RESOLUTION OIV-OENO
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- Sigrid Kruse
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1 RESOLUTION OIV-OENO BESTIMMUNG VON SULFAT IM WEIN MITTELS KAPILLARELEKTROPHORESE ERGÄNUNG DER RESOLUTION OENO 5/2006 (Bestimmung der wichtigsten organischen Säuren im Wein mittels Kapillarelektrophorese) DIE GENERALVERSAMMLUNG, in Anbetracht von Artikel II Absatz 2 Ziffer IV des Übereinkommens vom 3. April 2001 zur Gründung der internationalen Organisation von Rebe und Wein, gestützt auf die Arbeiten der Unterkommission Analysemethoden bzgl. der Bestimmung von Sulfat in Wein mittels Kapillarelektrophorese, gestützt auf die Resolution OENO 5/2006 bzgl. der Bestimmung der wichtigsten organischen Säuren im Wein durch Kapillarelektrophorese, unter Berücksichtigung des Vorschlags der Unterkommission Analysemethoden, die Methode zur Bestimmung von Sulfat in Wein mittels Kapillarelektrophorese in die Methode OENO 5/2006 (Bestimmung der wichtigsten organischen Säuren im Wein durch Kapillarelektrophorese - AS313-19) aufzunehmen, BESCHLIESST auf Vorschlag der Kommission Önologie, die Bestimmung von Sulfat auf die Methode AS (Bestimmung der wichtigsten organischen Säuren im Wein durch Kapillarelektrophorese) auszuweiten und den Titel wie folgt zu ändern: Bestimmung von wichtigen organischen Säuren und Sulfat in Wein mittels Kapillarelektrophorese, BESCHLIESST, die vorgeschlagenen Änderungen in die Sammlung internationaler Analysemethoden aufzunehmen. 1
2 Methode OIV-MA-AS Bestimmung von wichtigen organischen Säuren und Sulfat in Wein mittels Kapillarelektrophorese TYP Typ II-Methode für organische Säuren Typ III- für Sulfat 1. Einleitung Weinsäure, Apfelsäure, Milchsäure und Sulfat werden nach einfacher Verdünnung und Zugabe eines internen Standards mittels Kapillarelektrophorese getrennt und bestimmt. 2. Titel BESTIMMUNG VON WICHTIGEN ORGANISCHEN SÄUREN UND SULFAT IN WEIN MITTELS KAPILLARELEKTROPHORESE 3. Anwendungsbereich Mittels Kapillarelektrophorese können Wein- und Apfelsäure in Mosten sowie Wein-, Apfel- und Milchsäure sowie Sulfat in zuvor verdünnten, entgasten und nötigenfalls filtrierten Weinen bestimmt werden. 4. Definitionen 4.1 Kapillarelektrophorese Kapillarelektrophorese: Gesamtheit aller Techniken, die Kapillarrohre mit sehr kleinem Durchmesser einsetzen, um in einem geeigneten Puffer sowohl kleine als auch große elektrisch geladene Moleküle im Hochspannungsfeld wirksam zu trennen. 4.2 Elektrophoresepuffer Lösung, die sich aus einem oder mehreren Lösungsmitteln und gelösten Stoffen mit geeigneter elektrophoretischer Beweglichkeit zusammensetzt, die in der Lage sind, den p H -Wert dieser Lösung zu puffern. 4.3 Elektrophoretische beweglichkeit Fähigkeit eines Ions, sich im elektrischen Feld schnell zu bewegen. 4.4 Elektroosmotischer fluss Bewegung der in der Pufferlösung gelösten Ionen entlang der inneren Wand des Kapillarrohrs durch die Wirkung des elektrischen Feldes und der negativen elektrischen Ladung der Silanolgruppen an der Kapillarinnenwand. 5. Prinzip Das Trennen der wässrigen Lösungen von Stoffgemischen mittels Kapillarelektrophorese wird durch die unterschiedliche Wanderung in einer 2
3 elektrolytischen Pufferlösung in Bezug auf den Puffer erzielt. Die Elektrophorese findet in einer Quarzkappillare mit einem Innendurchmesser von 25 bis 75 µm statt. Die zu trennenden gelösten Stoffe werden gleichzeitig von zwei Kräften angetrieben, die in dieselbe oder entgegengesetzte Richtung wirken können. Die beiden Kräfte werden vom elektrischen Feld und dem elektroosmotischen Fluss erzeugt. Das elektrische Feld wird durch die in Volt gemessene elektrische Spannungerzeugt, die zwischen den Elektroden angelegt wird und je Zentimeter Quarzkapillare bezogen wird (V cm -1 ). Ionen haben die Eigenschaft, sich zu bewegen. Je kleiner die Moleküle und je stärker sie geladen sind, desto größer ist ihre Elektrophoretische Beweglichkeit. Wenn die Innenwand der Quarzkapillare unbeschichtet ist, bindet die negative Ladung der Silanolgruppen die Kationen des Puffers. Die Solvatation und Bewegung in Richtung Kathode eines Teils der Pufferkationen bewirkt der elektroosmotischen Fluss. Durch die gezielte Wahl des p H -Wertes des Puffers und die Anwendung von Additiven lassen sich die Richtung und Stärke des elektroosmotischen Flusses beeinflussen. Durch das Hinzufügen eines chromophoren Ions zum Puffer lassen sich negative Peaks erreichen, die die darin gelösten Stoffe quantitativ erfassen und welche bei der angewendeten Wellenlänge nicht absorbieren.. 6. Reagenzien und substanzen 6.1 Alle Chemikalien in der Qualität zur Analyse(z. A.) bzw. Einer Reinheit von mindestens 99% Natriumsulfat oder Kaliumsulfat L-Weinsäure DL-Apfelsäure Zitronensäure Monohydrat Bernsteinsäure Milchsäure Natriumdihydrogenphospaht Natriumgluconat Natriumchlorat Dipicolinsäure Cethyltrimethylammoniumbromid Acetonitril für HPLC Ultrafiltriertes entionisiertes reines Wasser Natriumhydroxid 6.2 Liste der Lösungen Kalibrierlösung Lösung mit den zu bestimmenden Säuren und mit Sulfat (6.1.1 bis 6.1.6) in reinem Wasser (6.1.13) mit einer genau bekannten Konzentration von 800 bis 1200 mg l -1 Lösung bei +5 C höchstens 1 Monat haltbar 3
4 Lösung des Internen Standards Natriumchloratlösung (6.1.9) mit ca. 2 g l -1 in reinem Wasser (6.1.13) Lösung bei +5 C höchstens 1 Monat haltbar Zu injizierende Kalibrierlösung Mit Hilfe von Pipetten der Kategorie "A" in einen 50 ml-messkolben der Kategorie "A" geben: 2 ml Kalibrierlösung (6.2.1) 1 ml Interner Standard (6.2.2) Mit reinem Wasser (6.1.13) auf 50 ml auffüllen Durch Schütteln homogenisieren Lösung täglich frisch herstellen Natriumhydroxid-Lösungen Natriumhydroxid-Lösung M In einen 100 ml-messkolben 4g Natriumhydroxid-Lösung geben (6.1.14), mit reinem Wasser (6.1.13) auffüllen, bis zur vollständigen Auflösung schütteln Natriumhydroxid-Lösung 0,1 M In einen 100 ml-messkolben 4g Natriumhydroxid-Lösung M geben ( ), mit reinem Wasser (6.1.13) auffüllen, homogenisieren Elektrophoretischer Puffer Mit In einen 200 ml-messkolben der Kategorie "A" geben: g Dipicolinsäure (6.1.10) g Cethyltrimethylammoniumbromid (6.1.11) 20 ml Acetonitril (6.1.12) ca. 160 ml reines Wasser ) Bis zur vollständigen Auflösung schütteln (nötigenfalls zur Beseitigung von Verklumpungen in ein Ultraschallbad geben) ph-wert zunächst mit Natriumhydroxid-Lösung M ( ), dann mit Natriumhydroxid-Lösung 0,1 M ( ) auf 5.64 bringen Mit reinem Wasser (6.1.13) auf 200 ml auffüllen Durch Schütteln homogenisieren Lösung monatlich neu herstellen Lagerung bei Zimmertemperatur Der Puffer kann durch ein gleichwertiges, auf dem Markt erhältliches Produkt ersetzt werden. 7. Geräte Eine für diese Bestimmung erforderliche Ausstattung zur Kapillarelektrophorese umfasst im Wesentlichen: Einen Probenwechsler Zwei Röhrchen (vials) mit Puffer 4
5 Ein unbeschichtetes Quarzkapillarrohr mit 50 µm Innendurchmesser und 60 cm Länge zwischen dem Kapillarrohrzulauf und der Sensorzelle. Je nach Gerät kann eine Zusatzlänge von 7 bis 15 cm erforderlich sein, damit das Ende des Kapillarrohrs auf halber Höhe eines anderen Röhrchens eingetaucht werden kann. Eine Hochspannungsversorgung (Gleichstrom), die eine Spannung von 30 bis + 30 kv gewährleistet. Die in beide Röhrchen eingetauchten Elektroden (an der Stelle, an der die Enden des Kapillarrohres einmünden) werden an die Klemmen des Generators angeschlossen. Ein Pneumatisches System, das den Puffer im Kapillarrohr fördert und das Injizieren der Probe ermöglicht. Einen UV-Detektor Ein Datenerfassungssystem 8. Vorbereitung der proben 8.1. Entgasung und Filtration Stark kohlensäurehaltige Proben werden 2 Min. lang mittels Ultraschall entgast. Trübe Proben werden durch ein Membranfilter filtriert, deren durchschnittliche Porengröße bei 0,45 µm liegt Verdünnung und Zugabe von internem Standard Man gibt 2 ml Probe in einen 50 ml-messkolben, fügt 1 ml internen Standard (6.2.2) zu und füllt mit reinem Wasser (6.1.13) auf 50 ml auf. Homogenisieren. 9. Durchführung 9.1. Vorbereitung (Konditionieren) eines neuen Kapillarrohrs (als Anhaltspunkt) Zirkulieren reinen Wassers (6.1.13) während 5 Min. mit einem Druck von ca. 40 psi (2,76 bar oder 276 kpa) in umgekehrter Richtung (vom Kapillarrohrende zum Zulauf). Zirkulieren von Natriumhydroxid-Lösung 0,1 M ( ) während 5 Min. mit demselben Druck in umgekehrter Richtung Zirkulieren reinen Wassers (6.1.13) während 5 Min. mit demselben Druck in umgekehrter Richtung (vom Kapillarrohrende zum Zulauf) Durchlaufzyklus mit reinem Wasser, Natriumhydroxid-Lösung 0,1 M und reinem Wasser wiederholen Zirkulieren des elektrophoretischen Puffers (6.2.5) in umgekehrter Richtung während 10 Min Konditionieren eines benutzten Kapillarrohres (fakultativ) Wenn die Qualität der Trennungen unzureichend wird, muss das Kapillarrohr neu konditioniert werden. Wenn die damit erzielten Ergebnisse noch immer nicht zufrieden stellend sind, muss ein anderes Kapillarrohr montiert und konditioniert werden. 5
6 9.3. Prüfen der Kapillarrohrqualität (fakultativ) Die Kalibrierlösung 5-mal unter den vorgesehenen Bedingungen analysieren Trenn- und Detektionsbedingungen (als Anhaltspunkt) Einbrennen der Detektorlampe 1 Stunde vor Beginn der Analysen Spülen des Kapillarrohrs durch Zirkulieren des elektrophoretischen Puffers (6.2.5) während 3 Minuten in umgekehrter Richtung bei einem Druck von 40 psi Injektion der vorbereiteten Proben (8.1.) unter 0,5 psi Druck während 6 bis 15 Sekunden Die Polung ist so einzustellen, dass sich die Anode auf der Seite des Detektors befindet. 1 Min. lang eine Spannung von 0 bis 16 kv und anschließend ca. 18 Min. lang 16 kv anlegen (die Trennungsdauer kann entsprechend der Kapillarrohrqualität leicht variieren) Temperatur wird bei + 25 C gehalten Detektion bei 254 nm Spülen des Kapillarrohrs durch Zirkulieren des elektrophoretischen Puffers (6.2.5) während 2 Min. in umgekehrter Richtung bei einem Druck von 40 psi Elektrophoretischen (6.2.5) Puffer in den Zulauf- und Ablaufröhrchen mindestens alle 6 Injektionen wechseln Reihenfolge der durchzuführenden Analysen (als Anhaltspunkt) Bei jeder neuen Analysenreihe den elektrophoretischen Puffer (6.2.5) wechseln. Die Analysen laufen in folgender Reihenfolge ab: Analyse der Kalibrierlösung (6.2.3), Analyse der Kalibrierlösungen (= externe Standards mit bekannter Konzentration für die einzelnen zu bestimmenden Säuren), Analyse der vorbereiteten Proben (8.2), die Chromatogramme sollten den im Anhang A aufgeführten Musterchromatogramm entsprechen Nach Beendigung der Analysen 10 Min. mit reinem Wasser (6.1.13) in umgekehrter Richtung (vom Ende des Kapillarrohrs zum Zulauf) spülen, Ausschalten der Lampe. 10. Berechnung der ergebnisse Die Berechnung erfolgt über die durch Integration erzielten Peak-Flächen. Die Peak-Flächen der gelösten Substanzen der Kalibrierlösung (6.2.3) werden unter Berücksichtigung der Schwankungen der Peak-Flächen des Internen Standards korrigiert. Dabei wird für jede Säure der Responsfaktor berechnet. Die Peak-Flächen des Internen Standards sowie der gelösten Stoffe werden bei jeder Probe ermittelt. Die Flächen der zu bestimmenden Stoffe werden unter erneuter Berücksichtigung der Schwankungen der Peak-Flächen des Internen Standards neu berechnet, um auf diese Weise korrigierte Flächen zu erhalten. 6
7 Die korrigierten Flächen werden anschließend mit dem Wert des entsprechenden Responsefaktors multipliziert. Es kann eine automatisierte Datenverarbeitung verwendet werden, sofern die Daten nach den Grundsätzen guter fachlicher Praxis geprüft werden können (z.b. Berechnung des Responsefaktors bzw. Erstellung einer Kalibrierkurve). BERECHNUNGSFORMEL Die für die Berechnung der einzelnen Säurekonzentrationen verwendeten Abkürzungen werden in folgender Tabelle dargestellt: Die Flächen werden als ganzzahliger Wert der Integrationseinheiten ausgedrückt. Die Konzentrationen werden in g /L angegeben (nur zwei Dezimalstellen berücksichtigen). ABKÜRZUNGEN PEAK-FLÄCHEN DER ANALYTEN PEAK-FLÄCHEN DES INTERNEN STANDARDS KONZENTRATIONEN DER ANALYTEN REFERENZLÖSUNG S AR S EIR C AR PROBE S AE S EIE C E Die Berechnungsformel lautet: C E = C SAE S SAR SEIE AR EIR Nach Möglichkeit sollte eine Doppelbestimmung zum Nachweis eventueller Fehler beim Erkennen der Peaks bzw. von Ungenauigkeiten bei der Integration durchgeführt werden. Mit dem automatischen Probenwechsler können die Analysen Tag und Nacht durchgeführt werden. 11. GENAUIGKEIT UND PRÄZISION (METHODENVALIDIERUNG) 11.1 Durchführung der Versuche Die Ringversuche und deren Ergebnisse sind in den Anhängen B1 und B2 aufgeführt. 7
8 11.2 Bestimmung der Messzuverlässigkeit AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE DURCH EINEN RINGVERSUCH Anzahl der teilnehmenden Labore: 5 Ergebnisse in mg / l WEIN- ÄPFEL- MILCH- SÄURE SÄURE SÄURE durchschnittliche Konzentrationen durchschnittliche Standardabweichungen der Wiederholbarkeit durchschnittliche Standardabweichungen der Reproduzierbarkeit 8
9 12. Anhänge ANHANG A ELEKTROPHEROGRAMM EINER SÄUREBEZUGSLÖSUNG Schwefelsäure INTERNEN STANDARDS Weinsäure Zitronensäure Apfälsäure Bernseinsäure Milchsäure Phosphorsäure GluconSäure 9
10 ELEKTROPHEROGRAMM EINES WEINS Schwefelsäure INTERNEN STANDARD Weinsäure Zitronensäure Bernseinsäure. Milchsâure Phosphorsäure Gluconsäure Apfels. 10
11 ANHANG B1 Aus den Ergebnissen von Ringversuchen (2006) hervorgegangene statistische Daten Gemäß ISO :1994 wurden nachfolgende Parameter in einem Ringversuch ermittelt. Der Versuch wurde vom Labor der Generaldirektion für Konsum und die Bekämpfung betrügerischer Praktiken in Bordeaux (Frankreich) durchgeführt. Jahr des Ringversuchs: 2006 Anzahl der Labors: 5 Anzahl der Proben: 8 mit doppelten Blindproben (sogenannte blind replicates ) (2 Weißweine, 2 weiße Likörweine, 2 Rosé- und 2 Rotweine) 11
12 RINGVERSUCHE Bestimmung von WEINSÄURE mittels Kapillarelektrophorese Probenart trockene weiße Rosé-Weine Rotweine Weißweine Likörweine A + D B + C E + F G + H I + J K + L M + N O + P Anzahl teilnehmender Labore Anzahl angenommener Ergebnisse Mittelwert in mg/l Angenommener Wert in mg/l Standardabweichung Wiederholbarkeit (Sr) Variationskoeffizient Wiederholbarkeit 1,4 1,0 7,7 1,0 2,2 1,9 1,8 1,3 Grenzwert Wiederholbarkeit (r) Standardabweichung Reproduzierbarkeit (S R ) Variationskoeffizient Reproduzierbarkeit 4,9 5 12,6 3,6 3 3,5 3,8 2,9 in % Grenzwert Reproduzierbarkeit (R)
13 RINGVERSUCHE Bestimmung von APFELSÄURE mittels Kapillarelektrophorese Probenart trockene weiße Rosé-Weine Rotweine Weißweine Likörweine A + D B + C E + F G + H I + J K + L M + N O + P Anzahl teilnehmender Labore Anzahl angenommener Ergebnisse Mittelwert in mg/l Angenommener Wert in mg/l Standardabweichung Wiederholbarkeit (Sr) Variationskoeffizient Wiederholbarkeit 2,1 1,2 6,7 1,4 1,4 5,2 4,1 3,7 Grenzwert Wiederholbarkeit (r) Standardabweichung Reproduzierbarkeit (S R ) Variationskoeffizient Reproduzierbarkeit 13,6 9, ,6 14,7 9 14,1 7,6 in % Grenzwert Reproduzierbarkeit (R)
14 RINGVERSUCHE Bestimmung von MILCHSÄURE mittels Kapillarelektrophorese Angabe der Ergebnisse in mg / l Kennzeichnung der Proben trockene weiße Rosé-Weine Rotweine Weißweine Likörweine A + D B + C E + F G + H I + J K + L M + N O + P Anzahl teilnehmender Labore Anzahl angenommener Ergebnisse Mittelwert in mg/l Angenommener Wert in mg/l Standardabweichung Wiederholbarkeit (Sr) Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit 3,1 3,2 7,8 15,1 4,8 5,3 3,7 16,0 Grenzwert der Wiederholbarkeit (r) Standardabweichung Reproduzierbarkeit (S R ) Variationskoeffizient Reproduzierbarkeit 13,6 9, ,6 14,7 9 14,1 7,6 in % Grenzwert der Reproduzierbarkeit (R) ANHANG B2 14
15 ANHANG B2 Aus den Ergebnissen mit Ringversuchen hervorgegangene statistische Daten (Sulfate2010) Gemäß ISO :1994 wurden nachfolgende Parameter in einem Ringversuch ermittelt. Der Versuch wurde vom Labor des Instituto dos Vinhos do Douro e do Porto (Portugal) durchgeführt. Jahr des Ringversuchs: Anzahl der Labors: 7 (ein Labor übersandte 2 Ergebnisserien, die mit 2 verschiedenen Geräten erzielt wurden) Anzahl der Proben: 6 mit doppelten Blindproben 15
16 Probenbezeichnung Weiß-wein (A/G) Rosé (B/F) Rosé (C/O) Rotwein (D/M) Likör-wein (E/N) Likör-wein (I/K) Weiß-wein (H/Q) Rotwein (J/P) Anzahl der Labore Anzahl der Wiederholungen Likör-wein (L) Minimum (g/l K 2 SO 4 ) 0,71 0,34 0,40 0,62 1,79 1,06 1,38 1,96 2,17 Maximum (g/l K 2 SO 4 ) 0,88 0,54 0,52 0,75 2,40 1,35 1,70 2,30 2,85 2 Varianz der Wiederholbarkeit s r 2 Varianz zwischen den Gruppen s L Varianz der Reproduzierbarkeit s R 2 0,0012 0,0011 0,0001 0,0016 0,0063 0,0013 0,0036 0,0015 0,0053 0, , , , , , , , , ,0027 0,0034 0,0018 0,0022 0,0258 0,0122 0,0103 0,0189 0,0408 Gesamt-Mittelwert (g/l K 2 SO 4 ) 0,78 0,43 0,44 0,69 2,01 1,19 1,49 2,15 2,41 Standardabweichung der Wiederholbarkeit 0,04 0,03 0,01 0,04 0,08 0,04 0,06 0,04 0,07 (g/lk 2 SO 4 ) Grenze r (g/l K 2 SO 4 ) 0,100 0,093 0,031 0,115 0,224 0,103 0,170 0,109 0,206 Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit 5% 8% 3% 6% 4% 3% 4% 2% 3% Standardabweichung der Reproduzierbarkeit 0,05 0,06 0,04 0,05 0,16 0,11 0,10 0,14 0,20 (g/l K 2 SO 4 ) Grenze R (g/l K 2 SO 4 ) 0,148 0,165 0,118 0,132 0,454 0,312 0,287 0,389 0,572 Variationskoeffizient der Reproduzierbarkeit 7% 14% 10% 7% 8% 9% 7% 6% 8% HORRAT-Wert 1,1 2,1 1,5 1,1 1,6 1,7 1,3 1,3 1,7 16
17 13. Literatur ARELLANO M., COUDERC F. et PUIG.L (1997): Simultaneous separation of organic and inorganic acids by capillary zone electrophoresis. Application to wines and fruit juices. Am. J. Enol. Vitic., 48, KANDL T. und KUPINA S. (1999): An improved capillary electrophoresis procedure for the determination of organics acids in grape juices and wine. Am. J. Vitic., 50, KLAMPF C.F. (1999): Analysis of organics acids and inorganics anions in different types of beer using capillary zone electrophoresis. J. Agric. Food Chem., 47,
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