interpretation Nach der Wartezeit haben sich die intakten Erythrozyten auf dem Boden der Reagenzgläser abgesetzt. Bei Hämolyse ist das Hämoglobin aus den Erythrozyten ausgetreten und kolloidal gelöst. Betrachten Sie die Reagenzgläser zuerst gegen ein weißes Blatt Papier und notieren Sie die NaCl- Konzentration, bei der eine erste Gelb- bis Rotfärbung der Lösung zu beobachten ist. Dieser Wert ist der Beginn der Hämolyse und somit der obere Wert der Resistenzbreite. Hier sind nur einige Erythrozyten hämolysiert, die restlichen Zellen konnten dem osmotischen Stress Widerstand leisten und befinden sich als Pellet am Boden des Reagenzglases. Betrachten Sie dann den Boden der Reagenzgläser und bestimmen Sie den NaCl-Wert, bei dem kein Pellet auf dem Boden des Reagenzglases mehr zu erkennen ist. Dafür ist es notwendig, die Reagenzgläser aus dem Ständer zu nehmen und von unten gegen das Licht zu betrachten. Achten Sie darauf, dass Sie die Gläser dabei nicht schütteln! Der Wert, bei dem kein Pellet mehr zu erkennen ist, ist die Osmolarität, bei der eine vollständige Hämolyse stattgefunden hat. Notieren Sie auch diesen Wert. Eine herabgesetzte osmotische Resistenz liegt immer dann vor, wenn die zu untersuchenden Erythrozyten bereits Kugelzellform besitzen, bevor sie in Lösung gegeben werden. Das trifft bei jener Anämie zu, die durch Sphärozytose hervorgerufen wird. Dabei ist das Verhältnis von Zelloberfläche und Volumen der Erythrozyten zugunsten des Volumens verschoben, so dass die Schwellreserve klein und frühe Hämolyse die Folge ist. Der Nachweis verminderter osmotischer Resistenz sichert hier die Diagnose. Klinisches Kernwissen: Hämolytische Anämie Vorkommen und Häufigkeit Wie häufig unter den Anämien die hämolytische Form ist, kann nur geschätzt werden. Von jenen Anämien, die direkt mit den Erythrozyten in Verbindung gebracht werden (korpuskuläre Anämien), sind weltweit rund 100 Mill. Menschen betroffen. Darunter ist die erbliche Sphärozytose als angeborener Membrandefekt der Erythrozyten in Mittel- und Nordeuropa am häufigsten, während im Mittelmeerraum vor allem die autosomal-dominant erblichen Thalassämien dominieren. Bei dieser Gruppe von Erkrankungen sind die Erythrozyten zu scheibchen-dünnen Zellen (Targetzellen) mit erhöhter Schwellreserve und erhöhter osmotischer Resistenz umgewandelt. B2-27

9 Ursachen Normale menschliche Erythrozyten werden beim Erwachsenen im roten Knochenmark gebildet, leben 120 Tage im Blut, legen eine Strecke von ca. 300 km zurück und werden in der Milz abgebaut. Unter bestimmten Bedingungen kann die Lebensdauer der Erythrozyten bis auf wenige Tage verkürzt sein. Anämien, die durch eine Verkürzung der Erythrozytenlebensdauer hervorgerufen werden, bezeichnet man als hämolytisch. Eine besondere Rolle spielt dabei die Milz, die veränderte Erythrozyten wie ein Filter aus dem Blut abfängt. Die Ursachen, die zu einer Hämolyse führen, können entweder mit den Erythrozyten selbst in Verbindung gebracht werden (korpuskulär) oder durch Faktoren ausgelöst werden, die außerhalb des Erythrozyten (extrakorpuskulär) lokalisiert sind: 1. Korpuskuläre hämolytische Anämien Angeboren: Membranproteindefekt z.b. hereditäre Sphärozytose Hämoglobindefekt z.b. Sichelzellanämie Stoffwechseldefekt z.b.glukose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PDH)- Mangel Erworben: Membranproteindefekt z.b. Paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie (PNH) 2. Extrakorpuskuläre Anämien Immunhämolyse z.b. Morbus haemolyticus neonatorum Mechanische Hämolyse z.b. bei künstlicher Herzklappe Toxische Hämolyse z.b. Malaria Diagnostik Vermutet man eine Form der hämolytischen Anämien, so konzentriert sich die Basisdiagnostik auf drei Fragen: - Liegt eine Anämie vor? - Hier sollten Anzahl der Erythrozyten, Hämoglobin, Hämatokrit und Erythrozytenindizes bestimmt werden. - Finden sich Zeichen eines erhöhten Erythrozytenabbaus? - Hier sind eine Erhöhung des indirekten Bilirubins oder der LDH und eine Erniedrigung des Haptoglobins deutliche Hinweise. - Finden sich Zeichen einer kompensatorisch verstärkten Erythropoese? - Hierfür spricht bei der mikroskopischen Untersuchung eines Blutausstrichs die Erhöhung der Retikulozyten. Bei der mikroskopischen Untersuchung sind ferner krankhaft veränderte Erythrozytenformen zu beachten. Therapie Die therapeutischen Möglichkeiten der hämolytischen Anämien sind gering. Eine kausale Therapie der korpuskulären Anämien ist bisher nicht möglich. Die hereditäre Sphärozytose bessert sich, sobald die Milz entfernt wird (Splenektomie). Eine kausale Therapie der extrakorpuskulären Anämien zielt darauf, die schädigenden Faktoren zu beseitigen. Gelegentlich ist die Gabe von Hormonen der Nebennierenrinde (Cortison) das Mittel der Wahl. B2-28

10 B 2 b) Blutgruppen Siehe unbedingt auch Vorgehensweise bei der Blutentnahme! Vorbereitung: Arbeiten Sie dieses Skript sorgfältig durch! Die Kenntnis des Versuchsablaufes ist notwendig für eine korrekte Durchführung. Überlegen Sie sich für jeden Versuch, warum er in dieser Form durchgeführt wird. Bereiten Sie die Theorie in Lehrbüchern vor, indem Sie zu jedem einzelnen Versuch die entsprechenden Kapitel lesen. Beispielsweise: Schmidt/Lang/Thews (29. Aufl.), Kap. 1 Grundlagen der Zellphysiologie Kap. 23 Blut Klinke/Pape/Silbernagl (5. Aufl.), Kap. 1 Wer liest schon Einleitungen? Kap. 9 Blut: Ein Flüssiges Organsystem Deetjen/Speckmann/Hescheler (4. Aufl.), Kap. 2.1 Ruhemembranpotential Kap. 6 Blut Golenhofen (4. Aufl.), Kap. 3 Fundamentale Zellfunktionen Kap. 7 Blut und Immunsystem Zusammenfassung Blutgruppen Unter Blutgruppen versteht man genetisch festgelegte Merkmale von Blutbestandteilen. Im wesentlichen handelt es sich bei Blutgruppenmerkmalen um Moleküle auf den Oberflächen der Blutzellen (Antigene), die in einem fremden Organismus eine Immunantwort (Antikörperbildung) auslösen können. Die Merkmale des AB0-Systems, des bekanntesten Blutgruppensystems, bestehen z.b. aus Glykolipiden in den Membranen nahezu aller Körperzellen. Man unterscheidet die Merkmale A und B. Diese können einzeln (Blutgruppe A bzw. B) und gemeinsam (Blutgruppe AB) vorkommen oder auch gänzlich fehlen (Blutgruppe 0). Jeder Mensch bildet im Laufe der ersten Lebensjahre reguläre Antikörper gegen die Blutgruppen-Antigene, die er selbst nicht besitzt. Menschen der Blutgruppe A besitzen demnach Antikörper gegen B-, Menschen der Blutgruppe B Antikörper gegen A- und Menschen der Blutgruppe 0 Antikörper gegen A- und B-Antigene. Diese Antikörper müssen bei jeder Bluttransfusion und Organübertragung berücksichtigt werden, da sie zur schnellen Zerstörung unverträglicher Erythrozyten bzw. zur Organabstoßung beim Empfänger führen können. Im Praktikum wird exemplarisch neben dem AB0-System das Rhesus-System untersucht. B2-29

11 Fallbeispiel In großer Aufregung ruft eine Rentnerin um die Mittagszeit in der Praxis ihres Hausarztes an. Sie erklärt, dass sie vormittags alleine zum Einkaufen in der Stadt gewesen sei. Bei der Rückkehr habe sie ihren Mann in einer großen Blutlache auf dem Fußboden des Badezimmers zusammengekauert vorgefunden. Er könne zwar sprechen, habe sich aber immer wieder übergeben müssen und dabei schwallartig ziemlich dunkles Blut erbrochen. Außerdem habe er starke Schmerzen im rechten Oberbauch. Verdachtdiagnose: Gastrointestinale Blutungen Blutungen im Magen-Darm-Trakt können entweder als Sickerblutungen lange Zeit okkult bleiben oder auch als akute gastrointestinale Blutungen einen dramatischen Verlauf nehmen, wobei die Blutungsquelle sowohl im oberen als auch im unteren Teil des Magen-Darm-Traktes liegen kann. Überwiegend ist der obere Gastrointestinaltrakt betroffen. Führende Symptome sind Blut-Erbrechen (Hämatemesis), schwarzer Stuhlgang (Melaena) oder Beimengungen von rotem Blut im Stuhl (Hämatochezie). In jedem Fall handelt es sich um einen möglicherweise lebensbedrohlichen Zustand, so dass eine unverzügliche stationäre Einweisung zu veranlassen ist. Nach schweren Blutverlusten können unabhängig von der Blutungsursache in Verbindung mit anderen Maßnahmen Bluttransfusionen lebensrettend sein. Vor jeder Bluttransfusion müssen die Blutgruppen des Empfänger- und des Spenderblutes auf ihre Verträglichkeit untersucht werden. Nur im Notfall darf das Blut der Blutgruppe 0 Rhesus-negativ transfundiert werden. Aufgabe: Blutgruppenbestimmung: ABO- und Rhesus-System Physiologisches Kernwissen Das 1901 von K. Landsteiner entdeckte AB0-System ist das am längsten bekannte Blutgruppensystem des Menschen. Die Einteilung in Blutgruppen erfolgt durch den Nachweis bestimmter Substanzen, die sich auf den Oberflächen der Erythrozyten, aber auch anderer Zellen befinden und als Antigene wirken. Inzwischen konnten rund 200 verschiedene solche Antigene nachgewiesen werden, so dass man außer dem AB0-System, das Rhesus-System, das Cartwright- System, das Diego-System, das Duffy-System, das Kell-System, das Kidd-System usw. unterscheidet. Insgesamt bilden die rund 200 beim Menschen nachgewiesenen Antigene etwa 15 verschiedene Blutgruppensysteme unterschiedlicher klinischer Bedeutung. Die Merkmale des AB0-Systems bestehen aus Glykolipiden in der Membran fast aller Zellen und demnach auch der Erythrozyten des Blutes. Dabei sind die endständigen Zucker dieses in die extrazelluläre Matrix gerichteten Glykolipides zwischen den Blutgruppen unterschiedlich. Das Blutgruppenmerkmal "A" hat N-Acetylgalaktosamin, das Merkmal "B" Galaktose als endständigen Zucker des Glykolipides. Man unterscheidet demnach Blutgruppe A (nur A-Substanz), B (nur B- Substanz), AB (A- und B-Merkmale nebeneinander) und 0 (nur das Glykolipid ohne endständigen Zucker). Das Glykolipid ohne endständigen Zucker ist kein Antigen im Menschen, so dass keine Antikörper gebildet werden. Pflanzen jedoch können auch gegen das Glykolipid ohne endständigen Zucker Antikörper-ähnliche Substanzen haben (Phythämagglutinine). In diesem Zusammenhang wird das Glykolipid ohne endständigen Zucker Antigen H genannt. Genetisch festgelegt ist bei dem AB0-System das Fehlen oder Vorhandensein der entsprechenden Glykosyltransferasen, die die B2-30

12 endständigen Zucker an das Glykolipid anhängen. AB0- und ähnliche Substanzen sind in der Natur weit verbreitet. Durch Kontakt mit Bakterien, die Blutgruppen-ähnliche Oberflächenmerkmale besitzen, bildet jeder Mensch im Laufe der ersten Lebensjahre reguläre Antikörper gegen diese Blutgruppensubstanzen. Dabei besitzen Personen mit der Blutgruppe A Antikörper gegen B im Serum, Personen mit Blutgruppe B Antikörper gegen A, Personen mit Blutgruppe 0 Antikörper gegen A und B und Personen mit der Blutgruppe AB keine Antikörper gegen A oder B. Diese Antikörper sind ständig im Serum vorhanden, werden also nicht erst gebildet, wenn ein Kontakt mit dem Antigen erfolgt. Deshalb ist die Reaktion des Organismus auf Zellen, die im AB0-System unterschiedlich sind, sehr schnell und heftig. Die Arbeiten von Livine und Stetson sowie von Landsteiner und Wiener führten 1939 bzw zur Entdeckung eines weiteren Blutgruppensystems. Es wird heute traditionell als Rhesus-System bezeichnet. Die Rhesus-Merkmale bestehen aus einer Kette von 412 Aminosäuren, die sich zwölfmal durch die Erythrozytenmembran windet. Aufgrund struktureller Ähnlichkeiten z.b. mit der Na + -K + -Pumpe wird eine Transportfunktion angenommen, zumal das extrem seltene Fehlen aller Rhesus-Merkmale zu einer Hämolyse führt. Aufgrund des Austausches einzelner Aminosäuren kann man u.a. die Merkmale D, C, c, E, und e unterscheiden. Das Merkmal D ist das wichtigste und stärkste Merkmal des Rhesus-Systems. Das allele Merkmal d führt aufgrund einer Deletion zu einer verkürzten Kette und kann mit Antiseren nicht nachgewiesen werden. Personen, die das Merkmal D besitzen, werden als "Rhesus-positiv", Personen ohne dieses Merkmal als "Rhesus-negativ" bezeichnet. Inzwischen ist bekannt, dass die von Landsteiner und Wiener beschriebenen Xenoseren gegen ein D-ähnliches Antigen reagierten, das als "LW-Antigen" bezeichnet wird. Nur der von Livine und Stetson entdeckte Antikörper war gegen das D-Antigen gerichtet. Kommen Rhesus-negative Personen in Kontakt mit Rhesus-positivem Blut (Transfusion oder auch Geburt), so bilden sie häufig einen Anti-D Antikörper, was bei weiteren Transfusionen (oder Schwangerschaften) zur Hämolyse der Rhesus-positiven Erythrozyten führt. Der Morbus haemolyticus neonatorum kann zum intrauterinen Tod des Rhesus-positiven Kindes führen. Im Gegensatz zum AB0-System sind im Rhesus-System also ohne vorangegangenen Kontakt keine Antikörper gegen D im Blut vorhanden, sondern es muss erst eine Sensibilisierung stattfinden, ehe Antikörper gebildet werden. Methode Wegen ihrer besonderen Bedeutung ist die Blutgruppenbestimmung durch Richtlinien der Bundesärztekammer geregelt. Die Blutgruppen des AB0-Systems werden unter Verwendung staatlich geprüfter Seren Anti-A (blau), Anti-B (gelb) und Anti-AB (farblos) bestimmt. Diese Bestimmung der Antigene im Serum muss durch eine Serumgegenprobe vervollständigt werden. Dabei werden Testerythrozyten bekannter Blutgruppenzugehörigkeit mit dem Serum des vorgesehenen Empfängerblutes in Kontakt gebracht. Normalerweise darf zwischen der Antigenbestimmung, wie sie auch im Praktikum durchgeführt wird und der Serumgegenprobe, auf deren Durchführung im Praktikum verzichtet wird, keine Diskrepanz auftreten. Als weiteren Unterschied zu den Richtlinien der Bundesärztekammer wird im Praktikum kein Anti-AB Serum verwendet, sondern ein Anti-H Serum. Wie oben beschrieben haben die Erythrozyten der Blutgruppe 0 Glykolipide in der Membran, deren endständiger Zuckerrest fehlt. Bestimmte B2-31

13 Pflanzen haben Antikörper, die das Glykolipid ohne endständigen Zucker erkennen können. Ein solches Antiserum wird im Praktikum verwendet, um Blutgruppe 0 zu charakterisieren. Zusätzlich erlaubt dieses Antiserum Blutgruppe A 1 und A 2 voneinander zu unterscheiden. Diese Blutgruppen unterscheiden sich nicht durch das Fehlen oder Vorhandensein der Glykosyltransferasen für N- Acetylgalaktosamin, sondern in der Aktivität des Enzyms. Bei der Blutgruppe A 2 ist die Aktivität des Enzyms so niedrig, dass neben dem Antigen A auch das Antigen H, also das Glykolipid ohne endständigen Zucker nebeneinander auf der Zelloberfläche vorkommt. Die Blutgruppen des Rhesus-Systems werden unter Verwendung eines staatlich geprüften Rhesus-Testserums Anti-D (rot) bestimmt, wobei eine Serumgegenprobe wie bei der Bestimmung der AB0-Blutgruppe nicht notwendig ist. Durchführung 1. Finger müssen gut durchblutet sein. Deshalb Hände reiben, evtl. unter warmes Wasser halten, Arme nach unten ausschütteln, um Blut in die Finger zu treiben. 2. Vorbereitung des Arbeitsplatzes: Zwei AB0-Platten, Tupfer, Desinfektionslösung und die verpackte Lanzette bereitlegen. 3. Desinfizieren der Fingerbeere. 4. Lanzette auspacken und beherzt seitlich in die Fingerbeere des Mittel- oder Ringfingers stechen, da der Schmerz beim Verletzen von nur der obersten Hautschicht genauso stark ist, die austretende Blutmenge jedoch nicht für die Messung ausreicht. Lanzette sofort in das Abfallgefäß werfen (Verletzungsgefahr!). 5. Tropfen Sie je einen Tropfen Blut in jede Vertiefung der ersten AB0-Schale und einen größeren Tropfen in die erste Vertiefung einer zweiten ABO-Schale. 6. Die Kursbetreuung wird dann sofort je einen Tropfen Antiserum zugeben, und zwar in Vertiefung A Anti-A, in Vertiefung B Anti-B und in Vertiefung 0 Anti-H Antikörper. In die vierte Vertiefung wird von der Kursbetreuung ein Tropfen Antiserum D auf den Blutstropfen gegeben. 7. Verrühren Sie das Blut sofort mit dem Antiserum. Benutzen Sie dabei unbedingt pro Vertiefung einen eigenen Plastikspatel. 8. Prüfen Sie unter leichten Schaukel- und Kippbewegungen, in welchem der vier Felder sich eine Agglutination zeigt. B2-32

14 Auswertung und Interpretation Osmotische Resistenz, Blutgruppen und Blutgerinnung A +Anti-A B +Anti-B 0 +Anti-H Blutgruppe A1 A2 B AB 1 AB 2 0 Auswertung und Interpretation erfolgen visuell, wobei die nachstehende Mehrfeldermatrix den Sachverhalt verdeutlichen soll: Beurteilen Sie, welche Vertiefung eine Agglutination aufweist. Nur wenn sich die Zellen nicht durch vorsichtiges Rühren mit dem Spatel wieder verteilen lassen, liegt eine Agglutination, also eine echte Antikörper-Antigen Reaktion vor. Wie aus nebenstehendem Schema ersichtlich zeigt Agglutination in Vertiefung A Blutgruppe A, eine in Vertiefung B Blutgruppe B an. Blutgruppe AB zeigt Agglutination in Vertiefung A und B und Blutgruppe 0 in Vertiefung 0. Die Blutgruppe A kann nochmals unterteilt werden in A 1 bzw. A 2. Der Blutgruppentest ist ein Test auf den Phänotyp und kann keine Aussage über den Genotyp machen. Die Bestimmung der Allel-Zusammensetzung kann nur eine Analyse der Während im Praktikum lediglich festgestellt wurde, ob die Erythrozyten eines potentiellen Spenders mit dem laborchemisch hergestellten Testserum eines potentiellen Empfängers harmonieren, setzt die lebensnotwendige Blutübertragung im Fallbeispiel voraus, dass außerdem die gesetzlich vorgeschriebene Kreuzprobe (cross match) von einem Arzt durchgeführt wurde, die aus zwei Testteilen besteht (s. nebenstehendes Schema): im Major-Test wird die Verträglichkeit zwischen Spendererythrozyten und Empfängerserum beurteilt, im Minor-Test die zwischen Empfängererythrozyten und Spenderserum. Die im Notfall durchgeführte Transfusion von Blut der Blutgruppe 0 besteht bei allen Blutgruppen außer der Blutgruppe 0 den Minor-Test nicht: Serum von Blutgruppe 0 enthält Antikörper gegen A und B und führt zu einer Agglutination der Erythrozyten des Empfängers. Obwohl ausschließlich Erythrozytenanreicherungen für eine Transfusion verwendet werden in denen die Serum-Menge, die der Empfänger erhält, stark erniedrigt ist, können die Antikörper des Spenderblutes Transfusionszwischenfälle hervorrufen. Deshalb ist es unumgänglich Blut derselben Blutgruppe zu transfundieren und die Blutgruppe 0 als "Universal-Spenderblut" nur im äußersten Notfall zu verwenden. Bei Rhesus-Negativität sind zusätzliche speziellere Untersuchungen notwendig, weil innerhalb des Rhesus-Systems mehrere Modifizierungen bestehen, die bei einer Bluttransfusion zu beachten sind. Bluttransfusionen mit dem falschen Rhesus-Faktor führen jedoch nicht, wie bei dem AB0-System zu einem sofortigen Transfusionszwischenfall, sondern induzieren erst eine Antikörperbildung im Empfänger, die dann allerdings bei nochmaligem Kontakt mit dem Fremdblut zu einem ernsthaften Schädigung des Patienten führt. B2-33

15 Klinisches Kernwissen: Gastrointestinale Blutungen Vorkommen und Häufigkeit In Deutschland werden Jahr für Jahr rund Patienten mit akuten Gastrointestinalblutungen notfallmäßig in Kliniken eingewiesen, wobei der Anteil älterer Patienten steigt. Bei mehr als der Hälfte aller Blutungsfälle liegt die Blutungsquelle im oberen Gastrointestinaltrakt, wobei neben peptischen Läsionen Rupturen von Ösophagusvarizen und Schleimhauteinrisse im Zuge des Mallory-Wess-Syndroms nach jahrelangem Alkoholabusus zunehmen. Im unteren Gastrointestinaltrakt dominieren Blutungen aufgrund von Divertikeln und verschiedenen Gefäßveränderungen (Angiodysplasien). Ursachen Die Ursachen der gastrointestinalen Blutungen sind zwar potentiell zahlreich, können aber oft auf einige wenige pathogenetische Faktoren zurückgeführt werden. Sicher spielt zum einen eine konstitutive Überempfindlichkeit des psychovegetativen Systems eine Rolle, was vor allem bei Magenschleimhautentzündungen und Geschwüren in Magen und Duodenum von Bedeutung sein kann. Eine wichtige Rolle spielt heutzutage aber zusätzlich eine Infektion mit dem Erreger Helicobacter pylori als Teilursache von Geschwüren. Zum anderen muss an Neoplasien (Tumoren) gedacht werden, die Gefäße eröffnen können, so dass eine akute Blutung einsetzen kann. Auch die Medikation mit nicht-steroidalen Antiphlogistika kann die Entwicklung von Blutungen begünstigen, zumal diese Medikamente zum Teil rezeptfrei zu erhalten sind, so etwa die Acetylsalicylsäure. Ferner ist an die Einnahme von Pyrazolonen und des Indometacins als Antirheumatikum zu denken. Bei Ösophagusvarizenblutungen liegt allerdings meist eine Leberzirrhose zugrunde, in deren Gefolge sich eine portale Hypertension entwickelt hat, deren Druck die nach und nach anschwellenden ösophagealen Venen nicht mehr standhalten konnten. Diagnostik Die Diagnostik bei akuten Gastrointestinalblutungen ist mehrschichtig. Sie muss innerhalb möglichst kurzer Zeit veranlasst werden. Dabei ist stets daran zu denken, dass gastrointestinalen Blutungen oft gleichzeitig mehrere Ursachen zugrunde liegen können. So können etwa Refluxösophagitis, Magenschleimhauterosionen und Ulcus duodeni gemeinsam auftreten. In anderen Fällen sind Ösophagusvarizen und peptische Läsionen zwei koinzidierende Ursachen, die unabhängig voneinander therapiert werden müssen. Alles in allem werden sich diagnostisch an die kurze Befragung, die orientierenden Gerinnungstests und die Bestimmung der Blutgruppe zwei Maßnahmen anschließen. Liegen Hämatemesis (Blut-Erbrechen) oder Melaena (schwarzer Stuhlgang) vor, ist die orale Notfallgastroskopie oder Notfallkoloskopie das Mittel der Wahl, bei Hämatochezie (rotes Blut im Stuhlgang) wird unter dem Verdacht auf Neoplasien oder ulzeröse Läsionen mit der rektal-digitalen Untersuchung begonnen, bevor auch hier mit Magensonde und Notfallendoskopie nach der Blutungsquelle gefahndet wird. Kann die Blutungsquelle hierdurch nicht identifiziert werden, kann eine abdominale Szintigraphie mit markierten Erythrozyten oder eine abdominale Angiographie erforderlich sein. Therapie Die Therapie zielt primär auf Kreislaufstabilisierung durch Bluttransfusionen oder Gabe von Plasmaexpandern. Sobald der Kreislauf stabilisiert ist, kann über die Art des weiteren Vorgehens entschieden werden, wobei in den meisten Fällen medikamentös-konservativ, in seltenen Fällen endoskopisch-operativ oder chirurgisch vorzugehen ist. Bei blutenden Ösophagusvarizen entscheidet man sich in der Regel für die endoskopische Sklerosierung. Im Fallbeispiel wurde die variköse Region des Ösophagus noch während der endoskopischen Untersuchung mit 1 %igem Polidocanol infiltriert, wodurch eine Sklerosierung der Varizen erreicht werden konnte. B2-34

16 B 2 c) Blutgerinnung Zusammenfassung Blutgerinnung Mit der Verletzung eines Blutgefäßes setzen verschiedene Reparatur- und Verschlussmechanismen ein. Zunächst erfolgt eine vorläufige Blutstillung (primäre Hämostase). Sie wird im wesentlichen durch Blutplättchen (Thrombozyten) hervorgerufen, die an der Verletzungsstelle aggregieren und diese nach und nach verschließen. Später erfolgt eine endgültige Blutstillung, die als sekundäre Hämostase bezeichnet wird. Sie beruht auf einer kaskadenartigen Aktivierung plasmatischer Gerinnungsfaktoren. Für viele der Aktivierungsschritte in der Gerinnungskaskade ist die Anwesenheit von Ca 2+ -Ionen notwendig. Die Aktivierung der Kaskade kann über einen sogenannten intrinsischen oder einen extrinsischen Weg erfolgen. Letztendlich führen beide Wege zu einer Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin, welches seinerseits die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin katalysiert. Fibrin bildet ein Netz, aus dem in der Regel durch Beimischung von Erythrozyten als Resultat der Hämostase ein gemischter Thrombus entsteht. Die Wundheilung wird schließlich durch eine mehrstufige Reaktion des Nachbargewebes abgeschlossen. Wenn das Fibringerinnsel seine Aufgaben beim Wundverschluss erfüllt hat, muss es im Verlauf der Wundheilung wieder beseitigt werden. Diese Funktion übernimmt das fibrinolytische Plasminsystem des Plasmas. Zahlreiche Mechanismen gewährleisten den regelrechten Ablauf der Hämostase. Einerseits darf sich kein Thrombus spontan im Gefäßbett bilden. Hierbei spielt eine ständige Fibrinolyse über das Plasminsystem eine entscheidende Rolle. Außerdem darf sich eine regelrecht einsetzende Hämostase nicht unkontrolliert weiter ausbreiten. Störungen, bei denen eine verminderte Hämostase vorliegt, bezeichnet man als hämorrhagische Diathesen, wobei zwischen mehreren Formen unterschieden wird. Zur Erfassung hämorrhagischer Diathesen gehören neben der Thrombozytenzählung eine Reihe orientierender Tests: die Bestimmung der Blutungszeit, der partiellen Thromboplastinzeit (PTT) und der Thromboplastinzeit nach QUICK. Fallbeispiel Ein 3250 g schweres männliches Neugeborenes entwickelt wenige Stunden nach der Geburt linksseitig am Schädel ein Hämatom. Der Hämoglobingehalt liegt mit 168 g/l innerhalb des Referenzbereiches für Neugeborene am ersten Tag. Nach regulärer Verlegung in eine Kinderklinik fällt der Hb-Gehalt bei erheblicher Zunahme des Hämatoms bis zur 29. Stunde auf 92 g/l und damit unter den unteren Referenzwert. B2-35

17 Verdachtdiagnose: Hämorrhagische Diathese Hämorrhagische Diathesen basieren auf Störungen der Hämostase. Da zahlreiche Faktoren an der Hämostase beteiligt sind, wird zwischen mehreren Formen der Hämostase unterschieden, je nachdem welcher der Faktoren in erster Linie für die Störung verantwortlich ist. Man unterscheidet zwischen thrombozytären, plasmatischen und vaskulären hämorrhagischen Diathesen. Die plasmatischen hämorrhagischen Diathesen werden auch als Koagulopathien bezeichnet. Die Diagnostik hämorrhagischer Diathesen ist oft durch Erfragen der Vorgeschichte (Anamnese) und Beobachten (Inspektion) möglich. Näheren Aufschluss geben eine Reihe von Laboruntersuchungen. Dabei können leichte hämorrhagische Diathesen in der Regel nur schwer erkannt werden. Eine erste Orientierung ist durch die Bestimmung der Blutungszeit möglich, die die primäre Hämostase erfasst Aufgabe: Bestimmung der Blutgerinnung: a) Partielle Thromboplastinzeit (PTT) b) Thromboplastinzeit nach QUICK Physiologisches Kernwissen Eine erste Orientierung, ob eine hämorrhagische Diathese vorliegt, liefert die Blutungszeit. Diese erfasst die primäre Hämostase, für die in erster Linie regelrecht funktionierende Thrombozyten verantwortlich sind. Damit die Thrombozyten sich an die kollagenen Fasern der geschädigten Gefäßwand anheften können, müssen auf der Thrombozytenmembran bestimmte Strukturen (Rezeptoren) vorhanden sein, an die der von WILLEBRAND Faktor (der mit Gerinnungsfaktor VIII einen Komplex bildet) ankoppeln kann, um als Bindeglied zwischen Thrombozyten und Endothelzellen fungieren zu können. Nach der Anheftung an die geschädigte Gefäßwand setzen die Thrombozyten zahlreiche Substanzen frei, deren Wirkungen im Zuge der primären Hämostase zur Bildung eines thrombozytären Pfropfes führen. Die Bestimmung der Blutungszeit erlaubt eine grobe Beurteilung der Thrombozytenfunktion. Für eine Standardisierung wird die Blutungszeit nach MARX verwendet: die verletzte Fingerkuppe wird in ein Becherglas getaucht, das Wasser von 37 C enthält. Gemessen wird die Zeit, bis der vom ruhig gehaltenen Finger ins Wasser niedersinkende Blutungsfaden abreißt. Während die Blutungszeit die primäre Hämostase erfasst, erfassen andere Tests hämorrhagische Diathesen, denen eine Störung des plasmatischen Systems zugrunde liegt. Hierbei muss zwischen intrinsischem (endogenem) und extrinsischem (exogenem) Teilsystem unterschieden werden, die in einen gemeinsamen Weg münden. Der Begriff intrinsisches System stammt von der Beobachtung, dass eine Blutgerinnung spontan abläuft, wenn Blut in saubere Glasröhrchen überführt wird. Dies führte zu der Vorstellung, dass alle notwendigen Komponenten für eine Blutgerinnung im zirkulierenden Blut vorhanden wären. Der tatsächliche Grund für die einsetzende Blutgerinnung ist die Anwesenheit anionischer Oberflächen. In der Gefäßwand entstehen anionische Oberflächen B2-36

18 nach Ruptur der Endotheloberfläche. Zum intrinsischen System zählen die Gerinnungsfaktoren XII, XI, IX und VIII. Die Funktionsfähigkeit dieses Weges wird durch die Bestimmung der partiellen Thromboplastinzeit (PTT) geprüft. Die Bezeichnung extrinsisches System leitet sich aus der Beobachtung her, dass ein zusätzlicher Faktor außerhalb des zirkulierenden Blutes vorhanden sein muss, der die Blutgerinnung einleitet. Dieser wird als Faktor III bzw. Gewebsfaktor (tissue-factor) bezeichnet. Die Bestimmung der Thomboplastinzeit nach QUICK erfasst über den Faktor VII die Aktivierung des extrinsischen Systems sowie über die Faktoren X, V, II und I die gemeinsame Endstrecke der beiden plasmatischen Gerinnungssysteme. Da alle genannten Faktoren in der Leber gebildet werden, kann die Bestimmung der Thromboplastinzeit nach QUICK zugleich Hinweise auf die Leberfunktion bieten. Die Synthese der Gerinnungsfaktoren IX des intrinsischen Systems, VII des extrinsischen Systems sowie X und II des gemeinsamen Weges beider plasmatischer Gerinnungssysteme kann nur unter Anwesenheit von Vitamin K stattfinden. Die Gerinnung kann somit langfristig durch die Gabe von Vitamin-K-Antagonisten (z.b. Marcumar) gehemmt werden. Die Wirksamkeit der Therapie mit Vitamin-K-Antagonisten, etwa im Anschluss an eine erfolgreiche Thrombosebehandlung oder nach einem Herzinfarkt kann dann über den QUICK-Wert kontrolliert werden B2-37

19 Schema des Gerinnungssystems Aus Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 29. Auflage B2-38

20 Methode: Partielle Thromboplastinzeit Osmotische Resistenz, Blutgruppen und Blutgerinnung Zur Bestimmung der partiellen Thromboplastinzeit (PTT) wird eine koagulometrische Methode benutzt. Dafür wird venös Blut entnommen und mit Citrat-Lösung (1 Teil Natriumcitratlösung (0,11 mol/l) mit 9 Teilen Blut) gemischt (grüne Monovetten). Das Citrat komplexiert die Calcium-Ionen im Blut und verhindert eine vorzeitige Gerinnung. Dieses Blut wird zehn Minuten bei 3000 g min -1 zentrifugiert, um Plasma zu gewinnen. Dabei werden neben den anderen Blutzellen auch die Thrombozyten zum größten Teil aus dem Plasma entfernt. Zu diesem Ca 2+ -verarmten Blutplasma wird ein Gemisch aus Cephalin (Phospholipid aus Kaninchenhirn) und mikrokristallinem Kaolin (Kieselgur, Oberflächenaktivator) gegeben. Der Mischung wird Calcium zugesetzt und die Zeitspanne zwischen Ca 2+ -Zugabe und Blutgerinnung gemessen. PTT-Messung Vorbereitung (Praktikumsleitung): 1. Venöse Blutabnahme und Gewinnung von Citrat-Plasma. 2. Anstellen des Wärmebades (37 C) und Überprüfen der Temperatur. 3. Kaolin-Suspension kräftig schütteln und in das Fläschchen mit Cephalin geben. Durchführung: 1. Kaolin-Cephalin schütteln, mit der CaCl 2 -Lösung (25 mmol/ L) in das Wärmebad stellen und Temperatur-Ausgleich abwarten. 2. Währenddessen in vier Teströhrchen (2 ml-eppendorf-reaktionsgefäß) jeweils 100 µl Citrat- Plasma geben. Pipettenspitze wechseln. Dann je 100 µl Kaolin-Cephalin-Suspension zufügen und in Teströhrchen vier mit neuer Pipettenspitze 5 µl Heparin zugeben. 3. Alle vier Eppendorf-Gefäße für mind. 30 sek in das Wärmebad stellen. 4. Nachdem die Mischung temperiert ist, in Röhrchen eins mit neuer Pipettenspitze 100 µl der ebenfalls temperierten CaCl 2 - Lösung zugeben und gleichzeitig mit dem Einpipettieren die Stoppuhr starten. 5. Mit der Öse kontinuierlich häkeln, die Zeit bis zum Auftreten des ersten Fibrinfadens messen und Werte in Sekunden protokollieren. 6. Öse wechseln und nacheinander die Versuche ab Punkt 3 starten. B2-39

21 Auswertung und Interpretation Die Auswertung erfolgt durch Vergleich mit Referenzwerten, die nicht nur physiologisch bedingt, sondern auch vom verwendeten Reagenz und seiner Chargennummer abhängig sind. Referenzbereich PTT bei Verwendung von Cephalin: s. Systematische Abweichungen von diesem Bereich können einerseits auf eine Voraktivierung der Probe durch Fehler bei der Blutabnahme oder Plasmagewinnung deuten, andererseits aber auch gerätebedingt sein. Häufige Fehler sind: Zu lange (länger als eine Minute) venöse Stauung, wodurch eine lokale Fibrinolyse bewirkt wird, unsachgemäße Venenpunktion, wodurch bei Kontakt mit Gewebe außerhalb der Vene Gewebsthromboplastin aspiriert wird, unzureichende Mischung, Inkubation oder Zentrifugation. Im Zweifelsfall sind laboreigene Referenzbereiche zu erstellen. Beim Neugeborenen kann aufgrund eines physiologischen Mangels an Gerinnungsfaktoren in den ersten Lebenstagen die PTT verlängert sein. Die PTT erfasst die Faktoren des intrinsischen sowie die gemeinsame Endstrecke des Gerinnungssystems. Etwa 95 % aller angeborenen hämorrhagischen Diathesen gehen mit einer Verlängerung der PTT einher. Durch Bestimmung der PTT ist nicht nur die Aufdeckung pathophysiologischer Störungen des Blutsystems möglich, sondern auch die Überwachung der antikoagulatorischen Therapie mit Heparin. Unter therapeutischer Antikoagulation mit unfraktioniertem Heparin (intravenös appliziert, im Gegensatz zum niedermolekularen Heparin mit einer längeren Halbwertszeit und subkutan appliziert) wird der Ausgangswert der PTT in etwa verdoppelt. Verlängerungen des PTT-Ausgangswertes um weniger als das 1,5-fache sprechen für eine unzureichende Antikoagulation, so dass trotz der Therapie das Risiko einer Thrombose besteht; Verlängerungen des PTT Ausgangswertes um mehr als das 2,5-fache signalisieren bei Heparintherapie eine Überdosierung, wobei die Gefahr einer Blutung besteht. Methode: Thromboplastinzeit (QUICK-Test) Hier wird Citrat-Plasma (Gewebs-)Thromboplastin (Gerinnungsfaktor III) und Calcium zugesetzt. Dadurch wird über das extrinsische System der Gerinnungsvorgang ausgelöst, indem der Faktor VII des exogenen Systems und konsekutiv die Faktoren X, V, II und I der gemeinsamen Endstrecke der plasmatischen Gerinnungssysteme aktiviert werden. Die Zeit bis zur Bildung des Fibringerinnsels wird gemessen und in Prozent, bezogen auf die Gerinnungszeit von Normalplasma, angegeben. Zu diesem Zweck wird eine Bezugskurve mit verschiedenen Normalplasmaverdünnungen erstellt. Da alle genannten Faktoren in der Leber gebildet werden, kann die Bestimmung der Thromboplastinzeit nach QUICK zugleich Hinweise auf die Leberfunktion bieten. Da die Synthese der Gerinnungsfaktoren IX des endogenen Systems, VII des extrinsischen Systems sowie X und II des gemeinsamen Weges beider plasmatischer Gerinnungssysteme unter anderem die Anwesenheit von Vitamin K voraussetzt, kann einerseits die Gerinnung langfristig durch die Gabe von Vitamin K-Antagonisten, etwa im Anschluss an eine erfolgreiche Thrombosebehandlung oder nach einem Herzinfarkt über den QUICK-Wert kontrolliert werden. B2-40

22 QUICK-Test Vorbereitung (Praktikumsleitung): 1. Venöse Blutabnahme und Gewinnung von Citrat-Plasma. 2. Anstellen des Wärmebades (37 C) und Überprüfen der Temperatur. Durchführung: 1. Thromborel schütteln und ins Wärmebad stellen. 2. Mit isotonischer NaCl-Lösung (0,9%) eine Verdünnungsreihe mit Citratplasma herstellen. Dazu zunächst in vier Reaktionsgefäße (2 ml-eppendorf-gefäße) die angegebene Menge Plasma pipettieren. Dann Pipettenspitze wechseln und mit NaCl-Lösung auf 100 µl auffüllen (s. Tabelle). Reihenfolge der Gefäße merken Konzentration 100 % 75 % 50 % 25 % Plasma 100 µl 75 µl 50 µl 25 µl Phys. NaCl 0 25 µl 50 µl 75 µl 3. Die vier Reaktionsgefäße für mindestens 1 min bei 37 C inkubieren. 4. In Röhrchen eins mit neuer Pipettenspitze 200 µl Thromborel zugeben und gleichzeitig Stoppuhr drücken. 5. Mit der Öse kontinuierlich häkeln, die Zeit bis zum Auftreten des ersten Fibrinfadens stoppen und Werte in Sekunden protokollieren. 6. Öse wechseln, nacheinander ab Punkt 3 alle Proben messen und die Werte in die Bezugskurve eintragen. Auswertung und Interpretation Das Messergebnis kann in Sekunden angegeben und mit Referenzwerten verglichen werden. Da die Messung jedoch auch durch methoden- und reagenzspezifische Faktoren stark beeinflusst wird, erreicht man eine bessere Vergleichbarkeit, wenn das Messergebnis nicht in Sekunden, sondern nach einem Vorschlag von A. Quick in Prozent einer standardisierten Bezugsgröße angegeben wird. Als Bezugsgrößen dienen einerseits Werte, die der Hersteller des Reagenzes für jede Charge der Subtanz mit verschiedenen Methoden ermittelt und der Verkaufspackung als Tabelle beigegeben hat. Diese Tabelle liegt aus und der Wert Ihres Versuches kann abgelesen werden. Andererseits ist es möglich, unter Verwendung eines normierten Standard-Humanplasmas aktuelle Bezugskurven zu ermitteln und das individuelle Versuchsergebnis mit diesen Bezugskurven zu vergleichen. Eine weitere Möglichkeit, Bezugskurven zu erhalten, besteht darin, dass man anstatt normiertes B2-41