R. Schneppenheim Klinik für Pädiatrische Hämatologie und Onkologie, Universitäts-Klinikum Hamburg-Eppendorf. Keywords VWF, VWD, genetics

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1 37/ Schattauer GmbH Molekulare Genetik des von-willebrand-syndroms R. Schneppenheim Klinik für Pädiatrische Hämatologie und Onkologie, Universitäts-Klinikum Hamburg-Eppendorf Schlüsselwörter VWF, VWS, Genetik Zusammenfassung Die multifunktionellen Eigenschaften des von Willebrand-Faktors (VWF) und seine komplexe Biosynthese und Struktur sind für die unterschiedlichen molekularen Mechanismen verantwortlich, welche die bekannte ausgeprägte klinische Heterogenität des von Willebrand- Syndroms (VWS) erklären. Die Identifizierung spezifischer Mutationen, die entweder mit dem kompletten oder partiellen Fehlen des VWF, Störungen der posttranslationalen Modifikation, wie Dimerisierung und Multimerisierung, Beeinträchtigung des intrazellulären Transports oder funktionellen Defekten einhergehen, haben die Möglichkeit für Struktur/Funktions-Studien des VWF und zu Genotyp/Phänotyp-Analysen des VWS geschaffen. Durch die heute verfügbare moderne Technik der Genanalyse können selbst bei dem sehr großen und komplexen Gen des VWF mit seinen 52 Exons die kausalen Mutationen in einer überschaubaren Zeit identifiziert werden. Die Mutationsanalyse kann somit bei der korrekten Diagnosestellung und der Klassifikation von Patienten hilfreich sein, was für viele Patienten für die Wahl der adäquaten Therapie von Bedeutung ist. Auch die Identifizierung von nicht betroffenen Mutationsträgern innerhalb einer Familie mit VWS ist hierdurch möglich. Darüberhinaus können die Mutationsanalyse und die aus ihr gewonnenen Erkenntnisse dazu beitragen, die molekularen Mechanismen des VWF nicht nur bei Blutungen sondern auch bei arteriellen thromboembolischen Erkrankungen zu verstehen. Der von Willebrand-Faktor (VWF) ist ein multifunktionelles Protein. Seine wichtigsten Funktionen bestehen in der Plättchenadhäsion über Thrombozytenoberflächen-Glykoprotein Ib (GpIb) und in deren Aggregation unter Bedingungen hoher Scherkräfte (z. B. in der Mikrozirkulation) über Thrombozyten-GpIIb/IIIa (s. Ruggeri, S. 1 11), sowie Keywords VWF, VWD, genetics Summary Due to the multifunctional character of von Willebrand factor (VWF), its complex biosynthesis and structure, many different disease causing molecular mechanisms exist which explain the well known marked heterogeneity of clinical symptoms in von Willebrand disease (VWD). Identification of specific mutations that can either cause complete or partial absence of VWF, interfere with post-translation processing of VWF like dimerisation and multimerisation, impair intracellular transport or disturb particular functions of VWF, offered the opportunity for structure/function studies of VWF and genotype/phenotype analysis of VWD. Today the molecular tools for such studies are readily available, enabling us to identify the molecular defects in a reasonable time even in the case of the large and complex VWF gene with its 52 exons. Mutation analysis can help to find the correct diagnosis and to classify patients with VWD which may be crucial to choose the adequate therapy. It can also identify unaffected carriers of the disease gene among family members of patients with VWD. Furthermore, mutation analysis and the conclusions drawn from such data can further help to understand the molecular mechanisms of VWF not only in bleeding but also in arterial thrombotic disease. Molecular genetics of von Willebrand disease Hämostaseologie 2004; 24: in der Bindung von Faktor VIII, wodurch dieser vor einem schnellen Abbau (z. B. durch das Protein-C-System) geschützt ist (8). Für seine plättchenabhängigen Funktionen in der primären Hämostase werden die besonders großen Multimere des VWF benötigt, während die FVIII-Bindung von der Größe der Multimere unabhängig ist. Neben den genannten Bindungstellen exis- tieren weitere, z. B. für Kollagen (16, 27), über das die Bindung des VWF an das verletzte Endothel erfolgen soll, und für Heparin (9) (Abb. 1). Diese Multifunktionalität und die Abhängigkeit der VWF-Funktion in der primären Hämostase von der Größe der VWF-Multimere eröffnet viele Fehlermöglichkeiten, die a) allgemein alle Funktionen, wenn ein quantitativer Defekt des VWF vorliegt, b) alle Funktionen in der primären Hämostase, wenn große Multimere des VWF quantitativ vermindert sind, c) die Funktion in der sekundären Hämostase, wenn die FVIII-Bindungsregion defekt ist, d) weitere isolierte Einzelfunktionen (z. B. GpIb-, Kollagen- oder GpIIb/IIIa-Bindung) betreffen können. Dies ist die Grundlage für die außergewöhnliche phänotypische Heterogenität des von-willebrand-syndroms (VWS), die sich auch auf die molekulare Basis zurückführen lässt. Das Gen für den VWF befindet sich am distalen Ende des kurzen Arms vom Chromosom 12 (12p13.3-p13.2). Dabei sind ca. 178 Kilobasen (kb) auf 52 Exons und Introns verteilt, von denen das erste nicht kodierend ist Nukleotide (nt), die sich aus 51 Exons zusammensetzen, kodieren für 2813 Aminosäuren. Das Exon 28 ist mit 1379 bp sehr groß (20). Das Gen enthält mehrere sich wiederholende homologe Regionen, die durch Genreplikation und Fusion, so genanntes Exon-Shuffling, während der Evolution entstanden sind (Abb. 1). Ein Pseudogen auf dem langen Arm des Chromosoms 22 (22q11-q12)ist zu 97% homolog zu den Exons des eigentlichen Gens (19). Diese hohe Homo-

2 38/48 Schneppenheim die Sequenzierung mittels Kapillarelektrophorese, deren Ergebnisse elektronisch und visuell ausgewertet werden können. Abb. 1 Struktur des VWF mit den unterschiedlichen funktionellen und strukturellen Domänen (D1-CK) SP: Signalpeptid, CGLC: Konsensussequenz für Disulfid-Isomerasen, FVIIIB: FVIII-Bindungsregion, Mult.: Multimerisierungsregion, CB: Kollagenbindungsregionen, GpIb: GpIb-Bindungsstelle, PS: proteolytische Schnittstelle für ADAMTS13, RGD: RGD-Sequenz für GpIIb/IIIa-Bindung, Dim.: Dimerisierungsregion in der CK-Domäne (cystine knot) logie des Pseudogens erschwert die molekulare Diagnostik mittels PCR. Dem muss bei der Auswahl von Primern für die spezifische Amplifikation des VWF-Gens unter Ausschluss des Pseudogens Rechnung getragen werden. Bisher identifizierte Mutationen des VWF sind in der ISTH-SSC-VWF-Database gelistet ( Gendiagnostik Zu den ersten Methoden der Gendiagnostik gehört der Southern Blot (38), ein autoradiographisches Verfahren mit genspezifischen Sonden zur Detektion genspezifischer Banden nach Verdau genomischer DNA mittels Restriktionsenzymen, DNA- Elektrophorese und Transfer der getrennten DNA-Fragmente auf eine Membran durch Kapillarblotverfahren. Dieses Verfahren bietet sich vor allem für die Identifizierung von großen Deletionen, Insertionen und Inversionen an (Abb. 2). Seit der Einführung der Polymerasekettenreaktion (PCR) in die molekulare Diagnostik kam der Southern Blot etwas»aus der Mode«, vor allem wegen der Probleme mit der Radioaktivität. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass ein Verzicht auf diese Technik zum Übersehen größerer Gendefekte führen kann. Die Erfindung der PCR durch Kary Mullis (26) revolutionierte die Gendiagnostik und führte sie zu der Routine, die inzwischen zum Standard vieler Labors gehört. Im Zusammenhang mit der sich parallel entwickelnden Automatisierung der Sequenzierverfahren wurde eine extrem schnelle Identifizierung auch von Punktmutationen möglich, die früher erst mühsam nach Klonierung und aufwändigen Präparationsschritten vor der eigentlichen Sequenzierung gelang. Aktuell werden zur Gendiagnostik im Allgemeinen alle kodierenden Exons des zu untersuchenden Gens amplifiziert, nach kurzer Reinigung erfolgt die PCRvermittelte Sequenzierreaktion nach Sanger (28) und anschließend Abb. 2 Southern Blot von Patienten mit VWS und Normalpersonen (detektiert mit einer VWF-genspezifischen Sonde) del: Patient mit schwerem VWS Typ 3 und kompletter homozygoter Deletion des VWF-Gens, erkennbar am Fehlen genspezifischer Banden. Mittels der genannten Verfahren kann in den meisten Fällen die molekulare Ursache einer hereditären Erkrankung nachgewiesen werden. Gelegentlich (z. B. bei kleinen Deletionen oder Insertionen) müssen Klonierungsschritte zwischengeschaltet werden. Quantitative Defekte des VWF Hierzu gehören definitionsgemäß die molekularen Ursachen für das VWS Typ 1: relative Verminderung des VWF und korrespondierende Beeinträchtigung seiner Funktionen sowie Typ 3: absolutes Fehlen des VWF und damit Ausfall seiner Funktionen. Die Entdeckung der ersten Gendefekte des VWF-Gens bei Patienten mit schwerem VWS Typ 3 bestätigten die Kausalität zwischen Defekten des VWF und dem VWS. Zunächst wurden große, meist komplette homozygote Deletionen des Gens mittels Southern-Blot-Verfahren identifiziert (23, 37). Die PCR ermöglichte dann den Nachweis auch von Punktmutationen. Beim VWS Typ 3 wurden vor allem sogenannte trunkierende Mutationen gefunden, wie z.b. kleine Deletionen und Insertionen, die zu einer Verschiebung des Leserasters führen und Nonsense-Mutationen mit der Folge instabiler mrna oder einem trunkierten Protein. Aber auch Missense-Mutationen wurden gefunden, welche meist zu Störungen der posttranslationalen Biosynthese, wie der Dimerisierung und Multimerisierung führen. Das Mutationsspektrum ist sehr heterogen. So finden sich meist auf einzelne Familien beschränkte homozygote oder compound-heterozygote Mutationen, entsprechend dem rezessiven Erbgang. Mutationen des VWS Typ 3 können theoretisch im gesamten Gen vorliegen (Abb. 3). Dies gilt fast für alle Populationen weltweit (3, 33, 40, 41). Allerdings tritt in den Ländern um

3 39/49 Genetik des VWS Mutationsspektrum (I. Peake, persönliche Mitteilung). Abb. 3 Mutationsspektrum beim schweren VWS Typ 3 (eigene Daten) die Ostsee auf Grund eines Founder- Effekts eine spezielle Mutation besonders häufig auf. Die Ein-Basendeletion 2435delC im Exon 18, findet man auf der Hälfte der Chromosomen schwedischer Patienten (40), auf 12-15% der Chromosomen deutscher Patienten (33) und sogar auf 75% der Chromosomen polnischer Patienten mit VWS Typ 3 (32), nicht jedoch bei anderen bisher analysierten Patienten (z. B. aus den Niederlanden, der Türkei) und nur in einem Fall bei einem compoundheterozygoten Patienten aus Italien (32). Mittels Haplotypanalysen konnten wir zeigen, dass es sich um eine»alte«baltischslawische Mutation mit einem gemeinsamen genetischen Ursprung handelt (32), die in den verschiedenen Ostsee-Anrainerstaaten auftritt (Abb. 4). Patienten mit einem VWS Typ 1 zeigen ein erniedrigtes VWF:Ag und gleichsinnig verminderte funktionelle Parameter, wie man sie auch bei heterozygoten Anlageträgern eines VWS Typ 3 finden kann. Die Hypothese, dass ein VWS Typ 1 auf einem heterozygoten Typ-3-Defekt beruhen könnte, ließ sich jedoch in den meisten Fällen nicht bestätigen. Wenn Verwandte von Typ 3-Patienten oft ebenfalls über Blutungssymptome klagen, ist dies nur schwer objektivierbar und könnte auf die erhöhte Aufmerksamkeit gegenüber einer Blutungssymptomatik und Aggravierung zurückzuführen sein (33). Eine systematische Suche nach Typ 3- Defekten bei Patienten mit einem VWS Typ 1 wurde bis vor kurzem nicht durchgeführt. Erst im Rahmen einer aktuell laufenden europäischen Studie zum VWS Typ 1 wurden die ersten Mutationen identifiziert. Hier wurde u. a. bei einem deutschen Patienten Heterozygotie für die»baltische«typ-3-mutation 2435delC entdeckt. Darüberhinaus fanden sich bisher allerdings überwiegend Missense-Mutationen und ein vom Typ 3 vollkommen abweichendes Qualitative Defekte Bei der Klassifikation des VWS zeigt der Typ 2 die größte phänotypische Heterogenität. Hieraus lässt sich bereits a priori das interessanteste Mutationsspektrum ableiten (Abb. 5). Generell findet man Formen mit einer isolierten Störung der primären Hämostase, wie bei einigen Phänotypen des Subtyps 2A und solche mit einer isolierten Störung der sekundären Hämostase wie beim Subtyp 2N. Isolierte Veränderungen der GpIb-Bindung (z. B. erhöhte Affinität für GpIb beim Subtyp 2B) oder der Kollagenbindung (ohne Bezeichnung), wurden nachgewiesen. Bisher wurde keine Mutation gefunden, bei der isoliert die GpIIb/IIIa-Bindung gestört war. Der Erbgang des Typ 2 ist meist dominant, jedoch werden der Typ 2N mit defekter FVIII-Bindung des VWF und der Phänotyp IIC des Subtyps 2A mit Mutationen im VWF-Propeptid rezessiv vererbt. Es ist vor allem die Heterogenität des Typs 2, die für das unterschiedliche klinische und biochemische Spektrum und die vielen ver- Abb. 4 Geographische Verteilung der so genannten baltischen Mutation 2435delC mit Angabe der prozentualen Häufigkeit der Mutation auf den Chromosomen von Typ-3-Patienten

4 40/50 Schneppenheim wird im Gegensatz zu den anderen rezessiv vererbt. Ein dominanter Erbgang wird hingegen für eine Sonderform des Phänotyps IIC, den Phänotyp IIC Miami mit Mutationen in der D3-Domäne beschrieben. Er unterscheidet sich vom normalen Phänotyp IIC durch ein erhöhtes VWF:AG (17). Abb. 5 Mutationscluster bei verschiedenen Subtypen (2N, 2B) und Phänotypen (IIC, IIE, IIA, IID) des VWS Typ 2 (CBD: Kollagenbindungsdefekte) schiedenen Varianten des VWS verantwortlich ist (s. Beitrag zu Klassifikation, S ). Prinzipiell sind für den Typ 2 verschiedene molekulare Pathomechanismen verantwortlich: 1. rein funktionelle Störungen, 2. Störungen der posttranslationalen Biosynthese (z. B. Dimerisierung und Multimerisierung mit Fehlen großer Multimere) 3. verminderte Resistenz gegenüber der spezifischen VWF-spaltenden Protease, ADAMTS13; Folge: verstärkter Abbau großer VWF-Multimere, 4. gestörter intrazellulärer Transport der großen VWF-Multimere bzw. ein rascher intrazellulärer Abbau strukturell fehlerhafter Multimere. Funktionelle Störungen Entsprechend der Lokalisation bestimmter Funktionen des VWF in definierten Domänen können durch Mutationen isolierte Teilfunktionen des VWF betroffen sein. Mutationen in der A1-Domäne führen zu einer verstärkten GpIb-Bindung beim Typ 2B (17). Die defekte FVIII-Bindung beim Typ 2N ist das Resultat von Mutationen in der FVIII-Bindungsregion der D -Domäne (11,24,30), und die isolierte Störung der Kollagenbindung ist durch Mutationen in der A3-Domäne bedingt (25, 34). Störungen der posttranslationalen Biosynthese Die effektive Dimerisierung der VWF- Monomere über deren CK-Domäne am carboxyterminalen Ende kann durch Mutationen in dieser Region (in der Regel Cysteinmutationen) verhindert werden (29). Es können dennoch Dimere entstehen, allerdings erst über Bindungen am aminoterminalen Ende des VWF. Eine weitere Multimerisierung ist dann jedoch nicht möglich. Heterozygote Mutationen der CK- Domäne sind für einen besonderen Phänotyp des Subtyps 2A, den Phänotyp IID verantwortlich (7, 29, 31), der in der älteren Nomenklatur als Typ IID bezeichnet wurde (s. Artikel Klassifikation, S ). Homozygote Mutationen in dieser Region wurden bei Patienten mit Typ 3 diagnostiziert (31). Die weitere Multimerisierung der VWF-Dimere erfolgt über mehrere Disulfid-Brücken in der cysteinreichen D3- Domäne. Mutationen in dieser Domäne beeinträchtigen die Multimerisierung der Dimere am aminoterminalen Ende und verursachen die Phänotypen IIE und IIF des Subtyps 2A (35). Bei den heterozygoten Patienten können die großen Multimere fehlen oder relativ reduziert sein. Homozygotie für einige dieser Mutationen kann für ein VWS Typ 3 verantwortlich sein (4). Die Multimerisierung in der D3-Domäne des VWF kann aber auch durch Defekte des VWF-Propeptids gestört werden (10, 36). Dies beruht auf der Beeinträchtigung der im Propeptid lokalisierten enzymatischen Aktivität für die Knüpfung von Disulfidbrücken (21) durch Mutationen in der D1- und D2-Domäne des VWF. Der resultierende Phänotyp IIC mit Fehlen der großen Multimere wird ebenfalls zum Subtyp 2A gerechnet. Dieser Phänotyp Verminderte ADAMTS13-Resistenz In der A2-Domäne des VWF zwischen Tyrosin 1605 und Methionin 1606 ist die spezifische proteolytische Schnittstelle für die Metalloprotease ADAMTS13 lokalisiert, Mutationen in der Nähe der Schnittstelle führen zu einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber ADAMTS13 (5). Folge ist ein Verlust der großen Multimere. Der spezifische Phänotyp wurde früher als Typ IIA bezeichnet, der in der aktuellen Klassifikation als Untergruppe des Subtyps 2A eingeordnet wird. Gestörter intrazellulärer Transport Ein Teil der in der A2-Domäne aber auch in weiteren Regionen des VWF lokalisierten Mutationen führt zu einer verminderten Sekretion der großen VWF-Multimere und damit ebenfalls zu einem Subtyp 2A (18). Weitere den intrazellulären Transport beinträchtigende Mutationen finden sich im VWF-Propeptid (2). Mutationscluster und Phänotypen Die verschiedenen molekularen Mechanismen korrelieren jedoch nicht in allen Fällen mit einem bestimmten Subtyp des VWS Typ 2. Die folgende Beschreibung basiert daher eher auf bisher identifizierten Mutationsclustern, die sich einem bestimmten Phänotyp zuordnen lassen. Die Möglichkeit, bestimmten VWS-Phänotypen spezifische Mutationen zuzuordnen, kann vor allem für die Verbesserung der Klassifikation genutzt werden (s. Artikel zur Klassifikation, S ).

5 41/51 Genetik des VWS D1- und D2-Domäne Missense-Mutationen in diesen Domänen sind überwiegend mit einem schweren Defekt der Multimerisierung verbunden (Abb. 6). In der Regel ist dabei der Erbgang rezessiv, so dass meist homozygote oder compound-heterozygote Mutationen gefunden werden (10, 36). Es sind Mutationen mit relativ leichten und schweren Auswirkungen auf den Phänotyp bekannt. Bei ersteren kann in den meisten Fällen die Diagnose eines VWS Subtyp 2A, Phänotyp IIC gestellt werden (Abb. 5), während schwere Mutationen zu einem Typ 3 führen können (Abb. 3) mit sehr niedrigem VWF:Ag und einer entsprechenden klinischen Symptomatik (33). D -Domäne In dieser Domäne, der FVIII-Bindungsdomäne des VWF, finden sich Mutationen, die isoliert die FVIII-Bindung beeinträchtigen (Abb. 5). Dies kann bei einzelnen Mutationen (E787K, T791M, R816W) mit völligem Fehlen der FVIII-Bindung und entsprechend niedriger FVIII-Konzentration bis zu 1% führen (30). Die häufigste Mutation (R854Q) bewirkt lediglich eine Einschränkung der FVIII-Bindung mit korrespondierenden FVIII-Werten von durchschnittlich 20% (30). Die meisten Mutationen finden sich in den Exons 18, 19 und 20 (11, 24, 30). Vereinzelt gibt es auch FVIII-Bindungsmutationen in weiteren Exons der D3-Domäne (35). Einzelne Mutationen beeinträchtigen auch die Multimerstruktur (1, 15). D3-Domäne Hier liegt ein Cluster von Mutationen vor, die die Multimerstruktur mehr oder weniger stark beeinflussen (Abb. 6). In den meisten Fällen handelt es sich um Mutationen, die entweder einen Verlust oder Gewinn des Aminosäurerestes Cystein bedeuten. Da die Multimerisierung über Disulfidbrücken in der D3-Domäne vermittelt wird, könnten die bisher identifizierten Cysteinmutationen direkt oder Abb. 6 Multimeranalyse des plasmatischen VWF von Patienten mit unterschiedlichen Phänotypen des VWS Typ 2 A (mit Verlust großer Multimere) im Vergleich zu Normalplasma (NP) und Plasma eines Patienten mit VWS Subtyp 2B NP: Normalplasma (betonte große Multimere) IB: relative Verminderung großer Multimere bei normaler Tripletstruktur IIA: Phänotyp mit verstärkter Proteolyse, erkennbar am Verlust großer Multimere und den betonten Satellitenbanden der Triplets 2B: Subtyp mit erhöhter Affinität zu GpIb und dem gleichen Multimermuster wie IIA IIC: Phänotyp mit gestörter Multimerisierung, fehlenden großen Multimeren und fehlenden proteolytischen Fragmenten IID: Phänotyp mit gestörter Dimerisierung, reduzierten großen Multimeren und Zwischenbanden als Hinweis auf Multimere mit ungerader Anzahl von Monomeren IIE: Phänotyp mit gestörter Multimerisierung, reduzierten großen Multimeren und reduzierter Proteolyse IIAv: Phänotyp mit reduzierten großen Multimeren und verwaschener Struktur der Multimerbanden indirekt zu einer fehlerhaften oder eingeschränkten Multimerisierung der VWF- Dimere führen. Abb. 7 Multimeranalyse des VWF eines Patienten mit VWS-Subtyp 2A, Phänotyp IIE: Auffallend ist der relative Verlust großer Multimere im Vergleich zu Normalplasma (N). Der molekulare Defekt lässt sich durch Untersuchung des rekombinant hergestellten mutanten VWF (riie) im Vergleich zum rekombinanten normalen VWF (wt) reproduzieren. Auch die Koexpression von mutantem und Normal- VWF (riie + wt) führt zu einem aberrantem VWF und bestätigt damit den dominanten Erbgang. (Abdruck mit freundlicher Genehmigung der Uni-Med Verlag AG, Bremen, aus: Schneppenheim R., Budde U. Das von-willebrand- Syndrom. Aktuelle Aspekte der Diagnostik und Therapie) Dabei üben die verschiedenen Mutationen einen unterschiedlichen Einfluss auf das Endprodukt des VWF aus. Einige Mutationen korrelieren mit einer deutlich eingeschränkten Sekretion des mutanten VWF. Homozygote derartige Mutationen oder deren Kombination mit einem Nullallel werden auch bei einzelnen Patienten mit einem VWS Typ 3 beobachtet (4). Heterozygote zeigen nur mäßig oder kaum veränderte Multimere, jedoch ein geringeres VWF:Ag, so dass diese Patienten gelegentlich auch als Typ 1 diagnostiziert werden (6). Heterozygote Mutationen, die mit einer normalen oder nur mäßig eingeschränkten Sekretion einhergehen, beeinflussen hingegen die Multimerstruktur viel deutlicher. Es zeigt sich in der Regel ein relativer Verlust der großen Multimere. Zusätzlich finden sich die Zeichen einer eingeschränkten Proteolyse des VWF. Der Phänotyp wird dominant vererbt und entspricht einem VWS Subtyp 2A (früher als Typ IIE bzw. IIF bezeichnet) (35). Der Effekt der Mutationen lässt sich durch Expressionsexperimente nachweisen (Abb. 7).

6 42/52 Schneppenheim A1-, A2- und A3-Domäne In einer umschriebenen Region der A1- Domäne wurde zunächst eine Reihe von verschiedenen Mutationen beschrieben, die mit einer erhöhten Affinität des VWF für GpIb korrelieren (Abb. 5) (39). Die in plättchenreichem Patientenplasma bereits durch geringe Konzentrationen Ristocetin auslösbare Plättchenagglutination ist diagnostisch wegweisend für diesen Subtyp. In den meisten Fällen fehlen auch die großen Multimere (Abb. 6). Es wurden einzelne Mutationen beschrieben, die bei Patienten mit dem Subtyp 2M oder Subtyp 2A-Varianten vorkommen (14, 22). Die A2-Domäne enthält die proteolytische Schnittstelle für die VWF-spezifische Protease ADAMTS13. Mutationen, die diese Schnittstelle flankieren, können zu einer höheren Empfindlichkeit gegenüber dieser Protease führen. Folgen: verstärktes Auftreten proteolytischer Fragmente und Verlust großer Multimere (5, 12) (Abb. 6). Andere Mutationen in derselben Region verursachen eine verminderte Sekretion großer Multimere, ebenfalls mit der Folge des Fehlens großer Multimere, allerdings ohne die verstärkte Proteolyse (18). Viele Mutationen wurden wiederholt beschrieben. Die A3-Domäne enthält die Bindungsregion für Kollagen Typ I und Typ III. Bisher wurde eine die Kollagenbindung in vitro nur mäßig beeinflussende Mutation bei Mutter und Tochter aus einer Familie beschrieben, bei denen klinisch auch eine Blutungsneigung vorhanden war (25). Drei verschiedene, die Kollagenbindung wesentlich stärker beeinflussende Mutationen in der A3-Domäne hingegen konnten wir bei drei Personen nachweisen, die nicht wegen einer Blutungsneigung aufgefallen waren, sondern aus anderen Gründen (z. B. Thrombophilie in der Familie) untersucht wurden (34). Die bei ihnen erzielten Ergebnisse sind schwer mit der postulierten Bedeutung der Kollagenbindung des VWF über die A3-Domäne zu vereinbaren. C1-Domäne mit RGD-Sequenz In dieser Domäne wurden bisher keine Mutationen identifiziert, die eine Blutungsneigung verursachen. CK-Domäne Die CK-Domäne ist vor allem im Hinblick auf die posttranslationale Biosynthese von Bedeutung, da in dieser cysteinreichen Region die Dimerisierung der VWF-Monomere erfolgt. Cysteinmutationen in dieser Domäne führen zu schweren Störungen der Dimerisierung aber damit auch zu einer Störung der Multimerisierung mit der Folge des Fehlens großer Multimere (7, 29). Somit liegt definitionsgemäß ein Subtyp 2A vor. Der Phänotyp entspricht dem früher beschriebenen Typ IID, mit Fehlen großer Multimere und einem aberranten elektrophoretischen Bandenmuster, das durch die Präsenz von Multimeren mit ungeraden Zahlen von Monomeren hervorgerufen wird (29) (Abb. 6). Allerdings gibt es auch in dieser Domäne Mutationen, die mit einer verminderten Sekretion korrelieren und dann u. U. auch bei homozygotem bzw. compound-heterozygotem Genotyp zu einem schweren VWS Typ 3 führen können (31) Diskussion Wegen der extremen Heterogenität des VWS und den damit verbundenen Schwierigkeiten einer exakten Diagnosestellung ist die Identifizierung der kausalen Mutationen für die verschiedenen Subtypen des VWS von unmittelbarer Bedeutung für einen fundierte Diagnose. In Fällen einer zweifelhaften phänotypischen Charakterisierung kann dennoch die Gendiagnostik Aufklärung bringen. Da die zu wählende Therapiestrategie abhängig vom Subtyp ist, sollte immer eine genaue Subtypisierung erfolgen, die eventuell erst mit einer Gendiagnostik abgeschlossen werden kann. Darüber hinaus ist bei bekannter Mutation die Identifizierung von bisher nicht betroffenen Patienten möglich, die z. B. im Rahmen von operativen Eingriffen vor allem im Schleimhautbereich blutungsgefährdet sind. Auch ist in den Fällen des rezessiv vererbten schweren VWS Typ 3 die Identifizierung von Anlageträgern nur über die Gendiagnostik möglich, die dann als Grundlage für die genetische Beratung genutzt werden kann. Dabei muss wegen der Komplexität und der Größe des VWF-Gens die Indikation zur Gendiagnostik kritisch gestellt werden. Jedoch kann bei Ausschöpfung der wichtigsten phänotypischen Methoden (VWF:Ag, VWF:RCo, RIPA, VWF:CB, VWF:FVIIIB, Multimeranalyse) die zu erwartende Lokalisation einer Kandidatenmutation prognostiziert werden. In diesen Fällen kann die Mutationssuche deutlich eingeschränkt werden. Dies gilt allerdings nicht für den Typ 3 und den Typ 1. Zusammenfassung Die Aufklärung der molekularen Ursachen des heterogenen von Willebrand-Syndroms hat zu einem weitreichenden Verständnis der Biosynthese, des intrazellulären Transports und der Funktion des von Willebrand-Faktors geführt. Seine Rolle bei der Entstehung und der Manifestation vor allem arterieller Gefäßerkrankungen und bei arteriellen Gefäßverschlüssen ist derzeitiger Gegenstand intensiver Forschung. Die Suche nach spezifischen Mutationen wird hierfür weiterhin von Bedeutung sein. Bei Patienten mit VWS gehört die Mutationssuche zwar nicht zur initialen Diagnostik, hilft jedoch bei vorhergehender bestmöglicher Definition des Phänotyps oftmals die Diagnose zu sichern bzw. ermöglicht sie erst. Literatur 1. Allen S, Abuzenadah AM, Blagg JL et al. Two novel type 2N von Willebrand disease-causing mutations that result in defective factor VIII binding, multimerization, and secretion of von Willebrand factor. Blood 2000; 95: Allen S, Goodeve AC, Peake IR et al. Endoplasmic reticulum retention and prolonged association of a von Willebrand s diseasecausing von Willebrand factor variant with

7 43/53 Genetik des VWS ERp57 and calnexin. Biochem Biophys Res Commun 2001; 280: Baronciani L, Cozzi G, Canciani MT et al. Molecular characterization of a multiethnic group of 21 patients with type 3 von Willebrand disease. Thromb Haemost 2000; 84: Baronciani L, Cozzi G, Canciani MT et al. Molecular defects in type 3 von Willebrand disease: updated results from 40 multiethnic patients. Blood Cells Mol Dis 2003; 30: Dent JA, Berkowitz SD,Ware J et al. Identification of a cleavage site directing the immunochemical detection of molecular abnormalities in type IIA von Willebrand factor. Proc Natl Acad Sci USA1990; 87: Eikenboom JC, Matsushita T, Reitsma PH et al. Dominant type 1 von Willebrand disease caused by mutated cysteine residues in the D3 domain of von Willebrand factor. Blood 1996; 88: Enayat MS, Guilliatt AM, Surdhar GK et al. 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