!!! Zum Start des Versuches 1 benötigt jede Gruppe bereits am 24. Oktober 2016 folgende Ausgangsmaterialien:

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1 1!!! Zum Start des Versuches 1 benötigt jede Gruppe bereits am 24. Oktober 2016 folgende Ausgangsmaterialien: 1.1. LACTOBACILLEN Joghurt, Quark, Sauerkraut, Silage, saure Bohnen, Sauerteig, usw SCHWEFELBAKTERIEN (Thiobacillus) anaerobe (nach H 2 S stinkende) Sedimente aus Pfützen, Tümpeln..., Erdproben aus Mülldeponien, Klärschlamm, abgestandenes (stinkendes) Wasser aus Blumenvasen ACTINOMYCETEN fein gesiebte Gartenerde, Komposterde 1.4. MYXOBACTERIEN faulendes Pflanzenmaterial, Kot pflanzenfressender Tiere, Baumrinde RHODOSPIRILLEN Wasserproben aus verschlammten Gräben oder Teichen 1.6. FLOURESZIERENDE PSEUDOMONADEN Erde; Teich- oder Flußwasser 1.7. RHIZOBIEN Wurzeln mit Wurzelknöllchen von Alfalfa, Lupinen, rotem Klee oder anderen Leguminosen 1.8. HALOBAKTERIEN gesalzener Fisch; Meersalz BDELLOVIBRIO (bakteriell) verschmutztes Teich- oder Flußwasser; Erdproben

2 2 AP / VP Mikrobiologie I WS 16/17 Bernhard Henrich Inhalt 1. Anreicherung von Bakterien 1.1. Lactobacillen 1.2. Schwefelbakterien 1.3. Actinomyceten 1.4. Myxobacterien 1.5. Rhodospirillen 1.6. Fluoreszierende Pseudomonaden 1.7. Rhizobien 1.8. Halobacterien 1.9. Bdellovibrio 2. Wachstum von Bakterien 2.1. Wachstumskurve 2.2. Wachstum in Abhängigkeit von der C-Quelle 2.3. Vitaminbestimmung mittels Bakterienwachstum 3. Abtötung von Bakterien 3.1. I naktivierung durch Hitze 3.2. In aktivierung durch UV-Licht 4. Resistzenz gegen Antibiotika 4.1. Resistenz einer Subpopulation 4.2. Resistenz von E. coli aus menschlicher Stuhlprobe 5. Charakterisierung von Bakterien 5.1. Artbestimmung von Lactobacillen Morphologie Temperaturoptimum Fermentationstyp Vergärung von Zuckern Verschiedene Stoffwechselleistungen Bestimmung der Milchsäure-Konfiguration 5.2. Identifizierung von Enterobacteriaceae 5.3. Mikrobiologische Trinkwasseruntersuchung Gesamtkeimzahl E. coli und coliforme Keime Sulfitreduzierende sporenbildende Anaerobier Pseudomonas aeruginosa Enterokokken 6. Genübertragung bei Bakterien 6.1. Transformation bei Bacillus subtilis 6.2. Konjugation bei E. coli 7. Bakteriophagen 7.1. Isolierung von Coliphagen aus Abwasser 7.2. Herstellung von Lysaten 7.3. Phagen-Wirtsspezifität (Lysotypie) 7.4. Isolierung Phagen-resistenter Mutanten 7.5. Bestimmung der "burst size"

3 1. ANREICHERUNG VON BAKTERIEN Ziel: Bakterien unterschiedlicher taxonomischer Gruppen sollen durch Anwendung gezielter Strategien aus Nahrungsmitteln und natürlichen Ausgangsmaterialien angereichert und beschrieben werden LACTOBACILLEN Material: Joghurt, Quark, Sauerkraut, Silage, saure Bohnen, Sauerteig, usw. Medium : Rogosa-Acetat-Agar: MRS-Bouillon, (MRS-Agar): Pepton aus Casein 10 g Hefeextrakt 5 g Pepton 1 g D(+)Glucose 20 g Fleischextrakt 5 g KH 2 PO 4 6 g Hefeextrakt 5 g NH 4 Citrat 2 g D(+) Glucose 20 g Tween 80 1 g K 2 HPO 4 2 g Na Acetat 15 g Tween 80 1 g MgSO g (NH 4 ) 2 H Citrat 2 g FeSO g Na Acetat 5 g MnSO g MgSO g Agar 15 g MnSO g H 2 O ad 1 l (Agar 12 g) ph 5.5 mit Essigsäure einst. ph 6.5 NICHT autoklavieren!! autoklavieren A. Zutaten (außer Agar!) in 700 ml H 2 O lösen, ph einstellen,-> 60 C-Bad; B. Agar in 300 ml H 2 O schmelzen (100 C), auf 60 C abkühlen; -> A + B 0.9 % NaCl (in 4.5 ml Portionen) 1. Verdünnungsreihe des Ausgangsmaterials in 0.9% NaCl (10-er Stufen: jeweils 4.5 ml NaCl-Lösung ml Probe) anlegen (bis 10-6 ). 2. Von den Verdünnungsstufen 10-4, 10-5 und 10-6 jeweils 0.1 ml in zwei parallelen Ansätzen auf Rogosa-Acetat-Agar ausspateln; im Anaerobentopf bebrüten; Inkubation bei 30 C (ca. 5 Tage) bzw. 37 C (ca. 3 Tage), je nachdem, ob Strepto- oder Thermobakterien erwartet werden. 3. Kolonien auf den Platten der verschiedenen Verdünnungsstufen zählen! Etwa 10, möglichst verschiedenartig aussehende Kolonien phasenkontrastmikroskopisch untersuchen: Kolonien mit der Impföse abheben und in je 0.1 ml steriler 0.9% NaCl-Lösung verreiben; ein kleiner Tropfen der Suspension wird mikroskopiert. 4. Suspensionen, deren Zellen stäbchenförmige Morphologie zeigen, werden mit je 5 ml MRS- Bouillon vermischt und bei 30 bzw. 37 C bebrütet. 5. Bakterien in den Kulturen erneut mikroskopisch auf Stäbchenform kontrollieren. Von 3 Proben Verdünnungsreihen anlegen (bis 10-7 ); je 0.1 ml der 10-5, 10-6 und 10-7 Verdünnungen auf MRS-Agar ausspateln und entsprechend bebrüten.

4 6. Von jeder Probe je 2 Einzelkolonien in je 5 ml MRS-Bouillon impfen und bebrüten; Einheitlichkeit der Kulturen mikroskopisch kontrollieren. (DIESE KULTUREN WERDEN AUCH IN DEN VERSUCHEN GEBRAUCHT!) 7. Stichkulturen in MRS-Agar anlegen, bebrüten, bei 4 C aufbewahren. 1. Anreicherungsstrategie erklären; 2. Gesamt-Keimzahl/ml ermitteln; 3. Beschreibung der 3 konservierten Isolate: Ausgangsmaterial; Bebrütungstemperatur; Koloniemorphologie; Zellform. Die isolierten Lactobacillen sollen in Abschnitt 5. näher charakterisiert werden SCHWEFELBAKTERIEN (Thiobacillus) Material: anaerobe (nach H 2 S stinkende) Sedimente aus Pfützen, Tümpeln..., Erdproben aus Mülldeponien, Klärschlamm, abgestandenes (stinkendes) Wasser aus Blumenvasen... Medium: Thio-Medium Metall-Lösung Na 2 S x 5H 2 O 10.0 g EDTA 50.0 g KH 2 PO g ZnSO 4 x 7H 2 O 22.0 g K 2 HPO g CaCl g MgSO 4 x 7H 2 O 0.8 g MnCl 2 x 4H 2 O 5.06 g NH 4 Cl 0.4 g FeSO 4 x 7H 2 O 4.99 g Metall-Lösung 10.0 ml (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 x 4H g H 2 O ad 1 l CuSO 4 x 5H 2 O 1.57 g 15 min bei 121 C autoklav. CoCl 2 x 6H 2 O 1.61 g ph 3.8 mit H 2 SO 4 einst. H 2 O ad 1 l ACHTUNG! alles getrennt (in kleinen Reagenzgläsern) abwiegen und in kleinen Volumina H 2 O lösen (EDTA zum Lösen mit NaOH konz. bis ca. ph 8.0 titrieren). Erst dann: alles zusammenkippen, mit H 2 O auf ca. 800 ml auffüllen, ph 6.0 mit KOH einstellen. Thio-Agar: Thio-Medium mit 15g Agar/l; ph 3.8 nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf C mit H 2 SO 4 einstellen (ACHTUNG! der ph-wert muß unbedingt stimmen!) ml Medium (in einem 100 ml Kolben) mit ca. 1 g Probenmaterial versetzen. 2. Über einen Zeitraum von 1 bis 2 Wochen in Abständen von 1 bis 2 Tagen Proben (2 ml) entnehmen, a) ph-wert messen b) Bakterien im Mikroskop (Phako) anschauen 3. Bei deutlicher ph-absenkung und Trübung: Verdünnungsaustriche auf Thio-Agarplatten. Bei Raumtemperatur bebrüten.

5 5 1. Anreicherungsstrategie erklären; 2. graphische Darstellung des ph-wertes (und ev. der Trübung der Kultur in Abhängigkeit von der Inkubationszeit; 3. Beschreibung der Zellmorphologie; 1.3. ACTINOMYCETEN Material: fein gesiebte Gartenerde, Komposterde Medien: Jensen Agar: Soja Nährboden: Glucose 2 g Pepton aus Caseinpepton 0.2 g Sojamehl 20 g KH 2 PO g Mannit 20 g MgSO 4 x 7 H 2 O 0.2 g Agar 18 g Spurenelementlsg. 5 ml Leitungswasser ad 1 l Agar 15 g H 2 O ad 1 l ph 6.8, autoklavieren ph , autoklavieren Nach dem Abkühlen auf ca.50 C Nystatin (= "Moronal", Fungistaticum) zugeben (300 E/ml) und sofort Platten gießen. Spurenelementlösung: 5 g möglichst stark mineralisierte Erde in 100 ml H 2 O kochen; zentrifugieren (5 min, 10 rpm); filtrieren; autoklavieren Ziel: Isolierung aerober Streptomyceten. Da Streptomyceten keine Einzelzellen bilden, werden Reinkulturen durch Vereinzelung und Auskeimen von Sporen angelegt g Probenmaterial in 100 ml Leitungswasser aufschwemmen; in Erlenmeyerkolben ca. 45 min schütteln; ein Teil der Suspension 1:10 mit H 2 O verdünnen. 2. Je 0,2 ml der unverdünnten und der 1:10 verdünnten Suspensionen mit je 10 ml Phenollösung (1 g Phenol / 140 ml H 2 O) vermischen; 15 min stehen lassen. 3. Je 0,2 ml der phenolbehandelten Suspensionen in 2 Petrischalen geben; je 20 ml geschmolzenen und auf 47 C abgekühlten Jensen Agar (mit Nystatin) zugeben; gut vermischen durch kreisende Bewegungen der Petrischalen (Das Benetzen von Schalenrand und Schalendeckel mit Agar ist zu vermeiden!); bei 28 C inkubieren; 4. Etwa zwischen dem 7. und dem 15. Tag nach Ausplattierung Sporen aus dem Luftmycel von mindestens 4 möglichst unterschiedlich aussehenden Kolonien vorsichtig mit der sterilen Impföse abtupfen; in Sektoren von Soja-Nährbodenplatten ausstreichen; bei Raumtemperatur inkubieren. 1. Anreicherungsstrategie erklären; 2. Entwicklung und Aussehen der Kolonien und des Mycels während der Inkubationszeit in Abständen von 2 bis 3 Tagen beobachten und dokumentieren.

6 MYXOBACTERIEN Material: faulendes Pflanzenmaterial, Kot pflanzenfressender Tiere, Baumrinde; Medien: Wasseragar: 20 g Agar / l H 2 O; ph 7.0 einstellen; autoklavieren; + Nystatin (30µg/ml) (Nystatin erst nach Erkalten des Agars auf C zugeben!) Futterbakterien: 24-stündige Kulturen von E. coli auf LB-Agarplatten E. coli-agar: gefriergetrocknete E. coli Zellen 1 g MgSO 4 x 7H 2 O 0.5 g CaCl 2 x 2H 2 O 0.5 g Agar 15.0 g H 2 0 ad 1 l 1. Auf 4 Wasseragarplatten jeweils einen DICKEN (!) Schmier ( ca. 1 x 4 cm) aus Futterbakterien aufbringen. Darauf KLEINE (!) Krümel aus Erde oder Baumrinde legen. 2. Platten bei 27 C in einer "feuchten Kammer" inkubieren; nach Tagen sollten schwärmende Zellen (Mikroskop), später (1...3 Wochen) Fruchtkörper sichtbar sein. 3. schwärmende Zellen oder Fruchtkörper baldmöglichst und möglichst weit vom Bakterienschmier entfernt abimpfen (z.b. mit ausgezogener Kapillare) und auf E. coli-agar ausstreichen; Platten bei Raumtemperatur inkubieren. 4. Mikroskopische Untersuchung der Myxobakterien. 1. Anreicherungsstrategie erklären; 2. Morphologische Beschreibung der isolierten Myxobacterien; 1.5. RHODOSPIRILLEN Material: Wasserproben aus verschlammten Gräben oder Teichen Medium: Rhodospirillen-Nährlösung: LÖSUNG A: LÖSUNG B: DL-Äpfelsäure 3.75 g K 2 HPO g NH 4 Cl 1.8 g KH 2 PO g MgSO 4 x 7H 2 O 0.3 g H 2 O ad 0.15 l CaCl g autoklavieren Hefeextrakt 0.75 g 1/25 Spurenelemente 12.0 ml Spurenelemente (vor Gebrauch 1:25 verdünnen!!) H 2 O ad 1350 ml Borsäure 2.86 g ph 6.8 mit 20% NaOH; ZnSO g autoklavieren MnCl g CuSO g Na 2 MoO 4 x 2H 2 O 0.04 g CoCl g H 2 O ad 1 l

7 7 Nach dem Autoklavieren Lösungen A und B zusammengeben und in sterile Schraubdeckelflaschen abfüllen Nähr-Agar: Agar 17 g ; H 2 O ad 500 ml autoklavieren; noch heißen Agar zu 500 ml steriler, warmer, doppelt konzentrierter Nährlösung I (s.o.) geben; gut mischen; vor dem Gießen auf 50 C abkühlen; ml Schraubdeckelflaschen mit 90 ml Rhodospirillen-Nährlösung füllen, 5 ml einer Wasserprobe zugeben und gut mischen; Flaschen mit Nährlösung bis zum Rand füllen und Deckel luftblasenfrei aufsetzen; Flaschen 2 bis 3 Wochen im Dauerlicht bei ca. 30 C bebrüten. 2. Von gut bewachsenen Kulturen Verdünnungsreihen mit steriler 0.9%iger NaCl-Lösung herstellen (bis 10-4 ); von den Verdünnungsstufen 10-2, 10-3 und 10-4 je 0.1 ml auf Nähragarplatten ausspateln; im Anaerobiertopf bei 30 C im Dauerlicht inkubieren. 1. Anreicherungsstrategie erklären; 2. Titerbestimmung der Photosynthetiker und Nicht-Photosynthetiker in der Flüssigkultur; 3. Beschreibung der Kolonieform und Farbe und der Zellmorphologie der isolierten photosynthetischen Bakterien; 1.6. FLOURESZIERENDE PSEUDOMONADEN Material: Erde; Teich- oder Flußwasser Medien: Succinate-Salts Medium Succinate-Salts Platten KNO g Succinate-Salts Medium K 2 HPO g + 15 g/l Agar MgSO 4 x 7 H 2 O 0.2 g CaCl 2 x 2 H 2 O 0.1 g FeSO 4 x 7 H 2 O 0.2 g Na-Succinat 4.0 g H 2 O ad 1 l ph 7.0; autoklavieren (Im Medium bildet sich ein leichter Niederschlag, der aber nicht stört) 1. 3 ml Succinate-Salts Medium mit 0.1 g Erde bzw. 0.1 ml Wasserprobe beimpfen; bei 30 C schütteln ml der bewachsenen Kultur in 3 ml frisches Succinate-Salts Medium überimpfen; bei 30 C schütteln 3. Verdünnungsausstrich auf Succinate-Salts Platten; bei 30 C inkubieren 1. Anreicherungsstrategie erklären; 2. Beschreibung der Kolonie- und Zellmorphologie.

8 RHIZOBIEN Material: Wurzeln mit Wurzelknöllchen von Alfalfa, Lupinen, rotem Klee oder anderen Leguminosen Medium: Hefeextrakt-Mannitol-Agar Spurenelementlösung Hefeextrakt 1.5 g trockene Erde g Mannitol 15.0 g Na 2 CO g Agar 22.5 g H ml Spurenelementlösung ml autoklavieren (1h), zentr. (5 min 10 Krpm), H 2 O ad 1.5 l filtrieren; ph 7.2 einstellen. ph 7.0 einstellen; autoklavieren. 1. Kurzes Wurzelstück mit einem Wurzelknöllchen ausschneiden; unter fließendem Wasser mit Bürste sorgfältig waschen; 3 min in eine sauere HgCl2-Lösung (0.1% HgCl2, O.2% HCl) legen und leicht bewegen (sterile Pinzette!); 5 min in 75% EtOH baden; mindestens fünfmal in sterilem H2O waschen. 2. Sechs sterile Petrischalen mit jeweils 1 ml sterilem H2O vorbereiten; Wurzelknöllchen in die erste Schale legen und mit steriler Pinzette aufbrechen; Inhalt mit dem H2O vermischen; 100 µl der Suspension zu dem sterilen H2O in der 2. Petrischale geben (automatische Pipette); mischen; Suspension kontinuierlich in den verbleibenden 4 Petrischalen weiterverdünnen. 3. Zu jeder der 6 Verdünnungen ca. 20 ml geschmolzenen und auf 45 C abgekühlten Hefeextrakt- Mannitol-Agar zugeben; mischen; bei Zimmertemperatur inkubieren; 4. Von Einzelkolonien Verdünnungsausstriche auf Hefeextrakt-Mannitol-Agar anlegen; bei Zimmertemperatur bebrüten. 1. Anreicherungsstrategie erklären; 2. Abschätzung der Gesamtbakterienzahl in einem Wurzelknöllchen; 3. Beschreibung der Zell- und Koloniemorphologie der isolierten Rhizobien HALOBAKTERIEN Material: gesalzener Fisch; Meersalz... Medium: Halobacterien-Medium Halophilen-Agar Caseinhydrolysat 7.5 g Halophilen-Medium Hefeextrakt 10.0 g + 20 g/l Agar; Tri-Natriumcitrat 3.0 g erhitzen bis Agar geschmolzen Kcl 2.0 g (VORSICHT, kocht schnell über!!) MgSO 4 x 7H 2 O 20.0 g FeSO 4 x 7H 2 O 0.05 g MnSO 4 x H 2 O 0.2 mg NaCl g H 2 O ad 1 l ph 7.4 mit konz. NaOH einstellen; NICHT autoklavieren!!!

9 ml Halophilen-Medium mit Probenmaterial infizieren; bei 37 C schütteln; 2. Verdünnungsausstrich auf Halophilen-Agar; 3 bis 4 Tage bei 37 C bebrüten (Platten in Plastiksäcke einpacken, um Austrocknung zu verhindern) 1. Anreicherunsstrategie erklären; 2. Beschreibung der Kolonie- und Zellmorphologie isolierter Halobakterien 1.9. BDELLOVIBRIO Material: (bakteriell) verschmutztes Teich- oder Flußwasser; Erdproben Medien: CaCO 3 -Platten: Hefeextrakt 10.0 g Glucose 20.0 g CaCO g Agar 15.0 g H 2 O ad 1 l Tris-YP-Medium: Hefextrakt 3.0 g Pepton 0.6 g 50 mm Tris-HCl, ph 7.5 ad 1 l Tris-YP-Weichagar: Tris-YP-Agar: Tris-YP-Medium + 0.6% Agar Tris-YP-Medium + 1.2% Agar Futterbakterien: Bakterienrasen von Pseudomonas putida auf CaCO 3 -Platten, abgeschwemmt in je 5 ml Tris-YP-Medium. für Wasserproben: ml und 1.0 ml Probe *) mit je 5 ml geschmolzenem und auf ca. 45 C abgekühltem Tris-YP- Weichagar und je 0.5 ml Futterbakterien (Pseudomonas) vermischen; auf Tris-YP-Agarplatten (möglichst auf 37 C vorgewärmt) auskippen. für Bodenproben: g Erde mit 10 ml Leitungswasser 20 min schütteln; Suspension 1:10 mit Wasser verdünnen *) ; davon 1 ml mit 5 ml geschmolzenem und auf ca. 45 C abgekühltem Tris-YP-Weichagar und 0.5 ml Futterbakterien (Pseudomonas) vermischen; auf Tris-YP-Agarplatten (möglichst auf 37 C vorgewärmt) auskippen. max. 6 Tage bei 30 C inkubieren. *) Um Kontaminationen durch andere Bakterien und Pilze zu vermeiden, können die Proben durch 0.45 µm-filter filtriert werden.

10 2. Plaques, die innerhalb der ersten 24 h sichtbar werden, rühren mit großer Wahrscheinlichkeit von Bakteriophagen; sie werden markiert, um eine Verwechslung mit Bdellovibrio-Plaques, die frühestens nach 2 Tagen zu sehen sind, zu vermeiden. (Im Gegensatz zu Phagen-Plaques nehmen Bdellovibrio-Plaques außerdem bei fortdauernder Inkubation stetig an Größe zu.) 3. Bdellovibrio mit der Impföse vom Rand der Plaques entnehmen (ausstechen) und in je 0.7 ml Tris- YP-Medium suspendieren (ca. 2 h schütteln); 10-1 und Verdünnungen in Tris-YP-Medium herstellen; je 0,1 ml der unverdünnten Suspension und derverdünnungen mit je 0.5 ml ausplattieren (s. Punkt 1.); bebrüten. Zusätzlich: 0.5 ml Futterbakterien mit 5 ml geschmolzenem (auf ca. 45 C abgekühltem) Tris- YP-Weichagar auf einer Tris-YP-Platte ausplattieren; nach Erkalten des Weichagars 15 µl der unverdünnten Bdellovibrio-Suspension auftropfen; eintrocknen lassen; bebrüten. 4. Einzelplaques in Tris-YP-Medium verreiben und phasenkontrastmikroskopisch auf die Gegenwart von dünnen, hochbeweglichen Vibrios untersuchen. 1. Anreicherungsstrategie erklären; 2. Bestimmung der Zahl der Bdellovibrio-Zellen in einem Plaque 3. Beschreibung der Zellmorphologie der isolierten Vibrios WACHSTUM VON BAKTERIEN 2.1. WACHSTUMSKURVE Ziel: Das Wachstum von Bakterien soll mittels verschiedener Methoden verfolgt werden. Stämme: Escherichia coli K-12 wt Escherichia coli B Escherichia coli JM109 Escherichia coli CSR603 Bacillus subtilis Medien: LB-Vollmedium: Pepton aus Fleisch 10.0 g Hefeextrakt 5.0 g NaCl 5.0 g (Agar 15.0 g) H 2 O ad 1 l autoklavieren 0.9% NaCl (in 4.5 ml Portionen ) zum Verdünnen Durchführung 1. 5 ml Vorkultur des zu verwendenden Bakterienstamms in LB Medium anlegen; über Nacht bei 37 C schütteln ml frisches, auf 37 C vorgewärmtes LB Medium in 1l Erlenmeyerkolben mit 1 ml (CSR ml!) der Übernachtkultur beimpfen; gut durchmischen; bei 37 C schütteln;

11 3. Zu den Zeiten t = 0, 30, 60, 90, 120,... min nach Beimpfung je 2 ml der Kultur STERIL entnehmen und SOFORT auf Eis stellen; (Messung bis die stationäre Phase erreicht ist oder mindestens 6 h) 4. In den entnommenen Proben a) O.D.600 durch Trübungsmessung, b) Geamtzellzahl mit Hilfe der Thoma-Kammer sowie c) Lebendkeimzahl durch Ausplattieren geeigneter Verdünnungen *) (0.1 ml) auf LB-Platten bestimmen. *) Die geeignete Verdünnungsstufe läßt sich abschätzen aus der Gesamtzellenzahl (Thoma-Kammer) mit dem Erfahrungswert, daß Kolonien pro Platte gut auswertbar sind. 1. Wachstumskurven (mit Bezeichnung der einzelnen Wachstumsphasen) durch Auftragen der O.D.600-Werte (a), der Gesamtzellenzahl (b) und der Lebendkeimzahlen (c) gegen die Zeit erstellen. (Bei der Auftragung soll auf der X-Achse der Maßstab 30 min = 1cm gewählt werden.) 2. Bestimmung der Generatiomszeit g aus der Steigung µ der linearen Kurvenabschnitte der O.D.- Kurve; µ = lnx - lnx 0 /t - t 0 ; g = ln2/µ; 3. Graphische Darstellung der Beziehung zwischen O.D.600 und Lebendkeimzahl; WACHSTUM IN ABHÄNGIGKEIT VON DER C-QUELLE Ziel: Die Verwertung verschiedener Zucker als Kohlenstoff-Quelle soll untersucht werden. Stämme: E. coli K-12 Wildtyp (Lac + und Sorb + Marker überprüfen!!) Medien: E-Minimalmedium: K 2 HPO g KH 2 PO g (NH 4 ) 2 SO g MgSO 4 x 7H 2 O 0.2 g FeCl 3 x 6H 2 O 2.7 mg H 2 O ad ml nach dem Autoklavieren: + 20 ml 40% Glucose (steril!) E-Minimalmedium OHNE Glucose Zuckerlösungen: Glucose, 0.02 g/ml Lactose, 0.1 g/ml Sorbit, 0.1 g/ml autoklavieren! ml Vorkultur des zu verwendenden Bakterienstammes in E-Minimalmedium + 0.8% Glucose anlegen; über Nacht bei 37 C schütteln; Bakterien einmal mit 40 ml E-Minimal-medium OHNE

12 Glucose waschen (Ja20 -Zenrifugenröhrchen); in 30 ml E-Minimalmedium OHNE Glucose resuspendieren (alle Gruppen gemeinsam) ml frisches, auf 37 C vorgewärmtes E-Minimalmedium OHNE Glucose (in 300 ml Erlenmeyerkolben) mit Zuckerlösungen (Glucose + Lactose bzw. Glucose + Sorbit) *) versetzen und mit 3 ml der gewaschenen Bakteriensuspension beimpfen; gut durchmischen, bei 37 C schütteln; 3. nach der Beimpfung in Intervallen von (höchstens) 20 min Proben (ca. 1 ml) entnehmen und O.D.600 messen (Kürzere Meßintervalle ergeben genauere Kurven). Entnahmezeiten und O.D.- Werte notieren. Messungen so lange fortsetzten, bis die zweite stationäre Phase erreicht ist! 12 *) Gruppe Glucose ml (20 mg/ml) Lactose ml (100 mg/ml) Sorbit ml (100 mg/ml) Halblogarithmische Darstellung der Wachstumskurven und Interpretation. (Bei der Auftragung soll auf der X-Achse der Maßstab 20 min = 1 cm gewählt werden.) 2.3. VITAMINBESTIMMUNG MITTELS BAKTERIENWACHSTUM Ziel: Bestimmung des Nicotinsäure-Gehaltes in Bier durch Messung des Wachstums und der Milchsäure-Produktion von Lactobacillus. Stamm: Lactobacillus plantarum Material: 1:50-1:200 verdünntes Bier (Bischoff Pils); (Bier vor dem Verdünnen entgasen!) Medien: Niacin-assay-medium (Difco) Nicotinsäure-Stammlösung: 10 µg/ml Nicotinsäure-Standard: Stammlösung 1:100 verdünnen (Endkonz. 0.1 µg/ml) Salzlösung: NaCl 5.0 g MgSO 4 x 7 H 2 O 0.12 g H 2 O ad 1 l autoklavieren Bromthymolblau: 0.1 g in 250 ml EtOH 1. Lactobacillus plantarum in 5 ml Niacin-Assaymedium (in kleinen Reagenzgläsern), supplementiert mit 50 µl Nicotinsäure-Stammlösung (Endkonz. 0.1 µg/ml), 24h bei 37 C anziehen

13 2. Zellen abzentrifugieren (Ja21-Röhrchen, 5 min, 8000 Upm); 2 x in je 5 ml Salzlösung waschen; in 5 ml Salzlösung suspendieren; 1:1000 verdünnen (d.h. 0.1 ml Zellsuspension ml Salzlösung); 3. Folgende Testreihen in doppelter Ausführung ansetzen (Angaben in ml): I Eichkurve I I Analyse I Röhrchen Nr Niacin-assaymedium 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Nicotinsäure- Standard H 2 O (ml) 2,5 2,5 2,35 2,2 2,0 1,75 1,5 1,25 2,25 2,0 1,5 1,0 - Probelösung (ml) ,25 0,5 1,0 1,5 2,5 Röhrchen autoklavieren (nur 10 min!); Jedes Röhrchen außer Nr.0 mit 0,1 ml der verdünnten Bakteriensuspension (s. 2.) beimpfen; h bei 37 C inkubieren; 5. Trübung bei 600 nm gegen Röhrchen Nr.0 (Nullwert) messen; 6. Weitere 3 Tage bei 30 C bebrüten; 7. Menge der gebildeten Milchsäure mit 0.1 N NaOH gegen Bromthymolblau (0.1 ml Bromthymolblau-Lösung zu 2.5 ml Kultur) bis zum Umschlag von gelb nach grün titrieren. 1. Erstellung zweier Eichkurven durch Auftragung der O.D.600-Werte bzw. der verbrauchten NaOH in ml gegen die eingesetzten Nicotinsäurekonzentrationen. 2. Bestimmung der Nicotinsäurekonzentration in der zu analysierenden Probe anhand der Eichkurven. Es sollten alle Werte, die sich aus der Auswertung der Röhrchen Nr.8 bis 12 ergeben, angegeben werden, sofern sie innerhalb der linearen Bereiche der Eichkurven liegen. 3. ABTÖTUNG VON BAKTERIEN Ziel: Erstellung der Abtötungskinetiken von Bakterien bei Einwirkung von Hitze oder UV- Licht INAKTIVIERUNG DURCH HITZE Stämme: Bacillus subtilis, Escherichia coli

14 14 Medien: LB-Medium, LB-Agar (s.2.1.) neutrale Kochsalzlösung: 0.9% NaCl 1. Übernachtkultur des zu testenden Stammes in 10 ml LB-Medium (2 Röhrchen à 5 ml) anlegen; 2. O.D.600 messen; Zelldichte (Zellen/ml) (a) anhand der in Versuch 2.1. erstellten Kurven und (b) mit Hilfe der Zählkammer ermitteln. Zellen abzentrifugieren (Ja20-Röhrchen, 5 min, 8000 Upm), 1x mit 10 ml 0.9% NaCl-Lösung waschen; in 0.9% NaCl-Lösung zu einer Zelldichte von ~ 1 x 10 9 (für E. coli) bzw. ~1 x 10 8 (für B. subtilis) suspendieren. 3. Titer der Zellsuspensionen durch Ausplattieren geeigneter Verdünnungen auf LB Agar überprüfen. 4. Jeweils 3 Reagenzgläser mit je 9 ml Kochsalzlösung beschicken; 3 Wasserbäder auf 48, 54 bzw. 57 C vorheizen. 5. Ein Glas mit Kochsalzlösung 5 min im 48 C Bad vorwärmen; mit 1 ml der gewaschenen Bakterienkultur beimpfen; nach 2, 5, 10, 20, 40 min Proben von jeweils 1 ml entnehmen, in Zehnerschritten mit 0.9% NaCl verdünnen (s. untenstehendes Schema) und Keimzahl der Überlebenden durch Ausplattieren auf LB-Agarplatten bestimmen. 6. Entsprechend (wie unter 5. beschrieben) wird bei 54 und 57 C verfahren. jeweils 0.1 ml der folgenden Verdünnungen ausplattieren: E.coli in 0.9% NaCl Temp Zeit 2 min 10-4,-5, ,-5, ,-4,-5 5 min 10-4,-5, ,-4, ,-3,-4 10 min 10-4,-5, ,-3, ,-1,-2 20 min 10-3,-4, ,-2, ,-1 40 min 10-3,-4, ,-1, ,-1 B. subtilis in 0.9% NaCl Temp Zeit 2 min 10-3,-4, ,-2, ,-1,-2 5 min 10-3,-4, ,-2, ,-1,-2 10 min 10-2,-3, ,-1, ,-1 20 min 10-1,-2, , ,-1 40 min 10 0,-1, , ,-1

15 15 1. Bestimmung des tatsächlichen Titers der verwendeten Zellsuspensionen; 2. Keimzahlen der Überlebenden für jede Temperatur und jeden Stamm logarithmisch über die Zeit auftragen; Inaktivierungsraten bestimmen; 3.2. INAKTIVIERUNG DURCH UV-LICHT Stämme: 1. E. coli K-12 wt 2. E. coli JM109 (reca) 3. E. coli CSR603 (uvra, reca) (200-ml Übernachtkulturen in 1l-Kolben) Medien: LB-Agarplatten 0.9 % NaCl-Lösung sterile Ja20- und Ja21-Becher (zum eventuellen Konzentrieren der Kulturen) 1. O.D.600 der ausgegebenen Übernachtkulturen (je 200 ml in 1l- Kolben) messen. Anhand der in Versuch 2.1. erstellten Kurven die Lebendkeimzahlen ermitteln. 2. Titer der Kulturen durch Ausplattieren geeigneter Verdünnungen auf LB-Agar überprüfen. (Jede Gruppe titriert jeden der drei Stämme!) 3. Von den Kulturen werden Verdünnungen in 0.9% NaCl hergestellt, die es erlauben, in je 0.1 ml die in der Tabelle angegebenen Zellzahlen auf eine LB-Agarplatte zu bringen. (ACHTUNG: Verdünnungen auf EIS herstellen!). Falls die Zelldichten in den ausgegebenen Übernachtkulturen zu niedrig sind, werden die gewünschten Zellkonzentrationen (s. Tabelle) durch Abzentrifugieren größerer Kulturvolumina und Resuspension der Bakterien in sterilem LB Medium eingestellt. 4. Entsprechende Verdünnungnen (0.1 ml) jeweils in doppelter Ausführung auf LB-Platten ausspateln; Platten 5 min trocknen lassen (vor der anschließenden Bestrahlung dürfen die Bakterien nicht wachsen. Platten, die nicht sofort bestrahlt werden können, sollten daher im Kühlschrank aufbewahrt werden). 5. Platten für die in der Tabelle angegebenen Zeiten aus den angegebenen Abständen bei 254 nm bestrahlen; bei 37 C über Nacht IM DUNKELN bebrüten; 6. Kolonien auszählen. Verdünnungen, Bestrahlungszeiten und Abstände: Bestrahlungszeit 30'' 90'' 180'' 300'' Stamm: E.coli K-12 Abstand: 41 cm Bakterienzahl / Platte 2x10 2 5x10 2 1x10 3 1x10 5 Stamm: E.coli JM109 Abstand: 82 cm Bakterienzahl / Platte 1x10 3 2x10 3 3x10 4 1x10 5 Bestrahlungszeit 7'' 15'' 30'' 60''

16 16 Stamm: E.coli CSR603 Abstand: 164 cm Bakterienzahl / Platte 3x10 4 1x10 5 5x10 5 5x Bestimmung des tatsächlichen Titers der verwendeten Kulturen; 2. Prozentsatz der überlebenden Zellen (= N t x 100/N o ) halblogarithmisch gegen die Bestrahlungsdauer auftragen; 3. Wie lange müßten die einzelnen Stämme bestrahlt werden, um die Lebendkeimzahl um den Faktor 10 6 zu reduzieren (d.h. N t /N o = 10-6 )? 4. RESISTENZ GEGEN ANTIBIOTIKA 4.1. RESISTENZ EINER SUBPOPULATION Ziel: Ermittlung des Anteils der Streptomycin-resistenten Subpopulation in einer Bakterienkultur. Stämme: Übernachtkulturen Streptomycin-sensitiver Stämme von Escherichia coli und Staphylococcus aureus Medien: LB-Agar; LB-Medium Streptomycin-Stammlösungen: 2 mg/ml in H 2 O 0,6 mg/ml in H 2 O Prinzip: Streptomycin wird in 5 Konzentrationen getestet; eine Kontrolle ohne Antibiotikum wird mitgeführt. Verschiedene Bakterienverdünnungen werden in Gegenwart der einzelnen Streptomycin- Konzentrationen ausplattiert. 1. Herstellung der Streptomycin-Verdünnungen: Ausgehend von der Streptomycin-Stammlösung mit sterilem H 2 O folgende Verdünnungen herstellen (es werden jeweils 2.5 ml der einzelnen Konzentrationen gebraucht): Konz. Nr. I II III IV V VI für E. coli mg/ml für S. aureus: mg/ml 2. Agar-Platten mit unterschiedlichen Streptomycin-Konzentrationen nach folgendem Verfahren gießen: Je 2 ml der einzelnen Streptomycin-Verdünnungen zu je 100 ml geschmolzenem und auf C abgekühltem LB-Agar geben, mischen, und jeweils 5 Platten gießen. Außerdem werden 5 Platten OHNE Streptomycin gegossen. Platten trocknen. 3. Übernachtkultur des Teststammes mit 0.9% NaCl in 10-er Schritten bis 10-8 verdünnen. 4. Jeweils 0.1 ml der Bakterien-Verdünnungen nach folgendem Schema auf den Streptomycinhaltigen Platten ausspateln:

17 17 Strep.Konz Nr. I II III IV V VI Bakterien verd. unverd. x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 5. Platten 1 bis 3 Tage bei 37 C bebrüten; Kolonien auszählen. 1. Bestimmung des Bakterientiters in den verwendeten Übernachtkultur durch Auszählen der Streptomycin-freien Platten (Verdünnungen berücksichtigen!); 2. Berechnung der tatsächlichen Antibiotika-Konzentrationen in den Platten; 3. Für jede Streptomycinkonzentration soll die Anzahl der resistenten Bakterien a) absolut (d.h. in Zellen/ml der Übernachtkultur) und b) als Prozentsatz der Gesamtpopulation ermittelt werden (graphische Darstellung!) RESISTENZ VON E. COLI AUS MENSCHLICHER STUHLPROBE Ziel: Untersuchung der Resistenz von E. coli aus eigener Stuhlprobe gegen gängige Antibiotika. Bakterien: aus eigener Stuhlprobe Kontrolle: E. coli K12-wt Medien: Endo-Agar: Pepton aus Fleisch 10.0 g K 2 HPO g Lactose 10.0 g Na-Sulfit 2.5 g Fuchsin 0.4 g Agar 12.5 g H 2 O ad 1 l LB-Agar, LB-Medium, LB-Weichagar, 0.9% NaCl-Lösung Antibiotika: Ampicillin (µg/ml): 100, 200 Kanamycin (µg/ml): 50, 100 Streptomycin (µg/ml): 100, 200 Tetrazyklin (µg/ml): 200, 400

18 1. Ausstrich einer eigenen Stuhlprobe mit abgebranntem Streichholz auf einer Endo-Agarplatte; 2-3 Tage bei 37 C bebrüten. (Als Kontrolle wird in jeder Gruppe mindestens einmal auch E. coli K-12 ausgestrichen und wie die Stuhlproben weiterbehandelt!) kräftig rote, metallisch glänzende Kolonien (E. coli) mit der Impföse abkratzen und in 3 ml LB-Medium vereinigen; gut suspendieren (Vortex); 5 h bei 37 C schütteln; 3. Kultur 1:50 mit 0.9% NaCl verdünnen; je 0.1 ml der unverdünnten Suspension und der Verdünnung mit 4 ml geschmolzenem und auf 45 C abgekühltem LB-Weichagar vermi-schen und auf zwei LB-Platten ausgießen. 4. Nach Erkalten des Agars je 2 Verdünnungen der zu testenten Antibiotika auf jede der beiden Platten auftropfen (ca.5 µl, automatische Pipette, sterile Spitzen); vorher Auftropf-Punkte markieren und beschriften!). Platten ca. 30 min stehen lassen bis die Antibiotikatropfen eingetrocknet sind; bei 37 C inkubieren. Tabellarische Darstellung der Ergebnisse aller Praktikumsteilnehmer CHARAKTERISIERUNG VON BAKTERIEN 5.1. ARTBESTIMMUNG VON LACTOBACILLEN Stämme: Jede Gruppe charakterisiert zwei Lactobacillus-Stämme, die in Versuch 1.1. isoliert wurden. Medium: MRS-Medium (s.1.1.) Morphologie Es werden die Flüssigkulturen aus Versuch 1.1., Punkt 6. verwendet. Phasenkontrastmikroskopie; Gramfärbung von Ausstrichpräparaten (bei der Gramfärbung sollten Kontrollorganismen, z.b. E. coli, gramnegativ, bzw. Bacillus, grampositiv, mitgefärbt werden!) Zellmorphologie und Färbeverhalten dokumentieren Temperaturoptimum 1. Zwei Serien von 7 Röhrchen mit jeweils 5 ml MRS Medium mit jedem der beiden Stämme (Kulturen aus Versuch 1.1., Punkt 6.) beimpfen (0.05 ml); in Brutschränken bzw. Wasserbädern bei 15, 20, 30, 37, 45, 50 bzw. 55 C maximal 15 h bebrüten; 2. Nach 15 h O.D.600 der Kulturen gegen MRS-Medium als Nullwert messen C- und 45 C-Röhrchen noch weitere 24 h bei den entsprechenden Temperaturen bebrüten; dann erneut O.D.600-Messung

19 1. Trübungswerte in Abhängigkeit von der Inkubationstemperatur graphisch auftragen; Bestimmung des Wachstumsoptimums; Korrelation zur Fermentationstemperatur des Ausgangsmaterials. 2. Handelt es sich bei den Isolaten um Strepto- oder Thermobakterien? Fermentationstyp Kulturen: Kulturen aus Versuch 1.1, Punkt 6. Medium : "Zuckermedium": MRS-Medium (s.1.1.) ohne Fleischextrakt und ohne Glucose % Chlorphenolrot (ACHTUNG: ph in MRS erst NACH Zugabe von Chlorphenolrot einstellen! + Durham-Gärröhrchen -> in 5 ml-portionen autoklavieren + 1 ml der zu testenden Zucker (5%ige Lösungen, autoklavieren) Zwei Röhrchen mit Zuckermedium inkl. Glucose mit je 0.05 ml der Kulturen aus 1.1. (Punkt 6.) beimpfen; 48 h bei 37 C bebrüten. Analyse der Diagnoseröhrchen: Trübung, Farbe, Gasbildung; Interpretation Vergärung von Zuckern Medium: "Zuckermedium" (s ) Zuckerlösungen (je 5%ig): Ausgehend von den beiden Lactobacillus-Kulturen aus Versuch 1.1. (Punkt 6.) jeweils eine Serie von Zuckermedien, die die zu testenden Zucker enthalten, beimpfen (je 0.05 ml); 48 h bei "optimaler" Temperatur (s ) bebrüten. Tabellarische Übersicht über die Zuckerspektren der beiden Iso-late. (Als positiv gelten nur eindeutig nach gelb umgeschlagene Kulturen. Im Zweifelsfall länger bebrüten oder Versuch wiederholen!) Verschiedene Stoffwechselleistungen Katalase Medien, Reagenzien und Durchführung > s. Methodenbuch Teil I, S. 46 u Nitratreduktion (Kulturen aus Versuch 1.1., Punkt 6. verwenden) mit je 0.05 ml beimpfen Arginin-Spaltung Kulturen: Vorkulturen aus

20 20 Medium : Argininmedium: Pepton 5 g Hefeextrakt 10 g K 2 HPO 4 2 g Glucose 0.5 g L-Arginin 3 g ph 7.0 H 2 O ad 1 l autoklavieren 1. Je 5 ml Argininmedium mit den beiden Isolaten ( aus 1.1., Punkt 6.) beimpfen (0.1 ml) und 48 h bei 30 C bebrüten; ml Kultur mit 0.5 ml Neßlers Reagenz (s. Methodenbuch, Teil I) vermischen; KONTROLLE: UNbeimpftes Argininmedium + Neßlers Reagenz (Gelbfärbung, aber Kein Niederschlag, da kein NH 3!) Positive Reaktionen (d.h. Spaltung von Arginin zu Citrullin und NH 3 ) liegt bei Bildung eines kräftigen gelben Niederschlages vor Bestimmung der Milchsäure-Konfiguration Zusammenhang zwischen ph-wert und Milchsäuregehalt der Kulturlösung 20 ml unbewachsenes MRS-Medium in einem kleinen Becherglas am ph-meter mit 10%iger Milchsäure bis zu einer Endkonzentration von 2% titrieren (d.h. es werden insgesamt 5 ml 10%ige Milchsäure zugegeben). Bei einer ph-abnahme um 0.1 Einheiten wird jeweils der Verbrauch an Milchsäure protokolliert. Graphische Darstellung des ph-wertes als Funktion der Milchsäurekonzentration (g/l) Optischer Milchsäuretest Prinzip: (a) Lactat + NAD + LDH Pyruvat + NADH + H + (b) Pyruvat + L-Glutamat GPT L-Alanin + -Ketoglutarat [Lactat] ~ [NADH] Reagenzien: Kommerzieller UV-Test zur Bestimmung von D- und L- Milchsäure (Boehringer Best-Nr ) SÄMTLICHE LÖSUNGEN BEI 4 C AUFBEWAHREN! Bestimmungsansatz: Wellenlänge: 340 nm Glasküvette: 1 cm Schichtdicke Temperatur : C Testvolumen: für D-Milchsäure 2.24 ml für L-Milchsäure 2.26 ml

21 21 Messung gegen Leerwert Milchsäuregehalt der Probelösung: 30 bis 350 µg/ml 1. 5 ml-kulturen der zu testenden Lactobacillus-Stämme in MRS-Medium anlegen; 24 h bei optimaler Temperatur bebrüten; 2. Zellen abzentrifugieren (10 min, 8000 rpm, Beckmann, Ja20); 3. Überstand abnehmen; ph messen; ungefähre Milchsäurekonzentration anhand der in erstellten Eichkurve bestimmen; 4. Gleiches Volumen eiskaler 1 N Perchlorsäure zusetzen; mischen; 10 min bei 5000 rpm zentrifugieren; 5. Überstand abnehmen; mit 2 N KOH neutralisieren; 20 min im Eisbad aufbewahren; 6. Ausgefallenes Kaliumperchlorat abzentrifugieren (10 min, 5000 rpm); der Überstand stellt die "Probe" für den optischen Test dar und muß ggf. durch Verdünnen mit H 2 O auf eine Milchsäurekonzentration von 20 bis 200 µg/ml eingestellt werden; 7. Es empfiehlt sich, zur Überprüfung der Arbeitstechnik zunächst Vorversuche mit den D- bzw. L- Lactat-Standards durchzuführen! 8. Optische Tests: Anleitung wird ausgegeben Ermittlung der Konzentrationen an D- bzw. L-Milchsäure in den untersuchten Kulturlösungen: Nach der allgemeinen Berechnungsformel für die Bestimmung der Konzentrationen gilt: V 1. MG c =. E [g/l]. d. V V 1 = Testvolumen [ml] V 2 = Probevolumen [ml] MG = Molekulargewicht der zu bestimmenden Substanz d = Schichtdicke [cm] = Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm = 6.3 [l. mmol -1. cm -1 ] Hg 365 nm = 3.4 [l. mmol -1. cm -1 ] Hg 334 nm = 6.18 [l. mmol -1. cm -1 ] Hieraus ergibt sich für D-Milchsäure: E c =. E = [g D-Milchsäure/l Probelösung] L-Milchsäure: E c =. E = [g L-Milchsäure/l Probelösung]

22 22 Ist bei der Probenvorbereitung eine Verdünnung vorgenommen worden, muß das Ergebnis noch mit dem Verdünnungsfaktor F multipliziert werden (beachte: Im Schritt 4. wurde die Probe mit Perchlorsäure vermischt!). Gesamtauswertung: Tabellarische Zusammenstellung aller über die Lactobacillen gesammelten Daten; Versuch der Bestimmung der beiden charakterisierten Stämme anhand der Tab. 1, 2 und IDENTIFIZIERUNG VON ENTEROBACTERIACEAE Ziel: Zwei Gemische aus je zwei Enterobacteriaceen-Gattungen sollen getrennt und die Gattungen bestimmt werden. Stämme: Flüssigkulturen in LB-Medium, die Mischungen aus je zwei Gattungen der Enterobacteriaceae enthalten. Medien: Brolacin-Agar (Merck Fertigmedium): Pepton aus Casein 4.0 g Universalpepton 4.0 g Fleischextrakt 3.0 g L-Cystein g Lactose 10.0 g Bromthymolblau 0.02 g Agar 12.0 g 33 g/liter H 2 O lösen, autoklavieren, Platten gießen. Auf Brolacin-Agar können Säurebildner und Nicht-Säurebildner differenziert werden: Aussehen der Kolonien Mikroorganismen groß, goldgeb, umgebendes E. coli, Lactose-positive Medium gelb Citrobacter u.a. groß, goldgelb, meist schleimig, umgebendes Medium gelb Enterobacter, Klebsiella, u.a. groß, farblos, umgebendes Proteus, Serratia, u.a. Medium blau Testmedien zur Bestimmung biochemischer und physiologischer Merkmale (genaue Zusammensetzung, Anwendung und Wirkungsweise der Medien s. Methodenbuch, Teil I) Das Wirkprinzip der gebräuchlichsten Testmedien ist in Tabelle 4 dargestellt. Endo-Agar (s. 4.2.) 1. Verdünnungsausstrich des Bakteriengemisches auf Brolacin-Agar; 24 h bei 37 C bebrüten; 2a. Falls das Wachstum auf Brolacin-Agar eine Differenzierung der beiden zu bestimmenden Gattungen erlaubt, können entsprechende Einzelkolonien zur Durchführung weiterer Tests abgeimpft werden; 2b. Falls Brolacin-Agar die beiden Gattungen nicht differenziert, muß eine genügend große Zahl (etwa 10) Einzelkolonien abgeimpft und einem (oder mehreren) physiologischen Tests unterzogen werden.

23 3. Als biochemische Raktionen, die oft am schnellsten zur Identifizierung von Enterobakterien führen, sind vor allem Indol-Bildung, H 2 S-Bildung, Methylrotprobe, Voges-Proskauer-Reaktion, Phenylalanin-Desaminierung, Malonat-Abbau und Harnstoffspaltung zu empfehlen. 1. Tabellarische Zusammenfassung der Testergebnisse; 2. Bestimmung der beiden Enterobacteriaceae-Gattungen anhand der untenstehenden Differenzierungstabelle 5 (Tab. 5); MIKROBIOLOGISCHE TRINKWASSERUNTERSUCHUNG Ziel: Verschiedene Wasserproben sollen gemäß der gesetzlichen Trinkwasserverordnung bakteriologisch untersucht werden. Material: Wasser aus Teichen, Flüssen, Bächen... oder aus dem Ablauf von Kläranlagen Gesamtkeimzahl Medium: Nähragar: Fleischextrakt 1 g Hefeextrakt 2 g Pepton 5 g NaCl 5 g Agar 15 g H 2 O ad 1 l ph 7.4, autoklavieren 1. Wasserproben mit sterilem H 2 O oder 0.9% NaCl in 10er Schritten bis 10-4 verdünnen; 2. Von den unverdünnten Proben und den Verdünnungen jeweils 1 ml in sterile Petrischalen pipettieren; 3. ca ml geschmolzenen und auf 55 C abgekühlten Nähragar pro Schale zugeben; zur Durchmischung Platten in Form einer 8 bewegen; 4. Platten 24 h bei 27 C bebrüten. Kolonien auszählen (Lupe!); Keimzahl pro ml untersuchten Wassers berechnen; E. coli und coliforme Keime Bei der Trinkwasseruntersuchung auf E. coli und coliforme Keime empfiehlt sich ein Vortest, da bei negativem Ausgang dieses einfachen Testes die aufwendige Hauptuntersuchung entfallen kann Vortest Medium: Lactose-Bouillon:

24 24 Pepton aus Fleisch 20 g NaCl 10 g Fleischextrakt 6 g Lactose 20 g Bromkresolpurpur 0.04 g H 2 O ad 1 l 1. Je 100 ml Lactose-Bouillon in sterilem Kolben mit je 100 ml der Wasserproben vermischen; bei 37 C bebrüten; nicht schütteln! 2. Kulturen nach ca. 20 und 44 h auf Trübung, und Umschlag der Farbe von purpur nach gelb prüfen. 3. Bei Trübung der Kulturen (nach ca. 20 h) Subkulturen in 5 ml Lactose-Bouillon (+ Durham Röhrchen) anlegen; bei 37 C bebrüten; auf Gasbildung prüfen; Zeigt die Kultur keine Lactosespaltung (kein Indikatorumschlag), so bedeutet das, daß sich in 100 ml des untersuchten Wassers weder E. coli noch coliforme Bakterien befinden: Das Wasser entspricht den gesetzlichen Anforderungen Hauptuntersuchung Material: bewachsene Lactose-Bouillon aus dem Vortest ( ) Medium : Endo-Agarplatten (s. 4.2.) 1. Verdünnungen der Kultur in Lactose-Bouillon (bzw. Verdünnungsausstrich) auf Endo-Agar ausplattieren; ca. 20 h bei 37 C inkubieren; 2. Feuchte rote oder metallisch rot glänzende Kolonien durch Verwendung geeigneter Testmedien zur Bestimmung biochemischer und physiologischer Merkmale (s. Methodenbuch, Teil I und Abschnitt 5.2.) in E. coli, Coliforme und Nicht-Coliforme differenzieren. Die relevanten Tests sind untenstehenden Tabellen zu entnehmen. (a) Test E. coli und Coliforme Nicht-Coliforme Endo-Agar feuchte rote oder metal- andere Kolonien lisch glänzende Kolonien Cytochromoxidase - + Lactose-Verwertung Gas- und Säurebildung keine Säurebildung (b) Test E. coli Coliforme Indolbildung + - Glucose-Verwertung Gas-und Säurebildung keine Säurebildung Citrat-Verwertung - +

25 Colititer Medien: Röhrchen mit je 10 ml Lactose-Bouillon (s ) und Durhamröhrchen 0.9% NaCl-Lösung 1. Wasserproben mit 0.9% NaCl-Lösung in 10er Schritten bis 10-4 verdünnen (s ); aus jeder Verdünnungsstufe und der unverdünnten Probe jeweils 3 Röhrchen mit Lactose-Bouillon beimpfen (je 1 ml Inokulat); 48h bei 37 C bebrüten; nicht schütteln! 2. Jedes Röhrchen auf Trübung, Gasbildung und Farbumschlag prüfen; Die Röhrchen mit der stärksten Verdünnung (d.h. mit dem kleinsten Animpfvolumen), welche noch positive Reaktionen (Trübung, Gasbil-dung, Farbumschlag) zeigen, erlauben die Angabe des Colititers in Zellen/ml Sulfitreduzierende sporenbildende Anaerobier (Clostridium perfringens) Medien: Sulfit-Glucose-Eisen-Agar: Fleischextrakt 3 g Pepton 10 g NaCl 5 g Glucose 20 g Agar 15 g in 18 ml-portionen H 2 O ad 1 l autoklavieren 10% Na 2 SO 3 -Lösung (steril) 8% FeSO 4 -Lösung (steril) 1. Je 100 ml der Wasserproben 20 min bei 70 bis 75 C inkubieren; schnell unter kaltem Wasser abkühlen; 2. Proben durch bakteriendichte Membranfilter (Porengröße 0.45 µm) filtrieren; 3. Filter STERIL, mit der Bakterienseite nach OBEN, in die DECKEL von Petrischalen legen (ACHTUNG: zwischen Filter und Deckel dürfen sich keine Luftblasen bilden!) 4. Zu jeweils 18 ml geschmolzenem Sulfit-Glucose-Eisen-Agar 1 ml Na 2 SO 3 - und 0.25 ml FeSO 4 - Lösung geben; Gemisch auf 55 C abkühlen und LANGSAM und VORSICHTIG über die Membranfilter gießen. (ACHTUNG: Filter dürfen dabei nicht von der Stelle bewegt werden!); 5. Unmittelbar danach den Boden der Petrischale so auf die Agarschicht legen, daß sich keine Luftschicht zwischen Agar und Petrischalenboden bilden kann; bei 37 C bebrüten. Nach ca. 20 und 44 h Zahl der schwarzen Kolonien bestimmen; Angabe des Titers (Zellzahl/ml) der sulfitreduzierenden, sporenbildenden Anaerobier in den einzelnen Wasserproben.

26 Pseudomonas aeruginosa Medien: Malachitgrün-Agar: King-P-Platten: Fleischextrakt 3 g Pepton 20 g Pepton 10 g Glycerin 10 ml NaCl 5 g K 2 SO 4 10 g Malachitgrün g MgSO 4 x 7 H 2 O 1.4 g Agar 15 g Agar 15 g H 2 O ad 1 l H 2 O ad 1 l King-F-Platten: Pepton 20 g Glycerin 10 ml K 2 HPO g MgSO 4 x 7 H 2 O 1.5 g Hefeextrakt 10 g D-Saccharose 25 g Agar 15 g H 2 O ad 1 l Endo-Agar (s. 4.2.) 1. Je 100 ml der Wasserproben durch 0.45 µm-filter filtrieren 2. Filter STERIL, mit der Bakterienseite nach OBEN, auf die Oberfläche von Malachitgrün- Agarplatten legen; 24 h bei 27 C bebrüten; 3. Von jeder gewachsenen Kolonie Verdünnungsausstrich auf Endo-Agar anlegen, 24 h bei 37 C bebrüten; 4. feuchte, farblose bis leicht gelblich gefärbte Kolonien markieren; solche Kolonien mit Cytochromoxidase-Teststäbchen (s.methodenbuch,teil I) betupfen auftropfen: im Falle Cytochromoxidase-positiver Kolonien färben sich die Stäbchen blauviolett bis schwarz; 5. Alle "positiven" Kolonien auf King-F- und King-P-Schrägagar ausstreichen; bei 37 C 24 h bebrüten. Anm.: auch 'fluoreszierende Pseudomonaden' aus Versuch 1.6. können hier überprüft werden. Pseudomonas aeruginosa bildet auf King-F bzw. King-P Agar oder auf beiden Medien meist Farbstoffe: Pyocyanin färbt den Nährboden blaugrün Pyorubin färbt den Nährboden rot bis dunkelbraun. Außerdem wird Fluorescein gebildet, das sich nach Anregen mit UV-Licht (256 nm) nachweisen läßt: Schrägagar in Petrischale überführen; von OBEN mit UV-Lampe bstrahlen. Ist Fluorescein auf keinem der beiden King-Nährböden nachweisbar, handelt es sich mit Sicherheit NICHT um P. aeruginosa. Läßt sich Fluorescein nur auf einem Nährboden nachweisen, müssen in der Praxis noch weitere Tests durchgeführt werden. Angabe des P. aeruginosa Titers (Zellzahl/ml) in den Wasserproben Enterokokken Medium: Enterokokken-Agar:

27 27 Trypton 20 g Hefeextrakt 5 g Glucose 2 g Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O 4 g Na-Azid 0.4 g Triphenyltetrazoliumchlorid 0.1 g Agar 10 g H 2 O ad 1 l autoklavieren 1. Je 100 ml der Wasserproben durch 0.45 µm Filter filtrieren 2. Filter STERIL, mit der Bakterienseite nach OBEN, auf die Oberfläche von Enterokokken- Agarplatten legen; 4 h bei 37 C, dann 44 h bei 44 C bebrüten; Filter bei gutem Licht ggf. mit Lupe betrachten: alle roten oder braunroten Kolonien werden als darmbewohnende Streptokokken gezählt. Angabe des Enterokokken-Titers (Zellzahl/ml) in den Wasserproben. Übersicht: tabellarische Zusammenfassung der über die einzelnen Wasserproben gesammelten Daten. 6. GENÜBERTRAGUNG BEI BAKTERIEN 6.1. TRANSFORMATION BEI BACILLUS SUBTILIS Ziel: Der trp-marker von Bacillus subtilis soll mittels Transformation von einem Donor in einen Rezipienten übertragen werden. Stämme: B. subtilis trp + (Donor) B. subtilis trp- (Rezipient) Medien, Puffer: LB-Medium (s.2.1.) 20% (w/v) N-Laurylsarcosin in Wasser 3 M Na-Acetat: ph 5.2 mit Eisessig einstellen. Lyse-Puffer: 0.5 M EDTA ph ml NaCl 1.17 g H 2 O ad 200 ml 70% EtOH (in H 2 O) EtOH absolut, 0 C Kompetenzmedium: Glucose 500 mg Caseinhydrolysat 20 mg

28 28 Kompetenzmedium : Glycerin = 9:1 L-Tryptophan 5 mg H 2 O ad 100 ml Transformationsmedium: Glucose 500 mg Caseinhydrolysat 10 mg L-Tryptophan 0.5 mg MgSO 4 x 7 H 2 O mg H 2 O ad 100 ml Salzlösung: NaCl 5 g MgSO 4 x 7 H 2 O 0.12 g H 2 O 1 Liter AM-Agar: K2HPO4 KH2PO4 Na-Citrat x 2 H2O MgSO4 x 7 H2O (NH4)2SO4 Agar H2O 3.5 g 1.5 g 0.5 g 0.1 g 1.0 g 15.0 g ad 1 Liter autoklavieren + 10 ml 20 % Glucose (steril) 1 x SSC: NaCl 150 mm Trinatriumcitrat 15 mm ph 7.0 Alle Lösungen (außer EtOH und Na-Laurylsarcosinat) autoklavieren! I. ISOLIERUNG VON DNA AUS DEM DONORSTAMM ml ÜN-kultur von B. subtilis-laborstamm in LB-Medium anlegen; bei 37 C heftig schütteln [Kultur so schwach animpfen, daß am Morgen die späte log-phase (OD ) erreicht ist!] 2. Zellen abzentrifugieren (Ja20, 10 min 10 Krpm, Raumtemp.); 1 x mit 10 ml Lyse-Puffer waschen. 3. Sediment in 4 ml Lysepuffer + 10 mg/ml Lysozym (FRISCH ansetzen!) suspendieren; in 15-ml Corexröhrchen überführen; 10 min bei 37 C inkubieren (nicht schütteln!) ml 20% Na-Laurylsarcosinat, VORSICHTIG mischen; 5 min bei 37 C weiterinkubieren ml Phenol (VORSICHT GIFT! -> Handschuhe, Abzug); gut mischen (> 15 min); 10 min bei 12 Krpm zentrifugieren (Gummiadapter verwenden!). 6. Obere, wäßrige Phase VORSICHTIG abheben; -> Schritte 5. und 6. mit 4 ml CHCl 3 :Isoamylalkohol (24:1) wiederholen. 7. Wäßrige Phase abheben; + 1/10 Volumen 3 M Na-Acetat, ph 5.2; mischen; Vol. EtOH (0 C); mischen. 8. Zentr. 15 min, 12 Krpm, 4 C; Überstand vorsichtig abkippen (besser: absaugen); Sediment mit 8 ml 70% EtOH waschen; Überstand vollständig absaugen; Sediment 30 min an der Luft trocknen. 9. DNA in 1 ml 1 x SSC lösen (24 h, 4 C). Reinheit durch Absorptionsmessungen bei 260 und 280 nm (Quarzküvetten!) geeigneter Verdünnungen abschätzen. Ungefähre DNA-Konzentration durch Elekrophorese von Aliquots in einem 0.7 %igen Agarosegel bestimmen. [Konzentrationsbestimmung der DNA durch O.D.260-Messung geht nicht, weil die Präparation auch RNA enthält-.] DNA Lösung im Kühlschrank aufbewahren.

29 29 II. PRÄPARATION KOMPETENTER ZELLEN 1. B. subtilis in 5 ml LB-Medium über Nacht (ca. 16 h) bei 37 C anziehen (schwach animpfen!), schütteln; 2. Übernachtkultur zu 20 ml frischem LB Medium (in 100 ml Erlenmeyer ) geben; schütteln bis O.D.600 = Kultur abzentrifugieren (5 min, 8000 rpm, Ja20); Zellen in 20 ml Kompetenzmedium suspendieren; je 10 ml zur Beimpfung von 2 Erlenmeyerkolben mit je 25 ml Kompetenz-medium verwenden; 4. Kolben 4 h bei 37 C sehr langsam schütteln; 5. beide Ansätze vereinigen; in 15 Röhrchen je 2.7 ml Bakteriensuspension abzentrifugieren; Sedimente in je 0,54 ml Kompetenzmedium:Glycerin (9:1) suspendieren; gründlich mischen; -> in Eppendorfgefäße überführen, in flüssigem N2 einfrieren und bei -70 C aufbewahren. III. TRANSFORMATION 1. Verdünnungen der Donor-DNA mit 1 x SSC in 2-er Schritten herstellen: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512 (jeweis 0.5 ml ml). DNA-Konzentrationen der Verdünnungen mit Hilfe des in I.9. ermittelten Wertes kalkulieren. 2. Kompetente Zellen unter kaltem Wasser rasch auftauen; abzentrifugieren (Eppendorfzentr., 1 min); Sedimente in je 0.4 ml Transformationsmedium resuspendieren (Eppendorfschüttler) ml-portionen der verschiedenen DNA-Konzentrationen (bzw. 0.4 ml 1 x SSC für den Nullwert) mit je 0.4 ml der Bakteriensuspension mischen; 90 min bei 37 C inkubieren; 4. Jedem Ansatz 40 µl DNase-Lösung (1 mg/ml in H 2 O) zugeben; mischen; 15 min bei 37 C inkubieren. 5. Ansätze entsprechend folgender Tabelle mit Salzlösung verdünnen und jeweils 0.2 ml auf AM-Agar + Tryptophan ausspateln: Ansätze 1 10 (+ DNA) 11 (-DNA) Verdünnungen unverd unverd Platten Trp* ) Auswertung *) 50 µg/ml Tryptophan Zahl der Transformanten + Revertanten Zahl der Revertanten Gesamt- Zellzahl Als Infektionskontrolle werden zusätzlich 0.05 ml der DNA-Lösung auf Kompetenzmedium + Trp ausgespatelt. 6. Platten 4 bis 6 Tage bei 37 C bebrüten; 1. Gesamt-Titer (Zellen/ml) der kompetenten Zellen durch Auszählen der Kolonien auf AM-Agar MIT Tryptophan bestimmen; 2. Titer (Zellen/ml) der transformierten Zellen für die einzelnen DNA-Konzentrationen bestimmen; 3. Graphische Darstellung der Transformationshäufigkeit (in %) in Abhängigkeit von der eingesetzten DNA-Konzentration: transformierte Zellen/ml % transformierte Zellen = x 100 Gesamtzellenzahl/ml