Modul 34: Osmotische Resistenz, Blutgruppen

Transkript

1 Modul 34: Osmotische Resistenz, Blutgruppen Stichworte: Hämolyse - kolloidosmotischer/onkotischer Druck - Osmolarität Sphärozytose - ABO-Blutgruppen - Rhesussystem - Morbus haemolyticum neonatorum Lern-Inhalte Wie alle anderen Zellen besitzen die Erythrozyten eine Zellmembran, die einerseits das Zellinnere schützend umschließt, andererseits innerhalb bestimmter Grenzen einen Stoffaustausch zwischen Zellinnerem und Zelläußerem ermöglicht. Auf diese Weise besitzt das Zellinnere im Vergleich zum Zelläußeren einen "eigenen Lebensraum", ein intrazelluläres Milieu. Das korrekte intrazelluläre Milieu ist eine wesentliche Voraussetzung für den regulären Ablauf aller zellulären Lebensvorgänge. Schäden in der Struktur der Zellmembran führen zu Veränderungen des intrazellulären Milieus oder gar zum Zelltod. Gleiches gilt, wenn extrazelluläre Einflüsse die Regulationsfähigkeit der Zelle übersteigen. Wird den Erythrozyten Wasser entzogen, so schrumpfen sie, bei anhaltendem Wassereinstrom schwellen die Erythrozyten an und können im Reagenzglas auch zum Zerplatzen gebracht werden. Führen Membrandefekte zum Untergang der Erythrozyten, so zeigen sich Erkrankungen, die zum Formenkreis der hämolytischen Anämien zählen. Die Bestimmung der osmotischen Resistenz ist ein Verfahren, das die Stabilität der Erythrozytenmembran testet. Den Blutgruppen liegen Oberflächenmoleküle auf den Blutzellen zu Grunde, die in einem fremden Organismus eine Immunantwort auslösen können. Bei dem sog. ABO-System sind dies bestimmte Glykolipide in den Membranen praktisch aller Körperzellen (A: n-acetylgalaktosamin, B: Galaktose als endständiger Zucker). Durch Kontakt mit Bakterien, die blutgruppenähnliche Oberflächenmerkmale besitzen, bildet jeder Mensch während der ersten Lebensjahre Antikörper gegen die Blutgruppensubstanzen, die er nicht besitzt. Diese Antikörper müssen bei jeder Bluttransfusion bzw. Organtransplantation berücksichtigt werden, da sie schnell zur Zerstörung unverträglicher Erythrozyten bzw. zur Organabstoßung führen. Fallbeispiel Während der empfohlenen Vorsorgeuntersuchung eines 4jährigen Jungen fällt dessen blassgelbe Hautfarbe auf. Die Mutter berichtet, ihr Sohn sei nie ernsthaft krank gewesen, so dass sie keinen Anlass gesehen habe, die für frühere Zeitpunkte vorgesehenen Vorsorgeuntersuchungen durchführen zu lassen. Der blassgelben Hautfarbe habe sie keine Bedeutung beigemessen, zumal das Kind sich offensichtlich wohlfühle. Allerdings habe sie schon seit längerem beobachtet, dass der Stuhl des Kindes eher dunkel verfärbt sei. Körperliche Untersuchung: kein Hinweis auf körperliche oder geistige Entwicklungsverzögerung, allerdings auffallend ausgeprägte Wangenknochen. 34-1

2 Verdachtdiagnose: Hämolytische Anämie Als Anämie bezeichnet man einen Zustand, bei dem die Hämoglobin-Konzentration (Hb), der Hämatokrit (Hkt) oder die Erythrozytenzahl erniedrigt sind (Hb < 13 g/dl (Mann) oder < 12 g/dl (Frau); Hkt < 42 % (Mann) oder < 38 % (Frau)) (s. Modul 35). Wenn die Anämie auf einen vermehrten Erythrozytenabbau zurückzuführen ist, liegt eine hämolytische Anämie vor. Bei Verdacht auf eine Hämolyse (haima = Blut; lysis = Auflösung) müssen zunächst labordiagnostisch Zeichen des gesteigerten Erythrozytenabbaus gesichert werden. Ferner sind Zeichen der kompensatorischen gesteigerten Erythrozytopoese (erythros = rot, rötlich; poiesis = das Hervorbringen, Machen) nachzuweisen. Eine Vielzahl von Ursachen kann hämolytischen Anämien zugrunde liegen. Im Fallbeispiel lag bei dem Kind eine normochrome Anämie vor (s. Modul 35). Drei Laborwerte der Blutuntersuchungen sprachen für einen gesteigerten Erythrozytenabbau: mäßige Erhöhung des indirekten Bilirubins, Erhöhung der Lactatdehydrogenase (LDH) und deutliche Erniedrigung des Haptoglobins. Bei der mikroskopischen Untersuchung des Blutes fanden sich unterschiedlich große Erythrozyten (Anisozytose) und zahlreiche junge Erythrozytenformen (Retikulozyten), aber auch viele Kugelzellen (Sphärozyten), so dass eine Bestimmung der osmotischen Resistenz durchgeführt wurde. Aufgabe 1 Osmotische Resistenz Physiologisches Kernwissen Einige Anämieformen entstehen infolge eines beschleunigten Abbaus von Erythrozyten. Mögliche Ursachen dieser Hämolyse sind entweder erythrozytenspezifische Defekte oder schädigende Einflüsse auf die Erythrozyten. Die erythrozytenspezifischen Defekte betreffen entweder die Erythrozytenmembran oder das Innere des Erythrozyten. Ein Verfahren, das die Stabilität der Erythrozytenmembran testet, ist der Nachweis der osmotischen Resistenz. Gibt man Erythrozyten in eine wässrige Lösung, so können sie in Abhängigkeit von den osmotischen Verhältnissen entweder schrumpfen oder schwellen. Als "osmotische Resistenz" bezeichnet man die Fähigkeit der Erythrozyten, osmotischen Gradienten zwischen Zellinnerem und Zelläußerem Widerstand entgegenzusetzen. Die Standardplasmaosmolarität liegt bei ca. 290 mosm/l, und die Hämolyse beginnt bei ca. 180 mosm/l. Je weiter die Osmolalität im Extrazellulärraum sinkt, desto mehr nimmt die Hämolyse zu. Bei etwa 100 mosm/l sind nahezu alle Erythrozyten hämolysiert. Methode Die Prüfung der osmotischen Resistenz erfolgt in einer absteigenden Verdünnungsreihe 1%iger NaCl-Lösung in 0,1%igen Abstufungen. In hypo-osmolalem Milieu diffundiert Wasser in die Erythrozyten, die zunächst zu Kugelzellen (Sphärozyten) anschwellen und bei Überschreiten des kritischen Volumens zerplatzen: das Hämoglobin geht in Lösung. In hyper-osmolalem Milieu kommt es unter Schrumpfung der Erythrozyten zur Ausbildung von Stechapfelzellen (Echinozyten). Praktikumsteilnehmer, die Blut entnehmen oder mit Blut-(Bestandteilen) arbeiten, müssen Einmal-Handschuhe tragen! Blut ist immer als potenzielle Infektionsquelle zu betrachten! Gehen Sie daher im eigenen Interesse mit den Blutproben entsprechend umsichtig um. 34-2

3 Geräte/Material 1. Reagenzglasständer Reagenzgläser 3. Markierungsstift 4. 1%ige NaCl-Lösung 5. Aqua dest. 6. Einmalhandschuhe 7. Meßpipette (10 ml) 8. Einmal-Pasteurpipetten 9. Pi-Pump-Pipettierhilfe 10. aus Modul 33 die gefüllte, grüne Monovette (5 ml, mit 0,5 ml Citratlösung) 11. Halibox 12. weißes DIN A4-Blatt als Hintergrund Durchführung 1. Venöse Blutentnahme mit der Gerinnungsmonovette (Abb. 33-1) findet in Modul 33 statt. 2. Herstellung einer Verdünnungsreihe von 1%iger NaCl-Lösung (1,0 g NaCl/dl) mit Aqua dest. in Abstufungen von 0,1% (Abb. 34-1). 11 Reagenzgläser im Reagenzglasständer absteigend von 11-1 numerieren und mit Pipette wie folgt mit der 1%igen NaCl-Lösung füllen 10 ml in Reagenzglas 1 9 ml in Reagenzglas 2 8 ml in Reagenzglas 3 7 ml in Reagenzglas 4 6 ml in Reagenzglas 5 5 ml in Reagenzglas 6 4 ml in Reagenzglas 7 3 ml in Reagenzglas 8 2 ml in Reagenzglas 9 1 ml in Reagenzglas 10 Abb. 34-1: Osmotische Resistenz Alle Reagenzgläser werden mit Aqua dest. auf 10 ml aufgefüllt. In Reagenzglas 11 wird nur Aqua dest. gefüllt. 3. In jedes Reagenzglas 1 Tropfen Blut geben und durch Schwenken mischen. 4. Nach 5 min kann beim Blick durch die Reagenzgläser gegen einen weißen Hintergrund (DIN A4-Blatt) festgestellt werden, in welchen Gläsern die Erythrozyten gelöst wurden und in welchen sie als Trübung noch vorhanden sind. 5. Alle Teile, die mit Blut kontaminiert sind, müssen in den dafür vorgesehenen Abfallbehälter entsorgt werden. 34-3

4 Auswertung und Interpretation Die Auswertung besteht in der Beurteilung der beginnenden und der vollständigen Hämolyse sowie der Feststellung der jeweiligen NaCl-Konzentrationen, bei denen diese Effekte auftreten. Die Interpretation beruht auf dem Vergleich mit Referenzwerten. Osmotische Resistenz: Referenzbereiche NaCl > 0,5% = keine Hämolyse (> 180 mosm/l) NaCl 0,3% - 0,5% = partielle Hämolyse ( mosm/l; "Deckfarbe") NaCl < 0,3% = komplette Hämolyse (< 100 mosm/l; "Lackfarbe") Zwischen beginnender und vollständiger Hämolyse besteht ein Übergangsbereich, der als "Resistenzbreite" bezeichnet wird. Das ist darauf zurückzuführen, dass im Vergleich zujüngeren Erythrozyten die osmotische Resistenz der älteren Erythrozyten geringer ist: ältere Erythrozyten hämolysieren früher, jüngere Erythrozyten hämolysieren erst bei deutlich niedrigerer Osmolalität des extrazellulären Milieus. Eine herabgesetzte osmotische Resistenz liegt immer dann vor, wenn die zu untersuchenden Erythrozyten bereits Kugelzellform besitzen, bevor sie in Lösung gegeben werden. Das trifft bei jener Anämie zu, die durch Sphärozytose hervorgerufen wird. Dabei ist das Verhältnis von Zelloberfläche und Volumen der Erythrozyten zugunsten des Volumens verschoben, so dass die Schwellreserve klein und frühe Hämolyse die Folge ist. Der Nachweis verminderter osmotischer Resistenz sichert hier die Diagnose. Aufgabe 2 Blutgruppenbestimmung: AB0-System Physiologisches Kernwissen Das 1901 von K. LANDSTEINER entdeckte AB0-System ist das am längsten bekannte Blutgruppensystem des Menschen. Die Einteilung in Blutgruppen erfolgt durch den Nachweis bestimmter Substanzen, die sich auf den Oberflächen der Erythrozyten, aber auch anderer Zellen befinden und als Antigene wirken. Inzwischen konnten rund 200 verschiedene solcher Antigene nachgewiesen werden, so dass man außer dem AB0- System das Rhesus-System, das CARTWRIGHT-System, das DIEGO-System, das DUFFY-System, das KELL-System, das KIDD-System usw. unterscheidet. Insgesamt bilden die rund 200 beim Menschen nachgewiesenen Antigene etwa 15 verschiedene Blutgruppensysteme unterschiedlicher klinischer Bedeutung. Methode Wegen ihrer besonderen Bedeutung ist die Blutgruppenbestimmung durch Richtlinien der Bundesärztekammer geregelt. Die Blutgruppen des AB0-Systems werden unter Verwendung staatlich geprüfter Seren Anti-A (blau), Anti-B (gelb) und Anti-AB (farblos) bestimmt. Diese Bestimmung der Antigene im Serum muss durch eine Serumgegenprobe vervollständigt werden. Dabei werden Testerythrozyten bekannter Blutgruppenzugehörigkeit mit dem Serum des vorgesehenen Empfängerblutes in Kontakt gebracht. Normalerweise darf zwischen der Antigenbestimmung, wie sie auch im Praktikum durchgeführt wird, und der Serumgegenprobe, auf deren Durchführung im Praktikum verzichtet wird, keine Diskrepanz auftreten. Geräte/Material 1. Einmalhandschuhe 2. Tüpfelplatte (Objektträger mit Vertiefungen zur Blutgruppenbestimmung) 3. Hautdesinfektionsmittel 4. Tupfer 34-4

5 5. Einmal-Pasteurpipette 10. Stechhilfe (Softclix R ) 6. physiologische NaCl-Lösung (0,9%) 11. Objektträger 7. Testserum Anti-A (blau) 12. Markierungsstift 8. Testserum Anti-B (gelb) 13. Pflaster 9. Testserum Anti-AB (farblos) 14. Halibox Durchführung 1. Versuchsperson (VP) sitzt am Tisch. 2. Versuchsleiter (VL) gibt in die Vertiefung Anti-A des Blutgruppen-Objektträgers einen Tropfen des Testserums Anti-A (blau), in die Vertiefung Anti-B einen Tropfen des Testserums Anti-B (gelb) und in die Vertiefung Anti-AB einen Tropfen des Testserums Anti-AB (farblos). 3. Da laut Herstellerangabe mit einem Tropfen 5%iger Erythrozytensuspension in isotonischer NaCl-Lösung gearbeitet werden soll, anstatt mit einem Tropfen 40-50%iger Erythrozytensuspension in Serum oder Plasma, reicht es zur Demonstration des Effektes aus, wenn der VL in jede der drei Vertiefungen der Platte zunächst je einen Tropfen physiologischer NaCl-Lösung gibt. 4. VL zieht Einmalhandschuhe an. 5. VL desinfiziert die Hautoberfläche der vorgesehenen Einstichstelle an der Endphalanx des linken Ringfingers der VP. 6. VL setzt mit der Stechhilfe eine Verletzung an der Endphalanx. 7. VL streift mit den verschiedenen Ecken eines Objektträgers einen austretenden Bluttropfen vom Ringfinger der VP und verrührt ihn in den Vertiefungen Anti-A, Anti- B und Anti-AB des Blutgruppen-Objektträgers. 8. VL lässt den Blutgruppen-Objektträger bei Raumtemperatur 1 min lang ruhig stehen. 9. VL nimmt den Blutgruppen-Objektträger auf und prüft unter leichten Schaukel- und Kippbewegungen, in welchem der drei Felder sich eine Agglutination zeigt. 10. Alle Teile (Kanülen, Spritzen, Tupfer etc.), die mit Blut kontaminiert sind, müssen in den dafür vorgesehenen Abfallbehälter entsorgt werden. Auswertung und Interpretation Auswertung und Interpretation erfolgen visuell, wobei das Schema der Abb den Sachverhalt zu verdeutlichen hilft. Abb. 34-3: Blutgruppenbestimmung im AB0-System. Die Blutgruppen werden in den Vertiefungen von vier Blutgruppen-Objektträgern mit Testseren vermischt. Teilweise treten Agglutinationsreaktionen auf (dunkle Zentren), teilweise nicht (helle Zentren). Durch Beurteilung der Agglutinationskombinationen wird die Blutgruppe bestimmt. 34-5

6 1. Tritt mit Testserum Anti-A (blau) im Blut der VP eine Verklumpung (Agglutination) auf, so ist auf der Oberfläche der Erythrozyten der VP A-Substanz vorhanden: VP hat die Blutgruppe A oder AB. 2. Tritt mit Testserum Anti-B (gelb) im Blut der VP eine Verklumpung (Agglutination) auf, so ist auf der Oberfläche der Erythrozyten der VP B-Substanz vorhanden: VP hat die Blutgruppe B oder AB. 3. Testserum Anti-AB (farblos) agglutiniert Erythrozyten der Blutgruppe A, B und AB. Tritt hier keine Agglutination auf, so liegt die Blutgruppe 0 vor, die gelegentlich auch als Merkmal H bezeichnet wird (heterogenetische Grundsubstanz). Abb. 34-4: Kreuzprobe Während im Praktikum lediglich festgestellt wurde, ob die Erythrozyten eines potenziellen Spenders mit dem laborchemisch hergestellten Testserum eines potenziellen Empfängers harmonieren, muss vor einer Transfusion bei einem Patienten außerdem die gesetzlich vorgeschriebene Kreuzprobe (cross match) von einem Arzt durchgeführt werden. Sie besteht aus zwei Testteilen: im Major-Test wird die Verträglichkeit zwischen Spendererythrozyten und Empfängerserum beurteilt, im Minor-Test die zwischen Empfängererythrozyten und Spenderserum. Aufgabe 3 Blutgruppenbestimmung: Rhesus-System Physiologisches Kernwissen Die Arbeiten von LEVINE und STETSON sowie von LANDSTEINER und WIENER führten 1939 bzw zur Entdeckung eines weiteren Blutgruppensystems. Es wird heute traditionell als Rhesus-System bezeichnet. Die Rhesus-Merkmale bestehen aus einer Kette von 412 Aminosäuren, die sich zwölf Mal durch die Erythrozytenmembran windet. Aufgrund struktureller Ähnlichkeiten z.b. mit der Na + /K + -ATPase wird eine Transportfunktion angenommen, zumal das extrem seltene Fehlen aller Rhesus-Merkmale zu einer Hämolyse führt. Die Rhesusproteine RhBG und RhCG, die mit den Proteinen der Blutgruppen-Merkmale Rh D und Rh CE verwandt sind, transportieren NH 3 / NH 4 +. Aufgrund des Austauschs einzelner Aminosäuren kann man u.a. die Merkmale D, C, c, E und e unterscheiden. Das Merkmal D ist das wichtigste und stärkste Merkmal des Rhesus-Systems. Das Merkmal D führt aufgrund einer Deletion zu einer verkürzten Kette und kann mit Antiseren nicht nachgewiesen werden. Personen, die das Merkmal D besitzen, werden als "Rhesus-positiv", Personen ohne dieses Merkmal als "Rhesus-negativ" bezeichnet. Kommen Rhesus-negative Personen in Kontakt mit Rhesus-positivem Blut (Transfusion oder auch Schwangerschaft), so bilden sie häufig ein Anti-D, was bei weiteren Transfusionen (oder Schwangerschaften) zur extravasalen Hämolyse der Rhesus-positiven Erythrozyten führt. Der Morbus hämolyticus neonatorum kann zum intrauterinen Tod des Rhesus-positiven Kindes führen. 34-6

7 Methode Die Blutgruppen des Rhesus-Systems werden unter Verwendung eines staatlich geprüften Rhesus-Testserums Anti-D (rot) bestimmt, wobei eine Serumgegenprobe wie bei der Bestimmung der AB0-Blutgruppe nicht notwendig ist. Unter den verschiedenen Methoden, die der Hersteller des Testserums angegeben hat, wird im Praktikum der Schnelltest bei Raumtemperatur durchgeführt. Geräte/Material wie Aufgabe 4 zusätzlich: Inkubator, Schale mit angefeuchtetem Papier, Testserum Anti-D Durchführung 1. VP sitzt am Tisch. 2. VL gibt in die Vertiefung Anti-Rh einen Tropfen des Rh-Testserums Anti-D (rot). 3. VL desinfiziert die Hautoberfläche der vorgesehenen Einstichstelle an der Endphalanx des linken Ringfingers der VP. 4. VL setzt mit der Stechhilfe eine Verletzung an der Endphalanx. 5. VL streift mit einer Ecke des Objektträgers einen austretenden Blutstropfen vom Ringfinger der VP und verrührt ihn in der Vertiefung Anti-Rh des Blutgruppen- Objektträgers. 6. Der Blutgruppen-Objektträger wird 5 min bei Raumtemperatur in "feuchter Kammer" inkubiert. 7. VL nimmt den Blutgruppen-Objektträger auf und prüft unter leichten Schaukel- und Kippbewegungen, ob sich im Feld Anti-Rh der Platte eine Agglutination zeigt. 8. Alle Teile (Kanülen, Spritzen, Tupfer etc.), die mit Blut kontaminiert sind, müssen in den dafür vorgesehenen Abfallbehälter entsorgt werden. Auswertung und Interpretation Auswertung und Interpretation erfolgen visuell. Tritt eine Agglutination auf, so ist das - Merkmal D vorhanden; die Beurteilung lautet: Rhesus-positiv. Bei Rhesus-Negativität sind zusätzlich speziellere Untersuchungen notwendig, weil innerhalb des Rhesus- Systems mehrere Modifizierungen bestehen, die bei einer Bluttransfusion zu beachten sind. Klinisches Kernwissen: Hämolytische Anämie Vorkommen und Häufigkeit Die Sphärozytose (Kugelzellanämie) ist die häufigste angeborene hämolytische Anämie in Nordeuropa. Ihr liegt ein Membrandefekt zugrunde, bei dem entweder das submembranäre Zytoskelett oder der Anionenaustauscher 1 (Bande 3-Protein) mutiert sein können. Bei Personen mit Abstammung aus dem Mittelmeerraum dominieren die autosomal-dominant erblichen Thalassämien (thalassa = Meer; haima = Blut). Bei dieser Gruppe von Erkrankungen liegt ein Defekt der Globinketten vor, die Erythrozyten sind zu scheibchendünnen Zellen (Targetzellen) mit erhöhter Schwellreserve umgewandelt. Daraus resultiert eine erhöhte osmotische Resistenz. Ursachen Normale menschliche Erythrozyten werden beim Erwachsenen im roten Knochenmark gebildet, leben 120 Tage im Blut, legen eine Strecke von ca. 300 km zurück und werden in der Milz abgebaut. Unter bestimmten Bedingungen kann die Lebensdauer der Erythrozyten bis auf wenige Tage verkürzt sein. Anämien, die durch eine Verkürzung der Erythrozytenlebensdauer hervorgerufen werden, bezeichnet man als hämolytisch. Eine besondere Rolle spielt dabei die Milz, die veränderte Erythrozyten wie ein Filter aus dem Blut abfängt. 34-7

8 Die Ursachen, die zu einer Hämolyse führen, können entweder mit den Erythrozyten selbst in Verbindung gebracht werden (korpuskulär) oder durch Faktoren ausgelöst werden, die außerhalb des Erythrozyten (extrakorpuskulär) lokalisiert sind. 1. Beispiele für Ursachen korpuskulärer hämolytischer Anämien Angeboren: Membranproteindefekt z.b. hereditäre Sphärozytose Stoffwechseldefekt z.b. Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase(G6PDH)-Mangel Hämoglobindefekt z.b. Sichelzellanämie Erworben: Membranproteindefekt z.b. Paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie (PNH) 2. Beispiele für Ursachen extrakorpuskulärer hämolytischer Anämien Immunhämolyse z.b. Morbus haemolyticus neonatorum Mechanische Hämolyse z.b. bei künstlicher Herzklappe Toxische infektbedingte Hämolyse z.b. Malaria Diagnostik Vermutet man eine der Formen hämolytischer Anämien, so konzentriert sich die Basisdiagnostik auf drei Fragen: - Liegt eine Anämie vor? - Hier sollten Hämoglobin, Hämatokrit, Anzahl der Erythrozyten und Erythrozytenindizes bestimmt werden (s. Modul 35). - Finden sich Zeichen eines erhöhten Erythrozytenabbaus? - Hier sind die Erhöhung des indirekten Bilirubins, eine Erhöhung der LDH und eine Erniedrigung des Haptoglobins deutliche Hinweise. - Finden sich Zeichen einer kompensatorisch verstärkten Erythrozytopoese? - Hierfür spricht bei der mikroskopischen Untersuchung eines Blutausstrichs die Erhöhung der Retikulozyten. Bei der mikroskopischen Untersuchung sind ferner krankhaft veränderte Erythrozytenformen zu beachten. Therapie Die therapeutischen Möglichkeiten der hämolytischen Anämien sind gering. Eine kausale Therapie stellt bei einigen korpuskulären Anämien die allogene Knochenmarks- bzw. Stammzelltransplantation dar. Die hereditäre Sphärozytose bessert sich, sobald die Milz entfernt wird (Splenektomie). Eine kausale Therapie der extrakorpuskulären Anämien zielt darauf ab, die schädigenden Faktoren zu beseitigen. 34-8