Immunhistochemische Untersuchungen zur Expression von inos, Mn-SOD und 3-NT bei Hunden mit Inflammatory Bowel Disease

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1 Tierärztliche Hochschule Hannover Immunhistochemische Untersuchungen zur Expression von inos, Mn-SOD und 3-NT bei Hunden mit Inflammatory Bowel Disease INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.) vorgelegt von Ina Holst Stade Hannover 2013

2 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein Institut für Pathologie 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein 2. Gutachter: PD Dr. Veronika Stein, PhD, Dipl ECVN Tag der mündlichen Prüfung:

3 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Literaturübersicht Der Aufbau des Gastrointestinaltrakts Magen Dünndarm Enddarm und Afterkanal Das intestinale Immunsystem IBD des Hundes Allgemeines und mögliche Ursachen Allgemeines Einfluss der Genetik Einfluss des intestinalen Milieus Diätetische Einflüsse Immunpathologische Einflüsse Formen der Inflammatory Bowel Disease Klassifikation der IBD und histologische Beurteilung Die lympho-plasmazelluläre Enteritis (LPE) Die lympho-plasmazelluläre Kolitis (LPK) Die eosinophile Gastroenteritis, Enteritis und Enterokolitis Die eosinophile granulomatöse Gastroenteritis Die histiozytäre ulzerative Kolitis des Boxers Die granulomatöse Inflammatory Bowel Disease Die transmurale granulomatöse Enterokolitis (regionale Enteritis) Rassespezifische Formen der IBD Erkrankungsmarker für IBD ROS, inos, 3-NT und Mn-SOD Reaktive Sauerstoffspezies Induzierbare Stickoxidsynthase Nitrotyrosin... 31

4 Inhaltsverzeichnis II Mangan-Superoxid-Dismutase inos und 3-NT bei IBD Mn-SOD bei IBD Material und Methoden Untersuchungsmaterial Fixation, Paraffineinbettung und physikochemische Färbemethode Histologische Beurteilung der Magen-Darm-Bioptate Kontrollhunde Hunde mit lympho-plasmazellulärer Enteritis bzw. Kolitis Hunde mit eosinophiler Gastroenterokolitis Immunhistochemische Untersuchungen Vorversuche zur Immunhistochemie Primärantikörper Sekundärantikörper Detektionssystem Färbemethode Immunhistochemische Nachweismethode Durchführung der Immunhistochemie (ABC-Methode) Spezifitätskontrollen Auswertung der Immunhistochemie Ergebnisse Immunhistochemische Befunde an Darmbiopsien der Kontrollhunde Expression von inos Expression von Mn-SOD Expression von Nitrotyrosin Immunhistochemische Befunde an Darmbiopsien der IBD-Hunde Expression von inos, Mn-SOD und 3-NT Semiquantitative Auswertung der Kontroll-, LPE- und EGE-Hunde Expression bei verschiedenen Altersgruppen der Kontrollhunde Expression von inos, 3-NT und Mn-SOD im Magen... 69

5 Inhaltsverzeichnis III Expression von inos, 3-NT und Mn-SOD im Dünndarm Expression von inos, 3-NT und Mn-SOD im Kolon Kruskal-Wallis Test Korrelation zwischen Immunhistochemie und Pathohistologie Zusammenfassung der wichtigsten Ergebnisse Diskussion Expression bei darmgesunden Hunden Expression von inos Expression von 3-NT Expression von Mn-SOD Expression bei verschiedenen Altersgruppen der Kontrollhunde Expression von inos, 3-NT und Mn-SOD bei Hunden mit IBD Expression von inos Expression von 3-NT Expression von Mn-SOD Schlussbetrachtung Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Anhang Expressionsmuster und Färbeintensität Expressionswerte für die Immunhistochemie Lösungen für die Immunhistochemie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Borat-HCl-Puffer (50mM) Tyramin Bezugsquellen für Geräte, Reagenzien, Chemikalien und Antikörper Abkürzungen

6 Inhaltsverzeichnis IV 10 Danksagung...147

7 Einleitung 1 1 Einleitung Die Inflammatory Bowel Disease (IBD) umfaßt verschiedene chronische und wiederkehrende intestinale Entzündungen unbekannter Ursache und tritt bei Menschen und bei verschiedenen Tierarten (Hund, Katze, Pferd) auf. Es werden verschiedene Formen wie die lympho-plasmazelluläre Enteritis (LPE) oder die eosinophile Gastroenterokolitis (EGE) unterschieden. Die Ätiologie bzw. Pathogenese ist bislang nicht bekannt. Aktuelle Studien vermuten ein multifaktorielles Geschehen bestehend aus einer gestörten intestinalen Mikroflora, einer dysregulierten Immunantwort sowie genetischer Prädisposition. Aus Untersuchungen an Menschen mit IBD (ulzerativer Kolitis und Morbus Crohn) ist bekannt, dass oxidativer Stress vermittelt durch reaktive Sauerstoffspezies zur Schädigung des Gewebes führen kann. Auch die antioxidativen Abwehrmechanismen wie die Mangan-Superoxid-Dismutase (Mn-SOD) spielen anscheinend im Rahmen der Pathogenese eine Rolle. Stickoxid gehört zu den Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Es wird von der induzierbaren Stickoxid-Synthase (inos) bei Stimulation durch bestimmte Zytokine, Mikroben und Bakterienprodukte in großen Mengen aus der Aminosäure Arginin synthetisiert. Zusammen mit dem Superoxid-Anion kommt es zur Bildung von Peroxynitrit, welches aufgrund seiner starken oxidativen Eigenschaften Enzyme oder DNA schädigen kann. Nitrotyrosin (3-NT) entsteht bei der Oxidation von Tyrosin und stellt einen Indikator für oxidativen Stress dar. Die Mn-SOD wirkt als enzymatisches Antioxidans der Entstehung von ROS entgegen. Andererseits kann NO im Darm verschiedene regulatorische, protektive und/oder anti-inflammatorische Reaktionen auslösen. Es führt z.b. zur Inhibition der Plättchenaggregation und der Leukozyten-Adhäsion, kann Vasodilatation auslösen und schützt vor toxischen Reaktionen induziert durch Wasserstoffperoxid. Bei Menschen mit IBD wurde eine Erhöhung der Expression von inos, 3-NT und Mn-SOD in der intestinalen Mukosa nachgewiesen. Über die Expression von inos, 3-NT und Mn-SOD im gastrointestinalen Gewebe von Hunden gibt es bislang im einschlägigen Schrifttum keine Erkenntnisse.

8 Einleitung 2 Zielsetzung dieser Arbeit war es, an Magen-Darm-Bioptaten von Hunden mit unterschiedlichen IBD-Formen (LPE und EGE) mittels immunhistochemischer Methoden die Expression von inos, 3-NT und Mn-SOD topografisch und semiquantitativ im Vergleich zu darmgesunden Hunden zu analysieren. Außerdem wurden transmurale Bioptate von Hunden unterschiedlicher Altersgruppen, die klinisch und pathohistologisch keine Magen-Darm-Veränderungen aufwiesen, auf das Vorhandensein der oben genannten Enzyme bzw. Abbauprodukte untersucht und der zelluläre Ursprung charakterisiert.

9 Literaturübersicht 3 2 Literaturübersicht 2.1 Der Aufbau des Gastrointestinaltrakts Der Rumpfdarm besteht aus Vorderdarm, Mittel- und Enddarm. Der Vorderdarm ist in Speiseröhre (Oesophagus) und Magen gegliedert. Der Mitteldarm (Dünndarm) teilt sich in den Zwölffingerdarm (Duodenum), in den Leerdarm (Jejunum) und in den Hüftdarm (Ileum) auf. Der Enddarm (Dickdarm) beinhaltet die Abschnitte Blinddarm, (Caecum), Grimmdarm (Colon) und Mastdarm (Rectum). Der Afterkanal (Canalis analis) stellt das Endstück des Darms dar und mündet mit dem After (Anus) nach außen (SCHUMMER und WILKENS, 1995). Alle Abschnitte des Rumpfdarmes sind nach dem gleichen Prinzip geschichtet: Die luminal gelegene Tunica mucosa besteht aus dem Epithelium mucosae, der Lamina propria mucosae und endet mit der Lamina muscularis mucosae. Es folgt die Tela submucosa und die Tunica muscularis, welche aus dem Stratum circulare und dem Stratum longitudinale gebildet wird. Zwischen diesen zwei Schichten findet sich das Stratum intermusculare, welches eine Verschiebeschicht darstellt. Es enthält Gefäße, und autonomes Nervengewebe (Plexus nervorum myentericus). Die abschließende Tunica serosa setzt sich aus der Lamina propria serosae sowie dem Mesothelium serosae zusammen (LIEBICH, 1993) Magen Der Hund weist einen einhöhligen, einfachen Magen auf, welcher gesamthaft von einer Drüsenschleimhaut und einem einschichtigen Zylinderepithel ausgekleidet ist. Die Drüsenschleimhaut bildet hohe, verstreichbare Falten mit grübchenförmigen Vertiefungen (Foveolae gastricae). Die Drüsen münden in den Grund der Foveolae gastricae. Es werden verschiedene Drüsenbereiche unterschieden: Der Mageneingangsbereich (Pars cardiaca) weist eine ringförmige Kardiadrüsenzone (Glandulae cardiacae) auf (SCHUMMER und WILKENS, 1995). Die Kardiadrüsen stellen sich als verästelte und stark geknäulte, tubuläre Drüsen dar, welche ein exokrines, alkalisches, schleimiges Sekret produzieren (LIEBICH, 1993; SCHUMMER und WILKENS, 1995). Außerdem finden sich in der Kardiadrüsenzone

10 Literaturübersicht 4 endokrine Drüsenzellen. Sie produzieren Serotonin, Somatostatin und Endorphine (LIEBICH, 1993). Die Fundus- oder Eigendrüsen (Glandulae gastricae propriae) kleiden fast den ganzen Magenkörper (Corpus ventriculi) sowie den Fundus ventriculi aus (SCHUMMER und WILKENS, 1995). Es sind lange, dicht gelagerte Schlauchdrüsen, die sich strukturell und funktionell in drei Abschnitte einteilen lassen (LIEBICH, 1993). Die Zellen des Isthmus sind flache, isoprismatische, häufig nicht ausgereifte Zellen am Grund der Foveolae (LIEBICH, 1993). Bei den Drüsenzellen des Halsabschnittes (Zervix) finden sich zum einen die Salzsäure- und Intrinsic- Faktor-produzierenden Belegzellen. Sie sind stark azidophil, rund bis birnenförmig, haben einen runden Kern und liegen zwischen oder außen an den Hauptzellen (siehe unten) (LIEBICH, 1993). Zum anderen finden sich meist nur blaß anfärbbare Nebenzellen mit basalem Kern. Sie produzieren einen sauren Schleim, welcher mit den Sekreten der Isthmuszellen und der Epithelzellen die Magenschleimhaut vor Proteasen und H + -Ionen schützt (LIEBICH, 1993). Das Mittelstück und der Drüsengrund (Pars principalis) bilden den letzten Abschnitt. Hier finden sich vor allem Belegzellen und Hauptzellen. Letztere sind hochprismatisch mit einem basophilen Zytoplasma und einem ovalen, im unteren Drittel der Zelle gelegenen Kern. Sie geben Pepsinogen, Lipasen und Labferment ab (LIEBICH, 1993). Auch intraepitheliale endokrine Zellen sind nachweisbar. Außerdem finden sich enterochromaffine, Serotonin-produzierende (EC-)Zellen, D-Zellen (Somatostatin) und G-Zellen (Gastrin) (LIEBICH, 1993). Die sich an das Corpus ventriculi anschließende Pars pylorica wird von den Pylorusdrüsen (Glandulae pyloricae) ausgekleidet (SCHUMMER und WILKENS, 1995). Anteile von Pylorusdrüsen sind auch im Korpus nachweisbar (LIEBICH, 1993). Die Schlauchdrüsen stellen sich als stark verästelte und geknäulte Drüsen dar. Die Zellen sind kubisch bis zylindrisch mit einem ovalen Kern. Das schleimige Sekretionsprodukt enthält Lysozym (LIEBICH, 1993). Des Weiteren gibt es endokrine G-Zellen (Gastrin) (LIEBICH, 1993). Der Magen hat verschiedene Funktionen. Er dient als Aufnahmebehältnis für die Nahrung und kontrolliert die Menge der in den Darmtrakt gelangenden Ingesta (SCHUMMER und WILKENS, 1995; STROMBECK, 1993). Über die Motilität des Magens werden zugleich die Motilität und damit die Leerung des Darmtrakts

11 Literaturübersicht 5 kontrolliert (STROMBECK, 1996). Außerdem hat der Magen mittels der Sekretion von Magensäure und proteolytischen Enzymen einen Anteil an der beginnenden Verdauung von aufgenommener Nahrung. Des Weiteren erfolgt eine Durchmischung und Zerkleinerung der Ingesta im Magen (SCHUMMER und WILKENS, 1995; STROMBECK, 1996) Dünndarm In allen drei Abschnitten des Dünndarms (Duodenum, Jejunum, Ileum) findet sich der oben beschriebene regelhafte Wandaufbau (SCHUMMER und WILKENS, 1995; LIEBICH, 1993). Ein wesentliches Merkmal des Dünndarms ist die Vergrößerung der inneren Oberfläche durch quer zur Längsachse des Darmrohres verlaufende Falten (Plicae circulares), welche in Richtung des Ileums flacher werden. Lange schlanke Dünndarmzotten (Villi intestinales) sowie ein dichter Mikrovillibesatz auf den Epithelzellen vervielfältigen die Schleimhautoberfläche (SCHUMMER und WILKENS, 1995; LIEBICH, 1993). Im Duodenum sind die Darmzotten zunächst regelmäßig, dicht und relativ breit, im Jejunum sind sie fingerförmig, schlank, lang und weniger dicht. Im Ileum sind die Zotten kürzer, weniger dicht und breiter (LIEBICH, 1993). Außerdem finden sich in der Lamina propria mucosae Einstülpungen, die von Darmdrüsen (Lieberkühn-Drüsen, Krypten) gebildet werden (SCHUMMER und WILKENS, 1995). Am Grund der Darmdrüsen finden sich undifferenzierte Epithelzellen, die der fortwährenden Regeneration des Epithels dienen (LIEBICH, 1993). Das einschichtige hochprismatische Epithel enthält neben Enterozyten Becherzellen und endokrine Zellen. Das Duodenum enthält nur vereinzelt Becherzellen. Im Jejunum und Ileum ist die Anzahl der Becherzellen dagegen vermehrt. In der Lamina propria mucosae sind zwischen den Schlauchdrüsen auch Immunzellen und lymphoretikuläres Gewebe nachweisbar (SCHUMMER und WILKENS, 1995; LIEBICH, 1993). Alle lymphoretikulären Einrichtungen der intestinalen Schleimhaut stellen das GALT (gut-associated lymphoid tissue) dar (LIEBICH, 1993). In der Tela submucosa finden sich neben dem Plexus nervorum submucosus Lymphknötchen (Lymphfollikel) oder aggregierte Lymphknötchen (Peyersche Platten). Im Jejunum liegen Lymphfollikel in der Lamina propria mucosae und in der

12 Literaturübersicht 6 Tela submucosa. Die Tela submucosa des Ileums weist Peyersche Platten auf, welche bis in die Tunica mucosa reichen können. Das Duodenum weist in der Tela submucosa außerdem die Glandulae submucosae (Brunner-Drüsen) auf. Sie geben einen alkalischen Schleim ab, der zur Pufferung des sauren Magensaftes dient (LIEBICH, 1993). Die Funktionen der Schleimhaut sind die Verdauung und Absorption der Ingestabestandteile. Mit Hilfe der glatten Muskulatur und der Peristaltik wird die Ingesta vermischt und langsam in aboraler Richtung fortbewegt. Die langsame Passage gewährt die vollständige Verdauung der Ingesta (STROMBECK, 1996) Enddarm und Afterkanal Im Dickdarm finden sich keine Darmzotten. Stattdessen senken sich Glandulae intestinales in die Lamina propria mucosae (LIEBICH, 1993). Das einschichtige Epithel besteht aus hochprismatischen Enterozyten und einer hohen Anzahl an Becherzellen (SCHUMMER und WILKENS, 1995). In der Tela submucosa sind Lymphfollikel oder Peyersche Platten vorhanden (LIEBICH, 1993). Im Rektum findet sich eine besonders hohe Zahl an Becherzellen. Die Tunica muscularis zeigt hier eine ausgeprägte Wandstärke (LIEBICH, 1993). Im Canalis analis geht die Schleimhaut in ein mehrschichtiges Plattenepithel über. Am Ende des Analkanals treten auch Haare, Talg- und Schweißdrüsen auf (LIEBICH, 1993). Der Dickdarm hat verschiedene Funktionen. Er dient zum einen als Speicher für den Kot, zum anderen werden Elektrolyte und Wasser entzogen. Schließlich findet an dieser Stelle auch die Entleerung des Kotes statt (STROMBECK, 1996). 2.2 Das intestinale Immunsystem Der Gastrointestinaltrakt ist ein komplexes Organ mit vielen verschiedenen Funktionen, wie z.b. die Verdauung und Absorption von Nährstoffen sowie die Kontrolle von kommensalen und pathogenen Mikroorganismen (STOKES and WALY, 2006). Das Immunsystem des Darms ist das größte immunologische Organ des Körpers und beinhaltet circa 50 Prozent aller Lymphozyten des gesamten Organismus (BRANDTZAEG et al., 1985).

13 Literaturübersicht 7 Zu den Abwehrmechanismen des Gastrointestinaltraktes zählen immunologische und mechanische Mechanismen. Zu letzteren zählt die Peristaltik des Darmes, die verhindert, dass sich Debris im Darm ansammelt. Verschiedene Verdauungssekrete zerstören Bakterien und Viren. Von Becherzellen produzierter Mukus umgibt in der Ingesta enthaltene Bestandteile und verhindert das Eindringen in die Mukosa. Die physiologische Bakterienflora verhindert die Kolonisation des Darms mit pathogenen Organismen (WILLARD, 1992). Die immunologischen Abwehrmechanismen untergliedern sich in das spezifische und das unspezifische Immunsystem. Zu den unspezifischen immunologischen Abwehrmechanismen gehört die Proteinverdauung durch Pankreas-Enzyme. Diese bewirken, dass nur wenige intakte Antigene mit der Darmmukosa in Kontakt kommen. Die Darmmukosa bildet mit ihrer Schleimschicht eine Barrierefunktion und verhindert eine Interaktion mit intestinalen Keimen. Feste Zell-Zell-Verbindungen (tight junctions) dichten die Epithelien außerdem ab. Sezerniertes Immunglobulin A (IgA) ist in der Lage, luminale Antigene, wie Proteine oder Bakterien vor dem Durchdringen der Schleimhaut abzufangen (ALLENSPACH und GASCHEN, 2003; BRANDTZAEG, 2009). Es wird von den in der Lamina propria befindlichen Plasmazellen gebildet und lumenwärts transportiert (BRANDTZAEG, 2009). Das spezifische Immunsystem wird von dem gut-associated lymphoid tissue (GALT) gebildet. Das GALT untergliedert sich in zwei Untereinheiten: das organisierte GALT und das diffuse GALT (WILLARD, 1992; RAMIRO-PUIG et al., 2008). Das organisierte GALT besteht aus isolierten lymphoiden Follikeln (Peyersche Platten) und den Mesenteriallymphknoten (WILLARD, 1992). Erstere finden sich im antimesenterialen Bereich des Darms und werden durch einen Monolayer von Zellen (follicle-associated epithelium, FAE) vom intestinalen Lumen separiert. Dieser Monolayer besteht aus zylindrischen Epithelzellen, M-Zellen, intraepithelialen Lymphozyten und Becherzellen (RAMIRO-PUIG et al., 2008). M-Zellen sind auf die Antigen-Aufnahme aus dem Darmlumen spezialisiert (ALLENSPACH und GASCHEN, 2003). Unter dem FAE findet sich ein Bereich, der aus dendritischen Zellen und Makrophagen gebildet wird (subepithelial dome) (RAMIRO-PUIG et al., 2008). Interfollikuläre Bereiche finden sich zwischen den Follikeln und bestehen aus

14 Literaturübersicht 8 T-Lymphozyten (hauptsächlich T-Helfer Zellen), reifen dendritischen Zellen und Makrophagen. Peyersche Platten bestehen aus vielen aus B-Lymphozyten geformten Follikeln (SANSONETTI, 2004; RAMIRO-PUIG et al., 2008). Das diffuse GALT besteht vorwiegend aus T-Lymphozyten, welche zwischen den Epithelzellen (intraepitheliale Lymphozyten) oder in der Lamina propria mucosae (Lamina propria Lymphozyten) liegen. Verglichen mit der gesamten Immunzellpopulation stellen die intraepithelialen Lymphozyten einen großen Anteil der Immunzellen dar (WILLARD, 1992; RAMIRO-PUIG et al., 2008). Die Lamina propria mucosae enthält reife, IgA-produzierende Plasmazellen, T- Lymphozyten und Makrophagen, dendritische Zellen und Mastzellen (RAMIRO-PUIG et al., 2008). Bei Kontakt mit einem infektiösen Agens erfolgen zunächst die angeborenen Immunmechanismen. Zu den Komponenten der angeborenen Immunität zählen die Phagozyten, wie Makrophagen und neutrophile Granulozyten (WILLARD, 1992; MURPHY, TRAVERS und WALPORT, 2009). Pathogene Mikroorganismen werden mit Hilfe von Rezeptoren, die mikrobielle molekulare Muster erkennen, sogenannte microbe-associated molecular patterns (MAMP), detektiert (CAVE, 2003). Gut charakterisierte Rezeptoren sind die membranständigen Toll-like Rezeptoren (TLR) und die intrazellulären NOD1- und NOD2-Rezeptoren, deren Aktivierung zu einer intrazellulären Signalkaskade und zu einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB führt (CAVE, 2003; SWERDLOW et al., 2006). Beim erwachsenen Tier durchdringen ca. 0,002% aller mit der Nahrung aufgenommenen Antigene die Mukosa-Schranke (ALLENSPACH und GASCHEN 2003). Dadurch kommt es zu den Mechanismen der erworbenen/adaptiven Immunantwort. Eine luminale Antigen-Aufnahme erfolgt zum einen durch M-Zellen (ALLENSPACH und GASCHEN, 2003), mittels parazellulärer Mechanismen oder durch Enterozyten. Letztere sind jedoch weniger zugänglich für makromolekulare Substanzen. Enterozyten sind außerdem in der Lage, Antigen zu prozessieren und den T-Lymphozyten zu präsentieren (RAMIRO-PUIG et al., 2008). M-Zellen nehmen Antigen auf und leiten dieses zu den Antigen-präsentierenden Zellen (APC) wie dendritische Zellen, Makrophagen oder B-Zellen, welche innerhalb

15 Literaturübersicht 9 der Dome-Region der Peyerschen Platten lokalisiert sind, weiter (ALLENSPACH und GASCHEN, 2003). Die APC internalisieren und prozessieren das Antigen und wandeln es in Peptide um, die mittels major histocompatibility complex (MHC) exprimiert werden (RAMIRO-PUIG et al., 2008). Sie wandern zu den Peyerschen Platten, wo sie mit naiven Lymphozyten interagieren und die Produktion von IgA aus B-Zellen induzieren (MOWAT, 2003). Die aktivierten Lymphozyten verlassen die Peyerschen Platten über Lymphgefäße und wandern zu mesenterialen Lymphknoten, um dort zu reifen und klonal zu expandieren. Über die systemische Zirkulation migrieren sie in die intestinale Lamina propria, um hier spezifisch zu agieren (CAVE, 2003; MOWAT, 2003). Zur Vermeidung einer überschießenden Immunreaktion bei Kontakt mit harmlosen Antigenen wird die Immunantwort durch regulative Mechanismen, wie z.b. mittels regulatorischen T-Zellen kontrolliert (orale Toleranz) (ALLENSPACH und GASCHEN, 2003; BRANDTZAEG, 2009). Nach Aktivierung durch Antigene können sich T-Helfer Zellen in zwei Effektor- Subpopulationen differenzieren (Th1- und Th2-Zellen). Die proinflammatorische Th-1 Immunantwort ist durch bestimmte Zytokine, wie z.b. Interferon-gamma (IFNγ) oder Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNFα) gekennzeichnet und wird mittels regulatorischen T-Zellen und Th3-Zellen und deren Zytokine kontrolliert (ALLENSPACH und GASCHEN, 2003). Th2-Zellen produzieren u.a. Interleukin 4 (IL- 4), IL-5, IL-10 und Transforming-growth factor β (TGFβ). Diese Zytokine vermitteln eine entzündungshemmende und immunsuppressive Antwort auf bestimmte Antigene (ALLENSPACH und GASCHEN, 2003). Die jeweils produzierten Zytokine beeinflussen außerdem die Entwicklung der jeweiligen Subpopulation, so dass sich jede Subpopulation selbst stimuliert und die andere reguliert (GAJEWSKI and FITCH, 1988). Bei einer Verletzung der Schleimhautbarriere kommt es zum Eindringen von Mikroorganismen und Antigenen und einer konsekutiv verstärkten Th1-Antwort. Die Zyktokinausschüttung führt zu einer weiteren Störung der Darmmukosa und zu einer Unterhaltung der Entzündung (ALLENSPACH und GASCHEN, 2003). Neben den Th1- und Th2-Zellen gibt es eine weitere Effektor-Population, die Th17- Zellen, welche ebenfalls durch ein spezifisches Zytokin-Muster charakterisiert sind

16 Literaturübersicht 10 (LANGRISH et al., 2005). Außerdem können naive T-Helfer Zellen zu regulatorischen T-Zellen, nämlich Th3- und Tr1-Lymphozyten (IL-10, TGFβ) differenzieren. Sie regulieren die Immunantwort bei entzündlichen und infektiösen Prozessen. Des Weiteren spielen sie bei der Entwicklung der oralen Toleranz eine Rolle (VIEIRA et al., 2004).

17 Literaturübersicht IBD des Hundes Allgemeines und mögliche Ursachen Allgemeines Die chronischen idiopathischen Darmentzündungen des Hundes sind auch unter dem Begriff Inflammatory Bowel Disease (IBD) bekannt. Damit wird eine heterogene Gruppe von Erkrankungen zusammengefasst, die sich durch mindestens vier Wochen anhaltende, gastrointestinale klinische Symptome wie chronisches Erbrechen und/oder Diarrhö unbekannter Genese auszeichnen. Histologisch sind entzündliche Veränderungen der Lamina propria von Dünn- oder Dickdarm festzustellen. Die IBD kann nur den Dünndarm, nur den Dickdarm oder beide Lokalisationen betreffen (JERGENS et al., 1992; GUILFORD, 1996; TAMS, 2003). Zur Diagnosestellung müssen mögliche Differentialdiagnosen wie bakterielle (z.b. Campylobacter, Salmonella, pathogene Escherichia coli), parasitäre oder virale Infektionen, Nahrungsmittelallergien und unverträglichkeiten, Fremdkörper oder gastrointestinale Neoplasien ausgeschlossen werden (HALL und SIMPSON, 2000; TAMS, 2003). Mittels Blut- und Urinuntersuchungen können weitere extraintestinale Ursachen, wie z.b. Leber- oder Niereninsuffizienz abgeklärt werden. Zum Ausschluss einer exokrinen Pankreasinsuffizienz eignet sich die Bestimmung der trypsinähnlichen Immunreaktivität (ALLENSPACH und GASCHEN, 2003). Insbesondere sind Infektionen mit Giardia, Cryptosporidium und Clostridum perfringens sowie bakterielle Imbalanzen der Darmflora (small intestinal bacterial overgrowth, SIBO) in Betracht zu ziehen (GUILFORD, 1996; TAMS, 2003). Klinisch zeigen die Hunde intermittierendes Erbrechen und/oder Diarrhö. Das Erbrechen kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Nahrungsaufnahme erfolgen. Eine Diarrhö ist möglicherweise das einzige Symptom einer IBD (GUILFORD, 1996; TAMS, 2003). Bei hochgradigen Erkrankungen kann es zu einer Proteinverlust-Enteropathie mit Hypoproteinämie, Aszites und Gewichtsverlust kommen (ZENTEK et al., 2007). Bei länger anhaltenden Enteritiden kann ein erniedrigter Cobalamin- und ein erhöhter Folsäure-Spiegel auftreten (GERMAN et al., 2003a).

18 Literaturübersicht 12 Die Faktoren, die zu einer IBD führen, sind bisher ungeklärt (GUILFORD, 1996; TAMS, 2003). Es wird über eine möglicherweise defekte mukosale Immunantwort, autoimmune Mechanismen, Veränderungen in der mukosalen Permeabilität, diätetische Einflüsse und infektiöse sowie genetische Ursachen diskutiert (GUILFORD, 1996; TAMS, 2003). Bei einigen Patienten kann die Gabe einer Diät zur (zeitweisen) Verbesserung der Erkrankung führen oder zu einer Reduzierung der medikamentellen Therapie beitragen (MARKS et al., 2002). Mit einer Diät kann eine Verminderung von Hypersensitivitätsreaktionen auf Nahrungsmittelantigene, eine Veränderung der Darmmotilität oder eine veränderte bakterielle Darmflora erreicht werden (GUILFORD, 1996). Zum Ausschluß des Verdachts einer allergisch bedingten Erkrankung kommt eine Eliminationsdiät mit anschließender Provokation zum Einsatz. Eliminationsdiäten sollen mindestens drei bis vier Wochen ausschließlich gegeben werden (TAMS, 2003; Guilford, 1996). Zur Therapie werden Antibiotika, Immunsuppressiva und oben genannte diätetische Maßnahmen eingesetzt (ZENTEK et al., 2007). Innerhalb der ersten drei Behandlungsmonate werden bei bis zu 71% kaniner IBD-Fälle günstige Behandlungsergebnisse erreicht (MÜNSTER et al., 2006). In 50% der Fälle kommt es jedoch zu rezidivierenden Verläufen und langfristig sind bei 26% der Hunde dauerhafte Remissionen zu erwarten. 13% zeigen sich von einer Therapie unbeeinflusst (CRAVEN et al., 2004). Komplikationen einer IBD sind z.b. die Entwicklung eines Lymphoms oder eine hämorrhagische Diathese induziert durch die intestinale Malabsorption von Fett und dem Fett-löslichen Vitamin-K (TAMS, 2003). In der Humanmedizin existiert ebenfalls das Krankheitsbild der IBD. Dazu gehören Morbus Crohn (chronische, granulomatöse Entzündung des Magen-Darm-Trakts) und die Colitis ulcerosa (chronische Entzündung von Dick- und Mastdarm) (SCHÖLMERICH, 1999).

19 Literaturübersicht Einfluss der Genetik Die Prädisposition bestimmter Rassen für IBD spricht für eine ätiologische Beteiligung der genetischen Vorraussetzungen dieser Rassen. In einer aktuellen Studie wurde an Hunden das Risiko untersucht, an IBD zu erkranken. Es ergaben sich signifikante Empfänglichkeiten bei fünf Rassen: Weimaraner, Rottweiler, Deutscher Schäferhund, Boxer und Border Collie (KATHRANI et al., 2011a). Auch bei der humanen IBD wird eine genetische Beteiligung an der Pathogenese vermutet (SIMPSON und JERGENS, 2011). Bei Morbus Crohn z.b. wurde eine Mutation im Immunrezeptor NOD2/CARD15 festgestellt. Diese führt bei der Anwesenheit von Mikroflora zu einer Hochregulierung der Zytokin-Produktion und einer verzögerten Abwehr gegen Bakterien und somit zur Aufrechterhaltung und Begünstigung von intestinalen Entzündungen (PACKEY und SARTOR, 2008; PEREZ et al., 2010). Auch bei Deutschen Schäferhunden und anderen Hunderassen mit IBD zeigte sich im Gegensatz zu Kontrolltieren ein Nukleotid-Polymorphismus im NOD2-Gen (KATHRANI et al., 2010a). Zusätzlich zeigte sich bei Deutschen Schäferhunden mit IBD ein Polymorphismus im TLR4- und im TLR5-Gen (KATHRANI et al., 2010b). Bei Boxern mit granulomatöser Kolitis wurde ein Nukleotid-Polymorphismus im NCF2-Gen festgestellt (CRAVEN et al., 2010). Beim Soft-Coated Wheaten Terrier ist eine Proteinverlust-Enteropathie sowie - Nephropathie feststellbar. Pedigree-Analysen ergaben einen gemeinsamen männlichen Vorfahren. Ein möglicher Erbgang und die Pathogenese der Erkrankung bleiben jedoch bisher unklar (LITTMANN et al., 2000). Weitere Rassedispositionen für IBD finden sich beim Yorkshire Terrier und wie unten beschrieben (2.4.9) beim Lundehund und beim Basenji Einfluss des intestinalen Milieus Die gastrointestinale bakterielle Umgebung spielt eine entscheidende Rolle für die Gesundheit des Wirtes. Sie dient als Barriere gegenüber invasiven Pathogenen, hilft bei der Verdauung und Energiegewinnung aus der Nahrung, unterstützt nutritiv die

20 Literaturübersicht 14 Enterozyten und stimuliert die Entwicklung des Immunsystems (SUCHODOLSKI, 2011). Jeder Hund beherbergt ein eigenes, individuelles, mikrobielles Profil (SUCHODOLSKI et al., 2004). Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Bifidobacterium spp. und Enterobacteriaceae werden am häufigsten aus dem caninen Darm kultiviert (SUCHODOLSKI, 2011). Verschiedene gastrointestinale Erkrankungen sind mit nicht-spezifischen Veränderungen der intestinalen Flora assoziiert. Die Dysbiose des Dünndarms wird zu den SIBO (small intestinal bacterial overgrowth) oder zu den Antibiotika-responsiven Diarrhöen gezählt (SUCHODOLSKI, 2011). Die erkrankten Hunde reagieren auf eine Antibiotika-Gabe, nach Beendigung der Therapie tritt die Diarrhö jedoch wieder auf (WESTERMARCK et al., 2005). In einer Studie waren keine Zusammenhänge zwischen einer erhöhten intestinalen Bakterienanzahl und der Schwere der Erkrankung feststellbar (GERMAN et al., 2003a). Molekulare Untersuchungen haben Unterschiede in der Zusammensetzung der intestinalen Flora im Duodenum von gesunden Hunden und an IBD erkrankten Hunden gezeigt: Erkrankte Hunde wiesen einen erhöhten Gehalt an Enterobacteriaceae und Clostridiaceae auf. Gleichzeitig fand sich eine geringere Vielfalt der bakteriellen Flora (XENOULIS et al., 2008; SUCHODOLSKI et al., 2010) Diätetische Einflüsse Um zwischen einer Futtermittelallergie-induzierten Enteropathie und IBD unterscheiden zu können, ist die Durchführung einer Eliminationsdiät mit anschließender Provokation sinnvoll (VERLINDEN et al., 2006). Bei Futtermittelallergien (FA) zeigen sich unspezifische gastrointestinale Symptome wie Erbrechen, Diarrhö, Bauchschmerzen oder eine erhöhte Defäkationsfrequenz (VERLINDEN et al., 2006). FA verursachen bei Hunden zudem häufiger entzündliche Hautveränderungen als gastrointestinale Symptome (FOSTER et al., 2003). Reaktionen auf Nahrungsmittel können verschiedene Hintergründe haben. So sind Reaktionen mit einer immunologischen Genese (FA) sowie nicht-immunologisch bedingte Reaktionen (Futtermittelintoleranz) und toxische Reaktionen (Intoxikationen) bekannt. Die Futtermittel-Intoleranz kann durch ein metabolisches Problem, durch eine pharmakologische Reaktion oder idiosynkratisch entstehen (ORTOLANI und PASTORELLO, 2006).

21 Literaturübersicht 15 Die meisten Allergene bei der FA sind wasserlösliche Glykoproteine mit einer Größe von 10 bis 70 kda (SICHERER und SAMPSON, 2010). Als häufige Futtermittelantigene bei Hunden erwiesen sich Proteine vom Rind und Huhn oder Milchprodukte, Weizen und Eier (VERLINDEN et al., 2006). Die Pathogenese, die beim Hund zu FA führt, ist bisher nicht bekannt. Es werden Überempfindlichkeitsreaktionen des Typs I, III und IV vermutet (VERLINDEN et al., 2006). Vermutlich kommt aus dem Futter stammenden Allergenen bei der Pathogenese der IBD eine gewisse Bedeutung zu. In einer Studie an 70 Hunden mit chronischer Enteropathie reagierten 56% der Hunde positiv auf eine zehntägige Eliminationsdiät mit Fisch und Reis. 79% dieser Hunde wurden nach 14 Tagen wieder erfolgreich auf ihre alte Nahrung umgestellt (ALLENSPACH et al., 2007). In einem über drei Jahre angelegten Versuch mit Hunden mit chronischer Enteropathie erhielten 18 Hunde eine hydrolysierte Nahrung und acht Hunde eine hochverdauliche Kontrolldiät. Im Gegensatz zu den Hunden mit der Kontrolldiät zeigten die Hunde mit der hydrolysierten Nahrung eine über den beobachteten Zeitraum anhaltende, signifikante Verbesserung der Erkrankung (MANDIGER et al., 2010). In einer Studie an Hunden mit chronischer Diarrhö und/oder Erbrechen wurden zehn Hunde mit einer Futtermittel-responsiven Enteritis mit einer Eliminationsdiät und neun Hunde mit einer Steroid-responsiven Enteritis mit Prednisolon behandelt. Vor und nach der Behandlung wurden Darmbiopsien histologisch untersucht. Dabei ergaben sich keine signifikanten Unterschiede bezüglich des histologischen Gradings, der totalen Zellzahl in der Lamina propria und der CD3-positiven Zellen vor und nach der Behandlung sowie zwischen den Gruppen der Futtermittel-responsiven und Steroidresponsiven Hunde (SCHREINER et al., 2008). Beim Soft-Coated Wheaten Terrier wurden Reaktionen gegenüber Getreide, Tofu, Hüttenkäse, Milch, Weizen und Lammfleisch beschrieben. Vermutlich sind Hypersensitivitätsreaktionen an der Pathogenese der protein-losing enteropathy/protein-losing nephropathy des Soft-Coated Wheaten Terriers beteiligt (VADEN et al., 2000).

22 Literaturübersicht Immunpathologische Einflüsse Bei der IBD des Hundes ist außer diätetischen Faktoren anscheinend eine Dysfunktion des mukosalen Immunsystems beteiligt. In verschiedenen Untersuchungen wurde die Immunzellzusammensetzung bei Hunden mit IBD bestimmt. Es zeigte sich ein Anstieg von IgA- und IgG-Plasmazellen in der Lamina propria, von CD3 + und CD4 + positiven Zellen, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten sowie reduzierte Mastzellzahlen (STONEHEWER et al., 1998; JERGENS et al., 1999; GERMAN et al., 2001). Weitere Untersuchungen zur Beteiligung von Mastzellen bei LPE/LPK des Hundes haben eine Abnahme von metachromatisch gefärbten (Kresylechtviolett, KEV) und histochemisch und immunhistochemisch gefärbten (Tryptase und Chymase) Mastzellen ergeben. Diese Reduktion könnte durch eine Th1-dominierte Entzündungsreaktion oder auch durch einen Verdünnungseffekt, der durch ein erhöhtes Auftreten von T-Zellen und Plasmazellen hervorgerufen wurde, oder durch Mastzelldegranulation verursacht werden (KLEINSCHMIDT et al., 2007). Bei der EGE dagegen war ein Anstieg der oben genannten Mastzellen zu verzeichnen, was auf eine Hypersensitivitätsreaktion vom Typ I mit einem Th2-Entzündungszellmuster hindeutet (KLEINSCHMIDT et al., 2007). Dendritische Zellen spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung der oralen Toleranz. Sie helfen bei der Differenzierung zu Th1-, Th2-, Th17- oder regulatorischen T-Zellen und führen somit zur Ausschüttung des entsprechenden Zytokinspektrums und beeinflussen auf diesem Wege die Entzündungszellantwort. Eine Balance zwischen Effektor-T-Zellen und regulatorischen Subpopulationen der T-Zellen wird durch Zytokine und Regulationsmechanismen erhalten (ALLENSPACH, 2011). KATHRANI et al. (2011b) untersuchten mit einem anti-cd11c Antikörper das Vorkommen dendritischer Zellen bei Hunden mit IBD. Die Zahl der dendritischen Zellen war im Gegensatz zu den Kontrolltieren im Duodenum, Ileum und Kolon signifikant verringert. In einer anderen Studie wurde das Vorkommen von regulatorischen T-Zellen (mittels Foxp3-Antikörper) bei Hunden mit IBD untersucht. Foxp3-positive Zellen

23 Literaturübersicht 17 waren bei IBD-Hunden signifikant vermindert, was auf eine reduzierte orale Toleranz hindeutet (JUNGINGER et al., 2012). Die IBD des Hundes zeichnet sich im Vergleich zu gesunden Hunden vermutlich durch ein verändertes mukosales Zytokin-Muster aus, welches im Gegensatz zu Untersuchungen beim Menschen auf eine gemischte Th1- und Th2-Zytokin Aktivierung hindeutet (GERMAN et al., 2000b; JERGENS et al., 2009a). Allerdings fanden sich in neueren Studien, in denen Real-time (RT)-PCR und semiquantitative RT-PCR eingesetzt wurden, keine eindeutigen Hinweise auf eine erhöhte Expression von bestimmten Zytokinen (PETERS et al., 2005; JERGENS et al., 2009a; DE MAJO et al., 2008). In einer aktuellen Studie von SCHMITZ et al. (2012) wurde die mrna- Expression von IL-17A und IL-22 (Th17-Zellen), IL-10 und TGFβ (regulatorische T- Zellen) und IFNy (Th-1 Zellen) in duodenalen Biopsien von Hunden mit IBD mittels quantitativer RT-PCR untersucht. Im Gegensatz zu Befunden beim Menschen war die IL-17A mrna Expression signifikant erniedrigt und die übrigen Zytokine wiesen keine Veränderungen auf. Weiterhin fanden sich widersprüchliche Ergebnisse zur Expression von einigen Zytokinen bei Hunden mit IBD (LOCHER et al., 2001; RIDYARD et al., 2002). In einer anderen Untersuchung wurde die Expression von IL- 1β und seinem Rezeptor-Antagonisten (IL-1Ra) charakterisiert. Im Vergleich zu den Kontrolltieren zeigten die IBD Hunde eine Abnahme des IL-1RA:IL-1β Quotienten. Diese Beobachtungen zeigten sich mittels Bestimmung der mrna als auch mittels Bestimmung des Proteins. Da die Aktivierung von TLRs die IL-1β-Expression in Makrophagen aufreguliert, ist es möglich, dass die erhöhte IL-1β-Expression bei IBD- Hunden durch eine verstärkte (möglicherweise fehlerhafte) Aktivierung von TLRs verursacht wird (MAEDA et al., 2012). Bei Untersuchungen von TLRs bei IBD Hunden fand sich eine signifikant erhöhte Expression von TLR2-mRNA im Duodenum (RT-PCR). Diese Erhöhung korrelierte außerdem mit dem canine chronic enteropathy clinical activity index (CCECAI) (MCMAHON et al., 2010). Weitere Untersuchungen wiesen eine erhöhte mrna- Expression von TLR2, TLR4 und TLR9 in Biopsien von Duodenum und Kolon bei IBD Hunden nach. Auch nach einer klinischen Verbesserung in Verbindung mit Behandlung durch Prednisolon zeigte sich keine Veränderung der Expression

24 Literaturübersicht 18 (BURGENER et al., 2008). In einer Studie, die sich mit Deutschen Schäferhunden mit IBD beschäftigte, stellte sich eine deutlich erhöhte Expression von TLR4 heraus, während TLR2 und TLR9 unverändert waren (ALLENSPACH et al., 2010). In einer anderen Studie war eine signifikant erhöhte Transkription verschiedener Chemokine in der duodenalen Mukosa von Hunden mit IBD, jedoch nicht ihrer Rezeptoren nachweisbar (MAEDA et al., 2011). 2.4 Formen der Inflammatory Bowel Disease Klassifikation der IBD und histologische Beurteilung Die Nomenklatur richtet sich nach der Art der auftretenden Entzündungszellen und der Lokalisation der betroffenen Darmabschnitte. Es werden folgende Formen unterschieden: lympho-plasmazelluläre Enteritis, eosinophile (Gastro-)Enteritis, eosinophile granulomatöse Gastroenteritis, histiozytäre ulzerative Kolitis, granulomatöse Kolitis und transmurale granulomatöse Enterokolitis. Außerdem gibt es weitere rassespezifische IBD-ähnliche Erkrankungen beim Basenji, Lundehund und Soft-Coated Wheaten Terrier (FLESJA und YRI, 1977; MCLACHLAN et al., 1988; GERMAN et al., 2003b). Im Laufe der Zeit wurden verschiedene Auswertungsmöglichkeiten für Darmbioptate von Hunden entwickelt, um den IBD Erkrankungsgrad zu bestimmen. JERGENS et al. (1992) entwickelten eine Gradeinteilung für die histologische Beurteilung. WILCOCK (1992) erstellte Richtlinien für die histologische Beurteilung von endoskopisch entnommenen, unveränderten und entzündlich veränderten Dick- und Dünndarmbiopsien. ROTH et al. (1990) beschreiben ein Gradingsystem für die Auswertung von unveränderten Kolonproben und Kolonproben mit lymphoplasmazellulärer Entzündung. JACOBS et al. (1990) entwickelten ein System zur Auswertung von entzündlich verändertem Dünndarm, insbesondere lymphoplasmazellulärer Entzündung bei Hunden. Die Interpretation von gastrointestinalen Proben variiert unter Pathologen. Zur Minimierung dieses Problems entwickelte die World Small Animal Veterinary Association (WSAVA) ein standardisiertes Bewertungsschema für die Beurteilung von gastrointestinalen Proben. So soll

25 Literaturübersicht 19 sichergestellt werden, dass Grad und Charakter sowie morphologische Veränderungen einer mukosalen Entzündung möglichst einheitlich bewertet werden (DAY et al., 2008). In einer retrospektiven Studie von WILLARD et al. (2010) an intestinalen Biopsien von Hunden mit intestinalen Läsionen und Hypoalbuminämie wurde die Vergleichbarkeit der histopathologischen Diagnosen untersucht. Vier Pathologen untersuchten nach den Richtlinien des WSAVA Bewertungsschemas unter Zuhilfenahme von bildlichen Vorlagen die Proben. Es ergab sich eine überraschend schlechte Übereinstimmung der Diagnosen. Ursächlich vermuteten WILLARD et al. (2010) u.a. Unterschiede in der Färbequalität der Schnitte. Eine Lösung des Problems könnte mittels standardisierter Bearbeitung der Proben möglich sein. Ein Vergleich von duodenalen und ilealen Biopsien bei Hunden mit IBD wies eine schlechte Übereinstimmung auf und macht somit deutlich, wie wichtig es ist, möglichst viele Lokalisationen zu bioptieren (CASAMIAN-SORROSAL et al., 2010) Die lympho-plasmazelluläre Enteritis (LPE) Die LPE ist die am häufigsten diagnostizierte Form der IBD. Meist sind Hunde mittleren Alters sowie ältere Tiere betroffen (VIBE-PETERSEN, 1991; JERGENS et al., 1992; GUILFORD, 1999; HALL und SIMPSON, 2000). Eine Geschlechtsprädisposition ist für den Deutschen Schäferhund bekannt (VAN DER GAAG und HAPPÉ, 1990). Die LPE zeichnet sich durch mukosale Entzündungszellinfiltrate, welche v.a. aus Lymphozyten und Plasmazellen bestehen, aus (VIBE-PETERSEN, 1991; JERGENS et al., 1992; GUILFORD, 1996; HALL und SIMPSON, 2000). Die LPE kann das Kolon und den Magen mitbetreffen (GUILFORD, 1996). Charakteristisch ist eine Zunahme von Lymphozyten und Plasmazellen in der Lamina propria. Die Entzündungszellinfiltrate reichen mitunter bis in die Zotten, wo sonst kaum Plasmazellen gefunden werden (GUILFORD, 1996). Die Verteilung der Entzündungszellen kann ungleichmäßig sein. So finden sich Areale mit deutlich erhöhtem und mit geringgradig erhöhtem Entzündungszellgehalt. Neutrophile Granulozyten, oft assoziiert mit mukosalen Erosionen oder Ulzerationen, und eine Zunahme von intraepithelialen Lymphozyten sind sichtbar (GUILFORD, 1996). Das Oberflächenepithel ist normal ausgebildet oder in schwerwiegenden

26 Literaturübersicht 20 Fällen ist eine Zottenatrophie oder Zottenfusion zu finden. Die Krypten können deformiert, hypertrophiert oder mit Mukus verstopft oder dilatiert sein. Gelegentlich können verstopfte und anschließend rupturierte Krypten aufgefunden werden. Reaktive Makrophagen und Riesenzellen können beobachtet werden. Außerdem treten ein Ödem der Lamina propria und geringgradig dilatierte Lymphgefäße auf. Die Tela submucosa zeigt keine Veränderungen (JACOBS et al., 1990; GUILFORD, 1996). Differentialdiagnostisch muß u.a. das maligne Lymphom in Betracht gezogen werden (GUILFORD, 1996; TAMS, 2003) Die lympho-plasmazelluläre Kolitis (LPK) Die chronische idiopathische Kolitis ist die häufigste Diagnose bei Dickdarmdiarrhöen (ROTH et al., 1990). Prädisponierte Rassen sind der Boxer und vermutlich der Deutsche Schäferhund. Junge bis mittelalte Hunde sind am häufigsten betroffen, aber auch Tiere unter zwei Jahren erkranken. Eine gleichzeitige lymphoplasmazytäre Entzündung des Dünndarms kann auftreten (JERGENS et al., 1992; GUILFORD, 1996). Klinisch findet sich eine erhöhte Frequenz des Absatzes von weichem Kot, Hämatochezie und/oder Tenesmus. Anorexie, Gewichtsverlust oder Erbrechen sind selten oder im Zusammenhang mit gleichzeitig auftretender Enteritis zu finden (JERGENS und WILLARD, 2000). Hunde mit LPK weisen eine erhöhte Anzahl an mukosalen IgA- und IgG-haltigen Zellen sowie CD3+ T-Zellen auf (JERGENS, 1999). Erhöhte Nitrit-Spiegel in der Kolon-Lavageflüssigkeit von Tieren mit LPK weisen auf eine Überproduktion von Stickoxid hin (GUNAWARDANA et al., 1997). Endoskopisch sind eine Hyperämie, eine Ödematisierung und eine Brüchigkeit der Darmwand charakteristisch. Mukusansammlungen, Erosionen und Blutungen können gefunden werden. Darüber hinaus kann der Dickdarm makroskopisch auch unverändert erscheinen (ROTH et al., 1990; GUILFORD, 1996). Die früheste histopathologische Veränderung ist eine Hyperplasie der Kryptzellen. Infiltrationen der Lamina propria mit Plasmazellen, Lymphozyten und geringgradig eosinophilen und neutrophilen Granulozyten sind sichtbar. Der Entzündungsprozess beschränkt sich auf die Mukosa, es kann jedoch eine Hyperplasie der submukosalen lymphoiden Einrichtungen beobachtet werden. In schweren Fällen findet sich eine ausgeprägte Infiltration mit neutrophilen Granulozyten. Die Kryptzellen können eine

27 Literaturübersicht 21 erhöhte Mitoserate aufweisen. Mit zunehmender Schwere der Erkrankung verschwinden die Becherzellen und es entsteht eine Degeneration des intestinalen Epithels. Es kann zu Desquamationen, Erosionen und Ulzerationen kommen. Auf epitheliale Erosionen folgt eine Einwanderung von neutrophilen Granulozyten. Bei einer anhaltenden Entzündung entsteht eine Fibrose in der Lamina propria, welche schließlich zur Deformation der Mukosa und zum Verlust der Kolondrüsen führt. Selten können auch Schleimhautstrikturen oder Granulome entstehen (ROTH et al., 1990; GUILFORD, 1996) Die eosinophile Gastroenteritis, Enteritis und Enterokolitis Die eosinophile Gastroenteritis (EGE) ist eine chronische, idiopathische Erkrankung, die den Magen und den Dünndarm betrifft und durch ein gemischtes, entzündliches Zellinfiltrat gekennzeichnet ist. Vorherrschend sind hierbei eosinophile Granulozyten. Je nach Beteiligung der Darmabschnitte treten eosinophile Enteritis, Gastroenteritis oder Enterokolitis auf (JOHNSON, 1992; GUILFORD, 1996). Insgesamt tritt die eosinophile Variante der IBD seltener auf als die LPE. Geschlechtsdispositionen sind nicht bekannt (GUILFORD, 1996). Häufig betroffene Rassen sind Deutsche Schäferhunde und Rottweiler (VAN DER GAAG und HAPPÉ, 1990). Die erkrankten Tiere sind im Mittel fünf Jahre alt oder jünger (VAN DER GAAG und HAPPÉ, 1990; GUILFORD, 1996). Klinisch finden sich, je nach Betroffenheit, die schon oben beschriebenen Symptome einer Enteritis oder Kolitis oder beides. Hämatemesis und Hämatochezie zeigen sich häufiger als bei den anderen Formen der IBD (JERGENS, 1999; GUILFORD, 1996). Bei einigen Hunden ist eine periphere Eosinophilie ist feststellbar (JERGENS, 1999). Die endoskopische Untersuchung kann ohne besonderen Befund verlaufen oder ähnliche Ergebnisse wie bei der oben beschriebenen LPK ergeben. Darüber hinaus kann der Magen Ulzera und verdickte, ödematisierte Rugae gastricae aufweisen (GUILFORD, 1996). Histologisch ist eine diffuse Infiltration der Lamina propria mit eosinophilen Granulozyten auffällig. Eine granulomatöse, eosinophile Entzündung ist ein seltener Befund bei Hunden mit eosinophiler Enterokolitis (JOHNSON, 1992; GUILFORD, 1996). Diverse weitere histopathologische Befunde beinhalten mukosale Ulzerationen, perivaskuläre Akkumulationen von eosinophilen Granulozyten, Fibrose und muskuläre

28 Literaturübersicht 22 Hypertrophie. Eosinophile Granulozyten stellen den diagnostisch vorherrschenden Entzündungszelltyp dar und sind im Vergleich zu gesunden Tieren eindeutig im Übermaß vorhanden. Das Infiltrat kann sich in die Submukosa und selten bis in die Tunica muscularis ausbreiten. Bei Hunden findet sich häufiger eine Beteiligung des Magens und seltener eine Beteiligung des Kolons (QUIGLEY und HENRY, 1981; GUILFORD, 1996). Differenzialdiagnostisch müssen bei der EGE parasitäre Infektionen, eine Futtermittelallergie oder auch Mastzelltumoren oder transmurale, granulomatöse Entzündungen in Betracht gezogen werden (GUILFORD, 1996) Die eosinophile granulomatöse Gastroenteritis Eine granulomatöse Entzündung ist ein seltener Befund bei Hunden mit EGE (JOHNSON, 1992). Gastrointestinale eosinophile Granulome finden sich im Ösophagus, im Magen, im Dünndarm und im Dickdarm. Der vorherrschende Entzündungszelltyp sind eosinophile Granulozyten. Die Abgrenzung zu gastrointestinalen Neoplasien ist teilweise schwierig (JOHNSON, 1992; GUILFORD, 1996). Die Erkrankung findet sich bei Hunden mittleren oder jüngeren Alters. Als übereinstimmender klinischer Befund wird häufig Erbrechen festgestellt. Eine periphere Eosinophilie kann vorkommen. Möglicherweise finden sich ultrasonografisch Umfangsvermehrungen im Magen oder Dünndarm oder gegebenenfalls zeigen sich endoskopisch fokale Verdickungen der Mukosa oder sogar Einengungen des Lumens (RODRIGUEZ et al., 1995; GUILFORD, 1996). Die eosinophilen Granulome können alle Schichten der Darmwand miteinbeziehen. Sie bestehen aus Makrophagen, Plasmazellen, Riesenzellen und eosinophilen Granulozyten. Letztere können diffus die Mukosa, die Tunica muscularis und Subserosa infiltrieren (VAN DER GAAG et al., 1987; JOHNSON, 1992). Des Weiteren finden sich Beschreibungen von eosinophilen Gastroenteritiden assoziiert mit viszeraler Larva migrans (HAYDEN und VAN KRUININGEN, 1973). Bei einem Husky wurde das Auftreten einer eosinophilen granulomatösen Gastroenteritis und Hepatitis beschrieben (BRELLOU et al. 2005). Als Differentialdiagnosen müssen Neoplasien, viszerale Larva migrans und weitere Ursachen für Granulome, wie Phykomykosis oder chronische Infektionen in Betracht gezogen werden (GUILFORD 1999).

29 Literaturübersicht Die histiozytäre ulzerative Kolitis des Boxers Die histiozytäre ulzerative Kolitis (HUK) wird hauptsächlich bei Boxer Hunden gesehen (VAN KRUININGEN, 1965; VAN DER GAAG, 1988). Diese schwer verlaufende Form der IBD betrifft vor allem junge Hunde unter vier Jahren (VAN KRUININGEN, 1965; VAN DER GAAG, 1888; GERMAN et al., 2000a). Selten erkranken Hunde anderer Rassen (VAN DER GAAG, 1988; STOKES et al., 2001). Betroffene Tiere zeigen Tenesmus und setzen in erhöhter Frequenz einen weichen, oft mit Blut gemischten Kot ab (VAN KRUININGEN, 1965). Histologisch finden sich initial Epithelzelldegenerationen, gefolgt von Entzündung, Nekrose und großflächigen Ulzerationen (VAN KRUININGEN, 1965). Die entzündete Lamina propria weist neutrophile Granulozyten und eine hochgradige Infiltration mit charakteristischen schaumigen, eosinophilen Makrophagen auf (VAN KRUININGEN, 1965; SANDER und LANGHAM, 1968). Die meisten Makrophagen weisen einen mit der Periodic acid Schiff-Reaktion (PAS-Reaktion) positiv darstellbaren, globulären Inhalt auf (VAN KRUININGEN, 1965; SANDER und LANGHAM, 1968). Es finden sich strukturelle Veränderungen der glandulären Architektur und die Zahl der Becherzellen ist reduziert (VAN KRUININGEN, 1965; SANDER und LANGHAM, 1968; GUILFORD, 1996). In fortgeschrittenen Läsionen ist kein Epithel mehr vorhanden und die freigelegte Tela submucosa wird von fibrinopurulentem Exsudat bedeckt. Sie kann durch granulomatöse Entzündungen, bestehend aus großen Mengen an schaumigen Makrophagen und begleitenden Lymphozyten, Plasmazellen und sich verflechtenden Kollagenfasern verdickt sein und bis zur Tunica muscularis reichen (VAN KRUININGEN et al., 1965; SANDER und LANGHAM, 1968; GUILFORD, 1996; GERMAN et al., 2000a). Bei fortschreitender Entzündung finden sich eine Beteiligung von Riesenzellen und Epitheloidzellen sowie eine transmurale Ausbreitung der Entzündung (GUILFORD, 1996). Da wenige Makrophagen Bakterien-ähnliche Strukturen aufwiesen, wurde eine bakterielle Ätiologie vermutet (VAN KRUININGEN et al., 1965). Mittels ultrastrukturellen Untersuchungen fanden sich in den Makrophagen und in phagozytischen Vakuolen und Phagosomen lipidund ribosomenreiche, kokkoide bis kokkobazilläre Organismen mit einer Zellmembran. Eine Anzucht war nicht erfolgreich (VAN KRUININGEN, 1975). Andere