Coagulation Laboratory, Lab. Association Prof. Arndt and Partners, Hamburg

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1 12/ Schattauer GmbH Standardisierte Diagnostik des von-willebrand-syndroms U. Budde 1, E. Drewke 1, K. Will 1, R. Schneppenheim 2 1 Coagulation Laboratory, Lab. Association Prof. Arndt and Partners, Hamburg 2 Department of Paediatric Haematology and Oncology, University Children s Hospital Hamburg-Eppendorf Schlüsselwörter Von-Willebrand-Syndrom, von-willebrand-faktor Zusammenfassung Das von-willebrand-syndrom (VWS) wird verursacht durch einen quantitativen und/oder qualitativen Defekt des von-willebrand-faktors (VWF), einem hochmolekularen multimeren Glykoprotein. Typisch ist ein Defekt der primären Hämostase mit Blutungssymptomen, die denen bei thrombozytären Störungen gleichen. Der VWF hat zwei Funktionen: Er ist für die Adhäsion von Thrombozyten an verletzten Gefäßen verantwortlich und er stabilisiert den FVIII im Plasma. Wegen der Komplexität der Gerinnungsstörung sind Diagnose und Klassifizierung des VWS eine Herausforderung für jedes Gerinnungslabor. Die Stufendiagnostik bei Verdacht auf ein VWS besteht aus Eigen- und Familienanamnese, orientierenden Untersuchungen (Blutungszeit, Filter-Testen, Thrombozytenzahl, aptt), erweiterten Testen (VWF:Ag, VWF:RCo, VIII:C) und spezieller Diagnostik (VWF:CB, RIPA-Test, Multimeranalyse, VWF:FVIIIB, thrombozytärer VWF). Verbessertes Verständnis der klinischen Phänotypen und der pathophysiologischen Grundlagen gaben Anlass zu einer VWS-Klassifizierung, die zwischen quantitativen und qualitativen Defekten des VWF-Moleküls unterschied. Diese beruhte auf der Darstellung struktureller Eigenschaften mittels Auftrennung des VWF im elektrischen Feld. Deutliche Fortschritte der molekularen Techniken erlaubten die Untersuchung von Phänotyp/ Genotyp-Relationen. Hierdurch konnten funktionelle Eigenschaften des VWF aufgeklärt werden sowie viele Gendefekte, die ein VWS verursachen können. Laboranalytisch kann das von-willebrand-syndrom (VWS) bei etwa 1% der Bevölkerung nachgewiesen werden (29). Eindeutige Symptome weist jedoch nur ein geringer Teil dieser Personen auf (1 : 3000 bis 1 : 10000). Ob es Keywords Von Willebrand disease, von Willebrand factor Summary Von Willebrand disease (VWD) is caused by quantitative and/or qualitative defects of the von Willebrand factor (VWF), a multimeric high molecular glycoprotein. Typically, it affects the primary haemostatic system, which is reflected by a mucocutaneous bleeding tendency simulating a functional platelet defect. The VWF promotes its function in two ways: It promotes platelet adhesion to the injured vessel wall under conditions of high shear forces and it functions as carrier for factor VIII in plasma. Due to its complexity diagnosis of VWD is one of the most challenging of coagulation disorders. The stepwise diagnosis of VWD includes patient s and family history, orientating procedures (bleeding time, filter tests, platelet count, aptt), confirmatory tests (VWF:Ag, VWF:RCo, VIII:C) and tests for final classification (VWF:CB, RIPA, multimeric analysis, bwf:fviiib, platelet VWF). Accumulating knowledge of the different clinical phaenotypes and their pathophysiological basis was translated into a classification scheme that differentiated between quantitative and qualitative defects by means of quantitative and functional parameters and by analyzing the electrophoretic pattern of VWF multimers. The advent of molecular techniques provided the opportunity for genotype/phaenotype studies which recently helped not only to elucidate or confirm important functions of VWF and the steps of its posttranslational processing but also many disease causing defects. Diagnostic standards of von Willebrand disease Hämostaseologie 2004; 24: sich bei den übrigen um ein reines Laborphänomen oder um eine klinisch relevante Erkrankung handelt, kann nur durch klinische Beobachtung geklärt werden. Hinzu kommt, dass für die Blutgruppe 0 eine von-willebrand-faktor-konzentration von 35% noch normal sein kann, während sie für die übrigen Blutgruppen eindeutig erniedrigt ist (14). Außerdem reagiert der von-willebrand-faktor (VWF) wie ein Akutphasenprotein (27). Dies bedeutet, dass er kurz- (Stress) oder längerfristig (Schwangerschaft, maligne Erkrankung) erhöht sein kann. Daher sind Eigen- und Familienanamnese unerlässlich zur Einordnung in Patienten mit von-willebrand- Syndrom oder Gesunde mit niedriger VWF-Konzentration (3). Der Referenzbereich der VWF-Konzentration ist mit 40 bis 160% suboptimal. So steigt z. B. die Adhäsivität von Thrombozyten bis zu einer Konzentration von 300% (40). Bei 40% wird eine kritische Grenze erreicht. Der VWF ist zwar noch normalen Anforderungen auch unter Stressbedingungen (z. B. Verletzung, operativer Eingriff) gewachsen, jede weitere Störung der Hämostase (z. B. Einnahme von Azetylsalizylsäure, Infektion) kann jedoch nicht mehr kompensiert werden und führt zu möglicherweise gefährlichen Hämorrhagien. Gerade die Unterscheidung von Patienten mit milden von-willebrand-syndrom und Gesunden mit niedriger VWF Konzent-ration ist von großer Bedeutung. Einer-seits können Menschen lebenslang zu»blutern«abgestempelt werden (Notfalloder Bluterausweis), andererseits können Patienten, die aufgrund einer VWF- Erhöhung kurzfristig normale Parameter aufweisen, fälschlich als gesund eingestuft werden. Folglich sind oft mehrere Untersuchungen notwendig, um eine Verdachtsdiagnose zu erhärten oder fallen zu lassen. Stressfreie Blutentnahmen gelingen erst ab dem 6. Lebensmonat. Somit können milde Formen erst ab diesem Zeitpunkt sicher diagnostiziert werden. Im Folgenden wird

2 13/21 Standardisierte VWS-Diagnostik versucht, einen standardisierten Untersuchungsgang von einer Verdachtsdiagnose bis hin zur Subtypisierung aufzuzeigen (4, 6). Untersuchungsgang Zur Erfassung einer Hämostasestörung hat die ausführliche Anamnese einen hohen Stellenwert und gibt Hinweise auf die zu erfolgende Labordiagnostik. Anamnestische Hinweise auf eine Hämostasestörung geben Anlass zu speziellen Untersuchungen, auch wenn die globalen Gerinnungsteste aufgrund fehlender Sensitivität im Referenzbereich liegen. Bedingt durch die ausgeprägte Heterogenität der Defekte des VWF ist auch die Blutungssymptomatik bei den Patienten unterschiedlicher Typen teils geprägt durch Störungen der primären Hämostase. Bei anderen finden sich sowohl Defekte der primären als auch der sekundären Hämostase (Tab. 1). Bei den Patienten, die genügend VWF:Ag aufweisen, um den FVIII im Plasma soweit zu stabilisieren, dass die FVIII-Aktivität 40% übersteigt, ist vorwiegend die primäre Hämostase betroffen. Dies sind Patienten mit Typ 1 und milder Verlaufsform, aber auch viele Patienten mit einem Typ 2. Bei den übrigen Patienten sind sowohl primäre als auch sekundäre Hämostase betroffen. Untypisch reagieren Patienten, deren von-willebrand-faktor den FVIII nicht stabilisiert (Typ 2N). Bei ihnen fehlen die charakteristischen Symptome einer primären Hämostasestörung. Sie verhalten sich abhängig von der Restaktivität des Faktors VIII wie Patienten mit milder, seltener mittelschwerer Hämophilie. Die Methoden zur Abklärung eines vermuteten von-willebrand-syndroms lassen sich wie folgt einteilen: orientierende Diagnostik Anamnese Blutungszeit Filtermethoden mit hohem Scherstress (z. B. PFA-100) partielle Thromboplastinzeit (aptt) erweiterte Diagnostik VWF: Antigen (VWF:Ag) Ristocetin-Cofaktoraktivität (VWF:RC) FVIII-Aktivität (VIII:C) spezielle Diagnostik VWF-Kollagenbindungskapazität Tab. 1 Blutungssymptome (%) bei Patienten mit VWS und Normalpersonen (reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Baillieres Tindall, London: Rodeghiero & Castaman, Bailliere s Clinical Haematology 2001; 14: ) (VWF:CB) Ristocetin-induzierte Aggregation (RIPA) Multimeranalyse VWF-Parameter in Thrombozyten FVIII-Bindungskapazität des VWF (VWF:FVIIIB) Orientierende Untersuchungen Blutungszeit Die Blutungszeit ist ein Globaltest der primären Hämostase. Sie erfasst qualitative und quantitative thrombozytäre Störungen, quantitative und qualitative Defekte des von-willebrand-faktors, Gefäßwandstörungen und Störungen durch Verminderung der Erythrozytenzahl. Charakteristisch und auch in den ersten Publikationen beschrieben, ist die verlängerte Blutungszeit. Sie ist jedoch bei milden Formen des von-willebrand-syndroms sehr variabel und oftmals werden Werte im Referenzbereich gefunden. Durch die sensitiveren In-vitro-Blutungszeitmethoden, die Untersucher-unabhängig und zudem atraumatisch sind, verliert die Blutungszeitbestimmung an Bedeutung. Sie ist nicht mehr eine essenzielle Methode für die Diagnostik des von- Willebrand-Syndroms. Adhäsionsmethoden mit hohem Scherstress Die In-vitro-Blutungszeitbestimmung mit dem PFA-100-Gerät (Dade Behring, Schwalbach) misst die Zeit bis zum Verschluss einer definierten Kapillare nach dem Blutdurchfluss durch speziell beschichtete Filter. Auch das Cone-andplate(let)-Aggregometer nutzt hohe Scherkräfte, wird jedoch aktuell mehr für wissenschaftliche als für klinische Fragestellungen genutzt. Ende 2003 wird das Routinegerät IMPACT (DiaMed, Cressier sur Morat, Schweiz) in den Handel kommen. Es wird jedoch zunächst nicht für die Diagnostik von Hämostasestörungen, sondern für patientennahe Diagnostik als Point-ofcare-Gerät konfiguriert werden. Diese Methoden arbeiten mit einem Scherstress, der dem in Arteriolen ähnelt.

3 14/22 Budde et al. Daher ist die Reaktion ausschließlich von der primären Hämostase abhängig. Die Ergebnisse werden neben dem VWF von der Thrombozytenzahl und -funktion sowie dem Hämatokrit beeinflusst. Diese Methoden sind bei Patienten mit mildem VWS deutlich sensitiver als die In-vivo-Blutungszeit. Jedoch gelingt auch hier nicht immer die Differenzierung zwischen Gesunden und Patienten mit mildem von-willebrand- Syndrom im so genannten Graubereich zwischen 35 und 60%. Aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aptt) Schwere Hämophilie-Formen mit deutlicher FVIII-Verminderung sowie VWS-Patienten mit dem Typ 2N fallen bei orientierender Gerinnungsuntersuchung nur durch die verlängerte aptt auf. Neben Hämophilie A und VWS und differenzialdiagnostisch bedeutsam sind: Hämophilie B, Faktor XI-, Faktor XII-, HMW-Kininogen- oder Präkallikrein-Mangel sowie interferierende (Lupus-Hemmkörper) und spezifische Hemmkörper gegen Gerinnungsfaktoren. Vergleichsstudien zeigten, dass die aptt aufgrund ihrer substanziellen, biologischen, pathologischen und analytischen Variabilität kein sensitiver Test ist: weder für die Subhämophilie noch für das von- Willebrand-Syndrom. Thrombozytenzahl Die Messung der Thrombozytenzahl dient eher dem Ausschluss einer anderen primären Hämostasestörung als der VWS- Diagnose. Bei Patienten mit Typ 2B und Pseudo(platelet type)-von-willebrand- Syndrom, finden sich jedoch in Abhängigkeit von der Reagibilität des von-willebrand-faktors konstante oder intermittierende Thrombozytopenien, die auf eine verstärkte Interaktion des thrombozytären Rezeptors (GP Ib) und der A1-Domäne des von-willebrand-faktors hinweisen. Erweiterte Diagnostik FVIII/VWF-Komplex, Faktor VIII Für alle Tests zur Bestimmung des FVIII/ VWF-Komplexes sind Standards erforderlich, die am WHO-Standard kalibriert wurden (17). Jedes Gerinnungslabor ist gehalten, eigene Referenzbereiche zu ermitteln. Ob separate Referenzbereiche für Menschen mit Blutgruppe 0 und andere erforderlich sind, wird kontrovers diskutiert. Der Faktor VIII (FVIII) ist beim von- Willebrand-Syndrom mit der Ausnahme des Typ 2N nur mittelbar betroffen. Solange genügend VWF (>30%) vorhanden ist, um den FVIII im Plasma zu stabilisieren, haben VWS-Patienten eine normale FVIII-Aktivität. Für die Variante 2N ist die Bestimmung der FVIII-Aktivität ein unentbehrlicher diagnostischer Test. Von-Willebrand-Faktor-Antigen (VWF:Ag) Die Bestimmung des VWF:Ag ist zur Diagnose unerlässlich, da nur so eine Differenzierung zwischen verminderter VWF- Konzentration und dysfunktionellem VWF möglich ist. Standardmethode ist ein zweiseitiger ELISA, basierend auf zwei polyklonalen (selten monoklonalen) Antiseren. Die kommerziell erhältlichen Latex-basierten Methoden erlauben eine relativ kostengünstige, rasche (ca. 15 min) und genaue Bestimmung. Die Untersuchung bei Verdacht auf ein von-willebrand-syndrom ist jedoch unvollständig, wenn die Bestimmung der VWF-Konzentration nicht mit einer Methode kombiniert wird, die die Funktion des von-willebrand-faktors erfasst. Ristocetin-Cofaktoraktivität (VWF:RCo) Etwa zeitgleich mit der Möglichkeit, das VWF-Antigen (VWF:Ag) spezifisch zu bestimmen, wurden Methoden beschrieben, die als funktionelle VWF-Eigenschaft die Ristocetin-Cofaktoraktivität quantitativ erfassen. Obwohl es ein unphysiologischer Test ist (das Antibiotikum Ristocetin spielt keine natürliche Rolle bei der Thrombozytenaktivierung), reflektiert er die Interaktion zwischen VWF und seinem Rezeptor GP Ibα. Ristocetin bindet an VWF und GP Ibα und verursacht dadurch eine Agglutination von Thrombozyten, die von funktionierendem VWF abhängig ist. Da Adhäsionstests unter hohem Scherstress kaum routinetauglich sind, wenn sie in Adhäsionskammern vorgenommen werden, setzte sich die Bestimmung des VWF:RCo als Surrogat-Test durch. Die Reaktion kann im Aggregometer, auf Testplatten oder im Thrombozytenzählgerät erfasst werden. Auf Dade/Behring- Gerinnungsautomaten kann die VWF:RCo automatisch bestimmt werden. Problematisch ist die große Variabilität der Methoden, die seit den Anfängen der VWF:RCo- Bestimmung bekannt ist, sich aber trotz vielfältiger Bemühungen nicht abstellen ließ. Kürzlich wurde eine besser standardisierbare ELISA-Methode publiziert (45). Prinzip: Die Bindung des von-willebrand-faktors erfolgt an immobilisiertes rekombinantes GP Ib. Dadurch wird eine vergleichbare Sensitivität und Spezifität wie bei der Bestimmung des VWF:Ag erreicht. Durch Variation der Ristocetinkonzentration kann diese Methode den RIPA-Test ersetzen. Bislang ist sie kommerziell nicht erhältlich. Die Ristocetin-Cofaktoraktivitat verhält sich wie VWF:Ag. Für Patienten mit mildem von-willebrand-syndrom differenziert sie etwas sensibler im unteren Referenzbereich. Patienten mit Typ 2 fallen häufig durch die Konstellation VWF:Ag > VWF:RCo auf, auch wenn beide Konzentrationen im Referenzbereich liegen. Die VWF:RCo ist unempfindlicher als die Kollagenbindungskapazität (VWF:CB) auf funktionell abnorme Moleküle. Sie kann jedoch als einziger spezifischer Parameter ohne großen Laboraufwand bestimmt werden und bleibt daher für die Akutdiagnostik wertvoll. Da sie die Interaktion zwischen VWF und GP-IB-Rezeptor erfasst, ist sie zur Diagnose des Typ 2M unerlässlich.

4 15/23 Standardisierte VWS-Diagnostik Spezielle Diagnostik Kollagenbindungskapazität (VWF:CB) Die Kollagenbindungskapazität beruht auf einer der Adhäsivfunktionen des von- Willebrand-Faktors, seiner Bindung an Kollagen, das auf Mikrotiterplatten immobilisiert ist. Dazu wird ein optimal bindendes Kollagen (Typ I und Typ III) benötigt, dessen Konzentration der limitierende Faktor ist. Stehen zu viele Bindungsstellen zur Verfügung, fällt die Konkurrenz zwischen hoch- und niedermolekularen VWF um die Bindungsstellen weg, der Test reflektiert dann eher die Konzentration von VWF:Ag als eine funktionelle VWF- Eigenschaft. Unter optimierten Bedingungen reagiert der Test hochempfindlich auf VWF-Moleküle mit einem Verlust großer Multimere. Bei Parallelbestimmung von VWF:Ag und VWF:CB im ELISA-Format aus einer Verdünnung erlaubt der Quotient VWF:CB/VWF:Ag eine Aussage über die VWF-Funktionsfähigkeit. In unserem Labor liegt der Grenzwert bei 0,8, d. h. mindesten 80% des VWF:Ag müssen kollagenbindend sein (41). Alle niedrigeren Werte sind pathologisch und bedürfen der speziellen Abklärung mithilfe der Multimeranalyse. Als Einzelbestimmung ist VWF:CB sinnlos. In Relation zum VWF:Ag detektiert ein niedriger Quotient VWF:CB/ VWF:Ag jedoch ein dysfunktionelles Molekül mit hoher Diskriminationsrate. Meist handelt es sich um einen angeborenen oder erworbenen Verlust der großen Multimere, selten um einen isolierten Defekt der VWF:CB hervorgerufen durch eine Mutation in einer der Kollagenbindungsregionen (A3-Domäne). Durch verbesserte Inter- und Intraassay-Präzision und geringe Variabilität zwischen verschiedenen Labors ist die Fähigkeit, zwischen einem normalen und dysfunktionellen VWF-Molekül zu unterscheiden, deutlich besser als bei der VWF:RCo. Ein weiterer Vorteil ist das Ansprechen der VWF-CB auf supranormale Multimere. Diese werden bei Patienten mit TTP (thrombotisch-thrombozytopenische Purpura) und nach Minirin-Infusion im Plasma entdeckt. Ristocetin-induzierte Aggregation im plättchenreichen Plasma (RIPA) Der RIPA-Test dient zur Identifizierung einer erhöhten oder verminderten Interaktion zwischen dem von-willebrand-faktor und dem thrombozytären Rezeptor GP Ib. % Normales PRP Typ IIA Typ IIB / Pseudo-VWS Abb. 1 Ristocetin-induzierte Aggregation im plättchenreichen Patientenplasma (RIPA-Test) bei Patienten mit Typ 2A und 2B im Vergleich zu Normalpersonen (wichtig: abgestufte Ristocetin-Konzentrationen mit den Endkonzentrationen 0,1-1,5 mg/ml): Ristocetin-Empfindlichkeit bei allen Patienten mit Typ 2B erhöht; beim Typ 2A variabel und oft nicht unterscheidbar von Gesunden und Patienten mit Typ 1. (Abdruck mit freundlicher Genehmigung der Uni-Med Verlag AG, Bremen, aus: Schneppenheim R, Budde U. Das von-willebrand-syndrom. Aktuelle Aspekte der Diagnostik und Therapie) Er wird mit plättchenreichem Plasma (PRP) des Patienten durchgeführt. Daher kann er nur vor Ort und (mit großem Bedenken) nach Versenden innerhalb von 24 Stunden vorgenommen werden. Wichtig ist, dass nicht das Ausmaß der Aggregation nach Stimulation mit einer (zu hohen) Standardkonzentration, sondern der Schwellenwert bis zum Auslösen einer deutlichen Aggregation beurteilt wird (Abb. 1). Begonnen werden sollte daher immer mit einer niedrigen Konzentration (0,5 mg/ml). Die Empfindlichkeit der Methode ist zu gering, um als Suchtest für ein von-willebrand-syndrom geeignet zu sein. Sie dient hauptsächlich zur Identifizierung von Patienten mit gesteigerter Interaktion zwischen VWF und Thrombozyten (Typ 2B und Platelet-Typ-von-Willebrand-Syndrom). Hilbert et al. (15) zeigten, dass Patienten mit Typ 2M eine verminderte RIPA aufweisen und durch diesen Test vom Typ 1 unterschieden werden können. Bei der Nachuntersuchung von Patienten, die durch einen so genannten funktionellen ELISA als Typ 1 diagnostiziert worden waren, fanden Nitu-Whalley et al. (25), dass alle fälschlicherweise als Typ 1 deklarierten Patienten mit einer Mutation im Exon 28 eine deutliche verminderte RIPA aufwiesen. Dies bedeutet, dass dem RIPA-Test eine breitere Indikation zukommt als nur die Unterscheidung zwischen den Typen 2A und 2B. VWF in Thrombozyten Megakaryozyten sind ein Biosyntheseort des von-willebrand-faktors. Solange er nicht von Thrombozyten in das Plasma sezerniert wird, kommt er nicht mit von- Willebrand-Faktor-spaltenden Proteasen in Kontakt. Daher reflektiert der thrombozytäre VWF das ursprünglich synthetisierte Molekül. Falls es gelingt, den thrombozytären von-willebrand-faktor nativ zu isolieren, können eine Reihe auch klinisch wichtiger Fragen beantwortet werden, die durch die Untersuchung allein des plasmatischen VWF unbeantwortet bleiben. Beim erworbenen von-willebrand-syndrom wird der korrekt synthetisierte VWF

5 16/24 Budde et al. im Plasma qualitativ oder quantitativ verändert. Dies ermöglicht in klinisch unklaren Situationen oft die Unterscheidung zwischen angeborenen und erworbenen Formen. Beim Typ 2A in der klassischen IIA- Subgruppe sind zwei Mechanismen bekannt. Mithilfe der Untersuchung des thrombozytären werden von-willebrand- Faktoren unterschieden: Retention der großen Multimere im Golgi-Apparat (Gruppe I-Mutationen) und Synthese eines VWF-Moleküls, das durch Proteasen leichter hydrolytisch gespalten wird (Gruppe II-Mutationen). Außerdem unterscheiden sich schwere Formen des Typ 1 vom Typ 3 durch Vorhandensein bzw. Fehlen des thrombozytären von-willebrand-faktors. Leider gibt es bisher weder einen Standard für den thrombozytären VWF noch sind Methoden zur Thrombozytenlyse oder ein Bezugspunkt als Standard (U/10 11 Thrombozyten, U/mg Protein, % des Thrombozytenpools) festgelegt. Daher gibt es keine anerkannte Standardmethode zur Charakterisierung des thrombozytären VWF. Abb. 2 Autoradiographie der VWF-Multimere nach Elektrophorese in einem mittelhoch auflösenden (1,5%) Agarosegel (Laufrichtung: von oben nach unten, d. h. große Multimere im oberen Bereich) Im Plasma Gesunder (Spur 1) besteht jedes Oligomer aus einem Triplet mit einer Zentralbande und einer oberen und unteren Subbande. Die übrigen (Sub-)Typen zeigen ein aberrantes Bandenmuster: Spur 2: Typ 2A (IIA); Spur 3: Typ 2B; Spur 4 Typ 2A (IIC); Spur 5 Typ 2A (IIC); Spur 6: Typ 2A (IID) Qualitative Veränderungen des von-willebrand-faktors VWF-Multimere Informationen über Konformationsänderungen im VWF-Molekül ergeben sich aus der Darstellung der Multimere. Methoden hierzu wurden erstmals von Ruggeri und Zimmerman (31) sowie Hoyer und Shainoff (16) publiziert. Prinzip: Im Testsystem von Ruggeri und Zimmerman werden die individuellen VWF-Oligomere zunächst in einem großporigen Agarosegel in Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat (SDS) elektrophoretisch getrennt. Anschließend diffundiert (durch Affinitätschromatographie gereinigter) 125 I-markierter Antikörper, der gegen den von-willebrand-faktor gerichtet ist, in das Gel. Die einzelnen Banden sind dann autoradiographisch darstellbar (Abb. 2). Abb. 3 Videosystem zur Darstellung und Auswertung lumineszenter Western-Blots (Fluorchem ) Die auf -30 C gekühlte CCD-Kamera befindet sich im oberen Teil des turmartigen lichtdichten Gerätes. Der Probenraum (unten) muss genügend groß sein, um ein Gel aufzunehmen. Der Mikrochip sollte so gewählt werden, dass er ein Gel komplett erfasst. Komplettiert wird das System durch Computer und Drucker. (Abdruck mit freundlicher Genehmigung der Uni-Med Verlag AG, Bremen, aus: Schneppenheim R, Budde U. Das von-willebrand-syndrom. Aktuelle Aspekte der Diagnostik und Therapie) Radioaktive Methoden werden jedoch inzwischen seltener verwendet. Außerdem bereiten wegen der Dicke der Gele (>1 mm) die extrem langen Diffusionszeiten Schwierigkeiten, z. B. bei Waschvorgängen, Inkubationen. In der Regel dauert die Prozedur mit solchen Gelen 5 Tage. Daher vereinfachte der Transfer auf geeignete Membranen (Nitrozellulose, Nylon) die Handhabung der Gele erheblich. Die Umstellung auf nicht radioaktive Methoden bereitet Probleme durch die vergleichsweise geringere Empfindlichkeit der an Antikörper gekoppelten Enzyme (alkalische Phosphatase und Peroxidase). Die ausreichend hohe Verdünnung des Plasmas ist jedoch eine Voraussetzung für optimale Ergebnisse. Alle Plasmaverdünnungen mit Verdünnungsfaktor <10 führen zu abnormen Verteilungsmustern der Banden und Subbanden, die nicht selten angeborenen Defekten des VWF-Moleküls ähneln. Neben den klassischen Versuchen,

6 17/25 Standardisierte VWS-Diagnostik Abb. 4 Darstellung der VWF-Multimere in einem mittelhoch auflösenden Agarosegel (1,6%) (Laufrichtung: von oben nach unten, d. h. große Multimere im oberen Bereich) Im Normalplasma (N) und im Plasma der Typen 2A (IB), 2A (IIA) und 2B besteht jedes Oligomer aus einem Triplet mit einer Zentralbande und einer oberen und unteren Subbande. Die übrigen (Sub)typen zeigen ein aberrantes Bandenmuster. die Empfindlichkeit zu erhöhen, wird z. B. mit Streptavidin/Biotin durch Lumineszenz eine Sensitivität erzielt, die radioaktive Methoden erreicht oder sogar übertrifft. Auch die Kurzlebigkeit der Lichtreaktion wurde verbessert, so dass die Gele mit innovativen Substraten (z. B. LumiLight plus, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) inzwischen länger als 24 Stunden leuchten. Der Übergang vom Röntgenfilm auf Videodetektion mit einer hochempfindlichen CCD-Kamera (Fluorchem, Alpha Innotech Corp., San Leandro, CA, USA; Abb. 3), erzielte optimale Sensitivität Abb. 5 Densitometrische Darstellung der VWF Multimere in einem mittelhoch auflösenden Gel (Laufrichtung: von links nach rechts, d. h. große Multimere im linken Bereich) mit gut sichtbaren proteolytischen Veränderungen der Triplet-Struktur rot: Normalplasma; schwarz: Plasma eines Patienten mit Typ 2A; linker Pfeil: Grenze zwischen großen (>10) und mittelgroßen (6-10) Multimeren; rechter Pfeil: Grenze zwischen den mittelgroßen Multimeren und Oligomeren (1-5) und hohen Komfort bei der Auswertung der Gele trotz der damit verbundenen relativ hohen Kosten. Durch die optimierte Darstellung von Banden mit der CCD- Kamera werden deutlich mehr Varianten entdeckt als das mit dem früher üblichen Röntgenfilm der Fall war. Diese Validität kann durch die Entdeckung spezifischer Mutationen nachgewiesen werden. In fast allen Übersichtsarbeiten wird propagiert, die spezielle Diagnostik mit der elektrophoretischen Trennung des von-willebrand-faktors in einem Gel mit niedrigem Auflösungsvermögen zu beginnen. Diese Gele lassen den VWF leichter einwandern als Gele mit hoher Agarosekonzentrationen. So kann sehr gut zwischen Proben mit Verlust der großen VWF-Multimere, solchen mit supranormalen und normalen Monomeren differenziert werden. Allerdings fallen die von uns häufig beobachteten Varianten mit abnormer Struktur der Oligomere kaum auf. Um diese nicht zu übersehen, benutzen wir als Standard ein Gel mittlerer Auflösungsfähigkeit (Abb. 4). Neben einer ausreichend guten Darstellung der großen Multimere, können Strukturdefekte so gut erkannt werden, so dass Gele mit höherem Auflösungsvermögen kaum notwendig werden. Trotz der enorm verbesserten Fähigkeit, mithilfe des Quotienten VWF:CB/ VWF:Ag ein VWS vom Typ 2 zu erkennen, führt ein Verzicht auf die Multimeranalyse dazu, dass mindestens 20% der Typ-2-Varianten nicht richtig zugeordnet oder bei normalem VWF:Ag sogar übersehen werden. Obwohl visuell der Verlust großer Multimere oder eine abnorme quantitative Verteilung innerhalb einer Bahn sehr gut erkennbar ist, ist die quantitative Auswertung mit einem Densitometer erstrebenswert. Moderne Densitometer erlauben inzwischen eine vergleichsweise einfache Auswertung. Röntgenfilme haben jedoch physikalische Eigenschaften, die eine densitometrische Auswertung deutlich erschweren. Zwischen einem unbelichteten (weiß) und einem voll belichteten Silberkorn (schwarz) liegen 100-mal weniger Graustufen als auf einem lichtempfindlichen Mikrochip. Daher sind auf einem Röntgenfilm un- und überbelichtete Areale wesentlich häufiger als auf einem Mikrochip. Werden solche Areale ausgewertet,

7 18/26 Budde et al. führt dies zu falschen Ergebnissen. Es existiert außerdem kein Konsens, was als große, mittelgroße und kleine Multimere zu definieren ist. Noch immer wird meistens die Aufteilung akzeptiert, die wir 1993 vorschlugen (Abb. 5): 1-5: kleine Multimere, 6-10: mittelgroße Multimere und >10: große Multimere. FVIII-Bindungskapazität des von-willebrand-faktors (VWF:FVIIIB) Mit den aufgeführten Methoden sind leichte bis mittelschwere Formen der Hämophilie A und von-willebrand-syndrom vom Typ 2N differenzialdiagnostisch nicht voneinander abzugrenzen. Allenfalls kann die familiär leicht verminderte VWF-Konzentration diagnostische Hinweise geben. Verdächtig sind Patienten, bei denen erblich bedingt (autosomaler Erbgang) die FVIII- Konzentration vermindert ist und deren VWF-Konzentration entweder im Referenzbereich liegt oder ebenfalls vermindert ist. Zur Diagnose des Typs 2N muss die Bindung von FVIII an den von-willebrand- Faktor der Patienten gemessen werden. Pädiatrische Fälle von VWF-Erhöhung Bei Neugeborenen und kleinen Kindern kommen Phasen mit vorübergehender oder dauerhaft erhöhter Konzentration des von-willebrand-faktors vor. Da der VWF wie ein Akutphasenprotein reagiert, ist die Diagnose bei kleinen Kindern oft schwierig, wenn es sich um milde Formen des Typs 1 handelt. Im Falle von sehr aufgeregten, schreienden Kindern ist immer von einer zu hoch gemessenen VWF-Konzentration auszugehen. Meist reicht ein Blick auf die überschießend gesteigerte VWF:CB, um eine solche Situation zu erkennen. Hier helfen nur mehrfache Kontrollen. Ein Typ 2 wird sich jedoch nur im Extremfall in einen normalen Phänotyp wandeln. Ein Beispiel hierfür ist ein thrombozytopenisches Neugeborenes. Dadurch, dass auch die Mutter thrombozytopenisch war, vermuteten die behandelnden Ärzte einen Typ 2B, der bei der Mutter trotz schwangerschaftbedingtem sehr hohem VWF: Ag problemlos durch RIPA-Test und Multimeranalyse zu verifizieren war. Dagegen waren die Multimere des Neugeborenen völlig unauffällig und auch die stressbedingt erhöhten Parameter VWF:Ag und VWF:CB sowie deren Quotient waren nicht hinweisend. Erst der RIPA-Test und die dann Wochen später pathologischen Multimere sicherten die vermutete Diagnose. Es ist zwar bei thrombozytopenischen Neugeborenen mit der zur Verfügung stehenden kleinen Blutmenge (ca. 1 ml) äußerst schwierig, einen RIPA-Test durchzuführen, doch in diesem speziellen Fall gelang dies problemlos. Eine Erfahrung aus unserem Umgang mit Fällen chronischer oder angeborener Thrombozytopenie im Kindesalter ist, dass grundsätzlich immer an einen Typ 2B oder an eine TTP gedacht werden muss, um gefährliche Fehlbehandlungen zu vermeiden. Während der Schwangerschaft steigt der VWF vor allem gegen Ende drastisch an. Dies führt beim Typ 1 zu diagnostischen, nicht jedoch zu therapeutischen Problemen (Normalisierung!), wenn daran gedacht wird, dass er nach der Geburt wieder rasch auf seinen Ursprungswert zurückgeht und möglicherweise Spätblutungen auftreten. Es ist ein zurzeit nicht erklärliches Phänomen, dass bei etwa 30% der Schwangeren ein Verlust der großen Multimere zu beobachten ist (2). Dieser Verlust führt jedoch nicht zu klinischen Problemen. Bei Patienten mit malignen Tumoren steigt der VWF ebenfalls dauerhaft und oft sehr stark an. Dies führte bei einer unseren Patientinnen dazu, dass während dieses Anstiegs ein von-willebrand-syndrom Typ 2N maskiert wurde. Bei einem FVIII:C von 84% und einem VWF:Ag von 385% war zwar der pathologische Wert des Quotien- Tab. 2 Charakteristische Befundkonstellationen der Typen des von-willebrand-syndroms

8 19/27 Standardisierte VWS-Diagnostik Abb. 6 Mutationen, die ein VWS Typ 2 induzieren (dreieckige Pfeile: betroffene Domänen). Unter dem schematisch gezeigten Gen sind die unterschiedlichen Domänen aufgeführt. (Abdruck mit freundlicher Genehmigung der Uni-Med Verlag AG, Bremen, aus Schneppenheim R, Budde U. Das von-willebrand-syndrom. Aktuelle Aspekte der Diagnostik und Therapie) ten richtungsweisend, nicht jedoch die jeweiligen Absolutwerte. VWS-Diagnose und -Subtypisierung (Tab. 2) Rein quantitative Defekte (Typ 1 und 3) Die Diagnose eines von-willebrand-syndroms ist relativ einfach, wenn die VWF- Konzentration nicht messbar (Typ 3) oder moderat vermindert (Typ 1) ist. Überschreitet das VWF:Ag jedoch 35% und unterschreitet es 60%, wird es schwierig, milde Formen des Typs 1 von Gesunden zu unterscheiden. Gerade hier entstehen oft große Probleme durch den großen Referenzbereich zwischen 35% (unterer Wert für die Blutgruppe 0) und 160% (oberer Wert für alle mit anderer Blutgruppe). Außerdem erhöht sich die Konzentration dieses Akutphasenproteins sehr schnell. Dies erschwert die Diagnose bei kleinen Kindern, die fast immer bei Blutentnahmen sehr aufgeregt sind. Hilfreich ist hier, dass die VWF:CB in diesen Fällen noch drastischer ansteigt und der erhöhte Quotient VWF:CB/VWF:Ag einen Hinweis auf dieses Problem gibt. In manchen Fällen ist die Bestimmung des thrombozytären VWFs hilfreich. Bei einer Verminderung Tab. 3 Typen und Subtypen des angeborenen von-willebrand-syndroms (Hamburg 2002) wird die Diagnose eines von-willebrand- Syndroms wahrscheinlich, da der thrombozytäre VWF die Synthese des Moleküls reflektiert. Der sensitivste singuläre Test zur Diagnose eines von-willebrand-syndroms ist die Bestimmung des VWF:RCo (29). Allerdings hat dieser Test einen inakzeptabel hohen Varaitionskoeffizienten und kann als singulärer Test niemals zwischen Typ 1 und 2 unterscheiden. Um die Diagnose eines von- Willebrand-Syndrom zu sichern, müssen FVIII:C, VWF:Ag, VWF:RCo (und VWF:CB) sowie deren Quotient zusammen mit dem RIPA-Test bestimmt werden, wenn immer die Anamnese für eine defekte primäre Hämostase spricht. Zum Ausschluss thrombozytärer Defekte müssen zudem Thrombozytenzahl und -funktion untersucht werden. Bei Patienten mit sehr niedrigem VWF:Ag (<5%) ist die Untersuchung des thrombozytären von- Willebrand-Faktors hilfreich, um zwischen Patienten mit den Typen 1, 3 oder einem homozygoten Typ 2 zu unterscheiden (34). Qualitative Defekte Sobald die soeben angeführte Batterie von Testen auf einen qualitativen Defekt hinweist, ermöglichen RIPA-Test, Multimeranalyse und VWF:FVIIIB die Subklassifizierung: Patienten mit einer verstärkten Interaktion zwischen GP IB und dem VWF (RIPA-Test 0,5 mg/ml) gehören dem Typ 2B an. Alle anderen Patienten mit einem Verlust der großen Multimere werden unter dem Typ 2A zusammengefasst. Qualitative Varianten mit verminderter Interaktion zwischen Thrombozyten und dem VWF, jedoch ohne den Verlust großer Multimere werden dem Typ 2M zugeordnet und der Typ 2N umfasst alle Patienten, bei denen der VWF seine Stabilisierungsfunktion für den FVIII verloren hat. Die raschen methodischen Fortschritte der vergangenen Jahre führten zur Aufdeckung der zugrundeliegenden Mutationen bei den

9 20/28 Budde et al. meisten Patienten mit dysfunktionellem VWF. Bei der Kartographie der unterschiedlichen Mutationen stellte sich heraus, dass alle Mutationen bei Patienten mit einem Typ 2 in funktionellen Domänen lokalisiert waren (Abb. 6). Zu unserer Überraschung gelang es häufig, einem spezifischen Multimermuster einen Gendefekt zuzuordnen. Daher gelangten wir zu der Überzeugung, dass es sinnvoll ist, bei Familien mit dysfunktionellem VWF den Indexpatienten möglichst vollständig phänotypisch und genotypisch zu charakterisieren, die Mutation im homozygoten und heterozygoten Zustand zu exprimieren und zu versuchen, eine Phänotyp/Genotyp- Relation herzustellen. Kompliziert wird dieses Vorhaben jedoch dadurch, dass nach der Biosynthese der VWF durch die von-willebrand-faktor-spaltende Protease im Plasmamilieu modifiziert wird. Durch die proteolytische Spaltung wird nicht nur die Molekülgröße modifiziert, sondern es entstehen charakteristische Spaltprodukte, die eine typische so genannte Triplet-Struktur in der Darstellung der Multimere hervorrufen. Die aus den Anfangszeiten der Multimerdarstellung übernommene Bezeichnung Triplet ist falsch (weil immer vier Banden durch Proteolyse entstehen), so dass die Bezeichnung Quartuplet korrekt wäre. Doch diese Bezeichnung hört sich so schrecklich an, dass die Bezeichnung»Triplet«im Sprachgebrauch verankert ist und auch beibehalten wird. Im Folgenden werden wir versuchen, ausgehend von den funktionellen Domänen, eine Phänotyp/Genotyp Relation herzustellen. Abb. 7 Rekombinante Expression von mutiertem VWF 2A, Subtyp IID mit einem gravierenden Defekt der großen Multimere in homozygoter Form (Spur 2) und einem relativen Verlust großer Multimere in heterozygoter Form (Spur 3). Die Pfeile zeigen auf Zwischenbanden. Der Wildtyp ist in Spur 1 aufgetragen (Agarosegel 1,6%). Typ 2A, Subtyp IID: Dimerisierungsregion im Exon 52 Der Subtyp IID wurde erstmals 1984 von Kinoshita et al. (20) beschrieben. Neben dem Fehlen der großen Multimere ist eine fehlende Tripletstruktur charakteristisch. Statt dessen imponiert eine deutlich schwächere Zwischenbande zwischen den Zentralbanden (Abb. 7). Davon abweichende Phänotypen haben statt einer bis zu drei Zwischenbanden (Mikroheterogenität). Schon früh wurde auch die verminderte proteolytische Spaltung beschrieben (44) und 2001 konnten wir die Entstehung dieses charakteristischen Musters weitgehend aufklären (33, 34). Bei unserer Indexpatientin fanden wir eine Cystein-Mutation im Exon 52. Von dem betroffenen Aminosäurerest war bekannt, dass er an der intermolekularen Bindung beteiligt ist. Wir konnten zunächst beweisen, dass diese Mutation die Dimerisierung verhindert, wenn sie homozygot in einem Fragment exprimiert wird. Am intakten Molekül wurde die Dimerisierung nicht verhindert. Dieses diskrepante Ergebnis war zunächst nicht zu erklären. Erst die proteolytische Spaltung des Dimers gab eine plausible Erklärung: Typ 2A: defekte Interaktion mit GP Ib Mutationen, die aufgrund fehlender großer Multimere zu defekter Interaktion mit GP Ib führen, sind extrem heterogen (Tab. 3). Von unseren Patienten mit Typ 2A zeigen nur etwa ein Viertel der Patienten die klassischen 2A-Veränderungen mit einer erhaltenen Triplet-Struktur, jedoch einer deutlichen Verstärkung der Satellitenbanden. Die übrigen weisen charakteristische Defekte der Bandenstrukur auf. Abb. 8 Multimerisierungsdefekt bei VWS Typ 2A (IIC): Patient (Mutation in der D2-Domäne) im Vergleich zu normalem VWF (rechte Spur); Agarosegel 1,6% (Abdruck mit freundlicher Genehmigung der Uni-Med Verlag AG, Bremen, aus: Schneppenheim R, Budde U. Das von-willebrand-syndrom. Aktuelle Aspekte der Diagnostik und Therapie)

10 21/29 Standardisierte VWS-Diagnostik le einer Kopf-zu-Kopf-Anlagerung eine Fuß-an-Fuß-Anlagerung entstand. Der Subtyp IID wird autosomal-dominant vererbt. Daher sind die Patienten heterozygot für die Mutation. Bei heterozygoter Expression entsteht ein charakteristisches Muster, das dem plasmatischen Muster sehr ähnelt. Die jeweiligen Zentralbanden werden durch eine schwächere Zwischenbande getrennt. Bei diesen Banden handelt es sich um ungerade Oligomere. Die Entstehung dieser in vivo nur beim Subtyp IID vorkommenden ungeraden Oligomere wird in Abbildung 8 erläutert. Auch die Mikroheterogenität des Subtyps IID hatte bei den exprimierten Molekülen ihre Entsprechung: Der rekombinante VWF von Patienten mit mehreren Zwischenbanden zeigte ein Set von eng zusammenliegenden Zwischenbanden. Abb. 9 Multimerisierungsdefekte in der D3-Domäne, die phänotypisch meist dem Subtyp 2A (IIE) angehören. Darstellung der intra- und intramolekularen Disulfidbrücken nach Dong et al. (12) (Abdruck mit freundlicher Genehmigung der American Society for Biochemistry and Molecular Biology Inc., Bethesda, Maryland, USA) Zwar war die carboxyterminale Dimerisierung nicht möglich, die Multimerisierungsregion am Aminoterminus konnte jedoch die Dimerisierung bewirken, so dass anstel- Abb. 10 Rekombinante Expression von mutiertem VWF 2A, Subtyp IIE (6) mit einem deutlichen Defekt der großen Multimere in homozygoter Form (Spur 1) und einem relativen Verlust großer Multimere in heterozygoter Form (Spur 2); Plasma eines IIE-Patienten zum Vergleich (Spur 4); rekombinanter Wildtyp-VWF (Spur 3); normaler plasmatischer VWF (Spur 5); Agarosegel (1,6%) mit mittlerem Auflösungsvermögen Die Kausalität der Mutation wird durch den relativen Verlust der großen Multimere bewiesen. Die aberrante Triplet-Struktur kommt durch Einwirkung der VWF-cP posttranslational zustande und ist im Expressionssystem nicht reproduzierbar. (Reproduktion mit freundlicher Genehmigung des Blackwell-Verlags, Oxford, UK) Typ 2A, Subtyp IIC: Multimerisierungsregion in der Prosequenz Der Subtyp IIC wurde erstmals 1982 von Ruggeri et al. (30) beschrieben. Neben dem Fehlen der großen Multimere sind ein deutlich verstärktes Protomer (Dimer) sowie eine fehlende Tripletstruktur charakteristisch. Wenige Jahre später wurde eine verringerte proteolytische Spaltung beschrieben (44). Die genetischen Defekte liegen in der Prosequenz. In der Prosequenz finden sich zwei charakteristische Regionen mit je einem Konsensusmotiv für eine Disulfid-Isomerase. Auch hier wurde mit dem exprimierten Molekül der Phänotyp exakt kopiert und somit der kausale Zusammenhang bewiesen (Abb. 9). Typ 2A, Subtyp IIC Miami: Multimerisierungsregionen in der Prosequenz und D3-Domäne Der 1993 (21) beschriebene Subtyp IIC Miami ist bei entsprechender Verdünnung des Plasma nicht vom Subtyp IIC zu unterscheiden. Im Gegensatz zum Subtyp IIC ist die Konzentration des VWF:Ag erheblich höher und liegt meist deutlich über dem Referenzbereich. Außerdem ist der Vererbungsmodus autosomal-dominant. Diese Sonderform des von-willebrand- Syndroms ist in Deutschland etwa so häufig wie der Subtyp IIC. Mutationen ließen sich sowohl in der Prosequenz als auch in der D3-Domäne lokalisieren (37). Auch hier wurde mit dem exprimierten Molekül der Phänotyp der Patienten exakt kopiert und damit der kausale Zusammenhang bewie-

11 22/30 Budde et al. sen. Obwohl der Mutationsnachweis bei den von uns analysierten Patienten ohne größere Probleme gelang, konnte eine Mutation bei der Originalfamilie bisher nicht identifiziert werden. Auch die Arbeitsgruppe um D. Meyer, die den Nachweis zuerst versuchte, wurde nicht fündig. Multimerisierungsregion in der D3-Domäne Die intermolekulare Bindung im engeren Sinne findet in der D3-Domäne statt, die daher die eigentliche Multimerisierungsregion darstellt. Charakteristisch ist, dass hier auf engstem Raum eine erstaunlich hohe Anzahl von Cysteinresten in räumlicher Nähe liegen, die nur durch wenige andere Aminosäurereste unterbrochen werden. Da im VWF-Molekül keine Cysteinreste mit freier SH-Gruppe existieren (12), sind alle an inter- bzw. intramolekularen Brückenbildungen beteiligt (Abb. 10). Für Cysteinrest 1142 ist eine intramolekulare Bindung eindeutig belegt. Ein, zwei oder alle drei Cysteinreste (1222, 1225 und 1227) bilden ebenfalls intermolekulare Bindungen. Die übrigen 30 Cysteinreste bilden somit mehr oder weniger große intramolekulare Schleifen. Fällt ein Cysteinrest weg oder entsteht ein neuer, ändert sich die Tertiärstruktur mehr oder weniger deutlich. Schon Jahre vor der Entdeckung der Mutationen in dieser Region fielen uns charakteristische Multimermuster auf, die häufig auftraten: Die großen Multimere waren meist vorhanden, jedoch relativ deutlich vermindert. Die normalerweise eindeutig sichtbaren äußeren Subbanden waren kaum sichtbar. Dagegen waren die inneren Subbanden betont und oft so verbreitert, dass sie mit der Zentralbande zu einer breiten Bande verschmolzen. Die Multimere ähnelten sehr den in den 1980er Jahren beschriebenen Varianten IIE, IIF und IIH.Wir hatten dieses Muster als durch eine abnormale Proteolyse entstanden gedeutet und in unseren Befunden als»typ 2A mit abnormer Proteolyse«beschrieben. Praktisch alle nachfolgend entdeckten Mutationen lagen in der D3-Domäne und betrafen Cysteinreste (39). Vor allem bei homozygoter Expression konnte das Fehlen der großen Multimere klar belegt werden (Abb. 11), während heterozygot exprimierte Moleküle weitaus mehr große Multimere aufwiesen. Bei Inkubation des mutierten Moleküls mit der rekombinanten VWF-spaltenden Protease konnte bewiesen werden, dass das Molekül durch veränderte Tertiärstruktur deutlich weniger proteolysiert wurde und unsere Deutung einer abnormalen posttranslationalen Prozessierung korrekt war. Auch für den Typ IIE hatten Zimmerman et al. (44) die verminderte proteolytische Spaltung sehr früh beschrieben. Somit finden wir auch für diesen Subtyp eine perfekte Phänotyp/Genotyp-Relation. Kollagenbindungsregion in der A3-Domäne Die Interaktion zwischen subendothelialem Kollagen und VWF mit nachfolgender Thrombozytenadhäsion gilt als Initialzündung der primären Hämostase. Bindungsregionen für den VWF sind in der A1- (Typ VI und Typ III) sowie in der A3-Domäne (Typ I und III) lokalisiert. Dafür, dass es sich um eine physiologisch wichtige Reaktion handelt, wurden bisher nur sehr wenige Familien mit isolierten Kollagenbindungsdefekten beschrieben. Etwa zeitgleich wurden von der französischen Arbeitsgruppe um D. Meyer und C. Mazurier (eine Familie) (28) und uns (drei Familien) (36) die ersten Patienten mit isolierten Defekten der Kollagenbindungskapazität beschrieben. Bei allen lag der molekulare Defekt in der A3-Domäne. Bei den von uns identifizierten Familien konnten Huizinga und Kollegen (18) eindeutig zeigen, dass die betroffenen Aminosäurereste an der Oberfläche der Kollagenbindungsregion lagen (zweimal) oder aber ihre Struktur veränderten (einmal). Die Expression der kausalen Mutation ergab ebenfalls den eindeutigen Beweis, dass isoliert die Kollagenbindungskapazität drastisch eingeschränkt war, ohne dass andere funktionelle Eigenschaften des Moleküls betroffen waren. Ernüchternd war für uns jedoch, dass bei genauer Analyse der betroffenen Patienten sich klar herausstellte, dass eine Relation zwischen der Blutungsneigung und dem Kollagenbindungsdefekt bei unseren Familien nicht herzustellen war. Dagegen war bei der französischen Familie der Hämostasedefekt eindeutig, der Defekt der Kollagenbindungskapazität jedoch weitaus geringer ausgeprägt. Derzeit laufen Abb. 11 Beweis der gesteigerten Proteaseempfindlichkeit von mutiertem VWF 2A (Subtyp IIA, Gruppe-II-Mutation): Rekombinanter Wildtyp-VWF (Spuren 2-5) wird mit zunehmender Verdünnung rekombinanter VWF-cP deutlich weniger proteolysiert. Mutierter VWF (Spuren 6-9) dagegen wird bereits in der stärksten Verdünnung bis zum Dimer hydrolysiert. Spur 1: nicht proteolysierter Wildtyp-VWF; Spur 10: plasmatischer VWF; rekombinanter, nicht protolysierter 2A-VWF (nicht dargestellt) wie Wildtyp-VWF (vgl. Spuren 2-5); elektrophoretische Trennung im Agarosegel (1,2%) mit niedrigem Auflösungsvermögen

12 23/31 Standardisierte VWS-Diagnostik Perfusionsstudien mit den rekombinanten Proteinen, um Klarheit über die Auswirkung des Defektes auf die Adhäsionsfähigkeit von Thrombozyten zu gewinnen. Klassischer Typ IIA: proteolytische Region in der A2-Domäne Die ersten Patienten, die durch die Multimeranalyse identifiziert wurden, zeigten die Konstellation eines starken Verlustes der großen und mittelgroßen Multimere sowie einer typischen Veränderung des Triplet-Musters der kleinsten Oligomere. Die flankierenden Subbanden, die normalerweise deutlich schwächer dargestellt sind als die Zentralbande, waren deutlich prominent (31). Diese sehr drastischen Veränderungen der Multimere waren das Kennzeichen für den klassischen Typ IIA. Andere Muster galten als sehr selten und wurden bis vor kurzem nur sehr selten beschrieben, meist bei einzelnen Familien, die nachfolgend in der Literatur kaum mehr auftauchten. Als Ursache für das charakteristische Muster konnte die La- Jolla-Gruppe Ende der 1980er und Anfang der 1990er Jahre eine verstärkte proteolytische Spaltung an der physiologischen Spaltstelle zwischen den Aminosäuren Tyr 842 und Met 843 aufdecken (44, 11). Die Identifizierung der verantwortlichen Protease benötigte mehr Zeit. Sie gelang 1996 unabhängig den Arbeitsgruppen von Furlan (13) und Tsai (42). Expressionsstudien zeigten, dass zwei Mechanismen für den Phänotyp Typ IIA verantwortlich sind: Bei der Gruppe-I-Mutation werden die großen Multimere im Golgi-Apparat retiniert und abgebaut, so dass nur gering multimerisierter VWF ins Plasma gelangt. Gruppe-II-Mutationen sind dadurch charakterisiert, dass ein Molekül entsteht, das extrem proteasesensibel ist. Hier werden die zunächst in normaler Weise multimerisierten Moleküle proteolytisch gespalten, sobald sie im Plasma mit der Protease in Kontakt treten (22). Werden die Mutationen exprimiert, sind Gruppe-I-Mutationen sehr einfach zu erkennen. Dagegen ist rekombinante VWF mit Gruppe-II-Mutationen nicht vom Wildtyp zu unterscheiden. Zur Erstellung einer Phänotyp/Genotyp-Relation ist die Inkubation mit definierten-proteasekonzentrationen im Vergleich zum Wildtyp erforderlich (Abb. 12). Typ 2A, Subtyp 2V (verwaschen): instabiler VWF durch Cystein-Mutationen Fallen beim Auswerten der Gele verschmierte Laufspuren auf (Abb. 13), denkt man zuerst an technische Probleme. Doch die Wiederholung der Elektrophorese ergibt exakt dasselbe Ergebnis. Schwierig ist allerdings die Eingruppierung in das aktuell (noch) gültige Schema. Da der VWF:RCo und die VWF:CB nicht obligat diskrepant sind, ist eine Variante des Typs 1 möglich. Allerdings sind in vielen Fällen die großen Multimere relativ vermindert. Auch ist das pathologische Bild der Multimere eindeutig nicht mehr als rein quantitative Veränderung einzustufen. Daher ist eine Gruppierung in den Typ 2 passender. Durch verbesserte Darstellung der Multimere fallen uns diese Varianten sehr Abb. 12 Multimere eines Patienten mit Typ 2M (Subtyp mit verwaschener Struktur, Spur 1): Neben den normal großen Multimere fallen supranormale Multimere (großer Pfeil) im Gel mit mittlerem Auflösungsvermögen (1,6%) auf. Eine Triplet-Struktur ist nicht erkennbar und die Zentralbande läuft schneller (kleine Pfeile). häufig auf. Im Jahr 2002 waren es 16% der Patienten mit Typ 2. Daher ist ein eigener Subtyp, z. B. Typ 2A, Subtyp 2V (verwaschen), gerechtfertigt. Cystein-Mutationen können nicht nur zur Bildung neuer Schleifen innerhalb des Moleküls, sondern auch zu instabilen Molekülen führen mit Ausbildung eines deutlich verschmierten Aspekts der Multimere (10, 19). Wir arbeiten zurzeit daran, die Phänotyp/Genotyp-Relation auch für diese Patienten zu etablieren. Relativer Verlust der großen Multimere, ohne Strukturveränderung (früher Subtyp IB) Etwa 15% unserer Patienten haben lediglich einen relativen Verlust der großen Multimere (Typ IB nach der alten Nomenklatur, Abb. 4). Einige wenige Mutationen konnten wir in der A1-Domäne lokalisieren, wo Typ 2M-Mutationen lokalisiert wurden (25). Patienten, bei denen alle Multimere nachweisbar sind, die großen Multimere jedoch deutlich schwächer dargestellt sind als bei Gesunden, werden trotz der qualitativen Veränderungen meist als Typ 1 deklariert. Gemäß der Definition, dass zum Typ 1 lediglich Patienten mit quantitativen Defekten gehören, sind sie jedoch dem Typ 2A zuzuordnen. Da wir bisher nur wenige Patienten charakterisieren konnten, wird erst in Zukunft die genotypische Klassifizierung möglich sein. Die bislang gefundenen Mutationen lagen in der A1-Domäne. Problematisch ist, dass auch ein prolongierter Transport ( 3 Tage bei Raumtemperatur) diesen Phänotyp induziert. Obwohl die VWF-spezifische Metalloprotease (ADAMTS-13) im Plasma nicht wirken kann, können andere unspezifische Proteasen den VWF wenn auch langsamer hydrolysieren. Typ 2B: verstärkte Bindung zwischen VWF und GP Ib in der A1-Domäne Noch vor der Multimer-Ära wurde von Ruggeri und Mitarbeitern 1980 ein neuer Subtyp des von-willebrand-syndroms beschrieben, der sich durch eine verstärkte Interaktion des Proteins mit seinem Plättchenrezeptor auszeichnete. Bei den ersten