Mutationsanalyse von Axin 2/ Conductin. bei Patienten mit Hypophysenadenomen und Kraniopharyngeomen

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1 Aus dem Institut für Neuropathologie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. Ingmar Blümcke Mutationsanalyse von Axin 2/ Conductin bei Patienten mit Hypophysenadenomen und Kraniopharyngeomen Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Regina Maria Stangl aus Neustadt an der Waldnaab

2 Meiner Tochter Helena

3 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Referent: Korreferent: Prof. Dr. Dr. Jürgen Schüttler Prof. Dr. Ingmar Blümcke Prof. Dr. Dr. Max-Josef Hilz Tag der mündlichen Prüfung:

4 Inhaltsverzeichnis Seite 1a Zusammenfassung 1 1b Summary 3 2 Einleitung Die Hypophyse Embryologie und Anatomie der Hypophyse Physiologie und Pathophysiologie der Hypophyse Hypophysenadenome Epidemiologie der Hypophysenadenome Histologie und Einteilung der Hypophysenadenome Ätiologie von Hypophysenadenomen Klinik der Hypophysenadenome Klinische Symptome bei Hypophyseninsuffizienz Klinische Symptome bei Prolaktinomen Klinik der ACTH-produzierenden Hypophysenadenome Klinik der GH-produzierenden Hypophysenadenome Klinik der TSH-produzierenden Hypophysenadenome Klinik von gonadotropen Hypophysenadenomen, plurihormonalen Tumoren und anderen nicht hormonproduzierenden Tumoren Diagnostik von Hypophysenadenomen Allgemeines Vorgehen Diagnostik von Prolaktinomen Funktionstests bei Verdacht auf ACTH-produzierende Hypophysenadenome Diagnostik von GH-produzierenden Hypophysenadenomen 31

5 Diagnostik und Funktionstests bei Verdacht auf TSH-produzierende Hypophysenadenome Diagnostisches Vorgehen bei Verdacht auf Morbus Simmonds oder hormoninaktive Tumoren (mit gonadotropen Hypophysenadenomen) Neurohypophysärer Funktionsausfal Therapie der Hypophysenadenome Allgemeine Strategie Therapie der Prolaktinome Therapie der GH-produzierenden Hypophysenadenome Therapie der ACTH-produzierenden Hypophysenadenome Therapeutisches Vorgehen bei hormoninaktiven Hypophysenadenomen, Gonadotropinomen und TSHproduzierenden Hypophysenadenomen Radiotherapie bei Hypophysenadenomen Kraniopharyngeome Definition, Epidemiologie und Ätiologie der Kraniopharyngeome Histologie und Einteilung der Kraniopharyngeome Klinik der Kraniopharyngeome Diagnostik von Kraniopharyngeomen Therapie der Kraniopharyngeome Der Wnt-Signalweg Definition und Bedeutung des Wnt-Signalwegs Die drei Achsen des Wnt-Signalwegs Der kanonische Wnt-Signalweg Die Bedeutung β-catenins 52

6 2.4.5 Charakterisierung des Axin 2/ Axil/ Conductin Der Wnt-Signalweg und seine Rolle bei der Entstehung von Krankheiten Fragestellung der Arbeit 56 3 Material und Methoden Material Patientenkollektiv Kontrollkollektiv Enzym Geräte Verbrauchsmaterialien Chemikalien Puffer und Lösungen Methoden DNA-Extraktion aus Gewebe DNA-Extraktion aus Vollblut Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Verwendete Primer Agarose-Gelelektrophorese Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus -Analyse (SSCP) Silberfärbung Elution der DNA aus Gelbanden Reinigung der PCR-Produkte 75

7 DNA-Sequenzierung Immunhistochemie 76 4 Ergebnisse Immunhistochemie SSCP-Analyse des Conductin (Axin 2/ Axil) Gens 81 5 Diskussion Nukleäre Akkumulation von β-catenin in adamantinösen Kraniopharyngeomen Mutationsanalyse von Conductin in Hypophysenadenomen und Kraniopharyngeomen Ausblick Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Danksagung Lebenslauf 120

8 a Zusammenfassung Hintergrund und Ziele: Bisher konnte die Pathogenese von Hypophysenadenomen und Kraniopharyngeomen nicht endgültig eruiert werden. Bei diesen innerhalb oder in der Nähe der Sella turcica lokalisierten Tumorentitäten scheinen in der Pathogenese deregulierte Siganalkaskaden beteiligt zu sein. So konnten einzelne Mutationen, Deletionen, Insertionen, Rearrangements oder Missense-Mutationen für APC, Axin, GSK3β und β-catenin, die für Liganden des Wnt-Signalwegs kodieren, nachgewiesen werden. Conductin als wichtige Komponente reguliert unter anderem den Abbau des β- Catenins. Bei hohen β-catenin-spiegeln wird über Transkriptionsfaktoren (LEF-1/TCF-Familie) die Transkription Wnt-responsiver Gene vermittelt. Die vorliegende Arbeit lässt sich in zwei Abschnitte unterteilen. Zunächst wurden immunhistochemisch β-catenin-anreicherungen in einem Tumorkollektiv aus Kraniopharyngeomen und Hypophysenadenomen detektiert. Aufgrund der Diskrepanz zwischen Mutationshäufigkeiten innerhalb des β-catenin Gens (80%) und der nachweisbaren immunhistochemischen Akkumulationen (94%) in den Tumorzellen, wurde eine Mutationsanalyse des Conductin Gens angeschlossen um gegebenenfalls genetische Alterationen nachzuweisen. Methoden: Die untersuchten Tumorproben wurden bei transsphenoidalen Eingriffen gewonnen. Mit standardisiertem Verfahren konnte DNA extrahiert und anschließend durch PCRs amplifiziert werden. Danach wurde die DNA thermisch denaturiert und im elektrischen Feld auf Polyacrylamidgelen nach ihren unterschiedlichen molekularen Größen aufgespaltet. Die mittels SSCP-Verfahrens detektierten, aberrant angeordneten Banden wurden aus den Polyacrylamidgelen ausgeschnitten und anschließend sequenziert, um veränderte Basenabfolgen in den Exonabschnitten der DNA aufzudecken.

9 Die immunhistochemische Färbung erfolgte mittels eines kommerziellen monoklonalen Antikörpers gegen β-catenin. Ergebnisse: In den Hypophysenadenomen wurden in vier Genabschnitten Basenveränderungen in kodierenden Bereichen gefunden: Für den Primer 1.4 konnte eine in der Literatur bereits beschriebene Mutation bei einem Patienten mit ACTH-produzierendem Hypophysenadenom detektiert werden. Durch diese Punktmutation wird die Proteinstruktur des Conductins verändert. Der Primerbereich 5.2 enthält bei drei Patienten mit adamantinösem Kraniopharyngeom eine synonyme oder stille Substitution. Ebenso konnten stille Substitutionen im Primerabschnitt 5.3 bei einem Patienten mit papillärem Kraniopharyngeom und im Abschnitt 7.3 bei weiteren sechs Patienten mit adamantinösem Kraniopharyngeom detektiert werden. Die Primerabschnitte 5.4, 6.2 und 7.1 enthielten in insgesamt 18 Kraniopharyngeomproben und in 20 Hypophysenadenomproben intronische Veränderungen. Die Kontrollproben zeigten in den Abschnitten 5.4, 6.2, 7.1, und 7.3 ebenfalls Basenveränderungen, diese traten jedoch mit geringerer Häufigkeit auf. Schlussfolgerung: In dieser Arbeit konnte eine Mutation im Conductin Gen bei einem Patienten mit einem ACTH-produzierendem Hypophysenadenom gefunden werden. Des Weiteren waren die gehäuft auftretenden intronischen Basenveränderungen in anderen amplifizierten Sequenzen auffällig. Ob diese Einfluss auf die Funktionalität des Conductins haben, muss in weiterführenden Studien geklärt werden. Conductin-Mutationen erklären somit nicht die Diskrepanz zwischen β-catenin Anreicherungen und dem Auftreten von Mutationen im β-catenin Gen. In welchem Grad andere mutierte Komponenten der Signalkaskade beteiligt sind und die Entstehung der Hypophysenadenome und Kraniopharyngeome beeinflussen, bleibt zu untersuchen.

10 b Summary Background and aims: So far the pathogenesis of pituitary adenomas and craniopharyngiomas has not been completely detected. In both of the tumors located in or near the sella turcica deregulated signalling pathways, which seem to play a significant role in their pathogenesis. Single mutations, deletions, insertions, rearrangements or missense mutations have been shown for APC, Axin, GSK3β and β-catenin, all coding for ligands of the Wnt-signaling pathway. As an important component conductin regulates among others the degradation of β-catenin. In case of high β-catenin levels the transcription of Wnt responsive genes is mediated with the help of transcription factors (LEF-1/TCF-family). This research can be divided in two parts, the immunohistochemical staining and the gene analysis. First accumulations of β-catenin were detected immunohistochemically in a group of tumor specimens consisting of craniopharyngiomas and pituitary adenomas. Because of the discrepancy between the mutation frequency in the β-catenin gene (80%) and the immunohistochemical accumulations (94%) in the tumor cell nuclei a mutation analysis of the conductin-gene was subsequently performed. Methods: The tumor specimens which were examined were obtained by transsphenoidal surgery. Their DNA was extracted using standardized techniques and subsequently amplified by PCR. Afterwards the DNA was thermally denatured and separated according to the different molecular sizes in the electric field onto polyacrylamid gels. The single-string alterations that were detected using the SSCP method, were cut out of the polyacrylamid gels and sequenced in order to find mutations in the nucleotid

11 sequence in the exons of the DNA. The immunohistochemical staining was performed using a monoclonal antibody against β-catenin. Results: Mutations of the nucleotid sequence were found in the pituitary adenomas of four exons for the protein-coding sequence. A mutation that has already been described in the literature was detected for the primer 1.4 in a patient with ACTH producing pituitary adenoma. Therefor the protein structure of the conductin was altered. In the case of three patients with adamantinomatous craniopharyngioma using the primer 5.2 we detected a synonymous or silent substitution. Equally silent substitutions could be detected with the primer 5.3 in a patient with papillary craniopharyngioma and the primer 7.3 in six other patients with adamantinomatous craniopharyngioma. Using the primers 5.4, 6.2 and 7.1 we detected intronic mutations in 18 specimens of craniopharyngiomas and in 20 cases of pituitary adenomas. Healthy tissue samples showed alterations for primersections 5.4., 6.2, 7.1 and 7.3 but not as frequently as tumor tissue. Conclusions: In this study a mutation in a conductin gene in a patient with ACTHproducing pituitary adenoma was discovered, this mutation has already been described. The frequent intronic mutations of the nucleotid sequence were considered conspicuous. The impact of these on the functionality of conductin should be examined in future studies. Mutations of conductin do not explain the discrepancy between the accumulation of β-catenin and the existence of mutations in the β-catenin gene. Therefore it remains to be examined to what extent other mutations of components of the signaling pathway are involved in and influence the development of pituitary adenomas and craniopharyngiomas.

12 Einleitung Die Bezeichnung Hypophyse stammt aus dem Griechischen und bedeutet soviel wie das unten anhängende Gewächs, der Sprössling. Im Deutschen wird die intrakraniell gelegene, endokrinologisch bedeutsame Struktur als Hirnanhangsdrüse bezeichnet. Erste bildliche Zeugnisse von Fehlfunktionen der Hypophyse stammen aus dem 2. Jahrtausend vor Christi Geburt. So findet man noch heute in Ägypten die steinerne Büste des Pharaos Amenophis III. mit Gesichtszügen, wie sie für die Akromegalie typisch sind. Es handelt sich dabei um eine Erkrankung, bei der meist durch einen hypophysären Tumor zuviel Wachstumshormon produziert wird (Kleine und Rossmanith, 2007). Die Bezeichnung Kraniopharyngeom setzt sich zusammen aus dem lateinischen Wort cranium (= Schädel), dem griechischen Wort pharynx (= Schlund) und der Endung om, die allgemein für Tumoren benutzt wird. Die Bezeichnung für den gutartigen Tumor, der in der Nähe der Hirnanhangdrüse entsteht, wurde von Cushing im Jahre 1932 eingeführt und ist seitdem allgemein geläufig. Eine deutsche Bezeichnung ist Erdheim- Tumor, nach dem Wiener Pathologen Jakob Erdheim. Bei Hypophysenadenomen und Kraniopharyngeomen handelt es sich um gutartige Tumoren, die intrakraniell in der Nähe der Sella turcica entstehen. Diese wird auch Türkensattel genannt und befindet sich in der mittleren Schädelgrube. Die Entstehung der beiden Raumforderungen ist bis heute noch nicht vollständig aufgeklärt. Sie sind monoklonalen Ursprungs, was bedeutet, dass sie aus einer veränderten Zelle entstanden sind, die sich ungehindert teilt (Sarubi et al., 2001; Herman et al., 1990; Alexander et al., 1990; Spada et al., 1994; Herman-Bonert und Fagin, 1995; Clayton et al., 2004). Monoklonale Tumoren enthalten häufig genetische Veränderungen, wie Mutationen, Deletionen und Rearrangements. Solche Modifikationen der DNA können zur Tumorentstehung beitragen. Nach der Knudsen- Hypothese sind häufig mindestens zwei Schädigungen der übergeordneten zellulären Wachstumskontrollmechanismen notwendig, bevor es zur

13 Zellentartung mit ungehindertem Wachstum kommt. In Studien des Neuropathologischen Instituts der Universitätsklinik Erlangen konnten bei Kraniopharyngeomen Mutationen im β-catenin Gen gefunden werden, einer zentralen Komponente des Wnt-Signalwegs. Dieser Signalweg übernimmt wichtige regulatorische Funktionen sowohl in der embryologischen Entwicklung als auch im Ablauf von Zellteilungen im adulten Organismus. Auf den Signalweg möchte ich später genauer eingehen, zunächst werde ich die Hypophyse, die Neubildungen der Hirnanhangsdrüse und die Kraniopharyngeome genauer erläutern. 2.1 Die Hypophyse Embryologie und Anatomie der Hypophyse Die Hypophyse besteht aus drei Teilen, die sich bezüglich ihrer Entstehung, Funktion und Morphologie unterscheiden. Der Adenohypophyse, auch Hypophysenvorderlappen (HVL) genannt, der Neurohypophyse, die ebenso als Hypophysenhinterlappen (HHL) bezeichnet wird und dem Hypophysenstiel (Abb1). Der histologisch abgrenzbare Mittellappen wird zum Vorderlappen gezählt und enthält Reste der Rachenwand. Die Neurohypophyse und der Hypophysenstiel entwickeln sich aus dem Infundibulum, einer Erweiterung und Vorwölbung des Diencephalons (= Zwischenhirn) nach caudal (Abb.2). Der HHL besteht zum einen aus Pituizyten, spezialisierten Gliazellen, die nur in der Neurohypophyse vorkommen und Transport, Speicherung und Freigabe von Hormonen in den Nervenfasern beeinflussen. Im HHL findet man des weiteren Axone der Neuronen aus den Kerngebieten des Hypothalamus. Die Nervenfortsätze stammen vor allem aus dem Bereich der vorderen Kerngruppe, zu der der Nucleus supraopticus und der Nucleus paraventricularis gehören. Diese Zellen produzieren die Hormone Oxytocin und Vasopressin, die durch Neurosekretion der Axone in den Blutkreislauf abgegeben werden und dadurch zu ihren Erfolgsorganen gelangen.

14 Abb. 1: Adaptiert aus H. Lippert, Lehrbuch Anatomie, 2006, Urban & Fischer Verlag Die Adenohypophyse ist entwicklungsgeschichtlich kein Bestandteil des Gehirns, sondern lagert sich diesem an. Sie entsteht in der dritten Embryonalwoche aus einer ektodermalen Ausstülpung des Stomadeums, die unmittelbar vor der Rachenmembran liegt und als Rathke-Tasche bezeichnet wird. Diese wächst nach dorsal in Richtung des Infundibulums und steht am Ende des zweiten Monats losgelöst vom Rachendach in enger Beziehung zum Infundibulum. Die Zellen der Vorderwand der Rathke- Tasche vermehren sich in der weiteren Entwicklung und bilden die Adenohypophyse. Später wächst aus diesen Zellen ein kleiner Lappen, die Pars tuberalis (Trichterlappen), den Infundibulumstiel entlang und umschließt ihn. Die Hinterwand der Rathke-Tasche bildet sich um zur Pars intermedia, die keine Bedeutung zu haben scheint. Wenn ein kleiner Rest

15 der Rathke-Tasche im Pharynx verbleibt, wird diese als Rachendachhypophyse bezeichnet (Abb. 2). Abb. 2: Embryologische Entwicklung der Adenohypophyse; adaptiert nach TheFetus.net Makroskopisch ist die Hypophyse in der Sella turcica, im mittleren Bereich der Schädelgrube, lokalisiert. Ein Venengeflecht, der sogenannte Sinus cavernosus, umgibt die Hypophyse. Unmittelbar benachbart liegt die Arteria carotis interna und der Nervus abducens (Vl), lateral befinden sich der Nervus occulomotorius (III), der Nervus trochlearis (IV) sowie Äste des Nervus trigeminus (V1 und V2). Kranial der Hypophyse befindet sich das Chiasma opticum aus linkem und rechtem Sehnerv. Die topographische Beziehung der Hypophyse zu den genannten intrakraniellen Strukturen ist von wichtiger klinischer Bedeutung und wird in Abbildung 3 dargestellt.

16 Abb. 3: Anatomie der Sella turcica und umgebender Strukturen aus Henry Gray, (1918) Anatomy of the Human Body. ( Mikroskopisch setzt sich der Hypophysenvorderlappen aus einer Vielzahl von Läppchen zusammen, die von einem gefäßreichen, retikulären Gewebe umgeben sind. Mit Hilfe einer Hämatoxylin-Eosin-Färbung lassen sich die einzelnen Zellgruppen des HVL unterscheiden. Hierbei erscheinen azidophile Zellen rot und basophile Zellen blau gefärbt. Chromophobe Zellen entsprechen degranulierten Zellen, die sich nicht anfärben lassen und folglich optisch leer erscheinen. In Abbildung 4 wird schematisch dargestellt wie sich azidophile und basophile Zellen aufgrund ihres Färbeverhaltens unterscheiden lassen, jedoch wird hier für das HVL- Gewebe eine Kresazanfärbung verwendet. In den verschiedenen Zellgruppen des HVL werden folgende Hormone produziert: Azidophile Zellen produzieren Wachstumshormon und Prolaktin, basophile und chromophobe Zellen Kortikotropin und Melanotropin. Follikel-stimulierendes Hormon und Luteotropes Hormon werden unter dem Begriff Gonadotropine zusammengefasst und entstehen wie das Thyroidea-stimulierende Hormon in basophilen Zellen. Im nächsten Abschnitt soll genauer auf die Funktion der verschiedenen Hormone eingegangen werden.

17 Abb. 4: Kresazanfärbung, 800 fache Vergrößerung; 1= chromophobe Zelle 2= Kapillare 3= azidophile Zelle (Wachstumshormon) 4= azidophile Zelle (Prolaktin) 5= basophile Zelle (TSH und LH) 6= basophile Zelle (Gonadotropin) 7= Stammzelle Abbildung aus H. Lippert, Lehrbuch Anatomie, 2006, Urban & Fischer Verlag Physiologie und Pathophysiologie der Hypophyse Die Freisetzung der Hormone in der Hypophyse wird über aktivierende und hemmende Signale aus dem Hypothalamus gesteuert. Das erfolgt zumeist über die Ausschüttung von Liberinen (stimulieren die Freisetzung) und Statinen (hemmen die Freisetzung). Diese werden in die Portalvenen abgegeben und gelangen so zu den Zielzellen in der Adenohypophyse. Außer Prolaktin, welches als Effektorhormon direkt auf die Brustdrüse wirkt, sind die HVL-Hormone glandotrope Hormone (Tropine), das heißt sie wirken auf endokrine Drüsen, die dann über weitere Hormonfreisetzung auf periphere Organe Einfluss nehmen. Dazu gehören auch die Hypophyse und der Hypothalamus selbst. Durch negative Rückkopplung werden die Hormonspiegel im Serum in einem Sollbereich gehalten. Steigen die Konzentrationen der Effektorhormone im Blut an, so werden die Hypophyse

18 und der Hypothalamus in ihrer weiteren Sekretion gehemmt. Die folgende Abbildung (Abb. 5) zeigt vereinfacht die Hierarchie der Hormonsteuerung als Regelkreis. Abb. 5 : Hierarchische Regulation der Hormonfreisetzung aus der Hypophyse (adaptiert nach Schäffler und Menche) Folgende Hormone werden über die Hypothalamus-Hypophysenachse produziert und reguliert: Gonadoliberin (Gonadotropin-Releasing-Hormon, GnRH) aus dem Hypothalamus stimuliert die Ausschüttung der Gonadoliberine LH (luteinisierendes Hormon) und FSH (Follikel stimulierendes Hormon) in der Hypophyse. Diese regulieren die Freisetzung der Sexualhormone (Östrogene, Gestagene und Testosteron). Corticoliberin (Corticotropin-Releasing-Hormon, CRH) fördert die Ausschüttung von Corticotropin (adrenocorticotropes Hormon, ACTH) durch die Adenohypophyse. Es stimuliert vor allem die Hormonfreisetzung durch die Nebennierenrinde (Glucocorticosteroide und Mineralocorticosteroide). Außerdem wird auch die Freisetzung von Melanotropin im HVL stimuliert (Melanozyten stimulierendes Hormon, MSH), das vor allem für die Pigmentierung der Haut verantwortlich ist.

19 Thyreoliberin (Thyreotropin-Releasing-Hormon, TRH) fördert die Hormonfreisetzung von Thyreotropin, das die Hormonbildung und das Wachstum der Schilddrüse stimuliert. Es kann ebenfalls die Ausschüttung von Prolaktin fördern, dies erfolgt jedoch auch durch Endorphine, Angiotensin II, Stress und VIP (vasointestinal peptide). Gehemmt wird die Freisetzung von Prolaktin durch Dopamin und Prolaktostatin (PIH) aus dem Hypothalamus. Hierunter ist Dopamin der wichtigste Regulator. Somit wird Prolaktin vor allem dann ausgeschüttet, wenn der Hypothalamus kein Dopamin freisetzt. Prolaktin fördet das Wachstum und die Differenzierung der Brustdrüse, hemmt die Ausschüttung von LH und FSH und kann das Immunsystem beeinflussen. Somatoliberin (Growth hormone releasing hormone, GHRH) und Somatostatin (Growth hormone release inhibiting hormone, GHRIH) regulieren die Freisetzung von Somatotropin (Growth hormone, GH oder somatotropes Hormon STH) aus der Adenohypophyse. Es fördert vor allem das Körperwachstum. Durch Stress wird auch Lipotropin (lipotropes Hormon, LPH) aus der Adenohypophyse freigesetzt, es fördert die Lipolyse. Oxytocin und Adiuretin werden in den Neuronen des Nucleus supraopticus und des Nucleus paraventricularis gebildet, die im Hypothalamus liegen. Sie gelangen über Neurosekretion in die Neurohypophyse und werden dort bei Bedarf freigesetzt. Oxytocin fördert die Kontraktion der Uterusmuskulatur, der Milchdrüsen und der Samenkanälchen. Adiuretin reguliert vor allem den Körperwasserhaushalt. Die folgende Abbildung (Abb. 6) gibt einen Überblick über die sekretorischen Mechanismen von Hypothalamus und Hypophyse.

20 Abb. 6: Hypophysen- und Hypothalamussystem, aus Taschenatlas der Physiologie, Silbernagel und Despopoulos, 2003, Thieme Verlag Der Hypothalamus kann die Hormonfreisetzung auch über das vegetative Nervensystem mit Hilfe von Adrenalin, Noradrenalin und Acetylcholin beeinflussen. Somit wird deutlich, dass die hormonelle Steuerung der Körperfunktionen über ein komplexes Zusammenspiel verschiedener Mechanismen funktioniert. Abbildung 7 stellt dies vereinfacht dar.

21 Abb. 7: Regulatorische Einbettung endokrinologischer Mechanismen, aus Taschenatlas der Physiologie, Silbernagel und Despopoulos, 2003, Thieme Verlag Funktionsstörungen hormoneller Regelkreise werden in primäre, sekundäre und tertiäre Funktionsstörungen unterteilt. Tertiäre Funktionsstörungen betreffen den Hypothalamus, der ungenügend Releasing-Hormone produziert und sezerniert. Primäre Funktionsstörungen betreffen das Zielorgan und können sowohl zu verminderter als auch gesteigerter Hormonausschüttung entweder im Zielorgan selbst oder in den übergeordneten Zentren führen. Die sekundären Funktionsstörungen betreffen die Hypophyse und sind zumeist durch Hypophysenadenome oder andere selläre Raumforderungen bedingt. In der Tabelle 1 werden die Ursachen hypophysärer

22 Funktionsbeeinträchtigung zusammengefasst. Im nächsten Kapitel werden die Hypophysenadenome genauer beschrieben. Ursachen hypophysärer Funktionsausfälle Hypophysenadenome ontogenetische Zellresttumoren Zysten und Fehlbildungen Primitive Keimzelltumoren Sonstige Tumoren Vaskuläre Veränderungen Entzündungen und Granulome Trauma Zu Grunde liegende Veränderungen hormoninaktive / hormonaktive Hypophysenadenome, Hypophysenkarzinome (extrem selten) Kraniopharyngeome, Epidermoide, Chordome, Lipome Zysten der Rathke schen Tasche, Kolloidzysten, sphenoidale Mukozelen, Arachnoidalzysten, Pseudotumor cerebri, Empty-Sella-Syndrom Dysgerminome,Teratome, ektope Pinealome, Dermoide Gliome (Astrozytome, Oligodendrogliome, Ependymome, Infundibulome, Chiasma-Opticum-Gliom), Meningeome, Enchondrome, Metastasen, primäre Lymphome Aneurysmen, Blutungen, Hämangiome Hypophysenabszesse, Sarkoidose,Tuberkulome, Histiozytosis X, Echinokokkuszysten, Autoimmunhypophysitis Operation, Bestrahlung, Schädelhirntrauma, Hypophysenstieldrehung, -abriss Tabelle 1: Ursachen Hypophysärer Funktionsausfälle, adaptiert aus MANUAL Endokrine Tumoren, 2. Auflage 2008, Tumorzentrum München 2.2 Hypophysenadenome Epidemiologie der Hypophysenadenome Das Hypophysenadenom ist die häufigste Erkrankung der Hirnanhangsdrüse. Die Inzidenz liegt bei 3-4/ Neuerkrankungen pro Jahr, die Prävalenz bei 30/ Einwohnern. Ihr Anteil unter den Hypophysentumoren beträgt 90 %. Sehr selten sind Hypophysenkarzinome, die sich nur durch den Nachweis von Metastasen diagnostizieren lassen (Lübke und Saeger, 1995). Das Hypophysenadenom zählt mit einem Anteil von 10-15% nach den Meningeomen und Glioblastomen zu den häufigsten primär intrakraniellen Neoplasien (Sanno et al., 2003). Autopsiestudien belegen, dass in bis zu 25% aller Sektionspräparate kleine Hypophysenadenome, sogenannte Inzidentalome, nachweisbar sind

23 (Burrow et al., 1981). Dabei handelt es sich fast ausschließlich um Tumoren im hormonproduzierenden Gewebe des Hypophysenvorderlappens. Meist handelt es sich um sporadische Hypophysenadenome. Nur 1% sind hereditäre Adenome im Rahmen der multiplen endokrinen Neoplasie Typ 1 (MEN1). Bei dieser Erkrankung liegt ein Komplex aus mehreren Adenomen vor mit entsprechender Symptomkombination. Betroffene Patienten entwickeln vorwiegend Nebenschilddrüsenadenome, häufig Hypophysenadenome (hauptsächlich Prolaktinome), Adenome und Karzinome aus endokrinen Pankreaszellen und vereinzelt Bronchialkarzinoide. Es handelt sich hierbei um eine autosomal-dominant vererbte Erkrankung mit Mutationen im Menin-Gen, das auf dem langen Arm von Chromosom (17q24) liegt (Dong et al., 2001) Histologie und Einteilung der Hypophysenadenome Hypophysenadenome sind Tumoren des Hypophysenvorderlappens, die wegen ihres gutartigen Wachstumsverhaltens als WHO-Grad I Tumoren klassifiziert werden (Histological typing of endocrine tumors, WHO, 2000). Ausgehend von Parenchymzellen des HVL, wachsen bis zu 42% der Adenome in benachbarte Strukturen ein (Sautner und Saeger, 1991). Lediglich 0,1 0,2% der Tumoren zeigen eine maligne Progression und Metastasierung (Davis et al., 2001). Ihre histologische Struktur lässt sich leicht von der oben beschriebenen des gesunden HVL unterscheiden. Die Adenome zeigen eine medullär-diffuse, solide, trabekuläre, sinusoidale oder pseudopapilläre Anordnung ihrer Zellverbände (Saeger et al., 2001). Häufig findet man vermehrt Kapillaren im Bereich der Adenome (Vidal et al., 2000) sowie rundliche Verkalkungen, die Psammomkörperchen genannt werden. Um die Gefäße können sich Tumorzellverbände gruppieren, die dann mikroskopisch als Pseudorosetten sichtbar werden.

24 Abb 8: HE-Färbung eines Hypophysenadenoms Abb. 9: HE-Färbung eines Wachstumhormon-produzierenden Hypophysenadenoms vom azidophilen Zelltyp; Urheber: jensflorian, Wikibooks.org; Die international gültige Klassifikation der Hypophysenadenome entstand durch Vorarbeiten von Horvath und Kovacs (Horvath und Kovacs, 1988). Sie berücksichtigt die Histologie, die Immunhistochemie, die oben erwähnten Färbeeigenschaften der unterschiedlichen Zelltypen, sowie elektronenmikroskopische Strukturen und klinisch-pathologische Symptome der Adenome (Solcia et al., 2000). Die Immunhistochemie ermöglicht den Nachweis von Hormonen in den Zellgranula der Adenome, wodurch eine Unterscheidung zwischen hormonell aktiven und hormonell inaktiven Tumoren möglich wird (Scherbaum et al., 1999). Die heute gängige Unterteilung der Adenome richtet sich in erster Linie nach dem immunhistochemischen Färbeprofil. Somit werden hormonproduzierende Adenome und nicht hormon-produzierende Adenome unterschieden. Hormoninaktive Tumoren werden unterteilt in silent Adenomas, das sind

25 HVL-Adenome die Hormone produzieren, aber nicht ausschütten, und in solche, die Hormone synthetisieren und in unterschiedlichen Mengen sezernieren, ohne klinische Symptome zu verursachen (v.a. Gonadotropine). Des weiteren in Adenome, die biologisch unwirksame Vorstufen (α-untereinheiten) produzieren, und in Nullzelladenome und Onkozytome, die keine Hormone produzieren (Stalla, 2008). Hormonproduzierende Adenome werden weiter unterteilt nach der Dichte der anfärbbaren Granula, nach der klinischen Symptomatik und nach dem produzierten Hormon oder der Kombination der produzierten Hormone. Die Häufigkeit ihres Auftretens, die entsprechende Klinik, die Histopathologie und das Antikörperprofil sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Adenomtyp Immunologischer Hormonnachweis FSH und/oder LH (α-subunit) FSH/LH-Zell- Adenom Nullzelladenom gering granuliertes Prolaktinzelladenom dicht granuliertes ACTH-Zell- Adenom dicht granuliertes STH-Zell- Adenom gering granuliertes STH-Zell- Adenom gering granuliertes ACTH-Zell- Adenom onkozytäres Adenom gemischtes STH/Prolaktin- Zell-Adenom Plurihormonales Adenom Prolaktin (α- Subunit) Wichtigste Kriterien Klinik Häufig -keit (in %) elongiert oder angedeutet vakuoläre Zellen, chromophob, oft onkozyt. Anteile kleine gleichförmige chromophobe Zellen, oft onkozytäre Anteile oft elongierte chromophobe Zellen, meist Schrumpfung unter Dopaminagonisten inaktiv, selten Gonadotropin-Exzess 23,5 inaktiv 14,6 Hyperprolaktinämie ACTH (α-subunit) stark PAS-positiv granuliert Morbus Cushing, evtl inaktiv STH (Prolaktin, α- Subunit, TSH, FSH, LH) STH (Prolaktin, α- Subunit, TSH, FSH, LH) azidophil fibrous bodies : keratinpositive paranukleäre Körper Akromegalie, sehr selten inaktiv Akromegalie, selten inaktiv ACTH (α-subunit) schwach PAS-positiv Morbus Cushing, evtl. inaktiv STH/Prolaktin (α- Subunit, TSH) STH/Prolaktin/TSH /FSH/LH, TSH/FSH/LH, Prolakt/ACTH usw. große, leicht azidophile Zellen, Nachweis durch Elektronenmikroskopie oder Semidünnschnitte dicht oder gering granulierte STH-Zellen, wie bei gering u. dicht granuliertem STH-Zell-Adenom; neben Prolaktin-zellen wie bei gering granuliertem Prolaktinzelladenom uneinheitlich 10 6,9 5,7 5,4 5,1 inaktiv 4,8 Akromegalie mit Hyperprolaktinämie oft Akromegalie, uneinheitlich 3,2 1,8

26 Adenomtyp Immunologischer Hormonnachweis TSH (α-subunit, STH, Prolaktin) TSH-Zell- Adenom Mammosomatropes Adenom dicht granuliertes Prolaktinzelladenom Crooke-Zell- Adenom STH/Prolaktin (α- Subunit, TSH) Prolaktin/STH Wichtigste Kriterien Klinik Häufig -keit (in %) kleine Zellen oder elongierte Zellen, chromophob azidophil (wie dicht granuliertes STH-Zell- Adenom), einheitlicher Zelltyp onkozytär wie okozytäres Adenom, Beweis durch elektronenmikroskop. Nachweis von Hyperthyreose, Hypothyreose, evtl Euthyreose Akromegalie mit Hyperprolaktinämie azidophiles Stammzelladenom Hyperprolaktinämie, evtl leichte Akromegalie Riesenmitochondrien Prolaktin azidophil Hyperprolaktinämie ACTH aus Crooke-Zellen aufgebaut (intrazytoplasmatischer, keratinpositiver hyaliner Ring) 1,4 0,8 0,3 0,2 inaktiv 0,1 Tabelle 2: Die Klassifikation beruht weitgehend auf der WHO-Einteilung, jedoch mit Vereinfachungen bei den inaktiven ACTH-Zell-Adenomen und den FSH/LH-Zell-Adenomen. Weiterhin spielen die Invasivität des Tumors und seine Größe eine Rolle. Adenome mit einem Durchmesser unter 10 mm werden Mikroadenome und solche mit einem Durchmesser größer als 10 mm Makroadenome genannt. Diese Unterteilung ist vor allem für die Diagnostik und die Therapie wichtig Ätiologie von Hypophysenadenomen Die Ätiologie der Hypophysenadenome ist bislang nicht vollständig geklärt. Anfänglich gab es zwei Theorien für deren Ursprung. Zum einen die Hypothese der exzessiv ungehemmten Hormonausschüttung, die eine Tumortransformation einleitet, zum anderen das Modell der Entwicklung aus intrinsischen hypophysären Defekten. Der Nachweis des monoklonalen Ursprungs der sporadischen Adenome ließ den Schluss zu, dass sie aus somatischen Genveränderungen einer einzelnen Zelle enstehen. Nach der Knudsen Hypothese sind mindestens zwei Alterationen nötig, um eine klonale Expansion einzuleiten. Die Tumorneovaskularisation (Neubildung

27 von Gefäßen im Tumor) ist wichtig für die Progression des ungehemmten Wachstums. Unter anderem tragen laut mehrerer Studien hypophysiotrope Hormone, die insuffiziente Ausschüttung von Suppressorhormonen und einige Wachstumsfaktoren dazu bei (Asa et al., 1998). Somit ist es wahrscheinlich, dass Mechanismen beider Theorien der Entstehung von Hypophysenadenomen zugrunde liegen. Kausale genetische Veränderungen konnten bislang nur vereinzelt identifiziert werden. Neue Studien postulieren die Beteiligung eines alterierten Tyrosinkinase- Rezeptors (Dworakowska et al., 2009). Im nächsten Abschnitt soll differenziert auf die Beschwerden der Patienten mit Hypophysenadenomen eingegangen werden Klinik der Hypophysenadenome Klinische Symptome bei Hypophyseninsuffizienz Zunächst sollen kurz die Symptome einer Hypophyseninsuffizienz dargestellt werden, wie sie bei allen Raumforderungen im Sellabereich auftreten können. Die klinischen Symptome resultieren aus der Lage und der Ausdehnung des Prozesses (Shimon und Melmed, 1998; Scherbaum et al., 1999; Schweikert, 1999). Ist die Raumforderung groß genug, kommt es durch Druckatrophie zunächst zur Beeinträchtigung der somatotropen - und gonadotropen Partialfunktionen, später fallen thyreotrope und kortikotrope Funktionen aus. Die klinischen Symptome der supprimierten Hormonachsen fasst Tabelle 3 zusammen. Ausfall der somatotropen Funktion Ausfall der gonadotropen Funktion Kleinwuchs im Kindes- und Jugendalter veränderte Körperzusammensetzung mit reduzierter Muskelmasse und vermehrter abdomineller Fetteinlagerung Fettstoffwechselstörung: erhöhtes LDL und erniedrigtes HDL erhöhtes Arterioskleroserisiko reduzierte körperliche Leistungsfähigkeit verminderte oder fehlende Achsel- und Schambehaarung vermehrte periokuläre und periorale Fältelung der Haut bei der Frau: Oligo- oder Amenorrhö, Mammaatrophie, Infertilität beim Mann: Infertilität, Libido- und Potenzminderung, kleine, weiche Testes

28 Ausfall der thyreotropen Funktion Ausfall der kortikotropen Funktion Kälteintoleranz Neigung zur Gewichtszunahme Müdigkeit Lethargie Wesensveränderung Bradykardie blasses Hautkolorit Schwäche Müdigkeit Apathie Gewichtsverlust Übelkeit Erbrechen in Stresssituationen Hypoglykämie Hypotonie Tabelle 3: Symptome einer Hypophysenvorderlappeninsuffizienz, aus MANUAL Endokrine Tumoren, 2. Auflage 2008, Tumorzentrum München Frühsymptome hypophysärer und hypothalamischer Erkrankungen sind im Allgemeinen Zyklusstörungen und Amenorrhö sowie Libidostörungen und Potenzverlust. Später, nach Massenzunahme des Tumors, kann eine Kompression des Chiasma opticum zu einem beidseitigen Gesichtsfeldausfall führen (bitemporale homonyme Hemianopsie) und im weiteren Verlauf zu einer Atrophie des Sehnervs und zu einem Visusverlust. Symptome einer allgemeinen Druckerhöhung im Gehirn wie Kopfschmerzen, Übelkeit, Erbrechen und Augenmuskellähmungen, durch Kompression der zugehörigen Nerven im Sinus cavernosus, können ebenfalls auftreten. Außerdem kann es zu einer Kompression des Hypophysenstiels kommen. Dadurch wird der inhibierende Dopamintransport zum HVL beeinträchtigt und es resultiert eine Entzügelungs-Hyperprolaktinämie. Die Differentialdiagnose zwischen Makroprolaktinom und hormoninaktivem Makroadenom mit Entzügelungs- Hyperprolaktinämie ist unter Umständen schwierig (Stalla, MANUAL Endokrine Tumoren, 2008) Klinische Symptome bei Prolaktinomen Prolaktinome sind häufig endokrin aktiv. Sie treten vor allem bei Frauen im mittleren Alter auf, führen zu Oligo- oder Amenorrhö und unerfülltem Kinderwunsch, seltener zu ein- oder beidseitiger Laktation. So findet man

29 bei 30% der Frauen mit sekundärer Amenorrhö ein Prolaktinom. Bei männlichen Patienten sind häufig Libidoverlust und Potenzstörungen zu beobachten. Ein Hypogonadismus ensteht durch erhöhtes Prolaktin, das zu einer Hemmung der Ausschüttung von LHRH im Hypothalamus führt. Dadurch fehlt die pulsatile Freisetzung von LH und FSH in der Hypophyse (Lui et al., 1995) Klinik der ACTH-produzierenden Hypophysenadenome ACTH-produzierende Tumoren der Hypophyse haben einen Anteil von 12% an den hormonproduzierenden Tumoren und verursachen den Morbus Cushing, der als das zentrale, endogene Korrelat eines Kortisol- Überschusses definiert ist. In 80% der Fälle ist ein ACTH-bildendes Hypophysenadenom Ursprung des M. Cushing im Erwachsenenalter. Klinische Symptome sind, wie auch bei anderen Ursachen für eine Zunahme der Kortisolproduktion, die Stammfettsucht, das typisch gerötete Vollmondgesicht, die Atrophie der proximalen Muskulatur, Müdigkeit und Leistungsabfall, Striae distensae, Störungen der Sexualfunktionen, Hirsutismus, psychopathologische Erscheinungen wie Depression, Schlafstörungen und Angstzustände, glukokortikoid bedingte Osteoporose, Hypertonie und eine diabetische Stoffwechsellage. Tabelle 4 stellt die Häufigkeit der genannten Symptome dar. Symptome Häufigkeit (%) Rotes, gerundetes Gesicht (Vollmond, Plethora) 90 Stammbetonte Fettsucht 85 Hypertonie 85 Hypogonadismus (Amenorrhö, Libido- und Potenzverlust) 80 Osteoporose 75 Striae rubrae, hämorrhagische Diathese 65 Muskelschwäche 60 Hirsutismus (bei Frauen) 70 Knöchelödeme 55 Büffelnacken 55 Akne 55 Rücken- und Knochenschmerzen 50 Psychische Veränderungen 45 Schlechte Wundheilung (Ulcus cruris) 35 Polyurie, Polydipsie 30

30 Kyphose 25 Nierensteine 20 Leichte Polyzythämie 20 Tabelle 4: Symptome des M.Cushing nach Häufigkeit ihres Auftretens geordnet, aus Stalla GK et al. Hypophysentumoren und andere selläre Raumforderungen, Göke B., Fürst H., Reinecke M. (Hrgb), 2. Auflage, Zuckschwerdt-Verlag, München, 2008, Eine Sonderform der ACTH-produzierenden Adenome stellt der Nelson- Tumor dar. Er wächst invasiv und tritt bei rund 29% der Patienten mit beidseitiger Adrenalektomie auf. Das klinische Bild des Nelson-Syndroms setzt sich zusammen aus dem Nelson-Tumor (einem ACTH-produzierenden Hypophysenadenom) und dem Auftreten eines braun pigmentierten Hautkolorits Klinik der GH-produzierenden Hypophysenadenome Wachstumshormon-produzierende Adenome, auch STH-/GH-Zell-Adenome genannt, sind ebenfalls häufig endokrin aktive Tumoren. Sie verursachen das typische Bild der Akromegalie mit pathologischem Wachstum von Stützgewebe, Proliferation der Haut und der inneren Organe. Bei etwa der Hälfte der Patienten kann eine pathologische Glucosetoleranz gemessen werden. Bei Kindern mit noch nicht erfolgtem Epiphysenschluss resultiert ein Gigantismus. 40% dieser Tumoren weisen eine Punktmutation im Gs- Membranprotein auf. Das Protein reguliert die intrazelluläre Adenylatzyklase, ein Enzym, das bei der Vermittlung der Hormonwirkung eine Rolle spielt. Die bis um das Vierfache erhöhte Mortalität der Patienten ist vor allem durch die Entwicklung folgender Pathologien bedingt: Zum einen die akromegale Kardiomyopathie (die sich durch Kardiomegalie im Rahmen der Viszeromegalie, durch den arteriellen Hypertonus und durch die Hyperinsulinämie entwickelt) und zum anderen respiratorische Erkrankungen, wie das Schlaf-Apnoe-Syndrom. Zudem werden bei Patienten mit Akromegalie vermehrt Kolonpolypen und in Jodmangelgebieten gehäuft Strumen diagnostiziert. Unbehandelt können des Weiteren schwere Arthropathien auftreten, die mit starken

31 Bewegungseinschränkungen der Patienten einhergehen. Die folgende Tabelle (5) stellt die Symptome und deren Häufigkeit bei Akromegalie dar. Symptome Häufigkeit (%) Vergrößerung der Akren 100 Kopfschmerzen Zyklusstörungen bei Frauen Sehstörungen Hyperhidrosis Hypertrichosis Libidoverlust Karpaltunnelsyndrom Gelenkbeschwerden Arterielle Hypertonie Schlafapnoe Tabelle 5: Symptome mit Häufigkeit ihres Auftretens bei Akromegalie, aus Stalla GK et al. Hypophysentumoren und andere selläre Raumforderungen, Göke B., Fürst H., Reinecke M. (Hrgb), 2. Auflage, Zuckschwerdt-Verlag, München, 2008, Klinik der TSH produzierenden Hypophysenadenome TSH-produzierende Hypophysenadenome führen zu einer Überfunktion der Schilddrüse, indem vermehrt Thyreoidea-stimulierendes Hormon (TSH) freigesetzt wird. Dieser Tumor ist äußerst selten (<1% der Hypophysenadenome) und führt zu Unruhe, Gewichtsverlust, vermehrtem Schwitzen, Schlafstörungen, Herzklopfen und Amenorrhö bei den weiblichen Patienten Klinik von gonadotropen Hypophysenadenomen, plurihormonalen Tumoren und anderen nicht hormonproduzierenden Tumoren Gonadotrope Adenome, mit einem hohen Anteil von rund 24 % an den hormonproduzierenden Tumoren, fallen vor allem durch Symptome der intrakranielle Massenzunahme auf. In den Blutproben der Patienten können

32 bei hormonell aktiven Tumoren erhöhte Hormonspiegel von LH und FSH gemessen werden, die jedoch klinisch häufig unauffällig bleiben. Plurihormonale Tumoren machen nur einen geringen Anteil der Hormonproduzierenden Adenome aus. Bei entsprechenden Patienten findet man eine Symptomkombination entsprechend der produzierten Hormone. Inaktive Tumoren, wie das Nullzelladenom, das onkozytäre Adenom und das Crooke-Zell-Adenom, bilden in etwa einen Anteil von 20% der Hypophysenadenome. Klinisch treten diese ebenso vor allem durch Symptome der intrakraniellen Massenzunahme in Erscheinung Diagnostik von Hypophysenadenomen Allgemeines Vorgehen Die Diagnostik der Hypophysenadenome setzt sich aus Anamnese, Hormonanalyse, bildgebender Diagnostik und gegebenenfalls einer ophthalmologischen Untersuchung zusammen. Bei Patienten mit akuter Visusminderung muss eine sofortige Abklärung durch eine Magnetresonanztomographie (MRT) erfolgen. Die MRT-Untersuchung ermöglicht in vielen Fällen bereits eine Differenzierung der tumorösen Struktur in Adenome und andere Raumforderungen im Bereich der Sella turcica. Durch T1-gewichtete Aufnahmen nach Kontrastmittelgabe ist es möglich, auch Mikroadenome im normalen Hypophysengewebe zu erfassen. Bei der Diagnostik eines Makroadenoms oder einer anderen größeren sellären Raumforderung sollte eine umfangreiche Hormondiagnostik erfolgen. Dies ist bei Mikroadenomen nicht zwingend erforderlich. Hier muss vor allem ein Prolaktinom oder ein beginnendes Cushing-Syndrom ausgeschlossen werden. Vor einem operativen Eingriff wird eine Hormondiagnostik durchgeführt, um hormonaktive von hormoninaktiven Adenomen zu differenzieren. Ein Prolaktinom muss ausgeschlossen werden, weil es auch als Makroadenom primär medikamentös therapiert wird. Perioperativ werden bei großen Raumforderungen immer Hydrokortison und gegebenenfalls ADH-Analoga

33 verabreicht, um einem Diabetes insippidus oder einer akuten Entgleisung der Elektrolyte (Addison-Krise) vorzubeugen. Postoperativ kann das verabreichte Hydrokortison in der Regel wieder kontrolliert abgesetzt werden. Aufgrund der Nähe zur Sehbahn verursachen supraselläre Raumforderungen häufig Sehstörungen. Es kann eine Kompression des Nervus opticus, des Chiasma opticum oder des Tractus opticus vorliegen, die zu Sehstörungen mit Gesichtsfeldausfällen oder einer Optikusatrophie führen. Zur Diagnosestellung wird eine Visusprüfung oder eine sensitivere Gesichtsfeldperimetrie durchgeführt, die es auch Computer-assistiert gibt. Die MRT-Untersuchung ist die Methode der Wahl bei klinisch gegebener Indikation zur Untersuchung der Sellaregion sowie vor Operationsplanung (Jansen und Hartmann, 2001). Folgende Abbildungen zeigen die MRT- Aufnahmen eines Hypophysenadenoms (Abb. 10) und eines suprasellären, zystischen Kraniopharyngeoms (Abb.11). Abb. 10: Hypophysenmakroadenom (schwarzer Pfeil) mit deutlicher Anhebung der Sehnervenkreuzung (Chiasma opticum = roter Pfeil). cmr; Dieses Foto ist öffentlich. Hochgeladen:

34 Abb. 11: Kraniopharyngeom: suprasellär gelegen, partiell zystisch; nach Magnevist-Gabe. Dreiecke umschließen den Tumor, dünne Pfeile markieren das Diaphragma sellae, dicker Pfeil zeigt eine Zyste der Pars intermedia der Hypophyse, adaptiert nach M.Reiser, W. Semmler. Magnetresonanztomographie, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2002, 380. Je nach Fragestellung können auch eine Computertomographie oder eine Single-Photon Emissionscomputerto-mographie (SPECT) zur Diagnostik nötig sein. Bei der Darstellung eines Makroadenoms mit supra- und/ oder parasellärem Anteil muss differentialdiagnostisch vor allem an Meningeome, Kraniopharyngeome, Gliome, Metastasen, Rathke-Zysten und andere seltenere Tumoren gedacht werden (siehe auch Tabelle 1). Mikroadenome müssen von eingebluteten Zysten unterschieden werden. Es können auch sehr kleine Adenome vorliegen, die aufgrund ihrer geringen Größe der Bildgebung entgehen, wie es häufig bei unter 3mm großen ACTH sezernierenden Adenomen der Fall ist. Dann ist vor allem die hormondiagnostische Abklärung wichtig. Basale Hormonspiegel sind für die Diagnostik meist nicht ausreichend. Eine Unterscheidung von kompletter und partieller HVL-Insuffizienz oder die Identifizierung der Ursache der Störung als hypothalamische oder hypophysäre Schädigung, erfordert spezielle Suppressions- oder Stimulationstests die im Folgenden genauer erläutert werden sollen.

35 Diagnostik von Prolaktinomen Die Bestimmung basaler Hormonspiegel im Serum ist grundlegend für die Diagnose eines Prolaktinoms. Die Blutentnahme sollte möglichst am Vormittag, mindestens eine Stunde nach dem Aufwachen, erfolgen. Die Normgrenze für Prolaktin liegt für Frauen bei 25 µg/l, für Männer bei 20µg/l. Werte zwischen 25 - <200 µg/l erfordern eine eingehende Medikamentenanamnese, die Erwägung einer Entzügelungs- Hyperprolaktinämie sowie weitere mögliche Differentialdiagnosen. Basale Spiegel über 200 µg/l sind nahezu beweisend und erfordern bei Makroadenomen die Abklärung der weiteren Hypophysenachsen. Hierbei ist vor allem auf die Bestimmung von TSH und der freien Schilddrüsenhormone zu achten. Eine Hypothyreose kann auch zu leichter Prolaktinämie führen. Die Bestimmung der Gonadotropine, des Estradiolspiegels bei der Frau und des Testosterons beim Mann sollte zum Ausschluss eines sekundären Hypogonadismus erfolgen. Bei erhöhten Hormonwerten und fehlender Symptomatik muss an das Vorliegen eines sogenannten Makroprolaktins gedacht werden, bei dem fälschlich erhöhte Prolaktinspiegel gemessen werden. Durch die Verwendung spezieller Tests kann in der Regel der richtige Wert bestimmt werden. Tabelle 6 fasst kurz die Diagnostik für den Nachweis eines Prolaktinoms zusammen. Hormonanalytik Bildgebende Diagnostik Ergänzende Untersuchungen 1. Bestimmung des Prolaktinspiegels, gegebenenfalls mehrfach; PEG-Fällung zum Ausschluss einer Makroprolaktinämie 2. Bestimmung der Gonadotropine LH und FSH sowie des Testosteronspiegels beim Mann und des Estradiolspiegels bei der Frau zum Ausschluss oder Nachweis eines sekundären Hypogonadismus 3. Überprüfen der hypophysären Partialfunktionen bei Raumforderung im Bereich der Sella, insbesondere bei einer Tumorgröße von > 1 cm Magnetresonanztomographie der Sellaregion 1. augenärztliche Untersuchung, insbesondere bei Raumforderung > 1 cm 2. bei länger bestehender Hyperprolaktinämie mit Oligo- oder Amenorrhö bzw. Hypogonadismus: Osteodensitometrie zum Nachweis einer relevanten Knochendichteminderung Tabelle 6: Diagnostik des Prolaktinoms aus MANUAL Endokrine Tumoren, 2.Auflage 2008, Tumorzentrum München

36 Funktionstests bei Verdacht auf ACTH-produzierende Hypophysenadenome ACTH-produzierende Hypophysenadenome müssen von anderen Ursachen, die ebenso einen erhöhten ACTH-Spiegel bedingen (unter anderem in Tabelle 7 dargestellt), aber keiner neurochirurgischen Intervention bedürfen, unterschieden werden. Vor allem ist eine Abgrenzung zu ektopen ACTH-produzierenden Tumoren und zu Nebennierentumoren, die Kortisol produzieren, wichtig. Tabelle 7 listet die unterschiedlichen Tumorentitäten auf. Des Weiteren kann das Cushing- Syndrom medikamentös oder ethyltoxisch induziert sein und bedarf in diesem Falle keines chirurgischen Eingriffs. ACTH-abhängige Form (zirka 85%) ACTH-unabhängige Form (zirka 15%) Morbus Cushing (= ACTH-sezernierendes Hypophysenadenom) Ektope ACTH-Bildung, z. B. kleinzelliges Bronchialkarzinom (10 15%) oder Bronchialkarzinoide Ektope Bildung von CRH oder anderer Peptide, die ACTH stimulieren (extrem selten) Nebennierenrindenadenom (zirka 10%) Nebennierenrindenkarzinom Bilaterale mikro- oder makronoduläre Nebennierenrindenhyperplasie (0,5 1%) Iatrogenes Cushing-Syndrom durch exogene Glukokortikoidgabe Tabelle 7: Ursachen für eine gesteigerte Kortisolproduktion, unterteilt in ACTH- abhängige und ACTH-unabhängige Formen, aus Stalla GK et al. Hypophysentumoren und andere selläre Raumforderungen, Göke B., Fürst H., Reinecke M. (Hrgb), 2. Auflage, Zuckschwerdt-Verlag, München, 2008, Erst mit Hilfe der biochemischen Tests kann der Tumor lokalisiert und eine Bildgebung veranlasst werden. Zum Ausschluss des Cushing-Syndroms erfolgt der 2 mg-dexamethason-hemmtest: nach Verabreichen von 2 mg Dexamethason i.v. fällt der Serumspiegel unter 1,8 µg/dl Kortisol. Bei pathologischem Test schließt sich zunächst die mehrfache Messung des Kortisols um 23:00 Uhr im Speichel oder Serum an, danach wird die Diagnose mit Hilfe der Bestimmung des freien Kortisols im 24-Stunden-Urin gesichert. Bei gesunden Personen folgt die Freisetzung von Kortisol einer Tagesrhythmik, die niedrigsten Serumkonzentrationen zeigen sich um 23:00 Uhr. Diese physiologischen Spiegelunterschiede sind bei Patienten mit

37 Cushing-Syndrom nicht vorhanden. Einen Überblick über die Stufendiagnostik zur Sicherung des Cushing-Syndroms mit Angabe der Grenzwerte und des Testprinzips gibt Tabelle 8. Testverfahren Testprinzip Interpretation Dexamethason-Hemmtest (2 mg, 23:00 Uhr oral, Blutentnahme 8:00 Uhr) Mitternächtlicher Serum- Kortisol-Spiegel (23:00 24:00 Uhr) Mitternächtlicher Speichel-Kortisol-Spiegel (23:00 24:00 Uhr) Ausscheidung des freien Kortisol im 24-Stunden- Urin Suppressionstest Kortisol-Tagesrhythmik Kortisol-Tagesrhythmik zeitintegrierte Kortisol- Sekretion Norm: < 1,8 μg/dl Graubereich: 1,8 2,9 μg/dl pathologisch: > 3 μg/dl Norm: < 3,0 μg/dl Graubereich: 3,0 4,9 μg/dl pathologisch: > 5 μg/dl Norm: < 1,0 ng/ml Graubereich: 1,0 2,4 ng/ml pathologisch: > 2,5 ng/ml Norm: < 100 μg/tag Graubereich: μg/tag pathologisch: > 200 μg/tag Tabelle 8: Stufendiagnostik des Cushing-Syndroms aus MANUAL Endokrine Tumoren, 2.Auflage 2008, Tumorzentrum München Nach der Diagnose eines Cushing-Syndroms folgen weitere biochemische Tests zur Lokalisation der Hormonüberproduktion bzw. zur Unterscheidung eines Morbus Cushing (zentral, hypophysär) von einer ektopen ACTH- Produktion. Die Testverfahren der Wahl sind der CRH-Test und der hochdosierte Dexamethason-Hemmtest. In Fällen einer nicht zweifelsfreien Unterscheidung von hypophysärer oder paraneoplastisch bedingter ACTH- Überproduktion kann in speziellen Zentren eine selektive Katheterdiagnostik durchgeführt werden. Hierbei wird beidseits über die Vena femoralis ein Katheter bis in den Sinus petrosus inferior vorgeschoben und anschließend eine bilaterale ACTH-Bestimmung vor und nach der Gabe von CRH durchgeführt. Das erfolgt unter gleichzeitiger peripherer Blutentnahme in den Abständen Minuten nach CRH-Gabe. Für das zentrale Cushing-Syndrom spricht ein deutlich höherer ACTH-Spiegel nach Stimulation (Gradient 3,0) im Sinus petrosus verglichen mit den Werten der Peripherie. Die folgende Tabelle (9) zeigt die biochemischen Tests zur Differenzierung von adrenaler, hypophysärer und ektoper ACTH- Produktion.

38 Testverfahren / ACTH/Kortisol- Bestimmungen Adrenal (ACTHunabhängig) Hypophysär (ACTH-abhängig) Ektop (ACTH-abhängig) Plasma-ACTH basal niedrig bis normal oder supprimiert hoch bis normal oder erhöht erhöht bis stark erhöht CRH-Test (Injektion von 100 μg CRH i.v. oder 1 μg/kg KG, Bestimmung von Kortisol und ACTH nach 0, 15, 30 und 60 Minuten) ACTH supprimiert kein Kortisol-Anstieg ACTH-Anstieg > 50% Kortisol-Anstieg > 30% kein ACTH-Anstieg kein Kortisol- Anstieg Dexamethason-Hemmtest (4 x 0,5 mg Dexamethason über 2 Tage, dann 4 x 2 mg über 2 Tage; alternativ 8 mg um 23:00 Uhr) kein Serum- Kortisol-Abfall Serum-Kortisol- Abfall > 50% des Ausgangswertes Kein Serum- Kortisol-Abfall Sinus-petrosus-Katheter (mit CRH-Stimulation, ACTH-Bestimmung nach 0, 2, 5, 10 Minuten) entfällt ACTH-Gradient zentral-peripher 3,0 vor und/oder nach CRH-Stimulation ACTH-Gradient zentral-peripher < 3,0 nach CRH- Stimulation Tabelle 9: Biochemische Tests zur Lokalisation der Kortisolüberproduktion adaptiert aus MANUAL Endokrine Tumoren, 2.Auflage 2008, Tumorzentrum München Bei Diagnose eines ektopen Cushing-Syndroms muss nach der Lokalisation gesucht werden. Hierbei sind Schilddrüsensonographie, MRT oder CT des Halses, eine CT von Thorax oder Abdomen und Octreotidszintigraphie sowie Dopa-PET einsetzbar. Das alkoholinduzierte Pseudo-Cushing- Syndrom lässt sich durch erhöhte Leberwerte und eine positive Anamnese abgrenzen Diagnostik von GH-produzierenden Hypophysenadenomen Das Wachstumshormon (Somatotropin) wird physiologischer Weise pulsatil freigesetzt, daher ist eine einmalige Bestimmung des Serumspiegels nicht aussagekräftig. Der insulinartige Wachstumsfaktor 1 (IGF-1, Somatomedin C) vermittelt die meisten Effekte des Wachstumshormons und weist konstante Serumspiegel auf. Wird dieser Wert zum Ausschluss einer Akromegalie herangezogen, müssen altersbezogene Normwerte und

39 mögliche Störeffekte durch IGF-Bindungsproteine berücksichtigt werden. Zur zusätzlichen Absicherung der Diagnose wird der orale Glucosetoleranztest (ogtt) herangezogen. Das Testprinzip basiert auf der physiologischen Supprimierbarkeit des Wachstumshormons bei Ingestion von 75mg Glucose auf Werte unter 0,2 ng/ml. Blutentnahmen erfolgen über 2 Stunden alle Minuten. Ein Abfall des GH unter 0,5 ng/ml schließt eine Akromegalie aus. Nicht supprimierbare Werte oder ein paradoxer Anstieg von GH im Serum gelten als beweisend für eine Akromegalie bei entsprechendem Tumornachweis im MRT. Bei unklarer Bildgebung mit diffuser Hyperplasie des HVL sollte einmalig GHRH bestimmt werden, um einen GHRH Exzess durch ektope Produktion als Ursache auszuschließen. In dem seltenen Fall, dass der Symptomatik solch ein Tumor zugrunde liegt, wird zunächst mittels Octreotid-Szintigraphie nach der Lokalisation gesucht und danach zur genauen Bildgebung gezielt eine CT oder MRT- Untersuchung angeschlossen. Außerdem erfolgen Sonographie des Abdomens und Echokardiographie zur Beurteilung einer möglichen Organomegalie Diagnostik und Funktionstests bei Verdacht auf TSHproduzierende Hypophysenadenome Bei erhöhten freien Schilddrüsenhomonen und nicht adäquat supprimiertem TSH muss an ein TSH-produzierendes Adenom gedacht werden. Zur Abklärung erfolgt zunächst eine Bildgebung, da nicht ein einzelner Wert die Diagnose sichert, sondern die Zusammenschau aller Befunde ausschlaggebend ist. Das sind bei TSH-produzierenden Adenomen: keine erhöhte Freisetzung von TSH im TRH-Test, keine Suppression durch T3- Gabe (Trijodthyronin = peripheres Schilddrüsenhormon) und ein erhöhter Quotient aus α-untereinheit und TSH im Serum. In seltenen Fällen zeigt die Bildgebung keinen eindeutigen Befund obwohl biochemische Tests für ein Adenom sprechen. Dann werden Verfahren wie Octreotid- oder Pentreotid- Scan, PET oder Sinus-Petrosus-Katether zur genauen Diagnose eingesetzt.

40 Diagnostisches Vorgehen bei Verdacht auf Morbus Simmonds oder hormoninaktiven Tumoren (mit gonadotropen Hypophysenadenomen) Synthetisch hergestellte Releasing-Hormone stimulieren in der gesunden Hypophyse die Freisetzung ihrer entsprechenden Effektor-Hormone. Ein Panhypopituitarismus (= vollständige Hypophyseninsuffizienz) liegt bei einem totalen Ausfall der Hormonproduktion und somit keiner Stimulierbarkeit der Hormonfreisetzung im CRH-, GnRH-, GHRH-, und TRH-Test vor. Dieses Krankheitsbild wird auch als Morbus Simmonds bezeichnet. Häufiger ist aber der partielle Ausfall der Hormonproduktion, der mit den oben beschriebenen Tests und Basalspiegelbestimmungen diagnostiziert wird. Hormoninaktive Tumoren fallen vor allem durch die intrakranielle Massenzunahme und die damit einhergehenden Symptome auf. Diese wurden bereits weiter oben beschrieben. Bei gonadotropen Adenomen verhält es sich ähnlich, da diese zumeist auch bis zur gesteigerten Massenzunahme klinisch stumm bleiben und erst dann symptomatisch werden. Im Serum können erhöhte Hormonspiegel von FSH und LH bestimmt werden Neurohypophysärer Funktionsausfall Hierbei steht vor allem der Diabetes insipidus im Vordergrund. Er ist Folge eines ADH-Mangels (Vasopressin-Mangels). Das klinische Bild zeigt einen vermehrten Wasserverlust über die Niere, da die Fähigkeit der Niere bei verminderter Wasserzufuhr konzentrierteren Harn zu produzieren, durch den ADH-Mangel verloren geht. Die Überprüfung der Funktion des HHL erfolgt durch den Durstversuch. Patienten erhalten ab dem Morgen nichts zu trinken und es werden engmaschig Harnmenge, Urinosmolalität, Körpergewicht, -temperatur, Blutdruck, Puls, Serumosmolarität und Natrium

41 im Serum kontrolliert. Ein Diabetes insipidus, das heißt eine unzureichende Freisetzung von ADH aus der Neurohypophyse, liegt vor, wenn die Urinosmolalität im Vergleich zum Ausgangswert nicht ansteigt. Außerdem findet man eine Reduktion des Körpergewichts, steigende Natriumkonzentration und Serumosmolarität. Steigt hingegen die Urinosmolalität auf Werte über 750 mosmol/kg, kann ein ADH-Mangel ausgeschlossen werden. Der Durstversuch darf nur dann durchgeführt werden, wenn die Ausgangswerte nicht bereits hochpathologisch sind. Der Test muss bei einer Urinausscheidung von 2l/ 4h abgebrochen werden. Soll ein Diabetes insipidus renalis ausgeschlossen werden, verabreicht man dem Patienten vor Beendigung des Tests DDAVP, womit das Ansprechen der Niere auf synthetisches ADH überprüft wird. Bei DDAVP handelt es sich um Desmopressin-acetat, ein synthetisch hergestelltes ADH-Analogon, das unter anderem zur Therapie des Diabetes insipidus eingesetzt wird. Der zentrale ADH-Mangel ist in über 2/3 der Fälle erworben. Ihm liegt meist eine Störung im Bereich der Sella turcica oder eine Schädigung des Hypothalamus zu Grunde. Ursächlich können sein: vorhergehendes Trauma oder Operation, Raumforderungen, einschließlich Metastasen und Leukämien, entzündliche oder granulomatöse Erkrankungen sowie Erkrankungen des Gefäßsystems (Stalla, 2008). Fehlendes Oxytocin bleibt in der Regel asymptomatisch Therapie der Hypophysenadenome Allgemeine Strategie Das primäre Therapieziel ist die Beseitigung der raumfordernden Struktur mit Normalisierung von Visus und Gesichtsfeld, sowie der Erhalt oder die Wiederherstellung einer normalen Hypophysenfunktion. Wird die Indikation zur operativen Therapie gestellt, erfolgt der Eingriff meist über einen transsphenoidalen Zugang, da dieser wesentlich schonender und sicherer für den Patienten ist. Als Zugangsweg kommt ein sublabialer Schnitt unter dem Vestibulum oris oder ein Schnitt über dem Nasenknorpel im Cavum

42 nasi in Frage. Das weitere Vorgehen beinhaltet die Schaffung eines Schleimhauttunnels bis zum Keilbein, das dann eröffnet wird. Nach Inzision der basalen Dura mater kann das normale Gewebe der Hypophyse von adenomatös verändertem Gewebe im Operationsmikroskop unterschieden werden. Angestrebt wird eine selektive Resektion des tumorösen Gewebes um die normale Funktion der Hypophyse weitestgehend zu erhalten. Die Indikation zur transkraniellen Operation ergibt sich für Tumoren, die extraselläre Anteile besitzen, eine asymmetrische Ausdehnung haben und für solche, die keine weite Kommunikation mit der Sella turcica aufweisen (<10% der Hypophysenadenome) und somit keinen transsphenoidalen Zugang ermöglichen. Hier muss ein frontotemporaler oder subfrontaler Zugangsweg gewählt werden. Nur in besonderen Fällen wird der basale frontale Mittellinienzugang benutzt (Buchfelder, 2009; Stalla, 2008) Wochen postoperativ erfolgt eine Hormonbestimmung zur Abschätzung des Operationserfolges. Folgende Parameter werden hierfür bestimmt: TSH, ft3, ft4, Kortisol, LH, FSH, Testosteron und IGF-1. Das entnommene Gewebe sollte immer histologisch untersucht werden, zum einen um die gestellte Diagnose zu sichern oder ein mögliches invasives Wachstum nachzuweisen, und zum anderen um eine Indikation für eine adjuvante Therapie, wie Radiotherapie oder Zytostatika-Gabe, nicht zu übersehen. Adjuvante Therapien werden vor allem bei granulomatösen Erkrankungen oder bei radiosensitiven Tumoren, wie dem Germinom, begonnen. Ferner stehen medikamentöse Therapieansätze und neue radiotherapeutische Verfahren zur Verfügung. Wann welches Behandlungsregime zum Einsatz kommt, ist zunächst auch von dem Typ des hormonproduzierenden Adenoms und der Ausdehnung abhängig. Im Folgenden soll darauf näher eingegangen werden Therapie der Prolaktinome Bei Prolaktinomen ist die Gabe von Dopaminagonisten die Therapie der ersten Wahl, weil dadurch selbst bei Patienten mit Makroadenom eine Größenabnahme des Tumors in 80% der Fälle zu beobachten ist.

43 Grundsätzlich stehen Dopaminagonisten erster (Bromocriptin) und zweiter Generation (Cabergolin) zur Verfügung. Bei Makroadenomen sollte initial eine Therapie mit Cabergolin begonnen werden, weil es eine stärkere Adenomverkleinerung zeigt (Colao et al., 2000), die Prolaktin- Serumkonzentration stärker senkt und zusätzlich weniger Nebenwirkungen als Bromocriptin aufweist. Bei Frauen mit Kinderwunsch wird jedoch aufgrund längerer Erfahrung weiterhin Bromocriptin verabreicht (Schlecht, 2003). Die Indikation zur Operation wird bei Unverträglichkeit der Medikamente, bei Auftrereten eines hypophysären Apoplex oder bei unzureichender Tumorrückbildung unter medikamentöser Therapie gestellt (Levy et al., 2004). Außerdem wählt man ebenfalls ein operatives Vorgehen bei weiterhin bestehenden oder progredienten Sehstörungen und bei großen zystischen oder eingebluteten Tumoren Therapie der GH-produzierenden Hypophysenadenome GH-produzierende Hypophysenadenome werden vorrangig durch eine transsphenoidale Operation behandelt. Wenn postoperativ beim ogtt eine GH-Suppression unter 0,5ng/ml möglich ist und ein normales IGF-1 gemessen wird, kann von einer langfristigen vollständigen Remission ausgegangen werden. Mikroadenome werden in 80-90% und Makroadenome, die häufiger infiltrierend wachsen, in 20-50% der Fälle durch eine Operation kurativ saniert. Bei Kontraindikationen für eine Operation stehen mehrere Medikamente für die Behandlung zur Verfügung. Somatostatin-Analoga zeigen relativ gute Ergebnisse bezüglich der Kontrolle der Hormonspiegel (50-65%) und in 10% der Fälle führen sie auch zur Größenreduktion des Tumors um 20-50%. Gelegentlich werden sie auch präoperativ eingesetzt. Eine alleinige Gabe von Dopaminagonisten zeigt unbefriedigende Ergebnisse. Pegvisomant ist ein Wachstumshormon- Antagonist ohne direkte Wirkung auf das Adenom und wird bislang nur bei Patienten verabreicht, die nach Ausschöpfung oben genannter Maßnahmen noch keine Remission zeigen. Patienten denen der GH-Antagonist verabreicht wurde, zeigen in 80-90% der Fälle normalisierte IGF-1 Spiegel.

44 Mögliche Kombinationstherapien aus Somatostatin-Analoga und Pegvisomant bedürfen noch genauerer Evaluation in weiteren Studien. Eine Tumorprogression trotz Therapie kann bei Verabreichung von Somatostatin-Analoga an steigenden GH-Spiegeln erkannt werden. Bei Pegvisomant ist das aufgrund analytischer Probleme bislang jedoch nicht möglich Therapie der ACTH-produzierenden Hypophysenadenome Die Therapie der ersten Wahl bei Vorliegen eines ACTH-produzierenden Hypophysenadenoms ist der transsphenoidale Eingriff. Postoperativ zeigen je nach Studie etwa 70-90% der Patienten eine vollständige Remission (Yeh et al., 1997). Als Kriterium hierfür gilt die induzierbare sekundäre Nebennierenrindeninsuffizienz, bzw. die vollständige Suppression nach Dexamethasongabe. Die medikamentöse Therapie mit Adrenostatika (Aminoglutetimid, Ketokonazol oder Methyrapon) und Adrenolytika (Bromocriptin, Cyproheptadin) wird ergänzend, nach Operation bei Tumorresten oder zur Überbrückung bis zum Beginn der Adenomrückbildung unter Strahlentherapie, angewandt (Yeh et al., 1997). Außerdem können bei schweren psychiatrischen Symptomen, metastasierenden Malignomen oder zur präoperativen Vorbereitung adrenostatische oder adrenolytische Medikamente verabreicht werden, deren Einsatz ist aber sehr begrenzt. Bei Persistenz der Beschwerden wird nach Ausschöpfen oben genannter Verfahren auch die beidseitige Adrenalektomie in Erwägung gezogen.

45 Therapeutisches Vorgehen bei hormoninaktiven Hypophysenadenomen, Gonadotropinomen und TSHproduzierenden Hypophysenadenomen Therapie der ersten Wahl ist sowohl für hormoninaktive (Losa et al., 2001) als auch für LH- und FSH-produzierende Adenome die Operation (Snyder, 1995). Bei Mikroadenomen die zufällig diagnostiziert werden und keinerlei Symptomatik oder Hormonproduktion aufweisen und keinen Bezug zum Chiasma opticum zeigen, kann auch eine abwartende Haltung eingenommen werden. Das bedarf allerdings engmaschiger Kontrollen der Patienten. TSH-produziernde Adenome werden ebenfalls primär operiert. In 50% der Fälle wird so eine komplette Heilung erziehlt. Da nicht selten eine Co-Sekretion von TSH, Prolaktin und GH zu messen ist, können postoperativ auch Dopaminagonisten und Somatostatinanaloga verabreicht werden. Gelegentlich sprechen hormoninaktive Adenome auch auf die Gabe von Dopamin- oder Somatostatinanaloga an Radiotherapie bei Hypophysenadenomen Die Strahlentherapie kann grundsätzlich in verschiedene Verfahren unterteilt werden. Zum einen steht die konventionelle Bestrahlung zur Verfügung. Daneben gibt es drei stereotaktische Verfahren die höhere Zieldosen ermöglichen: 1. Die stereotaktische Bestrahlung in einer oder mehreren Sitzungen (stereotactic radiosurgery), 2. Die einzeitige stereotaktische Kobalt-Bestrahlung nach Leksell (Gamma-Knife), 3. Die neuartige Cyberknife Technologie mittels eines Roboterarmes. Die stereotaktischen Verfahren kommen bei gut abgrenzbaren, hormoninaktiven Tumoren mit Durchmessern über 35 mm zum Einsatz. Die Indikation für das konventionelle Verfahren wird bei geringem Tumorabstand zu Chiasma opticum oder Nervus opticus, bei Kompressionen von Hirnstamm oder Temporallappen und bei großen, schwer abgrenzbaren Raumforderungen gestellt. Außerdem bei hormonaktiven Tumoren, die operativ oder

46 medikamentös nicht behandelt werden können, bei Tumorresiduen nach mikrochirurgischem Eingriff oder bei Adenomresten, die nach Operation eine Progression zeigen. Bei ACTH-produzierenden Hypophysenadenomen zeigt die Radiatio oder Radiochirurgie Remissionen bei 60-70% bzw % der Patienten. Häufig kann jedoch erst nach Monaten bis Jahren der volle Effekt der Radiotherapie beobachtet werden (Brucker-Davis et al., 1999; Levy, 2004). Nebenwirkungen der Bestrahlung sind Hypophyseninsuffizienz, Sehstörungen, sekundäre Malignome, neurokognitive Störungen und Strahlennekrosen im Temporallappen. Durch eine bessere Schonung des umliegenden Gewebes sind bei stereotaktischen Verfahren die Nebenwirkungen geringer, jedoch gibt es dazu noch keine Langzeitstudien. Wichtige Komplikationen nach einer Operation oder einer Bestrahlung im Bereich der Hypophyse sind die Hypophysenvorderlappeninsuffizienz und der Diabetes insipidus. 2.3 Kraniopharyngeome Definition, Epidemiologie und Ätiologie der Kraniopharyngeome Kraniopharyngeome sind gutartige (WHO-Grad I), epitheliale Tumoren, häufig mit zystischen Anteilen, die zum größten Teil suprasellär lokalisiert sind und meist zusätzlich eine intraselläre Komponente aufweisen. Ihre Inzidenz beträgt 1,3 pro Personen und sie stellen 2-5% der primär intrakraniellen Neoplasien dar. Sie haben einen Anteil von 5,6-15% an allen kindlichen Hirntumoren. Bezüglich der Altersverteilung fallen vor allem zwei Inzidenzspitzen bei 5-14 Jährigen und bei Jährigen auf, jedoch kann ein Kraniopharyngeom in jeder Altersklasse diagnostiziert werden, auch bereits pränatal (Thapar et al 1998; Karavitaki et al., 2006). Zum Verständnis der Ätiologie von Kraniopharyngeomen ist zum einen die Kenntnis der embryologischen Entwicklung der Adenohypophyse wichtig, die bereits weiter vorne erläutert wurde. Kraniopharyngeome können aus versprengten Resten der Rathke-Tasche entstehen, die sich aus dem ektodermalen Stomadeum abspaltet und in der sogenannten

47 kraniopharyngealen Rinne, dem Ductus craniopharyngealis, nach dorsal auf das Infundibulum zuwächst. Die genaue Ätiologie ist bislang nicht vollständig aufgeklärt. Es gibt zwei Theorien. Die unter Wissenschaftlern heutzutage favorisierte Theorie postuliert eine Tumorentwicklung aufgrund neoplastischer Transformation von squamösen embryonalen Zellresten (Goldberg et al., 1960). Die andere sieht den Ursprung der Kraniopharyngeome in metaplastischer Transformation von adenohypophysären Zellen (Hunter, 1955; Asa et al., 1983). Die Tumoren sind monoklonalen Ursprungs und bislang konnten einige chromosomale Veränderungen detektiert werden, wie Translokationen und Deletionen (Sarubi et al, 2001; Gorski et al, 1992; Karnes et al, 1992). Der adamantinöse Subtyp der Kraniopharyngeome zeigt regelmäßig Mutationen im β-catenin-gen, die Akkumulation von β-catenin im Zellkern von Tumorzellgruppen (Sekine et al, 2002; Buslei et al., 2005) und eine Aktivierung des Wnt-Signalwegs. Dadurch wird höchstwahrscheinlich das invasive Wachstum der Tumoren begünstigt. Die Beschreibung des Wnt- Signalwegs folgt später, zunächst soll die Anatomie, die Pathologie und die heute geläufige Einteilung der Kraniopharyngeome erläutert werden Histologie und Einteilung der Kraniopharyngeome Mikroskopisch können Kraniopharyngeome nach ihrem Aufbau in zwei Subtypen unterschieden werden. Die adamantinösen Kraniopharyngeome (siehe Abb. 12 und 13) stellen etwa 90% der Kraniopharyngeome dar. Ihre histologische Struktur zeigt ein mehrschichtiges Epithel mit palisadenartiger Anordnung der basalen Zellkerne, "wet keratin" (=Keratinschollen), zentrale Verhornungen und häufig schon makroskopisch sichtbare Verkalkungen. Vor allem bei Kindern findet man Zysten, die mit einer cholesterinreichen, öligen Flüssigkeit gefüllt sind. Diese wird häufig als maschinenölartig beschrieben. Der histologische Aufbau des adamantinösen Kraniopharyngeoms ähnelt stark dem des Adamantinoms (Ameloblastom), wovon sich die Bezeichnung adamantinöses Kraniopharyngeom ableitet. Das Adamantinom ist ein Tumor, der vor allem im Unterkiefer lokalisiert ist.

48 Er entwickelt sich aus Ameloblasten, die den Zahnschmelz bilden. Meist handelt es sich um eine benigne, dysontogenetische Veränderung, die lokal infiltrierend wächst (Pschyrembel, 258. Auflage 1998). Abb. 12: HE-Färbung eines adamantinösen Kraniopharyngeoms. Man erkennt deutlich das wet keratin (1), die palisadenförmig angeordneten Zellen (2) und Tumorzysten (3). Abb. 13: HE-Färbung eines adamantinösen Kraniopharyngeoms. Dargestellt sind die palisadenförmig angeordneten Zellen (1), fingerförmige Ausstülpungen (2), ZNS (3), Kalk (4) und mikrozystische Auflockerungen (5).

49 Der zweite Subtyp ist das papilläre Kraniopharyngeom (siehe Abb. 14). Gemäß seinem Namen finden sich hier vor allem pflastersteinartig angeordnete Zellverbände mit pseudopapillärem Phänotyp und plattenepithelialer Differenzierung. Der kompakte histologische Aufbau ähnelt dem der Mundschleimhaut. Auch bei diesem Typ können selten kleinere Zysten auftreten, deren Flüssigkeit heller als die der adamantinösen Kraniopharyngeome ist. Ihre mikroskopische Abgrenzung zu Rathke-Taschenzysten mit plattenepithelialer Metaplasie kann bei kleinen Biopsaten schwierig sein. Abb. 14: Papilläres Kraniopharyngeom mit pflastersteinartig aufgebautem, kompaktem Zellverband. Makroskopisch ist vor allem die Lokalisation der Kraniopharyngeome wichtig. Zumeist liegen sie über der Sella turcica mit intrasellärem Anteil (70%), es gibt aber auch rein supra- (20%) oder intrasellär (10%) wachsende Tumoren. Das papilläre Kraniopharyngeom ist fast ausschließlich suprasellär lokalisiert. Eher selten findet man

50 Kraniopharyngeome in der vorderen, mittleren oder hinteren Schädelgrube. Weitere Lokalisationen wie im Nasopharynx, im paranasalen Bereich sowie in den Siebbeinzellen, sind beschrieben. Zwischen dem Chiasma opticum, im Temporallappen, im Mittelhirn oder dem Kleinhirnbrückenwinkel oder auch gänzlich im dritten Ventrikel wachsende Kraniopharyngeome wurden ebenfalls dokumentiert (Harwood-Nash, 1994; Karavitaki et al., 2005; Graziani et al., 1994; Akimura et al., 1989; Cooper et al., 1972; Jiang et al., 1998; Duff et al., 1983; Sohn et al., 2004; Solarski et al., 1978; Bashir et al., 1996; Altinörs et al., 1984; Waga et al., 1979; Davies et al., 1997). Durch die Lokalisation der Tumoren lassen sich mögliche Beschwerden der betroffenen Patienten erklären. Im nächsten Abschnitt möchte ich näher auf die klinischen Symptome eingehen Klinik der Kraniopharyngeome Patienten mit Kraniopharyngeomen können verschiedenste Symptome entwickeln, die zum einen bedingt sind durch die allgemeine Druckerhöhung in der Schädelhöhle, zum anderen durch das Wachstumsverhalten, die Lokalisation und die Ausdehnung der Tumoren. Es können das Parenchym des Gehirns, benachbarte Nerven, das Ventrikelsystem, Blutgefäße oder das endokrine System durch Hypothalamus-/Hypophysenkompression betroffen sein. Vor allem bei suprasellärem Wachstum findet man Verhaltensauffälligkeiten, wie psychische Labilität, depressive Verstimmungen und verminderte kognitive Funktionen sowie gestörte Temperatur und Schlafregulation (Stalla, 2008; Karavitaki et al., 2006). Die häufigsten Beschwerden beruhen auf dem erhöhten intrakraniellem Druck, der durch den gestörten Liquorabfluss zu stande kommt. Dazu gehören zum Beispiel Übelkeit, Erbrechen und Kopfschmerzen. Diese treten vor allem bei Kindern auf. Bei den Vorsorgeuntersuchungen im Kindesalter sind die Leitsymptome die zu geringe Körpergröße und eine deutliche Adipositas, Antriebslosigkeit wird ebenfalls häufig beschrieben. Eine verspätete sexuelle Entwicklung wird bei älteren Kindern bzw. jungen Erwachsenen beobachtet. Patienten mittleren

51 Alters werden vorstellig aufgrund von Sehstörungen (62-84%) und Zeichen einer Hypophyseninsuffizienz (52-87%). Die kognitiven Dysfunktionen und psychischen Veränderungen (50%) werden zumeist bei älteren Patienten beobachtet. Tabelle 10 stellt die häufigsten klinischen Merkmale hinsichtlich der betroffenen intrakraniellen Strukturen dar. 1. Allgemeine Symptome durch Hirndruckerhöhung 2. Beeinträchtigungen des visuellen Systems 3. Hypothalamischhypophysäre Störungen 4. Beeinträchtigung von Parenchym und Hirnnerven Kopfschmerzen, Übelkeit/Erbrechen, Papillenödem Visusminderung, Gesichtsfeldausfälle, Doppelbilder, Optikusatrophie kognitive Dysfunktionen, Verhaltensauffälligkeiten (Affektlabilität, depressive Verstimmungen, etc.), gestörter Schlafrhythmus, gestörte Temperaturregulation, Somnolenz, Bewusstseinsstörungen, Adipositas, vegetative Dysfunktionen, Antriebslosigkeit, Anorexie Hormondefizite (Wachstumsretardierung, Entwicklungsverzögerung, Hypogonadismus, Polyurie, Polydipsie etc.), Hyperprolaktinämie, Pubertas präcox/tarda Halluzinationen, motorische Störungen (z.b. Ataxie), kognitive Ausfälle (z.b. Agnosie), Anosmie, Hörstörungen, Epilepsie 5. Durchblutung Wallenberg Syndrom (Infarkt der A.cerebelli inferior posterior oder der A. vertebralis), Epistaxis, Hirninfarkte Tabelle 10: Symptome durch Kraniopharyngeome unterteilt in Symptomgruppen, adaptiert aus Stalla GK et al. Hypophysentumoren und andere selläre Raumforderungen, Göke B., Fürst H., Reinecke M. (Hrgb), 2. Auflage, Zuckschwerdt-Verlag, München, 2008, Diagnostik von Kraniopharyngeomen Die Diagnostik der Kraniopharyngeome stützt sich vor allem auf die Bildgebung, hormonelle Funktionstests und ophthalmologische und neurologische Untersuchungen erfolgen additiv. Im CT können vor allem die knöchernen Strukturen des Schädels und Kalzifikationen beurteilt werden. Ebenso lässt die Computertomographie eine Unterscheidung von soliden und zystischen Arealen zu. Die MRT-Untersuchung ist hilfreich um topographische Verhältnisse und die Struktur der Tumoren beurteilen zu können. Außerdem kann die magnetresonanztomographische Untersuchung wegweisend bei der Unterscheidung der Kraniopharyngeome

52 von anderen parasellär wachsenden Tumoren sein. In Tabelle 11 werden die Differentialdiagnosen der Kraniopharyngeome dargestellt. Ein Ödem entlang der Sehbahn aufgrund einer Umgebungsreaktion oder vermehrter Liquoransammlung macht das Vorliegen eines Kraniopharyngeoms wahrscheinlich (Harwood-Nash, 1994; Nagahata et al., 1998). Beide Verfahren sind hilfreich für eine Operationsplanung. Bei Verdacht auf Kompression oder Umwachsung von Blutgefäßen wird häufig zusätzlich eine Angiographie veranlasst. Bildgebende Verfahren können jedoch nicht zuverlässig zwischen adamantinösen und papillären Kraniopharyngeomen unterscheiden (Harwood-Nash, 1994). Kalzifizierende inhomogene Tumoren mit zystischen Arealen deuten eher auf den adamantinösen Subtyp hin. Eine homogen strukturierte Raumforderung spricht für den papillären Typ. Die endgültige Klärung der Tumorentität kann nur durch eine eingehende histologische Untersuchung des entnommenen Materials erfolgen. Differentialdiagnostische Klassifikation von Tumoren mit Hilfe von CT oder MRT (nur Entitäten) Rathke-Taschenzysten, Dermoidzysten, Epidermoidzysten, Arachnoidalzysten Hypophysenadenome, Hypothalamisches Gliom oder Gliom der Sehbahn, Meningeome Germinome, Hamartome Histiozytosis X, Sarkoidose, Tuberkulose, Supraselläre Aneurysmen, Supraselläre Abszesse Tabelle 11: Mögliche Differentialdiagnosen der Kraniopharyngeome, mittels CT oder MRT Bildgebung. Auf eine genaue Beschreibung des radiologischen Bildes wurde verzichtet, adaptiert aus Karavitaki et al., 2006 Vor einer geplanten Operation ist es unbedingt erforderlich, mit den üblichen Tests die Hypophysenfunktion zu überprüfen. Eine Bestimmung des Natriums im Serum und im Urin sowie der Osmolalität des Urins und seines spezifischen Gewichts liefert Hinweise auf das vorliegen eines Diabetes insipidus. Dieser liegt bei bis zu 30% der Patienten vor (Stalla, 2008; Karavitaki et al., 2006). Die ophtalmologische Untersuchung ist eine weitere obligate Diagnostik. Es muss vor der Operation der

53 Augenhintergrund gespiegelt und das Gesichtsfeld bestimmt werden. Die neurologische Abklärung dient der Erhebung eines Funktionsstatus der Hirnnerve. Bei erhöhter Anfallsbereitschaft wird präoperativ eine antikonvulsive Therapie eingeleitet Therapie der Kraniopharyngeome Die operative Entfernung des Tumors wird zunächst angestrebt, kann jedoch nicht immer als Verfahren der ersten Wahl eingesetzt werden. Der transsphenoidale Zugangsweg ist schonend und wird bevorzugt. Der transkranielle Zugangsweg wird von Lage und Größe des Tumors bestimmt und geht mit einem erhöhten Komplikationsrisiko einher. Einen Vorteil bietet das intraoperative MRT bei schwierig zu resezierenden Tumoren. Es wird primär eine komplette Entfernung angestrebt, ohne Beeinträchtigung optischer und hypothalamisch-hypophysärer Strukturen. Das ist aufgrund der Wachstumseigenschaften und der Adhärenz an Nachbarstukturen nicht immer möglich. In solchen Fällen sollte aufgrund der hohen Warscheinlichkeit für das erneute Wachstum des Tumorrests (71%) postoperativ ein radiotherapeutisches Verfahren eingeleitet werden (Einhaus, 1999; Becker, 1999). Psychoneurologische Untersuchungen zeigen bei Kindern Verhaltensauffälligkeiten und verminderte intellektuelle Leistungen, bei Erwachsenen Merkfähigkeits-einschränkungen und Konzentrationsstörungen. Diese können sowohl vor als auch nach der Operation beobachtet werden. Inwieweit die weiter bestehenden Symptome durch den operativen Zugangsweg verursacht werden, oder durch die Therapie nicht gebessert werden, ist bislang noch nicht vollständig geklärt. Als primär kurativer Ansatz ist die alleinige Strahlentherapie nicht ausreichend, weil Kraniopharyngeome nur gering strahlensensibel sind. Die Ergebnisse der konventionellen Srahlentherapie nach inkompletter Operation sind bezüglich Überlebenszeit und Rezidivhäufigkeit mit denen vollständiger primärer chirurgischer Entfernung vergleichbar (progressionsfreies Überleben nach 10 Jahren 80-85%). Bei Kindern unter

54 Jahren ist bis vor wenigen Jahren häufig eine radikale Operation durchgeführt worden, weil mögliche Langzeitfolgen der Bestrahlung vermieden werden sollten. Eine Strahlentherapie ist gewöhnlich erst nach dem Auftreten eines Rezidivs angeschlossen worden. Dieses Vorgehen wird heute aufgrund unterschiedlicher Studien kontrovers diskutiert. Zudem konnte gezeigt werden, dass die postoperative Lebensqualität direkt von der Erfahrung des Operateurs abhängt (Sanford, 1994). Beim Auftreten eines Rezidivs nach Totalexstirpation des Tumors ohne Bestrahlung kann gegebenfalls eine erneute Operation erfolgen, bei vorausgehender Bestrahlung ist der Zweiteingriff aufgrund inoperabler Verwachsungen und Vernarbungen meist kontraindiziert. Die bereits bei den Hypophysenadenomen beschriebenen, neueren strahlentherapeutischen Verfahren kommen ebenfalls zum Einsatz. Die einzeitige stereotaktische Bestrahlung wird nur bei ausreichendem Abstand zum Chiasma opticum eingesetzt und hat auch für die Behandlung von Kraniopharyngeomen aufgrund der Strahlenbelastung nur einen geringen Stellenwert. Die stereotaktische Gamma-Radiotherapie als primäres Verfahren oder beim Vorhandensein eines Rezidivs ist möglich, jedoch gibt es hiermit nur begrenzte Erfahrungen. Eine weitere Methode ist die Instillation von Radioisotopen. Diese kommt vorwiegend bei monozystischen Kraniopharyngeomen zum Einsatz, jedoch bislang nur in Fällen mit Rezidiven bei denen operative und perkutane strahlentherapeutische Verfahren bereits ausgeschöpft wurden. Bei Rezidiven mit schwieriger anatomischer Lage und zystischem Aufbau kann nach Anlage eines Instillationskatheters toxisches Bleomycin oder Interferon eingebracht werden.

55 Der Wnt-Signalweg Definition und Bedeutung des Wnt-Signalwegs Während der embryologischen Entwicklung entstehen aus einer omnipotenten Stammzelle verschiedenste Gewebe aus spezialisierten Zellen. Damit dieser Prozess reibungslos abläuft, bedarf es genauer Koordination der Zellen bezüglich ihrer Funktion, Struktur und Position innerhalb des Gesamtorganismus. In den letzten Jahrzenten gelang es, einige der verantwortlichen Signalkaskaden und deren Wechselwirkungen zu identifizieren, unter anderem den Wnt-Signalweg. Der Name resultiert aus dem ersten in Säugern entdeckten Wnt-Gen, dem int-1 und dem homologen Gen in Drosophila melanogaster, dem Wingless. Int-1 wurde so benannt, weil es durch eine Insertion der Long-Terminal-Repeat-Region der proviralen DNA des Mouse mammary tumor virus aktiviert wird (Rijsewijk et al., 1987). Die Bezeichnung Wingless resultiert aus Studien an Drosophila melanogaster-mutanten, die durch Mutationen in Wnt-Genen keine Flügel ausbilden. Bislang konnten beim Menschen 19 Wnt-Gene isoliert und in zwölf Subfamilien unterteilt werden. Auch dem Menschen weniger verwandte Organismen besitzen diese Wnt-Gene. So fand man beim Fadenwurm (Caenorhabditis elegans) fünf Wnt-Gene und bei der Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) sieben Wnt-Gene, die hochkonserviert sind. Diese codierten Proteine weisen in den unterschiedlichen Organismen ähnliche biologische Aktivitäten auf (Danielian and McMahon, 1996; Logan and Nusse, 2004). Interessanterweise zeigten Analysen der Starlet Seeanemone (Nematostella vectensis) mindestens elf Wnt-Subfamilien, die auch beim Menschen bekannt sind. Evolutionsgeschichtlich wird das Alter dieser Seeanemone auf 650 Millionen Jahre geschätzt. Daraus kann geschlossen werden, dass die Wnt Subfamilien entwicklungsgeschichtlich sehr alt sein müssen (Kusserow et al., 2005). Es konnte außerdem anhand unterschiedlicher Studien gezeigt werden, dass der Wnt-Signalweg nicht nur an der korrekten Anlage von Gehirnstrukturen und Ausrichtung der primären Körperachse beteiligt ist, sondern auch eine wichtige Rolle in der

56 Genese von entarteten Tumoren spielt. Darauf soll später genauer eingegangen werden. Zunächst werden die drei verschiedenen Signalkaskaden vorgestellt, die durch Wnt-Proteine aktiviert werden können Die drei Achsen des Wnt-Signalwegs Wnt-Proteine sind sezernierte Glykoproteine, die von verschiedenen Zellen produziert werden (Cardigan und Nusse, 1997) und auf parakrine Weise verschiedene Signalkaskaden in den Zielzellen aktivieren. Diese Kaskaden lassen sich drei verschiedenen Zweigen zuordnen: 1. Dem kanonischen Wnt-Signalweg. Dieser aktiviert die Zielgene im Zellkern über einen gehemmten Abbau von β-catenin im Zytosol. Durch Experimente am Krallenfrosch (Xenopus laevis) wurde seine Beteiligung an der Achsenbildung während der Embryonalperiode zum ersten Mal verstanden. Wie bereits oben erwähnt ist dieser Pfad der Signalweitergabe auch für die Segmentpolarität und Flügelentwicklung wichtig, was durch Studien an Drosophila melanogaster gezeigt wurde. 2. Eine weitere Achse der Signalvermittlung stellt der planar cell polarity (PCP) Signalweg dar. Ihm unterliegt vor allem die Kontrolle korrekter zeitlicher und räumlicher Ausrichtung der Embryonen. Ein Beispiel am Krallenfrosch wäre die Kontrolle der Konvergenz und Extension der Körperachse oder bei Drosophila melanogaster die polare Anordung der Härchen auf dem Körper. Auf zellulärer Ebene wird über RhoA und Jun Kinase (JNK) die Ausrichtung des Zytoskeletts und damit die Polarität der Zelle reguliert. Das ist wichtig, um die korrekte Ausrichtung der einzelnen Zellen innerhalb der epithelialen Zellverbände zu gewährleisten. Abbildung 15 zeigt in der linken Hälfte die Signaltransduktion im PCP-Signalweg: Das auch im kanonischen Signalweg vorhandene Dishevelled (Dsh) reguliert über die Verbindung mit Daam1 (nicht dargetellt) die Effektoren GTPase Rho und die Rho assozierte Kinase (ROCK). Das Protein Naked (Nkd) hat antagonistische Wirkung auf das Dishevelled. Es bindet an Dsh und blockiert β-catenin (Huelsken and Behrens, 2002). 3. Der Wnt/Ca 2+ -Signalweg vermittelt eine erhöhte

57 intrazelluläre Ca 2+ Konzentration, worüber Ca 2+ sensitive Signalkomponenten gesteuert werden. Hierzu gehören die Phosphatase Calcineurin (nicht abgebildet), der Transkriptionsfaktor NF-AT (nukleärer Faktor aktivierter Lymphozyten) und die Calmodulin-abhängige Kinase (CaMKII). Der Wnt/Ca 2+ -Signalweg kann ebenfalls mit dem kanonischen Signalweg interagieren. Abb. 15: Die drei Pfade des Wnt Signalwegs (links der PCP-Signalweg, in der Mitte der kanonische Signalweg, rechts der Wnt/Ca 2+ -Signalweg), adaptiert nach Klipp und Liebermeister (2007) BMC Neuroscience 7(Suppl 1), Der kanonische Wnt-Signalweg Der kanonische Signalweg ist vor allem durch seine Bedeutung bei der Tumorentstehung von Bedeutung. Im Folgenden soll genauer erläutert werden, wie die verschiedenen Komponenten interagieren und somit das extrazelluläre Signal bis in den Zellkern übertragen wird. Wenn extrazelluläres Wnt an den 7-Transmembranrezeptor Frizzled (Fz) und seinen Korezeptor LRP (low-density-lipoprotein-related) bindet, wird die

58 Phosphorylierung von Dishevelled (Dsh) induziert. Das so aktivierte Dsh geht mit Axin eine Bindung ein. Axin fungiert zusammen mit Adenomatous Poliposis Coli (APC), Glykogen-Synthase-Kinase-3β (GSK3β) und Casein Kinase-1 (CK-1) als Komplex, der den stetigen Abbau von β-catenin im Zytosol reguliert, um den β-catenin-spiegel niedrig zu halten. Indem Axin an Dishevelled gebunden wird, wird der Komplex inaktiviert und der Abbau von β-catenin gehemmt. Es gibt Vermutungen, dass Dsh hierbei als Shuttle für Axin zur Membran fungiert (Cong et al., 2004). Zugleich sorgen GSK3β und CK-1 für die Phosphorylierung der intrazellulären Komponente des Frizzled Korezeptors LRP6 (Zeng et al., 2005). Axin wird dann an die intrazelluläre Domäne des LRP6 gebunden, eventuell durch Dsh vermittelt und gewährleistet die Inhibierung des β- Catenin Abbaus. Der APC-Axin-Glykogensynthasekinase-3-Komplex wird somit zuerst durch die Bindung von Axin an Dsh, danach durch die Bindung von Axin an LRP6 inaktiviert. Die Folge sind erhöhte zytoplasmatische Konzentrationen von β-catenin. Dieses kann nun in den Zellkern diffundieren und dort durch die Interaktion mit Transkriptionsfaktoren der LEF/TCF-Familie die Transkription der Wnt-Zielgene induzieren (Gordon and Nusse, 2006; He et al. 2006). Ohne die Bindung der Wnt- Signalmoleküle an Frizzled wird phosphoryliertes β-catenin von β-trcp ubiquitinyliert und anschließend von 26S-Proteasomen vollständig abgebaut (Behrens, 2005). In Abwesenheit von β-catenin im Zellkern sind die entsprechenden Transkriptionsfaktoren der TCF/LEF-Familie in einem Repressorkomplex mit Groucho-Faktoren, Histondeacetylasen (HDAC) und dem C-terminalen Binding Protein (CtBP) inaktiviert (Gordon and Nusse, 2006; He et al 2006). Abbildung 16 verdeutlicht die oben beschriebenen Interaktionen der Signalkette.

59 Abb. 16: Kanonischer Wnt-Signalweg (vereinfacht), nach Doble und Woodgett, (2003). GSK-3: tricks of the trade for multi-tasking kinase. Journal of cell science, 116, Die Bedeutung β-catenins Die zentrale Funktion des kanonischen Wnt-Signalwegs ist die Regulation des β-cateninspiegels im Zytosol und im Zellkern. Über den molekularen Aufbau des Proteins ist bisher nicht alles bekannt. Es besitzt eine so genannte Armadillo-Sequenzwiederholung. Diese liegt zentral und ist für die Vermittlung der Interaktionen mit α-catenin, E-Cadherin, Axin/Conductin, APC und TCF/LEF verantwortlich (Aberle et al, 1994; Behrens et al, 1998; Behrens et al, 1996; Huelsken et al, 1994; Rubinfeld et al 1995; von Kries et al, 2000; Xing et al, 2003). Am C-Terminus werden Transkriptionsfaktoren gebunden (Barker et al, 2000). Neue Studien lassen die Vermutung zu, dass β-catenin mit Hilfe eines Proteins (Kank) und dessen NLS (nuclear localization signal) sowie NES (nuclear export signal) in den Zellkern einund ausgeschleust wird (Wang et al, 2006) und dort Zielgene aktiviert. Auf welche Weise diese Signale den Import und Export regulieren, ist noch nicht endgültig geklärt. Außerdem hat das β-catenin eine wichtige Rolle bei

60 der durch Ca 2+ vermittelten Zelladhäsion. Zusammen mit alpha- und gamma-catenin (Plakoglobin) bindet es, Ca 2+ vermittelt, an E-Cadherin und steuert so den Kontakt mit den Nachbarzellen (Ozawa et al., 1989; Kemler et al., 1989). Abb. 17: Beteiligung von β-catenin an der Ca 2+ vermittelten Zelladhäsion. Adaptiert nach Dem N-terminalen Ende des Proteins kommt ebenfalls eine wichtige Bedeutung zu, so wird durch Phosphorylierung (von Ser45 und Ser33/37/Thr41) mit Hilfe von GSK3β und CK-1 die Stabilität des gesamten β-catenin reguliert (Behrens et al., 1998; Kikuchi et al. 1999; Dajani et al, 2001; Harwood et al, 2001) Charakterisierung des Axin 2/ Axil/ Conductin Axin 2, Axil, oder Conductin, sind Synonyme für ein Protein, das von einem Gen auf Chromosom 17q23-q24 kodiert wird. Das Gen besteht aus 10 Exonen, die insgesamt mehr als 25kb genomische DNA beinhalten. Das Protein ist Bestandteil des APC-Axin-Glykogensynthasekinase-3- Komplexes, wird jedoch nur durch ein aktives Wnt-Signal induziert. Funktionell sind Axin und Conductin homologe Proteine, die sich darin unterscheiden, dass nur Axin ständig exprimiert wird. (Yan et al, 2001; Lustig et al, 2002; Jho et al, 2002; Huelsken und Behrens, 2002). Des Weiteren besitzen Conductin und Axin in ihrem Aufbau identische Aminosäuren. In den konservierten Domänen beläuft sich deren Identität

61 auf 62%. Am N-Terminus von Conductin und Axin befindet sich eine RGS- Domäne (Regulator of G-Protein Signalling), an die das APC-Protein bindet (Behrens et al., 1998; Hart et al., 1998; Zeng et al., 1997; Lustig et al., 2003). Im Zentrum der Proteine findet man separate Bindungsdomänen für GSK3β und β-catenin (Behrens et al., 1998) und am C-terminalen Ende eine Domäne (DIX), die Dsh bindet und Axin dimerisieren kann (Zeng et al., 1997; Ikeda et al. 1998). In der Abbildung 18 wird der Aufbau des Conductins vereinfacht dargestellt. Abb. 18: Aufbau von Conductin aus Hughes TA. AXIN2 (axin 2). Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. (January 2007). Conductin übt eine negative Feedback-Wirkung auf den Wnt-Signalweg aus. Studien an Karzinomzellen konnten zeigen, dass die Conductin Expression durch TCF/β-Cateninkomplexe, welche das Wnt-Signal blockieren, herunterreguliert wird. In Zelllinien, in denen der Wnt-Signalweg durch eine Behandlung mit z.b. Wnt-1 aktiviert wird, lässt sich die Conductin-Expression stimulieren (Hülsken und Behrens, 2002). Neue Studien postulieren eine Beteiligung von Conductin an der Regulation der Zellteilung. So konnte in Darmkrebszelllinien gezeigt werden, dass Conductin ohne ein Wnt-Signal die Teilung der Zentrosome über Phosphorylierung von β-catenin verhindert. Zentrosome sind Zellorganellen, die vor der Mitose an entgegengesetzte Pole der Zelle wandern und durch Ausbildung von Mikrotubuli zur Bildung des Spindelapparates beitragen (Hadjihannas et al., 2010). Aufgrund der wichtigen Stellung innerhalb des Wnt-Signalwegs, kann ein Ausfall der Conductin vermittelten Funktionen zu unterschiedlichen Erkrankungen

62 führen. Da bereits in der frühen Embryonalperiode wichtige Entwicklungsschritte durch Wnt-Signale gesteuert werden, führen Defekte zu diesem Zeitpunkt zu Malformationen oder Agenesien. Beispiele hierfür sind Studien, in denen Mäuse mit nicht funktionsfähigem Conductin Malformationen des Schädelknochens entwickeln, ähnlich dem Krankheitsbild der Kraniosynostose beim Menschen (Ivy Yu et al, 2005). Ebenso treten Störungen der Zellregulation bei Defekten im Wnt-Signalweg in adulten Organisman auf. Beeindruckend ist eine Studie einer finnischen Familie. Hier führen Conductin-Genmutationen zu familiärer Zahnagenesie und einer Prädisposition für die Entwicklung von kolorektalen Karzinomen (Lammi et al., 2004; Logan and Nusse, 2004). Des Weiteren gibt es zahlreiche Studien, die Conductinveränderungen bei unterschiedlichen Tumorentitäten nachweisen, wie zum Beispiel bei Hepatoblastomen und hepatozellulären Karzinomen, bei kolorektalen Karzinomen und bei Medulloblastomen (Koch, A. et al., 2004; Liu et al., 2000; Lustig et al., 2002; Koch et al., 2007) Der Wnt-Signalweg und seine Rolle bei der Entstehung von Krankheiten Wie bereits beschrieben, liegt die Ursache für einige Erkrankungen in der Entkoppelung der Wnt-Signaltransduktion von der regulatorischen Kaskade. Das ist sowohl für die embryonale Entwicklung als auch im adulten Organismus belegt. Die deregulierte Signalübermittlung ist vor allem wissenschaftlich interessant, weil sie die Entstehung von malignen Tumoren begünstigt. Zuerst ist der Tumorsuppressor APC entdeckt worden und später dessen Rolle bei der Regulation von β-catenin. Mittlerweile ist die Beteiligung von β-catenin an Krebserkrankungen durch Mutationen, die dessen Abbau verhindern, mehrfach beschrieben worden. Auch Tumoren der Sella-Region scheinen β-catenin vermittelt eine Aktivierung des Wnt- Signalwegs aufzuweisen. So zeigten Studien an adamantinösen Kraniopharyngeomen und Hypophysenadenomen, dass in beiden Fällen eine Anreicherung von β-catenin sowohl im Zellkern als auch im

63 Zytoplasma zu finden war (Semba et al., 2001). Weitere Studien belegten dies vor allem für den adamantinösen Typ der Kraniopharyngeome (Sekine et al. 2002; Kato et al. 2004; Oikonomou et al. 2005;). Mutationen waren bei Sekine et al. in allen zehn (100%), bei Kato et al. in neun von 13 (69%), sowie bei Oikonomou et al. in sieben von 43 (16%) der untersuchten adamantinösen Kraniopharyngeome zu finden. In der Arbeitsgruppe Buslei et al. sind ebenfalls Studien an adamantinösen Kraniopharyngeomen durchgeführt worden. Hier zeigte sich eine Diskrepanz in der Häufigkeit von β-catenin Anreicherungen und Mutationen im β-catenin-gen. In 80% der Fälle konnten β-catenin-mutationen gefunden werden, jedoch reichern 94% der Kraniopharyngeome β-catenin im Kern von Tumorzellen an. Diese Mutationen betrafen allesamt Exon 3, das die für den Abbau wichtigen Phosphorylierungsstellen kodiert (Buslei et al., 2005). Da auch andere Proteine der Signalkaskade genetische Alterationen aufweisen können und eine deregulierte Signalvermittlung zur Folge haben, sollte in dieser Arbeit Conductin auf Mutationen hin untersucht werden. 2.5 Fragestellung der Arbeit Wie beschrieben wurden Mutationen von β-catenin in einem hohen Prozentsatz von adamantinösen Kraniopharyngeomen gefunden. Weitere Tumoren im Bereich der Sella (Hypophysenadenome, papilläre Kraniopharyngeome) zeigten hingegen keine β-catenin-mutationen. Mutationsanalysen des APC wiesen in adamantinösen Kraniopharyngeomen keine veränderte Basensensequenz auf (Buslei et al., 2005). Die Arbeitsgruppe Buslei des neuropathologischen Instituts Erlangen hat akkumulierende von nicht akkumulierenden Zellen adamantinöser Kraniopharyngeome mittels Laser-Mikrodissektion getrennt und in beiden Zellfraktionen Mutationen in den GSK3β-Phosphorylierungsstellen des β- Catenins gefunden (Hölsken et al., 2009). Das bedeutet, dass die Veränderungen im β-catenin-gen nicht allein ursächlich für die nuklären Akkumulationen in adamantinösen Kraniopharyngeomen sind. Conductin spielt, neben APC, eine zentrale Rolle bei der Regulierung des β-catenin Abbaus. Darum wurde ein repräsentatives Kollektiv von

64 Hypophysenadenomen uns Kraniopharyngeomen auf Mutationen im Conductin-Gen untersucht. 1. Das in der Arbeit verwendete DNA-Tumorkollektiv setzte sich aus Resektionspräparaten von 59 Patienten mit Hypophysenadenomen und 43 Patientenproben mit Kraniopharyngeomen zusammen. Zur Kontrolle an normalem Gewebe wurde ein entsprechendes, 50 Proben umfassendes, DNA-Kollektiv aus Lymphozyten von Personen ohne bekannte tumoröse Erkrankung angefertigt. 2. Mit Hilfe der Immunhistochemie wurden zunächst β-catenin Anreicherungen in den Hypophysenadenomen und Kraniopharyngeomen dargestellt. 3. Anhand des Kollektivs sollte das Auftreten von Mutationen im Conductin in tumorösen und gesunden Zellen untersucht werden. Dazu wurde zunächt die DNA mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt. Anschließend wurden die PCR-Produkte auf Nukleotidveränderungen mit der Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse (SSCP) untersucht. Die so detektierten Shifts wurden sequenziert, um die Veränderungen in der Basensequenz zu bestimmen. Durch diese Verfahren sollte festgestellt werden, ob ein mutiertes Conductin in diesen Tumoren vorliegt und ob gegebenenfalls Rückschlüsse auf die Genese der nuklären Akkumulationen gezogen werden können.

65 Material und Methoden 3.1 Material Patientenkollektiv Die in der Arbeit verwendeten Tumorproben wurden in der Neurochirurgischen Universitätsklinik Erlangen-Nürnberg mittels überwiegend transsphenoidalen Eingriffen innerhalb der letzten Jahre gewonnen. Das Patientenkollektiv setzt sich aus 59 Hypophysenadenomen und 43 Kraniopharyngeomen zusammen, davon wurde ein Teil bei -80 C nativ asserviert. Die DNA der Tumoren wurde mit der unten aufgeführten Methode aus den Gewebeproben extrahiert. Mit Hilfe der Patientenakten und der Operationsberichte konnten Angaben über das Alter und Geschlecht der Patienten ermittelt werden. Ebenso wurde die Invasivität der Tumoren dokumentiet und getrennt vermerkt, ob es sich bei dem vorliegenden Gewebe um ein Rezidiv handelt. Der Aufbau des Tumors und dessen produzierte Hormone wurden anhand histologischer Gewebeschnitte untersucht. Mit Hilfe der Immunhistologie konnte die Art des Adenoms bestimmt und produzierte Hormone nachgewiesen werden. Die folgenden Tabellen geben Auskunft über die Zusammensetzung des Hypophysenadenom- und des Kraniopharyngeom-Kollektivs in Bezug auf Geschlecht und Alter der Patienten bzw. die Art des Tumors. Patient Diagnose Geschlecht Alter und Altersverteilung (in Jahren) 1372 GH-Zell-Adenom weiblich GH-Zell-Adenom weiblich GH-Zell-Adenom männlich GH-Zell-Adenom weiblich GH-Zell-Adenom weiblich GH-Zell-Adenom männlich GH-Zell-Adenom männlich GH-Zell-Adenom weiblich GH-Zell-Adenom männlich 44

66 GH-Zell-Adenom weiblich 31 n = 10 GH-Zell-Adenome weiblich: 6 männlich: Gonadotropin-Zell-Adenom männlich Gonadotropin-Zell-Adenom weiblich Gonadotropin-Zell-Adenom männlich Gonadotropin-Zell-Adenom männlich Gonadotropin-Zell-Adenom weiblich Gonadotropin-Zell-Adenom; Rezidiv männlich Gonadotropin-Zell-Adenom männlich Gonadotropin-Zell-Adenom männlich Gonadotropin-Zell-Adenom; Rezidiv männlich Gonadotropin-Zell-Adenom weiblich Gonadotropin-Zell-Adenom weiblich 59 n = 11 Gonadotropin-Zell-Adenome weiblich: 4 männlich: Glucocorticoid-Zell-Adenom weiblich Glucocorticoid-Zell-Adenom männlich Glucocorticoid-Zell-Adenom weiblich Glucocorticoid-Zell-Adenom weiblich Glucocorticoid-Zell-Adenom weiblich Glucocorticoid-Zell-Adenom männlich Glucocorticoid-Zell-Adenom männlich Glucocorticoid-Zell-Adenom weiblich 14 Patient Diagnose Geschlecht Alter und Altersverteilung (in Jahren) Altersverteilung: 12 69; M = 49 Altersverteilung: 41 72; M = 54 n = 8 Glucocorticoid-Zell-Adenom weiblich: 5 Altersverteilung: 14 63; männlch: 3 M = Nelson-Tumor weiblich Nelson-Tumor weiblich Nelson-Tumor weiblich 50 n = 3 Nelson-Tumoren weiblich männlich 1482 Prolaktinom weiblich Prolaktinom weiblich Prolaktinom weiblich Prolaktinom männlich Prolaktinom weiblich Prolaktinom weiblich Prolaktinom; Rezidiv weiblich Prolaktinom weiblich 31 Altersverteilung: 36 57; M = 48

67 Patient Diagnose Geschlecht Alter und Altersverteilung (in Jahren) 1788 Prolaktinom weiblich Prolaktinom; Rezidiv weiblich 29 n = 10 Prolaktinom weiblich: 9 männlich: 1 Altersverteilung: 18 59; M = Plurihormonaler Tumor männlich Plurihormonaler Tumor männlich 57 n = 2 Plurihormonale Tumoren weiblich: 0 männlich: 2 Altersverteilung: 13 57; M = Nullzell-Adenom weiblich Nullzell-Adenom weiblich Nullzell-Adenom weiblich Nullzell-Adenom männlich Nullzell-Adenom weiblich Nullzell-Adenom weiblich Nullzell-Adenom; Rezidiv weiblich Nullzell-Adenom männlich Nullzell-Adenom; Rezidiv männlich Nullzell-Adenom männlich Nullzell-Adenom; Rezidiv weiblich Nullzell-Adenom; Rezidiv männlich Nullzell-Adenom männlich Nullzell-Adenom; Rezidiv männlich Nullzell-Adenom männlich 60 n = 15 Nullzell-Adenome weiblich: 7 männlich: 8 Altersverteilung: 43 77; M = 58 n g = 59 Hypophysenadenome Weiblich g : 34 Männlich g : 25 Altersverteilung g : 12 77; M g = 48 Tabelle 12: Patientenkollektiv Hypophysenadenome: n = Anzahl der Tumorproben einer Tumorentität, M = Altersmittelwert (in Jahren), n g = Anzahl der Tumorproben aller Hypophysenadenome, M g = Altersmittelwert aller Hypophysenadenom-Patienten (in Jahren)

68 Patientennummer Diagnose Geschlecht Alter und Altersverteilung 1259 Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom weiblich Adamantinöses-Kraniopharyngeom weiblich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom weiblich Adamantinöses-Kraniopharyngeom weiblich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom weiblich Adamantinöses-Kraniopharyngeom, Rezidiv weiblich Adamantinöses-Kraniopharyngeom weiblich Adamantinöses-Kraniopharyngeom weiblich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom weiblich Adamantinöses-Kraniopharyngeom weiblich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom weiblich Adamantinöses-Kraniopharyngeom weiblich Adamantinöses-Kraniopharyngeom, progredienter Rest 2186 Adamantinöses-Kraniopharyngeom, Rezidiv männlich 8 männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom weiblich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom weiblich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich Adamantinöses-Kraniopharyngeom weiblich Adamantinöses-Kraniopharyngeom weiblich 10

69 Patientennummer Diagnose Geschlecht Alter und Altersverteilung 3843 Adamantinöses-Kraniopharyngeom männlich 39 n a = 36 Adamantinöse-Kraniopharyngeome weiblich a : 15 männlich a : Papilläres-Kraniopharyngeom weiblich Papilläres-Kraniopharyngeom männlich Papilläres-Kraniopharyngeom weiblich Papilläres-Kraniopharyngeom weiblich Papilläres-Kraniopharyngeom männlich Papilläres-Kraniopharyngeom männlich 54 n p = 6 Papilläre-Kraniopharyngeome weiblich p : 3 männlich p : 3 Altersverteilung a : 2 7; M a = 33 Altersverteilung p : 33 54; M p = 43 Tabelle 13: Patientenkollektiv Kraniopharyngeome: n a = Anzahl der adamantinösen Kraniopharyngeome, M a = Altersmittelwert der Patienten mit adamantinösem Kraniopharyngeom (in Jahren), n p = Anzahl der papillären Kraniopharyngeome, M p = Altersmittelwert der Patienten mit papillärem Kraniopharyngeom (in Jahren) Kontrollkollektiv Im Kontrollkollektiv sind 50 Proben enthalten. Die DNA wurde aus den Leukozyten gesunder Probanden durch eine venöse Blutprobe gewonnen. Es wurde erstellt, um Vergleiche zwischen gesunden Probanden und Tumorpatienten ziehen zu können Enzym Das in der Arbeit verwendete Enzym für die Anfertigung der PCRs war eine Taq-DNA-Polymerase der Firma Qiagen, Hilden Geräte Agagelstandard ohne Kühlung Whatmann Biometra Typ G45/1 (Biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen)

70 Alpha Unit TM Block Assembly for PTC DNA Engine TM Systems (MJ Research Inc., Watertown, USA) Biometra Standard Power Pack P25 (Biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen) Gel Documentation System, UVP s GDS 1000/GDS 7500 (Ultra- Violet Products Ltd, Cambridge, UK) Modell T1-Thermoblock (Biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen) Multigel-Long Whatman Biometra Typ G47 (Biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen) Peltier Thermal Cycler PTC-200 DNA-Engine TM Systems (MJ Research Inc., Watertown, USA) Pipetten 2 µl, 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl (Gilson, Villiers-le- Bel, Frankreich) Powerpack 300 (BIORAD, USA) Schüttler (Johanna Otto GmbH, Hechingen) Thermocycler Biometra (Biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen) Thermomixer 5436 (Eppendorf GmbH, Hamburg) Trockner Biometra Maxidry Typ D64 (Biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen) Trockner Biometra Mididry Typ D62 (Biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen) Vortex Genie 2 (Scientific Industries Inc., Bohemia, USA) Zentrifuge (Fisher Scientific, Korea) Zentrifuge Biofuge fresco (Heraeus Instruments, Osterode) Verbrauchsmaterialien Feather Disposable Scalpel sterile No.11 (Produkte für Medizintechnik, Köln) GB 002 Gel-Blotting-Papier (Schleicher & Schnell, Dassel) Pipettenspitzen 1000 µl (Biozym Diagnostik GmbH, Hess. Oldendorf) Pipettenspitzen mikro Typ Gilson 0,1-10 µl (Hartenstein, Würzburg)

71 Pipettenspitzen natur, universal MBT U200 (MBT Brand, Gießen) Reaktionsgefäße 0,6 ml (Biozym Diagnostik GmbH, Hess. Oldendorf) Reaktionsgefäße 1,5 ml (Hartenstein, Würzburg) Safeseal Tips Premium 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl (Biozym Diagnostik GmbH, Hess. Oldendorf) Strips PCR-Deckel 0,2 ml/8-fach (Hartenstein, Würzburg) Strips PCR-Gefäße 0,2 ml/8-fach (Hartenstein, Würzburg) Transferpipetten 6 ml (Sarstedt, Nürnberg) Chemikalien 100 mm dntp Set, µl, 25 µmol each, 5 units/µl (Invitrogen, Carlsbad) Acrylamid Fertiglösung 40 % für die Elektrophorese (Merck KgaA, Darmstadt) Ammoniumacetat zur Analyse (Merck KgaA, Darmstadt) Ammoniumperoxodisulfat zur Analyse (Merck KgaA, Darmstadt) (APS) Essigsäure (Eisessig) 100 % zur Analyse (Merck KgaA, Darmstadt) Ethanol absolut zur Analyse (Merck KgaA, Darmstadt) Ethylendiaminetetraacetic ACID Anhydrous Approx. 99 % (titration) (SIGMA Chemical CO, St.Louis, USA) (EDTA) Formaldehydlösung 37 % (zur Analyse stabilisiert mit etwa 10 % Methanol) (Merck KgaA, Darmstadt) Formamid zur Analyse (Merck KgaA, Darmstadt) Glycerin etwa 87 % zur Analyse (Merck KgaA, Darmstadt) Magnesiumacetat (Merck KgaA, Darmstadt) N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin (Merck KgaA, Darmstadt) (TEMED) N,N -Methylenbisacrylamid Fertiglösung BIS 2 % für die Elektrophorese (Merck KgaA, Darmstadt) Natriumcarbonat wasserfrei zur Analyse (Merck KgaA, Darmstadt)

72 PeqGOLD Universal Agarose (peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) Salpetersäure 65 % zur Analyse (Merck KgaA, Darmstadt) Silbernitrat krist. reinst (Merck KgaA, Darmstadt) Sodium dodecyl sulfate 10 % Solution (SIGMA Chemical CO, St.Louis, USA) (SDS) Puffer und Lösungen Q-Solution 5 (Qiagen, Hilden) Molecular Biology Grade Water 50 ml (Eppendorf GmbH, Hamburg) PCR Puffer 10 (Qiagen, Hilden) Längenstandard Hyper Ladder IV 100 Lanes (Bioline, Lückenwalde) Längenstandard 100 bp DNA Ladder 500 µl/ml (New England Biolabs, Frankfurt) Ladepuffer DNA II (Appli Chem GmbH, Darmstadt) (greenjuice) Laufpuffer: 428 µl greenjuice 1:6 verdünnt 72 µl Formamid 100 µl Glycerin 50 % TBE-Puffer 10 ph 8,3 Tris-Borat-EDTA Puffer (Merck KgaA, Darmstadt) TE-Puffer (1 ) ph 7,5 (Appli Chem GmbH, Darmstadt) 1,5 % Agarose-Gel: 50 ml 1 TBE 0,75 mg Agarose 4 µl Ethidiumbromid SSCP-Stocklösungen: 10% (1:29) ohne 5% Glycerin Acrylamid 48,34 ml Bisacrylamid 33,34 ml 5 x TBE 20 ml 87% Glycerin - Aqua dest. 98,32 ml

73 % (1:29) mit 5% Glycerin ohne 5% Glycerin Acrylamid 58 ml 58 ml Bisacrylamid 40 ml 40 ml 5 x TBE 20 ml 20 ml 87% Glycerin 11,5 ml - Aqua dest. 70,5 ml 82 ml 12% (1:59) ohne 5% Glycerin Acrylamid 59 ml Bisacrylamid 20 ml 5 x TBE 20 ml 87% Glycerin - Aqua dest. 111 ml 14% (1:29) ohne 5% Glycerin Acrylamid 67,66 ml Bisacrylamid 46,66 ml 5 x TBE 20 ml 87% Glycerin - Aqua dest. 65,68 ml 14% (1:49) mit 5% Glycerin ohne 5% Glycerin Acrylamid 68,6 ml 68,6 ml Bisacrylamid 28 ml 28 ml 5 x TBE 20 ml 20 ml 87% Glycerin 11,5 ml - Aqua dest. 81, 9 ml 93,4 ml 14% (1:99) ohne 5% Glycerin Acrylamid 69,31 ml Bisacrylamid 14 ml 5 x TBE 20 ml 87% Glycerin - Aqua dest. 106,69 ml Tabelle 14: Zusammensetzung der SSCP-Stocklösungen SSCP-Gel: 20 ml entsprechender Stocklösung 200 µl APS 10 % 20 µl TEMED APS 10 %: 1 g Ammoniumperoxodisulfat in 10 ml aqua dest gelöst

74 % Salpetersäure-Lösung: 200 ml 65 % Salpetersäure 13 l aqua dest Natriumcarbonat-Lösung: 225 g Natriumcarbonat gelöst in 7,5 l aqua dest 3,75 ml Formaldehyd 0,2 % Silbernitrat-Lösung: 4 g Silbernitrat gelöst in 2 l Bidest Elutionspuffer: 7,7 g Ammoniumacetat 0,4 ml EDTA 0,5 M 2 ml SDS 10 % 2 ml Magnesiumacetat 1 M 200 ml Bidest 3.2 Methoden DNA-Extraktion aus Gewebe Um die in der Arbeit verwendeten DNA-Proben aus dem Tumorgewebe zu gewinnen, wird zunächst das tiefgefrorene Gewebe aufgetaut. Dann wird es zerkleinert und mit RNAse A enzymatisch verdaut. Das gewonnene Lysat wird auf die Ionenaustauschersäule des hierbei verwendeten E.Z.N.A. Tissue DNA Kit II der Firma Peqlab gegeben. Das Kit beinhaltet eine Silikatmembran, die es ermöglicht, die DNA zu binden und die restlichen Bestandteile des Lysats auszuwaschen. Nach Zentrifugation und zweimaligem Spülen mit Waschpuffer werden Lipid- und Proteinreste ausgewaschen. Mittels eines Elutionspuffers wird dann die DNA, abhängig von ihrem ph-wert, von der Silikatmembran gelöst DNA-Extraktion aus Vollblut Die DNA-Gewinnung aus kernhaltigen Blutzellen erfolgte mittels der nicht toxischen Aussalzmethode nach Miller et al. (1988).

75 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die Polymerase-Kettenreaktion ermöglicht es, bestimmte DNA-Abschnitte identisch zu vervielfältigen. Die Methode wurde von Kary Mullis 1983 entwickelt und ist grundlegend für diese Arbeit. Mit Hilfe zweier Oligonukleotidprimer wird ein DNA-Einzelstrang, der die Matrize darstellt, unter Zugabe von einzelnen Nukleotiden und eines hitzestabilen Enzyms, der DNA-Polymerase, zu einem Doppelstrang ergänzt. Die DNA- Polymerase stammt aus dem hitzestabilen Bakterium Thermus aquaticus. Indem das Enzym die komplementären Nukleotide anlagert entsteht doppelsträngige DNA, die wiederum in zwei Einzelstränge aufgetrennt wird und erneut als Vorlage dient. Somit wird eine exponentielle Vervielfältigung des gewünschten DNA-Abschnitts möglich (Mullis et al 1992 und 1990). Die PCR setzt sich aus drei Schritten pro Zyklus zusammen. Diese laufen mehrmals nacheinander ab. Zunächst erfolgt die Denaturierung der zugrunde liegenden DNA bei 94 C. Hierbei werden die Doppelstränge in Einzelstränge aufgespaltet, indem die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den einzelnen Basen gelöst werden. Zu Beginn des Vorgangs muss die DNA drei Minuten lang bei 94 C erhitzt werden, in den sich anschließenden 40 Zyklen nur noch 40 Sekunden. Der nächste Schritt, die Hybridisierung oder auch Annealing genannt, vermittelt die Anlagerung der beiden Oligonukleotidprimer an den DNA-Einzelstrang. Auf molekularer Ebene binden die Primer an den Einzelstrang, indem sie mit der vorliegenden Basensequenz neue Wasserstoffbrückenbindungen eingehen. Für diesen Vorgang sind primerspezifische Temperaturen notwendig. Diese liegen zwischen 50 C und 65 C. Das Lysat wurde 40 Sekunden lang erhitzt. Schließlich wird der Zyklus durch die Elongation beendet. Hierbei werden freie Nukleotide aus der Lösung angelagert und aus dem Einzelstrang entsteht ein Doppelstrang. Dies erfolgt durch die Taq Polymerase, deren Temperaturoptimum bei 72 C liegt. Die Dauer der Elongation richtet sich nach der Länge des zu vervielfältigenden Stranges und benötigt hier 40 Sekunden. Nach dem letzten Zyklus der PCR ist eine weitere Elongation über 10 Minuten bei 72 C notwendig. Das fertige DNA-Produkt wird dann auf 10 C abgekühlt.

76 Ein Reaktionsansatz, auch "Template" genannt, enthält folgende Bestandteile in einem 0,2 ml Reaktionsgefäß: 7,35 μl PCR-Wasser 1,0 μl 10 x PCR-Puffer 0,2 µl freie Nukleotide (je 10 mm datp, dttp, dgtp, dctp) 0,2 µl forward Primer und 0,2 µl reverse Primer 0,05 µl Taq 1 µl DNA-Probe Wird der Reaktionsansatz mit Verwendung von 2 µl Q-Solution (Qiagen) durchgeführt, reduziert sich die zu pipettierende Menge des PCR-Wassers auf 5,35 µl Verwendete Primer Zunächst werden anhand der Basensequenz des Conductin-Gens passende Primersequenzen detektiert. Gemäß den detektierten Sequenzen sind von der Firma Operon passende Primerstock-Lösungen angefertigt worden. Diese verdünnt man auf 10 mm Primer enthaltende Lösungen. Danach legt man die PCR-Bedinungen für die einzelnen Primerpaare fest, indem man mehrere Test-PCRs mit unterschiedlichen Bedingungen durchführt. Hierbei werden PCRs mit unterschiedlichen Temperaturen, unterschiedlicher Zyklenanzahl und mit oder ohne Zusatz von Q-Solution angefertigt. Das fertige PCR-Produkt wird dann auf ein Ethidiumbromid - enthaltendes 1,5%-Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Dadurch kann überprüft werden, ob die gewählten Variablen ein Produkt liefern. Wichtig ist, grundsätzlich eine Wasserprobe mitzuführen, die keine DNA enthält, aber alle entsprechenden anderen Reaktionszusätze. Wenn die Wasserprobe auf dem Agarosegel keine Banden liefert, kann eine eventuelle Verunreinigung ausgeschlossen werden. Schließlich werden die PCR-Bedingungen gewählt, die die schärfsten DNA-Banden unter UV-Licht liefern. Außerdem ermöglicht die

77 elektrophoretische Auftrennung eine Abschätzung ob die Basenpaarlänge der erwarteten Länge des Produkts entspricht. Zu diesem Zweck wird das PCR-Produkt mit einem Längenstandard verglichen. Sind einzelne Exone des Gens zu groß für die Detektion von Punktmutationen mittels SSCP (über 250 Basenpaare), werden überlappende Amplikons angefertigt. In Tabelle 15 sind die Details ersichtlich. Alle 19 Abschnitte des Conductins werden durch die PCR und der Verwendung des Qiagen-Kits, das die Taq- Polymerase, die entspechenden Substrate für das Enzym (dntps = Desoxribonucleotidtriphosphate) und Pufferlösungen enthält, amplifiziert. Amplikon Sequenz 5`- 3` bp C Q Zyklen 1.1 fo 5`-AGAGATTCCAGACTCAGTGG-3` re 5`-TTGGAAGAGACAGACATGG-3` 1.2 fo 5`-TCACCAAACCCATGTCTGTC-3` re 5`-ATCCTTCAGGTTCATCTGCC-3` 1.3 fo 5`-CAGGCAGATGAACCTGAAGG-3` re 5`-CACTCCTCACATATTCGAGG-3` 1.4 fo 5`-GGGGAGAAAACACAGCTTAC-3` re 5`-CCTGTATCCACTGTCAACAG-3` 2 fo 5`-TCCTTCAAGAGGAGCGATCC-3` re 5`-TACACTGCTGTCCGTCATGG-3` 3 fo 5`-GATGGAATTCCTCCTTATCG-3` re 5`-TCGGGAAATGAGGTAGAGAC-3` 4 fo 5` GAACCCACCGCCTGCCCAAGGAGATGA-3` re 5`-ACGCCGTGGACGGAAGCAGGAAG-3` 5.1 fo 5`-TGCTTCCTGGGTCACTTCTC-3` re 5`-AGTATCGTCTGCGGGTCTTC-3` 5.2 fo 5`-AAGACCCGCAGACGATACTG-3` re 5`-TGGTACTGCGAATGGTGGTG-3` 5.3 fo 5`-ACCACCATTCGCAGTACCAC-3` re 5`-TAGCAGTAATACTCGCTGCC-3` 5.4 fo 5`-CTAAATGCCTGTAATGCGGC-3` re 5`-GCGAGTATTACTGCTACTCG-3` 6.1 fo 5`-GATTAACCGGGTCTCTGGG-3` re 5`-TCACTCTCCAGCATCCACTG-3` 6.2 fo 5`-AGTGGATGCTGGAGAGTGAG-3` re 5`-CCATTCCCACAATACCTCCG-3` 7.1 fo 5`-AACGTTGGACTGAGCAGACC-3` re 5`-GGGGTAGGCCTTTTTTGTGC-3` 7.2 fo 5`-GCACAAAAAAGGCCTACCCC-3` re 5`-ATCGCAGGGTCCTGGGTGAAC-3` 7.3 fo 5`-TTCACCCAGGACCCTGCGATG-3` re 5`-TGCTTTGGGGGCTTCGACAC-3` 8 fo 5`-TACCTCTAAATCCCTCGCCC-3` re 5`-ATCTTCTGGAGCCAGGCTTG-3` 9 fo 5`-ACAAAGAGCCAAAGAAACTG-3` re 5`-CCTATAATTTCCCTTTTTGC-3` 10 fo 5`-CTTCAAAAAAGCAAGCGATG-3` re 5`-AAATGTTTTGTCGCAGTTGC-3` Tabelle 15: Die Sequenzen der Primerpaare, deren Produktgröße und die entsprechenden PCR-Bedingungen (Annealing Temperatur in C, Anzahl der Zyklen und die eventuelle Verwendung von Q-Solution).

78 Agarose-Gelelektrophorese Das Prinzip der Agarose-Gelelektrophorese beruht auf der Trennung der doppelsträngigen DNA-Fragmente im elektrischen Feld. Deren Laufweite ist abhängig von der Fragmentgröße und der Agarosekonzentration des entsprechenden Gels. Ein vordefinierter Längenstandard hilft bei der Abschätzung der Größe der einzelnen Fragmente. Am besten geeignet zur Längenbestimmung sind Fragmente zwischen 0,5 und 25 kbp. Kleinere Fragmente können auch aufgetrennt werden, jedoch ist keine Beurteilung bezüglich ihrer Länge möglich. Somit dient das Verfahren dann lediglich ihrem Nachweis. Die Laufrichtung der negativ geladenen DNA-Fragmente richtet sich im Gleichstromfeld immer zur Anode. Sichtbar gemacht werden die PCR-Produkte mittels der Zugabe von Ethidiumbromid, einem Fluoreszenzfarbstoff, der mit der DNA reagiert und unter UV-Licht die DNA- Banden und den mitgeführten Längenstandard fluoreszierendes Licht emittieren lässt. In dieser Arbeit wird 1,5% Agarose verwendet. Deren Herstellung erfolgt aus 0,75 mg Agarosepulver, das in 50 ml eines 1x TBE- Puffers gelöst wird. Danach wird die Flüssigkeit in der Mikrowelle bei 900 Watt eine Minute lang erhitzt. Nach einigen Minuten, in denen die Flüssigkeit bereits etwas abgekühlt ist, gibt man 4 μl des Fluoreszenzfarbstoffes Ethidiumbromid hinzu und füllt die Flüssigkeit in eine Gussform. In diese werden Kämme eingefügt, die als Platzhalter für die im fertigen Gel benötigten Taschen fungieren. Nach weiteren 30 Minuten unter Abdunkelung ist das Gel abgekühlt und erhärtet. Es ist notwendig das Gel vor Lichteinfall zu schützen, weil das zugegebene Ethidiumbromid UVlichtempfindlich ist. Die Kämme werden aus dem gehärteten Gel gezogen und es wird unter Zugabe von 1x TBE-Puffer in den Aga-Gelstandard Biometra gelegt. Nachdem zum PCR-Produkt 10 μl formamidhaltiger Ladepuffer pipettiert wurde, kann das Gel mit 8 μl aus dem Ansatz beladen werden. Eine Tasche wird mit 3 μl Längenstandard (Hyper Ladder IV 100bp, von Bioline) befüllt. Nach einer Laufzeit von 20 Minuten bei 120 Volt werden die Banden unter UV-Licht detektiert. Die Laufgeschwindigkeit ist umso größer, je kleiner das Produkt ist und je höher die Voltzahl eingestellt wird.

79 Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus- Analyse (SSCP) Die Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse dient dem Nachweis von genetischen Veränderungen wie zum Beispiel Mutationen. Es können abweichende Nukleinsäureabfolgen in mehreren oder nur in einer einzelnen Nukleotidposition detektiert werden. Seit der Einführung der Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse (single strand conformation polymorphism assay, oder kurz SSCP) 1989 (Orita et al., 1989), gilt sie als eines der bekanntesten und sensitivsten Verfahren zur Mutationsanalyse (Nataraj et al., 1999). Nukleinsäureeinzelstränge gehen Paarungen mit komplementären Strängen oder Abschnitten des eigenen Stranges ein. Diese lagern sich je nach Basensequenz unterschiedlich an einander und bilden somit verschiedene dreidimensionale Strukturen, deren räumliche Anordnung von der einzelnen Basenabfolge und der jeweiligen Temperatur bestimmt wird. Durch die unterschiedliche Konformation der Nukleotidstränge ergibt sich im elektrischen Feld eine unterschiedliche Laufweite trotz gleicher Basenanzahl. Das Verfahren kann sowohl für RNAals auch DNA-Stränge angewandt werden. Die zu untersuchenden PCR- Produkte werden als Einzelstränge im denaturierten Zustand auf das hierfür angefertigte Polyacrylamid-Gel aufgetragen und danach elektrophoretisch aufgetrennt. Notwendig hierfür sind passende Gele, die vorher durch Testläufe an Gelen mit unterschiedlichen Acrylamid- und Bisacrylamidanteilen sowie mit und ohne Zusatz von 87 % igem Glycerin ermittelt wurden. Die Temperatur spielt eine wichtige Rolle für das Verfahren. In der vorliegenden Arbeit werden alle Analysen bei Raumtemperatur durchgeführt. Weil die Durchführung der SSCP unter verschiedenen Bedingungen die Sensitivität der Analyse erhöht, werden für jedes Primerpaar die zwei unterschiedlichen Polyacrylamid-Gele mit den deutlichsten Banden ausgewählt. Folgende Gelbedingungen wurden selektiert: 10% (1:29) mit und ohne Glycerin, 12% (1:29) mit und ohne Glycerin, 12% (1:59) ohne Glycerin, 14% (1:29) ohne Glycerin, 14% (1:49) mit und ohne Glycerin und 14% (1:99) ohne Glycerin. In Tabelle 16 sind die

80 jeweiligen Gelvernetzungen für die einzelnen Primerpaare zusammengefasst. Primer 1. Gelbedingung 2. Gelbedingung % (1:29) - Glycerol 14 % (1:99) - Glycerol % (1:29) - Glycerol 14 % (1:29) -Glycerol % (1:29) - Glycerol 14 % (1:99) - Glycerol % (1:29) - Glycerol 14 % (1:29) - Glycerol 2 12 % (1:29) - Glycerol 14 % (1:29) - Glycerol 3 14 % (1:29) - Glycerol 14 % (1:49) + Glycerol 4 12 % (1:59) - Glycerol 14 % (1:29) - Glycerol % (1:59) - Glycerol 14 % (1:29) - Glycerol % (1:29) - Glycerol 14 % (1:49) - Glycerol % (1:29) - Glycerol 12 % (1:29) - Glycerol % (1:29) - Glycerol 14 % (1:99) - Glycerol % (1:29) + Glycerol 14 % (1:49) - Glycerol % (1:29) - Glycerol 14 % (1:49) - Glycerol % (1:29) + Glycerol 14 % (1:49) + Glycerol % (1:29) - Glycerol 14 % (1:49) - Glycerol % (1: 29) - Glycerol 14 % (1:49) + Glycerol 8 12 % (1:29) - Glycerol 14 % (1:49) - Glycerol 9 12 % (1:29) - Glycerol 14 % (1:49) + Glycerol % (1:29) - Glycerol 14 % (1:29) - Glycerol Tabelle 16: Verwendete Gelbedingungen für die entsprechenden Primer Zur Herstellung eines Gels gibt man zu 20 ml der Acrylamid-Stocklösung, 200 µl Ammoniumperoxodisulfat und 20 µl TEMED, um die Lösung schneller zu polymerisieren. Die Flüssigkeit wird zügig zwischen zwei mit Abstandhaltern vorgefertigte Glasplatten gegossen. Die Platten wurden vorher mit einer Silikonabdichtung versehen, um ein Auslaufen der Lösung zu verhindern. In das noch flüssige Polyacrylamid-Gel werden zwischen die Glasplatten Plastikkämme eingesetzt, die als Platzhalter für die DNA- Proben dienen. Nach 20 Minuten sind die Gele soweit gehärtet, dass die Kämme gezogen und die Silikonabdichtungen zwischen den Platten entfernt werden können. Danach spannt man die Glasplatten paarweise in Elektrophoresekammern (Multigel Long, Whatman Biometra ) ein. Die

81 Kammer wird mit 0,5 x TBE-Puffer aufgefüllt bis die Glasplatten mit Puffer bedeckt sind. Im Anschluss können 2-4 µl der denaturierten DNA-Proben in die Geltaschen pipettiert werden. Die Denaturierung erfolgt für 10 Minuten bei 94 C. Danach müssen die Proben im Eisblock gekühlt werden, da sonst die Renaturierung einsetzt. Die SSCP-Geltaschen werden mit der jeweiligen PCR-Probe, 0,8 µl eines Längenstandards und einer Wasserprobe beladen. Diese wird mitgeführt um eine eventuelle Verunreinigung ausschließen zu können. Die Gelelektrophorese erfolgt dann über einen Zeitraum von Stunden bei einer angelegten Spannung von 70 V Silberfärbung Die Färbung der SSCP-Gele mit Silbernitrat macht die elektrophoretisch aufgetrennten, denaturierten DNA-Abschnitte dauerhaft sichtbar (Budowle et al., 1991). Dies ist durch die Komplexbildung von DNA mit Silberionen möglich, die im Färbevorgang unter Zugabe von Natriumcarbonat und Formaldehyd zu elementarem Silber reduziert werden. Auf diese Weise können die DNA-Banden sichtbar gemacht werden (Nataraj et al., 1999). Die Gele werden aus den Glasplatten gelöst und für 3 Minuten in 10 % Ethanol inkubiert, um die DNA in der Gelmatrix zu fixieren. Nach Spülen der Gele mit Aqua dest. erfolgt ein Ansäuern in 1 % Salpetersäure für 3 Minuten. Nach erneutem Waschen mit Aqua dest. müssen die Gele für Minuten lichtgeschützt in einer 0,2 % Silbernitratlösung inkubiert werden. Während dessen lagern sich Silberionen der DNA an und bilden Komplexe aus. Die nicht gebundenen Ionen werden anschließend durch eine dreimalige Spülung in Aqua dest. ausgewaschen. Anschließend werden die Gele in eine formaldehydhaltige Natriumcarbonatlösung gegeben, die eine ph-änderung verursacht und die Silberionen somit zu elementarem Silber reduziert. Die DNA-Banden werden durch diesen Prozeß sichtbar. Dabei kann man die Natriumcarbonatlösung gegebenenfalls wechseln, um bessere Färbeeffekte zu erreichen. Durch eine erneute Ansäuerung in einem Waschvorgang mit 10 % Essigsäure wird die Färbung fixiert und der ebenfalls mitgefärbte Gelhintergrund aufgehellt. Nach erneutem Spülen in Aqua dest. werden die Gele auf Filterpapier aufgebracht und für ca. 2-8

82 Stunden in einem Vakuumtrockner bei C getrocknet. Anschließend kann man sie beschriften und archivieren Elution der DNA aus Gelbanden Zeigen sich nach dem Färbevorgang DNA-Banden mit aberrantem Laufverhalten, werden diese mit einem sterilen Skalpell aus dem noch feuchten Gel ausgeschnitten (Chen et al, 1996). In einem 1,5 ml Eppendorf Cup wird die Bande mit 50 µl Elutionspuffer über Nacht (mindestens für 12 Stunden) im Thermomixer bei 50 C gerüttelt, um die DNA zu eluieren. Danach werden 125 µl reines Ethanol zugegeben damit die DNA präzipitiert. Das Elutionsgemisch ohne das Gelstück, das getrennt weggefroren wird, muß bei 20 C für 2 Stunden tiefgefroren werden. Im Anschluss daran wird die Lösung bei Raumtemperatur mit Umdrehungen pro Minute 30 Minuten zentrifugiert. Die DNA lagert sich dadurch als Pellet am Gefäßboden ab. Nach diesem Vorgang wird der Überstand vorsichtig abpipettiert und der DNA nochmals 500µl 70%iger Ethanol zugegeben. Das Gemisch wird für 15 Minuten bei U/min zentrifugiert, der Überstand erneut abpipettiert. Im Wärmeschrank wird dann das Pellet bei 50 C getrocknet. Abschließend gibt man 20 µl PCR- Wasser hinzu Reinigung der PCR-Produkte Bevor die eluierte DNA sequenziert wird, muss diese durch eine PCR amplifiziert und anschließend aufgereinigt werden. Die Reinigung wird mit dem Qiagen PCR Purification Kit (Qiagen) durchgeführt. Gearbeitet wird gemäß dem Herstellerprotokoll. Das Funktionsprinzip des Kits basiert auf einer Ionenaustauschersäule. Die negativ geladene DNA bindet bei hoher Salzkonzentration an positiv geladene Bestandteile einer Matrix, in diesem Fall einer Silica-Gel Membran. Andere Probenbestandteile werden herausgewaschen und danach wird die DNA mit Tris-Puffer von den Membranen gelöst und eluiert.

83 DNA-Sequenzierung Die Sequenzierung der DNA-Proben erfolgt mit Hilfe der Kettenabbruch- Methode (Sanger et al., 1977). Die DNA wird denaturiert um Einzelstränge zu erhalten, dann wird sie mittels Polymerase und spezifischen Primern amplifiziert. Den Kettenabbruch bewirkt man durch Zugabe von Didesoxynukleotiden. Dabei handelt es sich um Nukleotide mit nur einem Wasserstoffatom am 3`- Ende statt einer OH-Gruppe. An diese können keine weiteren Nukleotide binden. Die verwendeten Didesoxynukleotide sind mit einem spezifischen Farbstoff markiert. Es wird nur eine bestimmte der vier Basen zugegeben. Anschließend wird das Produkt elektrophoretisch aufgetrennt. So erhält man DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe, die an der entsprechenden Base abbrechen. Diese Reaktion wird für alle vier Basen mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt, um dann anhand der ansteigenden Fragmentlängen und der vier verschiedenen Farbstoffe mittels eines Laser-Photometers die Sequenz ablesen zu können. Die Sequenzierung wurde von der Firma gatc-biotech (Konstanz, Deutschland) mit BigDye Version 3 als Sequenzierchemie und einem automatischen Sequenzierer, dem ABI 3700 Sequencer von Applied Biosystems bzw. Perkin Elmer, durchgeführt Immunhistochemie Mit der immunhistochemischen Analyse wird das Verteilungsmuster der HVL-Hormone und von β-catenin in den Tumorzellen der Hypophysenadenome bzw. der Kraniopharyngeome untersucht. Bei dieser Methode werden folgende Antikörper verwendet: Adrenocorticotropin (ACTH; Klon 02A3, DAKO), Follikel stimulierendes Hormon (FSH; Klon C10, DAKO), Wachstumshormon (hgh; DAKO), luteinisierendes Hormon (LH; Klon C93, DAKO), Prolaktin (PRL, DAKO) und Thyroidea stimulierendes Hormon (TSH; Klon 0042, DAKO). Um β-catenin darzustellen wurde der monoklonale Antikörper Klon 14 (BD Biosciences) eingesetzt. Die chirurgischen Präparate werden über Nacht in 4%

84 Formaldehyd fixiert und in flüssiges Paraffin eingebettet. Daraus werden mit einem Microtom (Microm, Heidelberg) 4μm dicke Schnittpräparate angefertigt, die auf positiv geladene Objektträger gelegt werden (Superfrost + Menzel). Die Schnitte werden anschließend im Brutschrank bei 37 C über Nacht getrocknet. Mit einem automatisierten Färbeautomaten (Nexes; Ventana, Illkirch, France) wird die immunhistochemische Färbung durchgeführt. Entsprechend dem Färbeprotokoll werden die Proben bei Bedarf in der Mikrowelle vorbehandelt. Die histopathologische Einteilung der Tumoren erfolgte gemäß der WHO Klassifikation von Tumoren des Nervensystems und der WHO Klassifikation von Tumoren endokriner Organe (IARC, Lyon, 2007, 2004).

85 Ergebnisse 4.1 Immunhistochemie Das Verteilungsmuster von β-catenin wurde an 59 Hypophysenadenomen, 49 adamantinösen Kraniopharyngeomen und acht papillären Kraniopharyngeomen untersucht. Des Weiteren wurden zwölf unveränderte Hypophysengewebe in die Studie einbezogen. Im Normalgewebe ist β- Catenin vor allem in der Zellmembran nachweisbar. Das Zytoplasma zeigt einen nur geringen Gehalt von β-catenin und im Kern gelang immunhistochemisch kein Nachweis. Alle Hypophysenadenome weisen dieses physiologische β-cateninverteilungsmuster auf, wie in Abbildung 19 dargestellt. Bei 29 Adenomen (50%) kann zusätzlich im Zytoplasma eine verstärkte Anreicherung beobachtet werden. Abb. 19: Immunhistochemische Färbung eines Hypophysenadenoms mit monoklonalem Antikörper (Klon 14, BD Bioscience) zur Darstellung der β-cateninverteilung (braun), (75 fache Vergrößerung).

86 Im Gegensatz dazu zeigen 46 (94%) der 49 adamantinösen Kraniopharyngeome Tumorzellen mit einer starken β-catenin Färbung im Kern. Die restlichen drei weisen das gewohnte β-catenin-verteilungsmuster in der Membran und im Zytoplasma mit fehlender Kernanreicherung auf. Von diesen Proben war allerdings nur wenig Tumormaterial für die Immunhistochemie vorhanden. Die Verteilung der neoplastischen Zellen mit β-catenin-anreicherung im Kern ist nicht homogen. Mikroskopisch wechseln sich kleine Zellverbände mit Akkumulationen mit Arealen ohne Akkumulation ab. Auffallend ist die Verteilung der Zellen mit Kernanreicherung innerhalb der adamantinösen Kraniopharyngeome. Aus den immunhistochemischen den Abbildungen 20 und 21 wird deutlich, dass diese vor allem im Zentrum epithelialer Ausstülpungen des Tumors in Richtung tumorfreiem, gesundem Parenchym oder mesenchymalem Narbengewebe liegen. Des Weiteren findet man die Kernanreicherungen in Tumorzellen, die an so genannte ghost cells angrenzen (Abbildung 22). Abb. 20: Immunhistochemische Färbung eines adamantinösen Kraniopharyngeoms (1) mit typischen β-catenin-akkumulationen (braun), angeordnet in Wirbeln (2).

87 Abb. 21: Adamantinöse Kraniopharyngeome mit Kernakkumulationen, typischerweise in Wirbeln angeordnet oder wie hier gut sichtbar in epithelialen Begrenzungen zu benachbartem Gewebe; immunhistochemische Färbung mit einem monoklonalen Antikörper (Klon 14, BD Bioscience). Abb. 22: Adamantinöses Kraniopharyngeom mit β-cateninanreicherungen (2) um ghost cells (1), immunhistochemische Färbung.

88 Keines der acht papillären Kraniopharyngeome lässt dieses spezielle Anreicherungsmuster für β-catenin erkennen. Ihr Färbeverhalten entspricht dem von gesundem Parenchym bzw. dem der Hypophysenproben. Die Abbildung 23 zeigt, dass sich vor allem die Zellmembranen und geringfügig das Zytoplasma der Zellen anfärben. Abb. 23: Papilläres Kraniopharyngeom mit immunhistochemischer Anfärbung des β- Catenins. 4.2 SSCP-Analyse des Conductin (Axin 2/ Axil) Gens Mit Hilfe der SSCP-Analyse konnte im Primerabschnitt 1.4 eine Bandenabweichung in einer Tumorprobe detektiert werden. Es handelt sich um einen 46-jährigen männlichen Patienten mit einem Glucocorticoid-Zell- Adenom. Die aberrante Bande ließ sich sowohl auf dem Gel mit der Bedingung 12% (1:29) ohne Glycerol, als auch auf dem 14% (1:29) ohne Glycerol nachweisen. Abbildung 24 stellt eine aberrant laufende Bande dar.

89 Abb. 24: Aberrante Bande, detektiert auf Acrylamidgel. Das Kontrollkollektiv zeigte diese Bandenabweichung nicht. Die Sequenzierung der aberrant laufenden Probe ergab an Position 822 einen Austausch der Base Cytosin (C) durch Thymin (T). Dies führt zu einem Aminosäure-Austausch. Das Triplet, das für Prolin (Cytosin-Cytosin-Adenin, CCA) kodiert, wird durch das Triplet, das für Serin (Thymin-Cytosin-Adenin, TCA) kodiert, ersetzt. Die Basenveränderung liegt an einer nicht degenerierten Position, was bedeutet, dass jede der drei möglichen Substitutionsarten (Substitution mit Thymin, Guanin oder Adenin) nicht synonym ist, also in jedem Fall für eine neue Aminosäure kodiert. Prolin ist eine zyklische Aminosäure. Nach Bildung einer Peptidbindung stellt diese kein Wasserstoffatom für eine Wasserstoffbrückenbindung zur Verfügung. Durch den nachgewiesenen Austausch mit Serin, das eine Hydroxygruppe in einer Seitenkette aufweist, wird die Peptidstruktur verändert. Es entsteht eine potentielle zusätzliche Phosphorylierungsstelle, durch die Abbau oder Aktivierungsvorgänge eingeleitet werden können. Dieser Austausch führt somit zu einer Mutation im Codon 245. Diese Missense-Mutation ist in der Literatur bereits vorbeschrieben. Die restlichen Hypophysenadenom- und Kraniopharyngeomproben enthalten keine Veränderungen im Primerabschnitt 1.4. Tabelle 17 fasst die Ergebnisse der Sequenzierung des Shifts im Primerabschnitt 1.4 zusammen. Dargestellt sind das betroffene Codon, der Basenaustausch, die codierten Aminosäuren sowie die Patientendaten.

90 Patientenprobe Cytosin Thymin Prolin Serin Diagnose Zell-Adenom Alter (Jahre) 46 Tabelle 17 mit den Sequenzierergebnissen des Primerabschnitts 1.4. Bei der SSCP-Analyse der Kraniopharyngeome konnten im Primerabschnitt 5.2 in den Patientenproben 2194, 2198, 2405 Bandenabweichungen gefunden werden. Die aberrant laufenden Banden stellten sich in der Gelbedingung 14% (1:29) ohne Glycerol dar. Das Kontrollkollektiv und die Hypophysenadenome zeigten diese verändert laufenden Banden nicht. Die Sequenzierung der Proben ergab veränderte Basenmuster in Codon 455 (Cytosin-Cytosin-Guanin, CCG ersetzt durch Cytosin-Cytosin-Adenin, CCA) und in Codon 462 den gleichen Basenaustausch. Hierbei wurde Codon CCG (Cytosin-Cytosin-Guanin), das mit einer Häufigkeit von 7,0/1000 im menschlichen Genom auftritt, durch Codon CCA (Cytosin-Cytosin-Adenin) mit einer Häufigkeit von 16,7/1000 ersetzt (Strachhan, T. und Read A, 2004). Der Austausch erfolgte an vierfach degenerierter Position, was bedeutet, dass jede Base an dieser Stelle im Triplet mit der vorangehenden Basenfolge Cytosin-Cytosin-X für die gleiche Aminosäure (Prolin) kodiert. Dies wird auch synonyme Substitution genannt. Es entspricht einer stillen (silent) Mutation, das heißt, beide Male führt der Basenaustausch nicht zur Bildung einer anderen Aminosäure. Auf Grund dessen kommt es zu keiner Strukturveränderung des Proteins. Die Ergebnisse der Analyse des Primerabschnitts 5.2 sind in Tabelle 18 zusammengefasst. Codon Basenaustausch Aminosäure Glucocorticoid- Patientenprobe Codon Basenaustausch Aminosäure Guanin Adenin Prolin 462 Guanin Adenin Prolin Guanin Adenin Prolin 462 Guanin Adenin Prolin Guanin Adenin Prolin 462 Guanin Adenin Prolin Diagnose adamantinöses Kraniopharyngeom adamantinöses Kraniopharyngeom adamantinöses Kraniopharyngeom Alter (Jahre) Tabelle 18 mit Angaben über das betroffene Codon, den Basenaustausch, die Diagnose und das Alter der Patienten mit Bandenabweichungen im Primerabschnitt 5.2

91 Im Primerabschnitt 5.3 wurde eine Bandenabweichung in der Tumorprobe 2121 detektiert. Diese zeigte sich in beiden Gelbedingungen (10% (1:29) ohne Glycerol und 12% (1:29) ohne Glycerol). In den Proben des Kontrollkollektivs und der Hypophysenadenome konnte die Bandenabweichung nicht nachgewiesen werden. Die Tumorprobe stammt von einer 40-jährigen Patientin mit einem papillären Kraniopharyngeom. Die Sequenzierung der aberrant laufenden Bande ergab im Codon 515 ebenfalls eine stille Mutation. Hierbei konnte ein Austausch der Basen Cytosin (C) mit Thymin (T) an zweifach degenerierter Position detektiert werden (siehe Tabelle 19). Eine zweifach degenerierte Position bedeutet, dass es eine Base gibt (hier Thymin), die bei Ersatz mit der ursprünglichen Base (Cytosin) weiterhin für die gleiche Aminosäure kodiert. Die restlichen Basen (hier Adenin und Guanin) würden an dieser Stelle (CAX) für eine andere Aminosäure kodieren. Das ursprüngliche Triplet CAC (Cytosin- Adenin-Cytosin) (Codonhäufigkeit: 15,0/1000) und die neue Codonvariante CAT (Cytosin-Adenin-Thymin) (Codonhäufigkeit: 10,6/1000) kodieren beide für die Aminosäure Histidin. Somit ergibt sich an dieser Stelle keine Veränderung im Aminosäureaufbau des Conductins. Patientenprobe Codon Basenaustausch Aminosäure Cytosin Thymin Histidin Histidin Diagnose papilläres Kraniopharyngeom Alter (Jahre) 40 Tabelle 19 mit den Sequenzierergebnissen des Primerabschnitts 5.3 Im Primerabschnitt 5.4 zeigten sich bei dreizehn Patienten mit Hypophysenadenomen und bei elf Kraniopharyngeomproben aberrante Banden. Diese wurden in den Gelbedingungen 14% (1:29) ohne Glycerol und 14% (1:99) ohne Glycerol nachgewiesen. Deren Laufverhalten auf den Polyacrylamidgelen wird in Abbildung 25 dargestellt. Gleiche Bandenabweichungen wurden im Kontrollkollektiv bei acht gesunden Probanden gefunden. Die Sequenzierung ergab an Position einen

92 intronischen Austausch von Guanin (G) nach Thymin (T). Die gefundenen Veränderungen der Tumorproben im Primerabschnitt 5.4. und deren Sequenzierergebnisse, sowie die zugehörigen Patientendaten werden für die Hypophysenadenome in Tabelle 20 dargestellt. Für die adamantinösen Kraniopharyngeome werden diese in Tabelle 21 aufgelistet. Abb. 25: Aberrantes Laufverhalten der Proben des Tumorkollektivs (b,f,i,k,l,m,s) im Primerabschnitt 5.4. Intronischer Basenaustausch (G T) detektiert auf Acrylamidgel. Patientenprobe Intronische Position Basenaustausch Diagnose Alter (Jahre) Guanin Thymin Prolaktinom Guanin Thymin Prolaktinom Guanin Thymin Prolaktinom Guanin Thymin Gonadotropin-Zell- 52 Adenom Guanin Thymin Gonadotropin-Zell- 44 Adenom Guanin Thymin Gonadotropin-Zell- 49 Adenom Guanin Thymin Gonadotropin-Zell- 59 Adenom; invasiv; Rezidiv Guanin Thymin Nelson-Tumor Guanin Thymin Glucocorticoid-Zell- 46 Adenom Guanin Thymin Gonadotropin-Zell- 72 Adenom Guanin Thymin Nullzell-Adenom Guanin Thymin GH-Zell-Adenom Guanin Thymin Gonadotropin-Zell- Adenom 59 Tabelle 20 beinhaltet die Tumorproben der Hypophysenadenome mit intronischem Basenaustausch an Position Weiterhin sind die Diagnose und das Alter der betroffenen Patienten dargestellt.