Bestimmung der pflanzlichen oder fossilen Herkunft von L- Weinsäure durch Ermittlung ihrer 14 C -Aktivität

Transkript

1 RESOLUTION OENO 12/2008 BESTIMMUNG DER PFLANZLICHEN ODER FOSSILEN HERKUNFT VON L-WEINSÄURE DURCH ERMITTLUNG IHRER 14 C -AKTIVITÄT DIE GENERALVERSAMMLUNG, unter Bezugnahme auf Artikel 2, Paragraf 2 IV des Gründungsübereinkommens vom 3. April 2001 der internationalen Organisation für Rebe und Wein und auf Vorschlag der Unterkommission für Analysemethoden BESCHLIESST, den Anhang A des Internationalen Sammelwerks für Analysemethoden durch folgende Typ-IV-Methode zu ergänzen: Titel Bestimmung der pflanzlichen oder fossilen Herkunft von L- Weinsäure durch Ermittlung ihrer 14 C -Aktivität Typ der Methode IV 1. GEGENSTAND UND ANWENDUNGSBEREICH Die Methode kann dazu benutzt werden, die pflanzliche oder fossile Herkunft von Weinsäure festzustellen und bei einer Mischung der Verbindungen unterschiedlichen Ursprungs ihren jeweiligen Anteil zu ermitteln. Dabei lässt sich fossile L-Weinsäure (L+-Weinsäure) bereits in Mengen von weniger als 10 % bestimmen. 2. PRINZIP Die im Handel erhältliche Weinsäure pflanzlichen Ursprungs ist in den meisten Fällen ein Erzeugnis des Weinbaus. Das im Hefetrub vorhandene Kaliumhydrogentartrat wird extrahiert und als L-Weinsäure in Verkehr gebracht. Der 14 C - Gehalt der Säure hängt daher, wie beim Weinalkohol, vom 14 C -Gehalt des Kohlendioxids der zu Grunde liegenden Weine des jeweiligen Jahrgangs ab. Diese Aktivität ist auf Grund des Herstellungsprozesses relativ hoch. Synthetische Weinsäure aus fossilen Produkten hat hingegen einen wesentlich niedrigeren bzw. fast zu vernachlässigenden 14 C -Gehalt. Durch die Messung der 14 C -Aktivität in dpm/g Kohlenstoff (decays per minute = Zerfälle pro Minute) durch Flüssigszintillationszählung können die Herkunft und jegliche Mischungen beider Formen ermittelt werden. 1

2 3. REAGENZIEN UND PRODUKTE 3.1 Reagenzien Szintillationsflüssigkeit, z. B. Instagel Plus C-Toluol, dessen Aktivität von einem Labor zertifiziert wurde, als Referenz zur Berechnung der Effizienz des Geräts und seines Wirkungsgrads durch Erstellen der Quenchkurve C-, 3 H-Standards und 12 C-Toluol zum Kalibrieren des Szintillationszählers bezüglich des Untergrundrauschens %iges Nitromethan ultrareines Wasser (> 18 MΩ) C-Toluollösung mit ca. 430 dpm/ml durch Verdünnen der 14 C-Standardstammlösung in 12 C- Toluol 3.2 Standards Erstellen der Quenchkurve Nach dem Kalibrieren des Szintillators mit jeweils zertifiziertem 14 C-, 3 H- und 12 C- Toluol die Quenchkurve gemäß folgendem Protokoll erstellen. Zwölf Kolben mit 10 ml einer Lösung mit 500 g/l fossiler L-Weinsäure in Wasser beschicken, anschließend soviel 14 C- Toluolstandard hinzugeben, dass man insgesamt auf dpm pro Kolben kommt (bei Bedarf eine Zwischenlösung der Standardlösung in Toluol vorbereiten). Zunächst steigende Konzentrationen Nitromethan, z. B. in 12 Reagenzgläsern 0, 0, 0, 5, 10, 15, 20, 35, 50, 100, 200 und 400 µl hinzugeben und anschließend 10 ml Szintillationsflüssigkeit. Mindestens 3 Proben müssen ohne Nitromethan bleiben. Die Quenchkurve einmal im Jahr erstellen und dazu die Reagenzgläser in der Reihenfolge zunehmenden Gehalts an Nitromethan analysieren. Mit der Quenchkurve kann man die Effizienz bzw. den durchschnittlichen Wirkungsgrad (Meaneff) ermitteln Bestimmung des Untergrundrauschens (Messung des Nulleffekts) Anhand von fossiler L-Weinsäure, z. B. der zur Berechnung des Wirkungsgrads verwendeten Weinsäure, das Untergrundrauschen ermitteln bzw. eine Messung des Nulleffekts durchführen. Diese Analyse muss unmittelbar nach der Quenchkurve erstellt werden und anschließend ungefähr einmal im Monat. 2

3 3.2.3 Erstellen der Kalibrierkurve Vor der Szintillationsmessung muss die Reinheit der fossilen und der pflanzlichen L- Weinsäure durch HPLC geprüft werden. Kalibrieren mit einer Mischung aus Weinsäure pflanzlichen Ursprungs (mit garantierter Herkunft) mit der fossilen Form zwischen 0 % und 100 %. Herstellen der Lösungen mit 500 g/l Nullmessung bzw. Untergrundrauschen Standards Kontrollmessung jeweils in 50 ml-messkolben Wiegen 25 g fossile L- 25 g bekannte Blindlösung Weinsäure Mischungen aus fossiler und pflanzlicher L- Weinsäure Auflösen verschließen Mischung gut durch Schütteln und/oder auf Kopf stellen homogenisieren Herstellen der Szintillationsmischungen In Kunststoffkolben jeweils hinzufügen Testbeginn ausgehend v. Lösungen mit 500 g/l 10 ml mit Hilfe von Messpipetten Zusatz ///////////////////////// ///////////////////////// 100 µl Zugabe 10 ml mit Hilfe eines Automaten Szintillationsflüssigkeit gut verschließen und stark schütteln 15 Min. warten und während 500 Min. analysieren 3.3 Kontrollmessung Art der für die Kontrollmessung verwendeten Substanz Eine fossile L-Weinsäurelösung mit 500 g/l wird mit 14 C Toluol (dpm < 100) dotiert. Die Bestimmung des Untergrundrauschens muss zusammen mit der gleichen fossilen L- Weinsäure vorgenommen werden Art der Kontrollmessung Durch die Kontrollmessung wird sichergestellt, dass im Untersuchungsmedium keine fremde Aktivität vorhanden ist. 3

4 3.3.3 Maximal zulässiger Nullwert Der maximal zulässige Nullwert hängt vom verwendeten Material ab, ein Wert von 5% ist annehmbar Häufigkeit und Verfahren der Nullwertmessung Bei normalem Gebrauch wird einmal im Monat bzw. bei jeder Analysenreihe eine Nullwertmessung am Szintillatinsmessgerät durchgeführt. Diese Kontrolle wird auch bei jedem Wechsel der Szintillationsflüssigkeit bzw. nach Erstellen einer neuen Quenchkurve durchgeführt Entscheidungsregeln in Abhängigkeit von den Ergebnissen der Nullwertmessung Wenn die Ergebnisse nach Überprüfen des Messprotokolls außerhalb der Kontrollgrenzen liegen, müssen eine Kalibrierung des Szintillatinsmessgerät und anschließend eine neue Kontrollmessung vorgenommen werden. Wenn die Kalibrierung richtig ist, die Messung der neuen Kontrollmessung hingegen nicht, eine neue Quenchkurve erstellen und erneut eine Kontrollmessung durchführen. 4. GERÄTE 4.1 Mehrkanal-Flüssigszintillationsspektrometer mit Rechner, Drucker und voreingestellter Kalibrierung der Auswerteeinheit, dessen Quenchkurve zum Beispiel mit Nitromethan ermittelt wurde 4.2 Kaliumarme Kolben ( 40 K) mit Schraubverschlüssen, mit schwachem und identischem Hintergrundrauschen ml-pipetten mit 2 Messstrichen 4.4 Automatische Bürette mit einer Gewindeverbindung, passend für die Scintillationsgefäße 4.5 Laborgläser 4

5 5. PROBEN Die Reinheit der Proben kann erforderlichenfalls vor der Analyse durch Szintillation per HPLC überprüft werden. In ultrareinem Wasser eine Lösung mit 500 g/l zu analysierender Probe herstellen. Herstellung der Lösungen mit 500 g/l Analytische Nullmessung bzw. Untergrundrauschen Standards Kontrollmessung Probe jeweils in 50 ml-messkolben Wiegen 25 g fossile L-) 25 g bekannte Nulllösung Weinsäure Mischungen aus verwenden fossiler und 25 g pflanzlicher L- Weinsäure Auflösen verschließen Mischung gut durch Schütteln und/oder auf Kopf stellen homogenisieren Herstellung der Szintillationsmischungen In Kunststoffkolben jeweils hinzufügen Testbeginn ausgehend v. Lösungen mit 500 g/l 10 ml mit Hilfe von Messpipetten Zusatz ///////////////////////// ///////////////////////// 100 µl ///////////////////////// Zugabe 10 ml mit Hilfe eines Automaten Szintillationsflüssigkeit gut verschließen und kräftig schütteln 15 Min. warten und während 500 Min. analysieren Anmerkungen Nach jeweils 5 bis 10 analysierten Proben eine Probe mit 0 % natürlicher Weinsäure, d. h. 10 ml fossile Weinsäure und 10 ml Szintillationsflüssigkeit verwenden. Am Ende jeder Analysereihe das Untergrundrauschen bestimmen. 6. BERECHNUNG Die Messungen werden direkt in Stöße pro Minute (cpm) angegeben, müssen aber in dpm/g Kohlenstoff umgerechnet werden. 6.1 Ergebnisse Berechnung der spezifischen 14 C-Aktivität der Probe in dpm/g Kohlenstoff: 5

6 A = ( X X' ) , ( 1) Rm m - A: Aktivität in Zerfälle/Minute und pro Gramm Kohlenstoff - X: Impulse pro Minute der Probe - X : cpm der für das Untergrundrauschen benutzten fossilen L-Weinsäure - m: Masse der Weinsäure in der 10 ml Lösung bei Testbeginn mit 500 g/l, d. h. 5 g Säure - Rm: entspricht dem durchschnittlichen Wirkungsgrad in Prozent (1) es sind 3,125 Gramm Weinsäure pro Gramm Kohlenstoff (Verhältnis des Molekulargewichts der Säure (150 g/mol) in Bezug auf die Gesamtmasse an Kohlenstoff (d. h. 4 * 12 = 48 g/mol) vorhanden. Das Ergebnis wird mit einer Dezimalstelle angegeben. 6.2 Überprüfung der Ergebnisse durch die Kontrollmessung Das Ergebnis muss durch den Vergleich des in Punkt 6.1 erhaltenen Werts mit dem Ergebnis aus dem Zusatz verglichen werden. Bei einer großen Differenz (> 5%) muss der Wert in dpm ausgehend vom Wert in cpm wie folgt neu berechnet werden: dpm korrigiert= cpm/ Rm mit einem durchschnittlichen Wirkungsgrad (Rm) ausgehend von der Quenchkurve. Die beiden Ergebnisse dürfen nicht um mehr als 5 % vom Durchschnittswert abweichen. Ansonsten muss die Probe erneut analysiert und dazu die Menge des Zusatzes verdoppelt werden. Die 2 erzielten Ergebnisse mit den Standards vergleichen. Wenn sie nicht um mehr als 5 % vom Mittelwert von einander abweichen, das durchschnittliche Ergebnis angeben. Anmerkung: Das bedeutet, in diesem Fall liegt ein solches Quenching der Probe vor, dass die direkte Analyse nicht verwendbar ist. 6.3 Unsicherheit Die bei unseren Analysebedingungen erreichte Unsicherheit beträgt ± 0,7 dpm/g Kohlenstoff. 6

7 7. VALIDIERUNG DURCH VERGLEICH MIT EINER REFERENZMETHODE 7.1 Prinzip Die Weinsäure wird durch einen Verbrennungsprozess in CO 2 und anschließend in Benzolumgewandelt. Die Messung erfolgt dann durch Flüssigszintillation. Nach einer Vorbehandlung zur Beseitigung von Verunreinigungen wird das CO 2 der Probe gemäß folgender Reaktionskette in Benzol umgewandelt: C + O 2 CO 2 (1) CaCO HCl CO 2 + H 2 O + Ca Cl - (2) 800 C 2 CO Li Li 2 C Li 2 O (3) Li 2 C H 2 O C 2 H LiOH (4) Al 2 O 3 mit Cr 3+ und V 3 C 2 H 2 C 6 H 6 (5) (1) Organische Probe: Der Kohlenstoff der Probe wird unter Sauerstoffspülung und Hitze (oder einer Verbrennung unter Sauerstoffdruck ) zu Kohlendioxid (CO 2 ) umgewandelt. (2) Mineralische Probe (Karbonate marinen, terrestrischen, oder aquatischen Ursprungs, usw.): Das Karbonat wird durch Salzsäure (HCl) in Kohlendioxid (CO 2 ), Wasser und Kalziumionen zersetzt. (3) Durch Reaktion des Kohlendioxids (CO 2 ) mit auf +600 C bis +800 C erhitztem Lithiummetall entsteht Lithiumcarbid (Li 2 C 2 )und Lithiumoxid (Li 2 O). (4) Die Hydrolyse von Lithiumcarbid mit Wasser ergibt Acetylen (C 2 H 2 ) und Lithiumhydroxid (LiOH). Es muss tritium- und radonfreies Wasser verwendet werden. (5) Die Trimerisation von Acetylen an einem Aluminiumkatalysator, der mit Chrom- Vanadium überzogenen ist, bei ca. 185 C ergibt Benzol (C 6 H 6 ). 7.2 Vorgehensweise: Das entweder nach Abbrennen, Verbrennen oder Säureangriff einer Probe erzielte Kohlendioxid (CO 2 ) wird in einem Gaszylinder aufbewahrt. Man gibt die nötige Menge Lithium ( = Katalysator in eine Nickelschale und stellt anschließend das Ganze auf den Boden eines Wärmereaktors. Man erzeugt im Reaktor ein Vakuum und erhitzt den unteren Bereich, wobei gleichzeitig der obere Bereich an der Wandung mit Wasser gekühlt wird. 7

8 7.2.1 Herstellung des Carbids Nach ca. einer Stunde Erhitzen erreicht die Temperatur ca. 650 C. Nun kann das CO 2 mit dem geschmolzenen Lithium zusammengebracht werden. Die Lithiummenge liegt im Vergleich zur Kohlenstoffmenge der Probe immer im Überschuss vor. Der in Bezug auf die stöchiometrischen Bedingungen zu verwendende Lithiumüberschuss variiert nach verschiedenen Literaturangaben zwischen 20 und 100 %. Die chemische Reaktion (Herstellung des Carbids oder Einfangen ) findet praktisch unmittelbar danach statt, sodass die ersten Minuten für die Reaktion entscheidend sind. Diese Reaktion ist exotherm (Temperaturanstieg um 200 C). Die Umsetzung erfolgt ziemlich schnell und ist bereits nach den ersten 20 Minuten abgeschlossen, während das Erhitzen noch weitere 45 bis 50 Minuten fortgesetzt wird, um Radonspuren (aus Uran), die eventuell im Kohlendioxid enthalten sein können, zu entfernen Abkühlen Nach Abschluss der Behandlung (Erhitzen) lässt man den Reaktor bis auf Raumtemperatur (25 30 C) abkühlen Hydrolyse des Lithiumcarbids Man gibt Wasser im Überschuss (1,5 l) in den Reaktor. Die chemische Reaktion findet sofort statt und gleichzeitig wird Acetylen freigesetzt. Auch diese Reaktion ist exotherm (Temperaturanstieg von +80 bis zu +100 C). Das entstandene Acetylen wird dann verdampft, um mit dem Aluminiumkatalysator mit Vanadium-Chrom (Cr 3+ ) in Kontakt zu treten. Dieser wird vorab mindestens drei Stunden lang luftgetrocknet und dann weitere zwei Stunden unter Vakuum und Erhitzen auf +380 C. Dies ist von größter Bedeutung, um das gesamte auf dem Katalysator verbliebene Wasser zu entfernen Trimerisation Katalytische Polymerisation von Acetylen zu Benzol Vor der Trimerisation muss die Temperatur des Katalysators wieder auf +60 bis +70 C abgefallen sein. Da diese Reaktion ebenfalls exotherm ist, wird diese Temperatur von alleine aufrechterhalten. Anschließend wird der Katalysator während 1,5 Stunden erneut auf +180 C erhitzt und das Benzol desorbiert, um in einer Röhre, die mit flüssigem Stickstoff umgeben ist, aufgefangen zu werden. Das Desorbieren erfolgt unter Vakuum. Am Ende des Versuchs lässt man das kristallisierte Benzol sich wieder auf Raumtemperatur erwärmen, damit es vor der Verwendung zur Szintillationsmessung seine flüssige Form zurück erhält. 8

9 7.3 Apparatur für die Synthese von Benzol Vorrat C 2 H 2 Vorrat CO 2 OFEN PUMPE PUMPE Wasserkreislauf zur Abkühlung HEIZREAKTOR AUFFANGEN DES BENZOLS OFEN 750 C 7.4 Referenzlösung für die Szintillationsmessung Als Referenz für die Flüssigszintillationszählung wird eine auf 4 ml festgelegte Menge Lösung verwendet. Diese Lösung enthält idealer Weise 3,52 g Benzol als Probe in der Szintillationsflüssigkeit, die aus einem primären und sekundären Szintillanten besteht. Es gilt, dass die Dichte von Benzol 0,88 g/liter beträgt, d.h. 0,88 X 4 ml = 3,52 g. 9

10 Primäre Szintillationsflüssigkeit Chemische Bezeichnung Maximale Fluoreszenzwellenlänge Sekundäre Szintillationsflüssigkeit Chemische Bezeichnung Fluoreszenzwellenlänge Optische Absorptions- und Emissionseigenschaften der beiden szintillierenden Stoffe: Wellenlänge der maximalen Absorption Wellenlänge der maximalen Emission Butyl-PBD (2-(4-Biphenylyl)-5-(4-Tert-Butyl- Phenyl)-1,3,4-Oxadiazol) 367 nm bis-msb 1,4-Di-(2-Methylstyryl)-Benzol 415 nm 409 nm 412 nm 7.5 Korrektur des Delta 13 C-Werts für die isotopische Fraktionierung Die Messung erfordert eine Korrektur für die Isotopenfraktionierung mit einem 13 C PDB Standard und einem Wert von -25 o / oo. 8. VERFAHRENSKENNZAHLEN DER METHODE 8.1 Durchführung Zur Herstellung der Weinsäuretestlösungen mit 500 g/l wurden eine Weinsäureprobe aus dem Weinbau und eine synthetische Weinsäureprobe verwendet. Der Gehalt an Weinsäure aus dem Weinbau in den Testlösungen variierte zwischen 0 % und 100 %. Herkunft und Reinheit der beiden Ausgangsproben wurden mit Hilfe der Referenzmethode geprüft. 10

11 8.2 Ergebnisse: Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle und der Grafik aufgeführt: TATSÄCHLICHER GEHALT % WEINSÄURE AUS DEM WEINBAU ERGEBNISSE DER ERGEBNISSE DER ALTERNATIVEN REFERENZMETHODE METHODE 0 0 und ,5 und 6, ,4 und ,6 und 25, ,7 und ,4 und 50, ,8 und 58, und 63,

12 Activité Aktivität du Kohlenstoff carbone (in dpm/g Kohlenstoff) (en dpm/g de C) Alternative Methode C 14 -Aktivität entsprechend Gehalt an fossiler (L+) Weinsäure Méthode Alternative Activité C 14 en fonction de la teneur en acide tartrique (L+) fossile y = 0,159x + 0,2543 R 2 = 0,9917 % natürliche Weinsäure % de l'acide tartrique naturel 8.3 Genauigkeit, Präzision Die Genauigkeit beträgt 6,9 %. Die Standardabweichung für die Wiederholbarkeit der Alternativmethode beträgt 2,86 % pflanzliche Weinsäure. 9. LITERATUR Sammlung der internationalen Methoden zur Analyse von Spirituosen, Alkohol und des aromatischen Anteils der Getränke, Internationale Organisation für Rebe und Wein, offizielle Ausgabe, Juni 1994, Seite 201, 204, 210 und 307. EG-Analysemethoden für neutralen Alkohol, geltend für den Weinbereich, Verordnung der Kommission (EG) Nr. 625/2003 vom 02. April 2003 (ABl. Nr. L90 S.4 vom )] J. GUERAIN et S. TOURLIERE, Radioactivité carbone et tritium dans les alcools, Industries Alimentaires et Agricoles 92. Jahrgang, Juli - August 1975, Nr. 7-8 S. COHEN, B. CRESTO, S. NACHAMPASSAK, T. PAYOT, B. MEDINA, S. CHAUVET, Détermination de l origine de l acide tartrique L(+): naturelle ou fossile par la détermination de son activité C 14 - Document OIV FV 1238,