RESOLUTION OIV-OENO
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- Eleonora Kranz
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1 RESOLUTION OIV-OENO BESTIMMUNG VON ZUCKERN IN MOST UND WEIN MITTELS HOCHLEISTUNGSFLÜSSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE - AKTUALISIERUNG DER METHODE OIV-MA- AS DIE GENERALVERSAMMLUNG, gestützt auf Artikel 2 Absatz 2 iv des Übereinkommens vom 3. April 2015 zur Gründung der Internationalen Organisation für Rebe und Wein, auf Vorschlag der Unterkommission Analysemethoden, BESCHLIESST auf Vorschlag der Kommission Önologie, die Methode OIV-Ma-AS der Sammlung internationaler Analysemethoden für Wein und Most wie folgt zu ändern. Type II-Methode 1 Bestimmung von Zuckern in Most und Wein mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie 1. - Geltungs- Und Anwendungsbereich Die Methode dient der direkten quantitativen Bestimmung von Zuckern in Mosten und Weinen in Konzentrationen bis zu 20 g/l und auch in höheren Konzentrationen bei vorheriger Verdünnung. Glycerin (0,5 15 g/l) und Saccharose (1 40 g/l) können ebenfalls in gleicher Weise bestimmt werden Prinzip Zucker und Glycerin werden durch HPLC auf einer Alkylamin-Säule getrennt und mit einem Refraktometer nachgewiesen Reagenzien Entmineralisiertes Wasser, Typ I (ISO 3696) oder entsprechend (HPLC-Qualität), Acetonitril [ ] (Transmissionsminium 200 nm - Reinheit > 99 %), Fructose [ ] (Reinheit 99 %), Glucose [ ] (Reinheit 99 %), Saccharose [ ] (Reinheit 99 %), Glycerin [ ] (Reinheit 99 %). HERSTELLUNG DER REAGENZLÖSUNGEN Entmineralisiertes Wasser (3.1): filtriert durch eine Cellusose-Membran (Porengröβe 0,45 µm) Eluent: Acetonitril (3.2)/Wasser (3.9) 80/20. 1 Typ II für Glucose und Fructose, Typ IV für Saccharose und Glycerin 1
2 Hinweis 2: Das Verhältnis Wasser/Acetonitril kann je nach Untersuchunsziel angepasst werden Material Cellulosemembran, 0,45 µm, Filterpatrone aus octadecylmodifiziertem Kieselgel (z.b. Sep packs C18), Hochleistungsflüssigkeitschromatograph, Säule, Alkylamin 5 µm, 250 x 4,6 mm, Hinweis 3: Es können Säulen mit anderen Längen, Innendurchmessern und Partikelgröβen verwendet werden; als Typ II-Methode nimmt sie jedoch Bezug auf die oben beschriebene Säule Refraktometrischer Detektor (RID), übliches Labormaterial Probenahme Die Proben werden ggf. zuvor entgast (z.b. mit Stickstoff, Helium oder im Ultraschallbad) Durchführung Vorbereitung der Probe Verdünnung Weine mit einem Gehalt von weniger als 20 g/l Glucose + Fructose werden unverdünnt analysiert. Moste und Weine, die mehr als 20 g/l enthalten, sind so zu verdünnen, dass deren Konzentrationen innerhalb des Kalibrierbereichs liegen Filtration Die Probe wird vor der Analyse durch ein Filter, Porengröβe 0,45 µm (4.1) filtriert Entfernung phenolischer Verbindungen (falls notwendig) Most oder Wein: durch eine C18-Filterpatrone (4.2) passieren Analyse Analytische Bedingungen Hinweis 4: Die folgenden Vorschriften sind für die Methode als Typ II-Methode verbindlich. Hinweis 5: Die Bedingungen können vom Labor jedoch angepasst werden, wobei dann die Klassifizierung als Typ II Methode dann nicht mehr gilt. Hochleistungsflüssigkeitschromatograph (4.3) mit Säule (4.4) und RID (4.5) Mobile Phase: isokratischer Eluent Acetonitril/Wasser (3.10) Flussrate: 1 ml/min Einspritzvolumen: μl je nach verwendetem Material Beispiele für Chromatogramme sind in Anhang B, Abb. 1 und 2 aufgeführt. Auflösung Fructose-Glucose: 2 ist empfohlen Externe Kalibrierung Kalibrierlösung für alle in vorliegendem Verfahren aufgeführte Verbindungen: Glycerin (3.6) 10 g/l ± 0,01 g/l Fructose (3.3) 10 g/l ± 0,01 g/l Glucose (3.4) 10 g/l ± 0,01 g/l Saccharose (3.5) 10 g/l ± 0,01 g/l Hinweis 6: Soll nur eine der Verbindungen quantitativ bestimmt werden, kann eine Lösung hergestellt werden, die nur diese Verbindung enthält Berechnungen der Responsefaktoren für die externe Kalibrierung bei Routineanalysen RF i= Fläche i/c i wobei: Fläche i = Peakfläche des Produkts in der Kalibrierlösung 2
3 C i = Menge des Produkts in der Kalibrierlösung Es kann ebenfalls eine Kalibrierkurve verwendet werden Angabe der Ergebnisse Berechnungen der Konzentrationen C e = Fläche e /RF i wobei: Fläche e = Peakfläche des Produkts in der Probe Die Ergebnisse werden in g/l angegeben. Hinweis 7: Die Ergebnisse werden mit höchstens einer Dezimalstelle angegeben Qualitätssicherung und Kontrolle Rückführbar auf die internationalen Normen durch Masse, Volumen und Temperatur. Synthetische Mischungen oder Proben, wie zum Beispiel von Ringversuchen werden für die interne Qualitätskotrolle benutzt. Eine Kontrollkarte kann verwendet werden Leistungen der Methode Keine bekannte Verbindung koeluiert mit Fructose, Glucose oder Saccharose. Robustheit: Die Analyse ist gegenüber geringen Temperaturschwankungen empfindlich. Die Säulen müssen gegen Temperaturschwankungen geschützt sein Genauigkeit (Siehe Anhang B.3) Glucose (Gehalt 3 g/l) Wiederholgrenze Vergleichsgrenze = 13 % Fructose (Gehalt 2 g/l) Wiederholgrenze = 7 % Vergleichsgrenze = 10 % Glucose + Fructose (Gehalt 5 g/l) Wiederholgrenze Vergleichsgrenze = 10 % 3
4 Anhang A (informativ) Beispiele für HPLC-Chromatogramme mv GY mv Gl yc ér ol FR GL SA GY FR Zeit (min) Zeit (min) Abb. 1 Chromatogramm einer Standardlösung Abb. 2 - Chromatogramm eines Roséweins (Zucker und Glycerin 10 g/l) Glycerin (GY), Fructose (FR), Glucose (GL), Saccharose (SA) 4
5 mv GY FR GL Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 RT1-10 W1/2 RT1 RT2 RT2 + 10W1/2 Abb. 3 Aufzeichnung des Grundrauschens nach Messwertspreizung Fructose (FR), Glucose (GL), Saccharose (SA) Glycerin (GY), RT1: Retentionszeit von Fructose, RT2: Retentionszeit von Glucose W1/2: Peakbreite auf halber Höhe, Yi: Tonhöhe an Punkt i 5
6 Anhang B (informativ) Genauigkeit B.1 Proben des Ringversuchs Die Studie wurde vom interregionalen Labor für Betrugsbekämpfung in Bordeaux durchgeführt. Der Ringversuch umfasste 12 Proben (6 verschiedene Doppelblindproben) bezeichnet mit den Buchstaben A J (4 Weiβweine, 4 Rotweine, 2 weiβe Portweine und 2 rote Portweine) mit einem Glucose- und Fructosegehalt von jeweils 2 bis 65 g/l. Die Weine aus der Region Bordeaux wurden mit Glucose und Fructose versetzt und mit 100 mg SO 2/L stabilisiert (TRICARD und MEDINA 2003). B.2 Chromatographische Bedingungen Unter Berücksichtigung der Responsefaktoren der beiden Zucker und des Messbereichs der Chromatogramme entspricht das Rauschen einer Fructosekonzentration von 0,04 g/l und einer Glucosekonzentration von 0,06 g/l (siehe Abb. A3). Daraus wurden die Nachweisgrenzen (dreifaches Rauschen) und die Bestimmungsgrenzen (zehnfaches Rauschen) ermittelt: LD Fructose = 0,12 g/l LD Glucose = 0,18 g/l LQ Fructose = 0,4 g/l LQ Glucose = 0,6 g/l Diese Ergebnisse entsprechen den Ergebnissen von TUSSEAU und BOUNIOL (1986) und sind bei anderen Chromatogrammen wiederholbar. B.3 Genauigkeit An der Studie beteiligten sich 9 Laboratorien: Istituto Sperimentale Per L'Enologia, Asti, Italien Laboratoire de la DGCCRF de Montpellier, Frankreich Laboratoire LARA, Toulouse, Frankreich Instituto do vinho do Porto, Porto, Portugal Instituto de Vinha E Do Vinho, Unhos, Portugal Estacion de Viticultura y Enologia, Vilafranca del Penedes, Spanien Comité Interprofessionnel du vin de Champagne, Epernay, Frankreich Station fédérale de Changins, Schweiz Laboratoire de la DGCCRF de Talence, Frankreich 6
7 3 Punkte der Kalibrierreihe und 12 Proben wurden nacheinander unter Anwendung der vorgegebenen Methode analysiert. Die Ergebnisse wurden gemäβ dem OIV-Protokoll analysiert (Validation Protocol of methods of analysis Resolution OENO 6/1999). Laut diesem Protokoll werden die Analysen nicht wiederholt; 4 Laboratorien gaben hingegen Ergebnisse von Analysen an, die dreimal wiederholt wurden. Für die Analyse der Ergebnisse nach dem OIV-Protokoll wurde nur die erste Datenreihe berücksichtigt. Es wurden Berechnungen der Wiederholbarkeit nach Youden, der Vergleichbarkeit und Tests nach Cochran und Grubbs durchgeführt. Die Daten der Wiederholungen ermöglichten es, die en der Wiederholbarkeit auf andere Weise (gemäβ ISO 5725) zu ermitteln. 7
8 B.3.1 GLUCOSE Glucose mittels HPLC (g/l) Laboratorien Proben Mittelwert 2,9 2,9 12,6 12,4 44,6 67,5 der 0,44 0,17 0,67 0,34 1,05 3,31 Wiederholbarkeit Wiederholgrenze 1,42 0,55 2,15 1,07 3,35 10,58 der 0,78 0,30 0,90 0,52 1,43 3,28 Vergleichbarkeit Vergleichsgrenze 2,32 0,90 2,68 1,55 4,28 9,78 Horrat-Wert 5,7* 2,1 1,84 1,08 1,01 1,62 * bei der Angabe der Genauigkeit nicht berücksichtigt Glucose mittels HPLC r und R entsprechend dem Glucosegehalt r oder R in g/l Gehalt in g/l Korrelation zwischen r und R und der Glucosekonzentration (ISO 5725) 8
9 r oder R in g/l B.3.2 FRUCTOSE Fructose par HPLC (en g/l) Laboratorien Proben Mittelwert 1,9 5,2 10,0 13,0 62,6 73,0 der 0,09 0,24 0,32 0,16 3,20 2,10 Wiederholbarkeit Wiederholgrenze 0,27 0,79 1,03 0,51 3,20 6,72 der 0,25 0,25 0,32 0,43 2,91 1,93 Vergleichbarkeit Vergleichsgrenze 0,75 0,75 0,96 1,30 8,68 5,77 Horrat-Wert 2,54 1,09 0,81 0,87 1,53 0,89 Fructose mittels HPLC r und R entsprechend dem Fructosegehalt Gehalt in g/l Korrelation zwischen r und R und der Fructosekonzentration (ISO 5725) 9
10 r oder R in g/l B.3.3 GLUCOSE + FRUCTOSE Glucose + Fructose mittels HPLC (g/l) Laboratorien Proben Mittelwert 4,7 8,1 22,6 25,4 107,3 140,5 der 0,48 0,38 1,06 0,46 1,92 5,30 Wiederholbarkeit Wiederholgrenze 1,52 1,21 3,07 1,48 6,13 17,0 der 0,89 0,46 1,06 0,64 3,47 4,74 Vergleichbarkeit Vergleichsgrenze 2,64 1,38 3,17 1,90 10,34 14,15 Horrat-Wert 4,17* 1,39 1,33 0,72 1,15 1,26 * bei der Angabe der Genauigkeit nicht berücksichtigt Glucose + Fructose mittels HPLC r und R entsprechend dem Gehalt von Glucose + Fructose Gehalt in g/l Korrelation zwischen r und R und der Konzentration von Glucose + Fructose (ISO 5725) 10
11 Literatur TRICARD C. et MEDINA B. (2003) : Essai inter laboratoire OIV Dosage des sucres dans les vins par HPLC. Feuillet Vert n 1143, 8 Seiten. TUSSEAU D. et BOUNIOL C., Sc. Alim., 6, TUSSEAU D., Limite de détection - limite de quantification. Feuillet vert OIV Protocole pour la planification, la conduite et l'interprétation des études de performance des méthodes d analyse. Resolution OIV-OENO Norm ISO 5725 (1994): Anwendung der Statistik - Genauigkeit (Richtigkeit und Präzision) der Messverfahren und Messergebnisse... 11
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