Forschungsschwerpunkt Tumorzellregulation

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1 Übersicht Forschungsschwerpunkt Sprecher: Prof. Dr. Friedrich Marks (- 03/02) Pathochemie (B0100) Prof. Dr. med. Volker Kinzel , FAX Biochemische Zellphysiologie (B0200) Prof. Dr. rer. nat. Walter Pyerin , FAX Biochemie der Zelle (B0300) Prof. Dr. rer. nat. Dieter Werner (- 09/01) , FAX Molekulare Biologie der Mitose (B0400) Prof. Dr. phil. Herwig Ponstingl , FAX Biochemie der gewebsspezifischen Regulation (B0500) Prof. Dr. rer. nat. Friedrich Marks , FAX Differenzierung und Carcinogenese in vitro (B0600) Prof. Dr. med. Norbert Fusenig , FAX Tumorbiochemie (B0700) Prof. Dr. med. Dietrich Keppler , FAX Signaltransduktion und Wachstumskontrolle (B0800) Dr. rer. nat. Peter Angel , FAX Genetik der Hautcarcinogenese (B0900) PD Dr. rer. nat. Petra Boukamp , FAX Zentrale Spektroskopie (R0400) William E. Hull PhD , FAX Im Zentrum der Arbeit des Forschungsschwerpunktes steht der Prozess der zellulären Signalübertragung und -verarbeitung. Eine Schlüsselreaktion der zellulären Signalverarbeitung ist die Proteinphosphorylierung. Die dabei beteiligten Enzyme, die Proteinkinasen und Phosphatasen, werden von mehreren Abteilungen untersucht. Auch das Gebiet der Lipidmediatoren, die nahezu jeden zellulären Prozess beeinflussen, werden von mehreren Abteilungen des Schwerpunktes bearbeitet. Die für die Biosynthese von Lipidmediatoren verantwortlichen Enzyme werden zunehmend als Angriffspunkte für krebsverhütende Ansätze diskutiert. Einen speziellen Aspekt der zellulären Signalübertragung stellen Transportkomplexe dar, die u.a. auch für das Ausschleusen von Giftstoffen aus der Zelle verantwortlich sind und deren Überaktivierung eine Ursache für die in der Klinik so gefürchtete Resistenzentwicklung von Tumoren gegen Chemotherapeutika sein kann. Grundlegende Eigenschaften dieser Transportkomplexe sowie Aspekte der sogenannten Multidrogenresistenz werden in mehreren Abteilungen des Schwerpunktes untersucht, wobei das vordringliche Ziel die therapeutische Überwindung der Zytostatikaresistenz darstellt. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeiten konzentriert sich auf die Entschlüsselung der molekularen Mechanismen der Zell-Zell und Zell-Matrix- Wechselwirkungen und ihrer Rolle in der normalen Geweberegeneration sowie der Tumorentstehung und Progression. Funktionelle Analysen von Transkriptionsfaktoren in genetisch veränderten Mäusen und Zellkultursystemen sind ein weiterer wichtiger Bestandteil des wissenschaftlichen Programms des Forschungsschwerpunktes. Die Abteilung Pathochemie befaßt sich mit folgenden Aspekten der zellulären Signaltransduktion: (1) Molekulare Mechanismen und funktionelle sowie strukturelle Konsequenzen von Proteinphosphorylierung/Dephosphorylierung; (2) Mechanismen der Katalyse, Regulation und Hemmung von Proteinkinasen mit dem Ziel der Entwicklung und Verbesserung klinisch anwendbarer Proteinkinase-Inhibitoren; (3) Struktur und Dynamik aktuell interessanter Proteindomänen, speziell die Wechselwirkung des HIV Glykoproteins 120 (gp 120) mit dem T-Zellrezeptor CD4, mit dem Ziel, diese zu hemmen. Hier befinden sich HIV-Hemmstoffe zu therapeutischen Zwecken in Entwicklung. Die Arbeiten der Abteilung Biochemie der Zelle zielen auf die Analyse von zellulären Strukturen und Ereignissen, die für die Proliferation von Zellen von Bedeutung sind. Hierzu gehören die Identifizierung und die molekulare Charakterisierung von Proteinen, die am Proliferationsprozess beteiligt sind oder Bestandteile von Zellzyklus-relevanten Zellstrukturen sind. Dabei gilt das Hauptinteresse den Proteinen des Centrosoms und den chromosomalen Verpakkungsproteinen vom Nicht-Histon-Typ. Der Leiter Prof. Werner ging 2001 in Ruhestand. Weitergeführte Arbeiten gelten der zellbiologischen und funktionellen Identifizierung, Analyse und Revertierung 53

2 54 Forschungsschwerpunkt B von Zytostatikaresistenz, auch im Rahmen klinischer Kooperationen. Die Abteilung Biochemie der gewebsspezifischen Regulation untersucht die molekularen Mechanismen der Tumorentwicklung. Ab März 2002 ist sie auf zwei Arbeitsgruppen aufgeteilt. Die Arbeitsgruppe Differenzierung normaler und neoplastischer Epidermis untersucht die Differenzierungswege des menschlichen Haarfollikels, des größten und komplexesten Anhangsorganes der Epidermis. Die Untersuchungen konzentrieren sich auf die Differenzierung des Follikels unter normalen Bedingungen, und schließen die Veränderungen bei erblichen Haaranomalien sowie bei der Entstehung haarfollikel-abgeleiteter Tumoren ein. Als Differenzierungsmarker dienen die epithelialen Keratine, die Haarkeratine, sowie ihre assozierten Proteine. Die Arbeitsgruppe Eicosanoide und epitheliale Tumorentwicklung untersucht molekulare Mechanismen der Eicosanoidwirkung in einfachen und stratifizierten Epithelien des Menschen und der Maus. Insbesondere interessieren in diesem Zusammenhang die physiologische Wundheilung, pathologische, entzündlich-degenerative Erkrankungen und die Entwicklung von Haut-, Brust- und Pankreastumoren. Die Arbeiten konzentrieren sich auf die Funktion und Regulation von Cyclooxygenasen und Lipoxygenasen, den Schlüsselenzymen der Eicosanoidbiosynthese, deren Expression und Aktivität bei diesen Prozessen transient oder permanent gestört ist sowie auf Eicosanoid-abhängige Genexpressionsmuster. Darüber hinaus werden Cyclooxygenasen und Lipoxygenasen auf ihre Eignung als Zielproteine für chemopräventive Maßnahmen geprüft. Die Untersuchungen der Abteilung Differenzierung und Carcinogenese konzentrieren sich auf Fragen zum molekularen Mechanismus der Zell-Zell Interaktion in der normalen Haut und ihrer Veränderungen im Rahmen der Hautcarcinogenese, insbesondere zur Tumor-Stroma- Wechselwirkung. Im Rahmen der Untersuchungen von Epithel-Mesenchym-Wechselwirkungen bei der Geweberegeneration konnte ein neuer Mechanismus wechselseitiger Regulation über die Induktion parakriner Faktoren aufgezeigt werden. Die Detailanalyse dieser Steuerungsmechanismen und ihrer zunehmenden Entgleisung bei der Tumorprogression soll helfen, das autonome Wachstum von Tumorzellen in vivo besser verstehen und beinflussen zu können. An einem von uns entwickelten Hautcarcinogenese-Modell wird die Wachstumsregulation und Tumor- Stroma-Wechselwirkung an verschiedenen Tumor-Entwicklungsstadien an Transplantations- und Zellkultur- Modellen untersucht. Derzeit im Vordergrund stehen Arbeiten zum Mechanismus der Tumor-Angiogenese und deren Blockade als Tumor-therapeutisches Prinzip. Diese neuen Tumortherapieverfahren werden in Zusammenarbeit mit anderen Gruppen und Industriefirmen mechanistisch analysiert und für den praktischen Einsatz vorbereitet. Das Forschungsprogramm der Abteilung Tumorbiochemie konzentriert sich auf die molekulare und kinetische Charakterisierung von Membrantransportern. Die Hemmung von Transportern der MRP-Familie, die für eine Übersicht Mehrfachresistenz gegen Zytostatika verantwortlich sind, ist ein wichtiges Ziel bei der Verbesserung der klinischen Chemotherapie von Tumoren. Die Produkte von Resistenz-Genen und die Produkte der MRP-Genfamilie, welche mehrere Konjugat-Exportpumpen normaler und maligner Zellen umfaßt, werden nach gezielter Mutagenese mit zellbiologischen und transportkinetischen Methoden untersucht. Die Klonierung, Expression und funktionelle Charakterisierung von Membrantransportern umfaßt auch Proteine, die für die Aufnahme physiologischer und zytotoxischer Substanzen in die Zelle verantwortlich sind und zur Familie der organic anion transporting polypeptides (OATPs) zählen. Die Abteilung Molekulare Biologie der Mitose hat sich zum Ziel gesetzt, molekulare Mechanismen nachzuweisen, die den Ablauf von Zellteilungen regeln, ihre Störungen in Tumoren aufzuklären und neue Wege zur therapeutischen Hemmung unkontrollierter Zellteilungen zu finden. Den Schwerpunkt dieser Arbeiten bildet die Analyse des sogenannten RCC1-Ran-Regulationsweges (RCC = regulator of chromosome condensation). Dieser Signalübertragungsweg ist an der Kontrolle der DNA-Replikation und der Zellteilung sowie am Kerntransport von Proteinen und an der Prozessierung von mrna beteiligt. Die Klärung der Regulationsmechanismen sowie ihrer Störungen soll dazu beitragen, Möglichkeiten zur gezielten Hemmung dieses Regulationsweges zu finden. Die Projektgruppe Biochemische Zellphysiologie arbeitet an der Aufklärung von Pathomechanismen proliferativer Prozesse. Zum einen werden Mechanismen untersucht, die durch Proteinkinase CK2 (Caseinkinase II) kontrolliert werden, einer lebenswichtigen, hoch konservierten Phosphotransferase, die an Signalvorgängen und Genexpressionen beteiligt und deren ungestörte Gegenwart Voraussetzung für das (Wieder)Eintreten von Zellen in den Zellzyklus ist. Insbesondere wird systematisch und genomumfassend nach Genen gesucht und ihre funktionelle Bedeutung charakterisiert, deren Expression von CK2 kontrolliert wird und die mit dem Auslösen der Zellproliferation verknüpft ist. Um zu erfahren, wie der Kontrolleur selbst kontrolliert wird, werden molekularphysiologisches Verhalten der CK2 sowie Struktur und Transkriptionskontrolle der CK2-kodierenden Gene analysiert. Zum anderen hat die Gruppe mit Untersuchungen zur zellulären und molekularen Biologie normaler und entarteter Knochenzellen begonnen und versucht mittels Chips-basierter Verfahren Gene zu identifizieren und in ihren zellulären Rollen zu charakterisieren, deren Expression mit Tumor-assoziierten Knochenerkrankungen und Knochenschmerz korrelieren. Damit sollen Ansatzpunkte für individualisierte Diagnose- und Therapieverfahren gefunden werden. Die Abteilung Signaltransduktion und Wachstumskontrolle untersucht die Mechanismen der Signalübertragung von physiologischen und pathologischen extrazellulären Signalen (Strahlung und andere genotoxische

3 Übersicht Substanzen mit kanzerogenen oder tumorpromovierenden Eigenschaften) und die dadurch ausgelösten Veränderungen in der Expression spezifischer Gene. Die Arbeiten konzentrieren sich auf die Funktion und Regulation von Untereinheiten des Transkriptionsfaktors AP-1 (Fos/Jun) und der Identifizierung und funktionellen Analyse von AP-1 Zielgenen durch Genom-weite Expressionsanalyse. Es werden sowohl genetisch veränderte Mäuse (transgene und knockout Mäuse) als auch davon abgeleitete in vitro Zellkultursysteme eingesetzt, um die spezifische Funktion dieser Untereinheiten bei der Zellproliferation, Transformation, Apoptose, Embryonalentwicklung, Angiogenese und Regeneration der Haut aufzuklären. Durch die Etablierung krankheitsrelevanter Tiermodelle und davon abgeleitete in vitro Systeme versuchen wir die molekularen Ereignisse der Krebsentstehung auf der Ebene der Genregulation zu verstehen. Seit Oktober 1999 ist der Abteilung eine selbständige Arbeitsgruppe Hormonwirkung und Signaltransduktion angegliedert, die von Frau PD Dr. Doris Mayer geleitet wird und sich mit dem Einfluß von Steroidhormonen auf die Entstehung von Tumoren befaßt. 55 Das Ziel der neu gegründeten Abteilung Genetik der Hautcarcinogenese ist, genetische Veränderungen zu identifizieren und funktionell zu charakterisieren, die bei der Entwicklung von UV-bedingten Hautcarcinomen eine Rolle spielen. In der dem Forschungsschwerpunkt angegliederten Zentralen Spektroskopie (ZS) wird, neben der routinemäßigen analytischen Dienstleistung (Aufklärung von Molekülstrukturen mittels Kernspinresonanz (NMR), Massenspektrometrie (MS) sowie IR- und UV-Spektroskopie), an der Entwicklung und Anwendung neuer Analyse-Verfahren in der Krebsforschung gearbeitet. Die Schwerpunkte der MS- Anwendungen sind Phospholipid-, Protein- und Peptidanalytik. Mit der MR-Spektroskopie bzw. Hochfeld-MR- Bildgebung in vivo werden u.a. Pharmakokinetik, Tumormetabolismus und Metastasenwachstum untersucht. Im Bereich molecular modeling wird ein über das Internet benutzbares Informationssystem bereitgestellt und Untersuchungen zur Konformation und Dynamik von Oligosacchariden und Glykoproteinen, sowie über denen Wechselwirkungen werden durchgeführt.

4 Abteilung B0100 Pathochemie 56 Abteilung Pathochemie (B0100) Leiter: Prof. Dr. Volker Kinzel Senior Wissenschaftler Dr. Dirk Bossemeyer PD Dr. Dieter Kübler Prof. Dr. Jennifer Reed Post-docs Dr. Michael Gaßel (01-) Dr. Dan Mihailescu (00- Gastwissenschaftler Dr. Saturnino Herrero (01-) Doktoranden Karin Bettinger (01-) Frank Gesellchen Darko Gosenca Anna Lisa Picciolo (- 00) Andreas Schlosser (zusammen mit R0400) Thorsten Schneider (- 01) Techniker/innen Hannelore Horn (1/2) Norbert König James Richards Ursula Stanior Die Abteilung befaßt sich mit molekularen Aspekten der zellulären Signaltransduktion: - mit Liganden/Rezeptor-Wechselwirkungen, der Steuerung des Zellzyklus durch exogene Faktoren und schwerpunktmäßig - mit Proteinkinasen, deren Hemmung und Aspekten der Proteinphosphorylierung. Die reversible Proteinphosphorylierung ist ein universelles Werkzeug zur schnellen Steuerung der biologischen Aktivität von Proteinen. Auch beim Wachstum von Krebszellen spielt sie eine große Rolle. Das Verständnis dieser Reaktion erfordert die Kenntnis der für Proteinphosphorylierung verantwortlichen Schlüsselenzyme - der Proteinkinasen - auf molekularer Ebene bis hin zu ihrer Regulation, Funktion und Hemmung bei der lebenden Zelle. Proteinkinase-Hemmstoffe werden bereits zur Therapie verschiedener Krebsformen eingesetzt. Überraschend wenig ist über die reversiblen Konsequenzen der Proteinphosphorylierung für die Struktur von Peptiden bekannt. Als Beitrag dazu interessieren uns Teilaspekte, die sich z.b. aus dem Vergleich von Dephosphound Phosphopeptiden ergeben. Um eine ebenfalls reversible Strukturveränderung bei Peptiden und dafür verantwortliche Faltungsmotive geht es in einem HIV-Projekt, bei der Milieu-bedingte Veränderungen, wie sie bei Liganden- Rezeptor-Wechselwirkungen stattfinden, eine Rolle spielen. Proteinkinasen der Zelloberfläche und extrazelluläre Proteinphosphorylierung D. Kübler, D. Gosenca In Zusammenarbeit mit Prof. I. Friedberg, Universität Tel Aviv, Israel; W.D. Lehmann, M. Wind, H. Heid, DKFZ Zusatzfinanzierung: DKFZ-Israel Kooperation An Zellentwicklung und Einbindung in die zelluläre Umgebung sind enzymatische Aktivitäten der Zelloberfläche beteiligt. Durch diese Enzyme können sowohl gebundene Substrate auf der Zelloberfläche als auch fremde Substrate aus der Zellumgebung verändert werden. Die von uns in den letzten Jahren an vielen Zellen nachgewiesenen Ser/Thr Proteinkinasen an der Zelloberfläche (Ekto-PK) besitzen Eigenschaften camp-abhängiger PK (PKA) und von Proteinkinasen CK1 und CK2. Ekto-CK1 und CK2 können im Tandem von intakten Zellen in das extrazelluläre Kompartiment freigesetzt werden, womit der Wirkungsbereich der enzymatischen Aktivität erweitert ist. Ekto-PK ermöglichen es Zellen, Substratproteine in ihrer biologischen Wirkung spezifisch zu verändern. Damit zeigen unsere Befunde, dass das mächtige Werkzeug der Proteinphosphorylierung auch außerhalb der Zellen genutzt wird und als Mechanismus der extra-intrazellulären Signalvermittelung wirkt. Eine inzwischen große Zahl von Literaturdaten zu normalen und maligne veränderten Prozessen unterstreicht diese zentrale Rolle extrazellulärer Proteinphosphorylierung. Ekto-PK und ihre Substrate bieten somit vermutlich wichtige pharmakologische und therapeutische Ziele. Ekto-PK-Substrate der Zelloberfläche können mittels radioaktiver Markierung sichtbar gemacht werden. und zeigen sich nach SDS-Gelelektrophorese und Autoradiographie als Zelltyp-spezifische Spektren von Phosphoproteinen. Einzelne dieser Ekto-Substrate sind relativ hoch markiert und kommen häufig bei Zellen vor. Durch biochemische und immunologische Analysen einschließlich Mikrosequenzierung und Massenspektroskopie-Daten ist es uns gelungen, pp120 als ein weiteres dieser stark phosphorylierten Zelloberflächenproteine zu charakterisieren [1]. Es wurde als Homologes eines bisher nur intrazellulär (besonders im Nukleolus) nachgewiesenen Proteins enttarnt. Die funktionelle Charakterisierung dieses sowie anderer Ekto-Substrate, die Mechanismen ihrer Expression als Zelloberflächenproteine und vergleichende Untersuchungen an Normal- und Tumorzellen sind Ziele laufender Arbeiten. Zu den Substraten der Ekto-PK gehören Moleküle mit unterschiedlichen Funktionen wie Wachstumsfaktoren, Hormone, Entzündungsmediatoren oder Komponenten der extrazellulären Matrix. In Zusammenarbeit mit I. Friedberg (Tel Aviv) wurden Untersuchungen zur Funktion von extrazellulären Nukleotiden (ATP) als Zellproliferationshemmer von transformierten und Tumorzellen durchgeführt. Die ATP-induzierte Zellwachstumshemmung korreliert mit der Inaktivierung von Wachstumsfaktor-Rezeptor gekoppelter

5 Tyrosinkinase-Aktivität und nachgeschalteter Signalwege. Die durch Ekto-PK katalysierte Phosphorylierung eines extrazellulären kleinen Proteins, das als Abkömmling eines Plasma-Glykoproteins identifiziert wurde, ist für die Zellwachstumshemmung entscheidend. Untersuchungen zur Herstellung dieses Wachstumsinhibitors aus Vorstufen, seine (Phospho-)Aktivierung sowie die Suche nach Rezeptoren auf Zielzellen und nachgeschalteter Signalwege sind Schwerpunkte für das Verständnis der Mechanismen der ATP-induzierten Tumorzellhemmung. Bioregulation der camp-abhängigen Proteinkinase D. Bossemeyer, S. Herrero de Vega, M. Gassel, N. König, V. Kinzel In Zusammenarbeit mit Dr. R.A. Engh, Roche-Diagnostics Penzberg; Prof. Dr. R. Huber und Dr. T. Holak, MPI für Biochemie, Martinsried; Prof. Dr. F.W. Herberg, Ruhruniversität Bochum; W.-D. Lehmann, A. Schlosser, DKFZ Zusatzfinanzierung: Roche-Diagnostics, Penzberg Die Mehrzahl aller menschlichen Krebserkrankungen und viele andere Krankheiten sind eng mit der Fehlregulation von Proteinkinasen verknüpft. Proteinkinasen als zentrale Schalter der zellulären Regulation und Signaltransduktion phosphorylieren Proteine, wodurch deren Funktionszustand reversibel geändert wird. Der Grundzustand der meisten Proteinkinasen ist allerdings der der Inaktivität, ihre pathologischen Wirkungen resultieren in der Regel aus ihrer Überexpression oder Daueraktivierung. Hemmstoffe für die Aktivität von Proteinkinasen sind daher äußerst vielversprechende Agenzien in der Tumortherapie mit z. t. überwältigenden therapeutischen Erfolgen bei nur geringen Nebenwirkungen. Dies zeigt eindrucksvoll das Beispiel des Proteinkinaseinhibitors STI571 (Gleevec) bei der Behandlung der chronischen myeloischen Leukämie. Dieser wurde auf der Basis der Struktur der ATP-Bindestelle von Proteinkinasen, wie sie von uns für die camp-abhängige Proteinkinase 1993 mit als erstes vorgelegt wurde, maßgeschneidert. Ein großes Hindernis bei der strukturbasierten Entwicklung von selektiven Proteinkinaseinhibitoren ist der Mangel an Kristallstrukturen therapeutisch relevanter Proteinkinasen. Von den über 600 verschiedenen Proteinkinasen des menschlichen Genoms sind bisher noch nicht einmal 5% kristallisiert. Die Arbeitsgruppe versucht daher, auf zwei Wegen räumliche Strukturinformationen von Proteinkinasen für die Inhibitorentwicklung zu gewinnen. Der direkte Weg führt über die rekombinante Expression, Reinigung und Kristallisation von Proteinkinasen, z. Z. überwiegend aus der Gruppe der AGC-Kinasen, zu der u. a. so wichtige Vertreter wie PKA, PKC, PDK1, PKB gehören. Hierzu werden sowohl bakterielle als auch eukaryontische (Insektenzell-) Expressionsysteme eingesetzt. Der indirekte Weg führt über die katalytische Untereinheit der PKA. Kokristallisationsstudien mit Proteinkinaseinhibitoren lassen Rückschlüsse darauf zu, welche Faktoren und Eigenschaften für die Bindung von Inhibitoren eine Rolle spielen [2]. Hierzu wurden von uns schon in der Vergangenheit eine Reihe von Kristallstrukturen von Proteinkinase/Inhibitorkomplexen veröffentlicht. Wegen der Abteilung B0100 Pathochemie hohen Konserviertheit des katalytischen Kerns von Proteinkinasen lassen sich bestimmte Eigenschaften und strukturelle Charakteristika anderer, verwandter Kinasen durch gerichtete Mutagenese von PKA nachahmen (dabei entstehen sogenannte Surrogatkinasen). Dieser Weg bietet den Vorteil der leichten Gangbarkeit, da für PKA vielfältige Aktivierungs- Reinigungs- und Kristallisationssysteme entwickelt wurden, die sich längst im Routineeinsatz bewährt haben. Um eine möglichst breite und solide Basis für die Entwicklung neuer Hemmstoffe zu schaffen, versuchen wir darüber hinaus, die strukturellen und funktionellen Mechanismen der Katalyse und der zellulären Inaktivierungsprozesse von Proteinkinasen zu verstehen. Hierzu kombinieren wir strukturelle Analysen [3], gerichtete Mutagenesen von ausgewählten Aminosäureresten und konservierten Strukturelementen und funktionelle sowie kinetische Studien, z. B. mittels Surface Plasmon Resonanz. Ein natürlicher Regelmechanismus von Proteinkinasen führt über die Phosphorylierung dieser Enzyme. PKAc z. B. verfügt, je nach Isoform, über mindestens 4 Phosphorylierungsstellen. Mit diesen Phosphorylierungen haben wir uns in einer Reihe von massenspektrometrischen Untersuchungen beschäftigt [4,5]. Außerdem gelang es uns, die unterschiedlichen strukturellen Eigenschaften dieser Phosphorylierungsstellen mittels NMR-Spektroskopie zu verstehen [6]. Die Wirkung zahlreicher Hormone wird über Änderungen des intrazellulären camp-spiegels vermittelt. Hauptwirkort dieses sekundären Botenstoffes ist ein einziges Enzym, PKA. Die vielfältigen und für das jeweilige Hormon spezifischen zellulären Antworten lassen sich nur durch subzellulär unterschiedliche Verfügbarkeiten und individuell besondere Eigenschaften von PKA und PKA-Isoenzymen erklären. Genetisch kennt man C=, C>, CC, sowie C>2 (entdeckt und kloniert in der Abteilung), und einige andere Splicevarianten. C>2 ist insofern ungewöhnlich, als es eine aminoterminale Extradomäne aufweist. Gegenwärtig untersuchen wir die Rolle von C>2 und seiner Extradomäne im Hinblick auf biochemische und biologische Wirkungen, wie Regulation, Protein-Proteinwechselwirkung, Translokation und Substraterkennung. Wir haben gefunden, dass C>2, welches ubiquitär in Säugern und auch in Vögeln vorkommt, funktionell einen Mangel an C= ausgleichen kann [7]. Auf der Proteinebene wurden zwei isoelektrische Ladungsvarianten der Proteinkinase A detektiert und in der Abteilung charakterisiert. Dies führte zur Entdeckung einer konservierten in vivo Deamidierungsstelle am Aminoterminus aller myristoylierten PKAc Isoformen, möglich nur unter Einsatz massenspektrometrischer Techniken, wie bereits zuvor publiziert. Unser Verständnis der funktionellen Rolle dieser Deamidierungsstelle beginnt sich aus der Untersuchung lebender Zellen abzuzeichnen. Die intrazelluläre Verteilung und Lokalisation wird demnach in hohem Maße durch diese posttranslationale Modifikation bestimmt. Als Folge wird die Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors CREB (camp-responsive element binding protein) durch PKA beeinflusst. Darüber hinaus wurde der eigentliche Prozess der Deamidierung von PKA, der von 57

6 58 Forschungsschwerpunkt B Razemisierungen begleitet wird, von uns bis ins Detail untersucht [8,9,10,11]. Kontrolle des Zellzyklus am G2/Mitose Übergang V. Kinzel, N. König, J. Richards In Zusammenarbeit mit W. D. Lehmann, A. Schlosser, M. Wind DKFZ Bei vielzelligen Organismen wird die Vermehrung der Zellen durch meist reversible Hemmung an physiologischen Restriktionspunkten im Zellzyklus, teils in G0, teils in G2 Phase vor der Zellteilung (Mitose, M) kontrolliert. Protein- Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsvorgänge spielen dabei eine Schlüsselrolle und damit implicite die dafür verantwortlichen Katalysatoren, Proteinkinasen und Proteinphosphatasen. Die Kenntnis deren Regulation auf molekularer Ebene ist daher Voraussetzung für das Verständnis der normalen sowie der gestörten Zellzykluskontrolle. Wir befassen uns mit der Regulation der Proteinphosphatase 2A (PP2A) am Übergang von G2 Phase in die Mitose. Dazu gab es bisher in der Literatur nur indirekte Hinweise. Es gelang erstmals, die Hemmung der PP2A am G2-M Übergang und in Mitose direkt zu zeigen [Klingler M. Dissertation 1999]. Vermutlich wird dabei die katalytischen Untereinheit der PP2A (PP2Ac) phosphoryliert, wie mit Antikörpern erhaltene Befunde andeuten. Ziel ist nun, zu zeigen, ob Immunreaktivität und an Protein gebundenes Phosphat einander entsprechen, d.h. der physikalische Nachweis. Dafür ist isolierte PP2Ac nötig, deren Reinigung aus synchronen Zellen inzwischen annährend quantitativ in einem Schritt gelingt. Sobald die auf Phosphorylierung hinweisende Immunreaktivität dieser PP2Ac stabil gehalten werden kann, soll das Protein mit Hilfe der Massenspektrometrie analysiert werden. Strukturdeterminanten von Proteinen J. Reed, K. Bettinger, D. Mihailescu In Zusammenarbeit mit: Prof. J.C. Smith, Universität Heidelberg, Prof. Dr. Langosch, Technische Universität München Zusatzfinanzierung: HGF Strategiefond, VW-Stiftung Abteilung B0100 Pathochemie In jüngster Zeit wurde immer deutlicher, daß in einer Reihe von Fällen Domänen eines Proteins, die für eine bestimmte Funktion verantwortlich sind, in isolierter Form - ohne den Kontext der nativen Proteinmatrix - sowohl ihre Struktur als auch ihre Funktion bewahren. Dies erleichtert Untersuchungen von Struktur-Funktionsbeziehungen bei solchen Domänen ganz erheblich, weswegen solche Studien heute in der medizinischen Grundlagenforschung sowie bei der gezielten Entwicklung von Medikamenten üblich sind. Diese Gruppe benützt biophysikalische Techniken wie Cirkulardichroismus- (CD) und magnetische Kernresonanz-spektroskopie (NMR) in Verbindung mit computergestützter Molekülmodellierung zur Analyse kritscher Kontrollaspekte bei Proteindomänen von medizinischem Interesse - zum einen, was Liganden-Rezeptor Wechselwirkungen im allgemeinen betrifft, zum anderen, wie posttranslationale Strukturveränderungen die biologische Aktivität beeinflussen. Der Konformations-Schalter im HIV1 Hüllprotein Der Befund dieser Gruppe, daß die CD4 Bindungsdomäne des Glykoproteins gp120 von HIV1 einen konservierten Konformations-Schalter enthält, d.h. einen Abschnitt, der eine kooperativen Umfaltung von einer >-Struktur zu einer 3 10 Helix bei Membranbindung erfährt, ermöglichte zwei Ansätze für eine neue Form anti-viraler Therapie. Beide zielen auf die Blockade des initialen Infektionsschrittes, der Bindung des Virus an den CD4 Rezeptor von Wirtszellen. Die Tatsache, daß die kooperative Umfaltung der Schalterdomäne absolut nötig ist zur Bindung an CD4, führte zur Suche nach Verbindungen, die diese Kooperativität hemmen. Die Suche war erfolgreich. Diese Substanzen verhindern in der Tat die Rezeptorbindung des gp120 Fragments an CD4 exprimierende Zellen. Im Zuge der Verfeinerung mit Hilfe von QSAR und Molekülmodellierung wurden Umfalt-Hemmer hergestellt mit einer ID 50 im niedrigen nanomolaren Bereich, die auch nicht toxisch waren in Zellkulturen. An diesem Punkt schien das Projekt reif für eine industrielle Weiterentwicklung, die mit einer Steinbeis GMBH eingeleitet wurde (Transferzentrum für angewandte Biologische Chemie und Transferzentrum Glykoconjugate). Das hohe Maß der Konservierung der Faltungseigenschaften der CD4 Bindungsstelle von gp120 - trotz einer erheblicher Sequenzvariabilität - eröffnet zusätzlich einen neuen immunologischen Ansatz. Die Strategie besteht in der präzisen Bestimmung des Peptid-Rückgrats dieser Domäne in freier, d.h. nicht an CD4 gebundener Form. Die diversen Aminosäuresequenzen in diesem Bereich der verschiedenen HIV1 Stämme kann dann auf die konservierte Rückgratstruktur aufmodelliert und die so erzeugten, Molekül-Oberflächen auf Ähnlichkeiten bezüglich der Ladungsverteilung, Hydrophobizität, sterische Charakteristika etc. überprüft werden. Sofern sich dann Regionen mit konservierten Oberflächeneigen-schaften identifizieren lassen, könnten sie als Schablone zur Herstellung eines Antigens dienen, das eine vom Virus-Stamm unabhängige Immunantwort auslösen kann. Die starke Tendenz zur Aggregation erlaubte bisher keine NMR Messungen der Rückgrat-Struktur der verschiedenen CD4 Bindungsdomänen unter polaren Bedingungen (Lindemann et al., eingereicht). Wir haben dieses Problem dadurch gelöst, daß wir den unter apolaren Bedingungen ermittelten NMR Strukturen mit Hilfe molekulardynamischer Berechnungen erlaubten, in simuliertem Wasser zu relaxieren [12] (Mihailescu et al., submitted). Sie mündeten alle in dieselbe Grundstruktur, die dann für die Modellierung der Molekül-Oberflächen unterschiedlicher Sequenzen ( 19 von insgesamt 8 HIV1 clades, der Gruppen M und O) herangezogen wurden. Dabei ergab sich ein übereinstimmendes, zum Pharmakophor geeignetes Phantom für den Entwurf eines stammübergreifenden Antigens zur Vakzine-Entwicklung.

7 Post-translationale Modifikationen Obwohl post-translationale Modifikationen bekannterweise ganz entscheidend sind für die Regulation von Zell- Wachstum und Stoffwechsel, so ist doch nur in ganz wenigen Fällen die Art und Weise bekannt, wie sie die Funktion von Proteinen ändern. Deshalb haben wir untersucht, wie solche Modifikationen, speziell Phosphorylierung, die Protein-Struktur lokal wie auch global beeinflussen [13]. Mit Hilfe von CD- und NMR-Messungen wurden an nativen wie auch künstlichen Peptidsequenzen die strukturellen Konsequenzen von Phosphorylierung, Deamidierung und Myristoylierung gemessen. Dabei ergab sich erstmals, daß Phosphorylierung direkt den bevorzugten Dihedral-Winkel des Peptid-Rückgrats am modifizieten Aminosäurerest verändert. Untersuchungen der interaktiven Effekte multipler Modifikationen am N-Terminus der katalytischen Untereinheit der PKA als Modell haben gezeigt, wie diese in synergistischer Weise Struktur und Membran-Affinität beeinflussen [14]. Fusionsfördernde Peptide Die Fusion von biologischen Membranen ist essentiell bei zahlreichen zellulären Prozessen und unterliegt vielen mikrobiellen Infektionen. Meist wird sie in gezielter Weise durch einen Satz spezialisierter Peptide induziert. Es wäre medizinisch nützlich, diesen Vorgang kontrollieren zu können, doch ist nicht bekannt, wie fusionsfördernde Peptide arbeiten. In einem von der VW Stiftung geförderten Projekt versuchen wir herauszufinden, welche Eigenschaften dieser ziemlich kurzen Peptide für die Fusion verantwortlich sind. Mit Hilfe synthetischer Peptide, die die fusionsfördernden Signale von Synaptobrevin II und Syntaxin 1A nachahmen, konnten wir zeigen, daß die fusionsfördernde Wirkung mit deren Fähigkeit gekoppelt ist, 1) selbst mit einander zu assoziieren und 2) dabei >-Struktur anzunehmen [15]. Helix-fördernde Maßnahmen verringerten die fusionsfördernde Wirkung. Diese Untersuchungen sollen auf fusionsfördernde Sequenzen des vesicular stomatitis Virus ausgedehnt werden, um zu sehen, ob hier ein allgemeiner Mechanismus vorliegt. Die Aufklärung der zur Membranfusion erforderlichen Sequenzeigenschaften könnte die Entwicklung von Peptiden erlauben, mit deren Hilfe eine spezifisch gezielte, liposomale Applikation von Medikamenten möglich wird. Peptidsequenzen mit Schaltereigenschaften Der Konformations-Schalter der CD4 Bindungsdomäne von HIV1 gp120 ist kein Einzelfall. Wir haben in zahlreichen anderen Proteinen spezifische Sequenzen mit polaritätsgesteuertem Konformations-Schalter identifiziert. Wir sind nun dabei zu untersuchen, ob solche Schalter einen allgemeinen Mechanismus zur Förderung von Protein- Membran- und Protein-Protein-Wechselwirkungen darstellen und wie sie identifiziert werden könnten. Die Fähigkeit, zu benennen, welche Eigenschaften eine Schaltersequenz als solche kennzeichnen und welche Wechselwirkungen dadurch gesteuert werden, würde die Vorhersage von Proteinfunktionen allein aus Kenntnis der Sequenz stark erweitern - ein vitaler Aspekt in der Post-Genom Ära. Abteilung B0100 Pathochemie Kooperationen Die Erfahrungen auf dem Gebiet der CD-Analysen der Sekundärstruktur von Proteinen haben zu einer Reihe Kooperationen geführt, die alle innerhalb des oben skizzierten Forschungsrahmens angesiedelt sind [16,17,18,19]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Kübler, D. (2001) Ecto-protein kinase substrate p120 revealed as the cell-surface-expressed nucleolar phosphoprotein Nopp140: A candidate protein for extracellular Ca 2+ -sensing. Biochem. J. 360, [2] *Engh, R.A., Bossemeyer, D. (2002) Structural aspects of protein kinase control - role of conformational flexibility. Pharmacology & Therapeutics, in press [3] *Engh, R.A., Bossemeyer, D. (2001) The protein kinase activity modulation sites: Mechanisms for cellular regulation - targets for therapeutic intervention. Adv. in Enzyme Regulation 41, [4] Schlosser, A., Lehmann, W.D. (2000) Five-membered ring formation in unimolecular reactions of peptides: a key structural element controlling low energy collision-induced dissociation of peptides. J. Mass Spectrom. 35, [5] Schlosser. A., Pipkorn, R., Bossemeyer. D., Lehmann, W.D. (2001) Analysis of protein phosphorylation by a combination of elastase digestion and neutral loss tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry 73, [6] *Seifert, M.H., *Breitenlechner, Ch., Bossemeyer. D., *Huber, R., *Holak, T.A., *Engh, R. (2002) Phosphorylation and flexibility of cyclic-amp dependent protein kinase (PKA). using 31 P NMR spectroscopy. Biochemistry, in press [7] Thullner, S., Gesellchen, F., Wiemann, S., Pyerin, W., Kinzel, V., Bossemeyer, D. (2000) Cß2 - A splice variant ofthe Cß subunit ofthe camp-dependent protein kinase characterized at the protein level. Biochem. J. 351, [8] Pepperkok, R., Hotz, A., König, N., Girod, A., Bossemeyer, D., Kinzel, V. (2000) Intracellular distribution ofmammalian protein kinase A catalytic subunit altered by conserved Asn2 deamidation. J. Cell Biol. 148, [9] Lehmann, W.D., Schlosser, A., Erben, G., Pipkorn, R., Bossemeyer, D., Kinzel, V.(2000) Analysis of isoaspartate in peptides by electrospray tandem mass spectrometry. Protein Science 9, [10] Kinzel, V., König, N., Pipkorn, R., Bossemeyer, D., Lehmann, W.-D. (2000) The amino terminus of PKA catalytic subunit - a site for introduction of posttranslational heterogeneities by conserved deamidation: D-Asp2 and D-isoAsp2 containing isozymes: Protein Science 9, [11] *Eberle, H.B., *Serrano, R.L., *Radke, S., *Füllekrug, J., Schlosser. A., Lehmann, W.D., *Lottspeich, F., *Kaloyanova, D., *Wieland, F.T., *Helms, J.B. (2002) Identification and characterization of a novel human plant-pathogenesis related protein that localizes to lipid-enriched microdomains in the Golgi complex. J. Cell Sci., in press [12] Mihailescu, D., *Smith, J.C., Reed, J. (2002) Solution structure of a putative HIV1 immunogenic peptide: Computer simulation of the principal CD4 binding domain of gp120. J. Med. Chem. 45, [13] *Eidenmüller, J., *Fath, T., *Pool, M., *Hellwig, A., Reed, J., *Sontag, E., *Brandt, R. (2000) Structural and functional implications oftau hyperphosphorylation: Information from paired helical filament (PHF)-like tau phosphomutants. Biochemistry 39, [14] Tholey, A., Pipkorn, R., Bossemeyer, D., Kinzel, V., Reed, J. (2001) Influence of myristoylation, phosphorylation and deamidation on the structural behaviour of the N-terminus of the catalytic subunit of camp-dependent protein kinase. Biochemistry 40,

8 Abteilung B0100 Pathochemie 60 [15] *Langosch, D., *Crane, J.M., *Brosig, B., *Hellwig, A., *Tamm, L.K., Reed, J. (2001) Peptide mimics of SNARE transmembrane segments drive membrane fusion depending on their conformational plasticity. J. Mol. Biol. 311, [16] Hofmann, I., Mücke, N., Reed, J., Herrmann, H., Langowski, J. (2000) Physical characterization of plakophilin 1 reconstituted with and without zinc. Eur. J. Biochem 267, [17] *Schneikert, J., *Hübner, S., *Langer, G., *Petri, T., *Jäättelä, M., Reed, J., *Cato, A.C.B. (2000) Hsp70-RAP46/chaperonecochaperone interaction in downregulation ofdna binding by the glucocorticoid receptor. EMBO J.19, [18] Pfrepper, K.-I., Reed, J., *Rackwitz, H.-R., Schnölzer, M., Flügel, R.M. (2001). Characterization of peptide substrates and viral enzyme that affect the cleavage site specificity of the human spumaretrovirus protease. Virus Genes 22, [19] *Simons, A., *Ruppert, T., *Schmidt, C., *Schlicksupp, A., Pipkorn, R., Reed, J., *White, A.R., *Bayer, T.A., *Cappai, R., *Multhaupt, G. (2002) Copper binding of APP-family members in an evolutionary reconstruction. J. Biol. Chem., in press

9 B0200 Biochemische Zellphysiologie Biochemische Zellphysiologie (B0200) Leiter: Prof. Dr. Walter Pyerin Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Karin Ackermann Dr. Andreas Krehan, (-07/00) Dr. Bernd Sorg Doktoranden Thomas Barz Oliver Böcher (-06/01) Gaelle Dubois (gem. m. Dr. R. Eils, H0900, DKFZ) Sabine Eisenberger Godehard Hoppe Kerstin Knerr Diplomanden Patrizia Bastone (-11/01) Jochen Gerber (-12/01) Tanja Neidhart Elke Schultz (-08/01) Anja Strasser (-03/01) Techniker Michael Emmenlauer Andrea Waxmann Wir untersuchen Pathomechanismen proliferativer Prozesse in zwei miteinander verzahnten Schwerpunkten. Zum einen analysieren wir einen konkreten Steuerungsmechanismus zellulärer Funktionen, den Proteinkinase-CK2- Komplex, zum anderen Zusammenhänge von Genexpressionen mit Tumor-assoziierten Knochenerkrankungen. Proteinkinase CK2 ist eine hoch konservierte tetramere Ser/Thr-Phosphotransferase bestehend aus zwei katalytischen Untereinheiten (CK2= und/oder CK2= ) und zwei regulatorischen Untereinheiten (CK2>). CK2 verhält sich janusköpfig. Einerseits lebenswichtig, kann CK2 andererseits Onkogencharakter entwickeln. Störungen von Aktivität oder Struktur ändern das Proliferationsverhalten von Zellen und in Modellsystemen wie Hefe oder Maus den Phänotyp. Zusammen mit der breiten Palette bekannter oder vermuteter CK2-Interaktionspartner, weist dies auf Beteiligung an einer großen Zahl zellulärer Funktionen hin. Trotz intensiver Arbeit in verschiedenen Laboratorien ist es bisher nicht gelungen, die erzielten Ergebnisse in eine eindeutige Vorstellung umzusetzen, welchen physiologischen Zweck CK2 besitzt und wie die Janusköpfigkeit zustande kommt. Es ist unser Ziel, zur Lösung dieses Rätsels beizutragen. Wir wollen Gene identifizieren und funktionell charakterisieren, deren Expression von CK2 kontrolliert wird und die an der Proliferationsauslösung beteiligt sind, und wir wollen zugehörige transkriptionsbestimmende CK2-Interaktionspartner finden [Grein und Pyerin 1999 Mol. Cell. Biochem. 191, ; Li et al J. Mol. Biol. 293, ]. Untersucht werden die Transkriptome des Menschen sowie der Modellsysteme Maus und Hefe. Darüberhinaus wollen wir wissen, wie die Expression des Kontrolleurs CK2 selbst kontrolliert wird. Im Berichtzeitraum konzentrierten wir uns auf CK2-abhängige Genexpressionen des Hefegenoms, weil dieses komplett entschlüsselt und damit in seiner Gesamtheit untersuchbar ist sowie auf Bau und Transkriptionskontrolle der Gene, die die Untereinheiten menschlicher CK2 kodieren. Tumor-assoziierte Knochenerkrankungen sind eine volkswirtschaftlich bedeutende Belastung; der Knochen ist nach Leber und Lunge das am dritthäufigsten von der Filialisierung maligner Tumore betroffene Organsystem. Das Wissen über die molekularen Hintergründe seiner tumorspezifischen Kolonisierung und die Pathogenese des begleitenden Knochenschmerzes ist lückenhaft und widersprüchlich. Proteinkinase CK2 spielt im Knochen wichtige intra- und extrazelluläre Rollen. Ziel unserer Arbeiten ist es, einen Beitrag zu liefern zu einer patientenspezifischen, DNA-Chips-gestützten, diagnose- und therapierelevanten molekularen Taxonomie von Metastasierung und Tumorschmerz. Mit den Arbeiten haben wir im Berichtzeitraum begonnen. Sie erfolgen im Rahmen des Tumorzentrums Heidelberg-Mannheim. 61

10 62 Forschungsschwerpunkt B Proteinkinase CK2-Komplex im Kontext proliferativer Prozesse W. Pyerin, K. Ackermann, T. Barz, G. Dubois, T. Neidhart In Kooperation mit: U. Wirkner, EMBL Heidelberg; H. Ansuini, Universita Perugia, Italien; O. Filhol, C. Cochet, INSERM Grenoble, Frankreich; C. V. C. Glover, University of Georgia, Athens, USA; J. DeRisi, University of California, San Francisco, USA; P. Lichter, R. Eils, DKFZ. Gefördert von: HGF-Strategiefonds III. CK2-kontrollierte Genexpression Ob eine Zelle den Weg der Proliferation, Differenzierung oder Apoptose einschlägt, entscheidet sich in der Zellzyklus-Anfangsphase und ist das Resultat spezifischer, temporärer Programme der Expression und Repression von Genen. Störungen sind häufige Ursache von Krankheiten, einschliesslich Krebs. Wir konnten zeigen, dass ohne die ungestörte Gegenwart des Proteinkinase-CK2-Komplexes menschliche Zellen die Zellzyklus-Anfangsphase nicht oder nicht korrekt durchlaufen [Pepperkok et al J. Biol. Chem. 269, ; Lorenz et al FEBS Letters 448, ], CK2 also an der Realisierung der dafür verantwortlichen Expressionsprogramme beteiligt ist. Mit Hilfe der DNA-Chip-Technologie, die ein Erstellen von Expressionsprofilen von hunderten und tausenden von Genen gleichzeitig und unter identischen Bedingungen erlaubt, versuchen wir herauszufinden, welche der Gene in CK2-abhängiger Weise exprimiert werden. Wir ermitteln Genexpressionsprofile an Zellen, deren Proteinkinase- CK2-Komplex wir gezielt verändern (Nukleinsäure- und Proteinebene). Wenn wir CK2-Gene im Modellsystem Hefe mutieren oder deletieren, finden wir eine Reihe von Genen signifikant in ihrer Expression erhöht oder erniedrigt. Ein Grossteil davon lässt sich zu Gengruppen ordnen, die ganze Regulone repräsentieren. Zwei davon, das Phosphatregulon und das Flockungsregulon, haben wir bisher näher untersucht. Insgesamt zeigen etwa 5-10% aller Gene des Hefegenoms in der einen oder anderen Weise Abhängigkeit von CK2 in ihrer Expression [1]. B0200 Biochemische Zellphysiologie Das Phosphatregulon interessiert, weil die Versorgung mit Phosphat essentiell ist für alle Zellen jeden Typs. Phosphatmangel hemmt Zellwachstum und löst Zellteilungsstop aus. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae besitzt für die Aufrechterhaltung der Phosphatversorgung den PHO- Stoffwechselweg, der transkriptionsreguliert ist und der sich aus einer Gruppe von etwa 20 Genen zusammensetzt. Die gezielte genetische Perturbation der vier Gene, die in Hefe die CK2-Untereinheiten kodieren, führt, wenn wir die Genexpressionsprofile beim Eintritt in den Zellzyklus erfassen (Übergang G0/G1-Phase; frühe G1-Phase), zu einer massiven Transkriptionsänderung der PHO-Gene. Ein Fehlen der regulatorischen CK2-Untereinheiten verursacht eine signifikante Depression der Gene, die für die Phosphat-versorgenden Phosphatasen (PHO5, PHO11, PHO12) und Phosphattransporter (PHO84, PHO89) kodieren sowie deren zentralen Transkriptionsaktivator (PHO4). Im Gegensatz zu diesen exekutiven PHO-Komponenten bleibt die CK2-Manipulation für die Komponenten des zentralen PHO-Regulationskomplexes aber ohne Konsequenzen: Die Gene PHO85, PHO80 und PHO81, die jeweils für eine Cyclin-abhängige Kinase (CDK), ein Cyclin, und einen CDK-Inhibitor kodieren, bleiben in ihrer Expression unverändert. Mit unseren Daten zeigen wir erstmals, dass die Gegenwart ungestörter CK2 für den PHO-Stoffwechselweg von essentieller Bedeutung ist. Störung reprimiert auf Dauer die Expression der Komponenten der Phosphatversorgung und des Phosphatsensoriums und entkoppelt sie damit von ihrem zentralen Cyclin-CDK-Kontrollkomplex, der CK2-unabhängig und Zellzyklus-verknüpft ist [2]. Das Flockungsregulon ist für massive Änderung der Lebensäusserung von Hefezellen verantwortlich. Hefen, die unter optimalen Kulturbedingungen ohne die Bildung flockender Verbände leben, flocken aus, wenn die Bedingungen ungünstig werden. Die Gene, die für Flockungsproteine und mit ihnen kooperierende Faktoren der Zellmembran kodieren, sind unter Optimalbedingungen reprimiert. Unsere Untersuchungen zeigen, dass diese Repression aufgehoben wird, wenn CK2 genetisch gestört wird. Folgerichtig führt dies unter Optimalbedingungen zum Ausflocken der Hefezellen. Wir finden dann eine signifikant erhöhte Expression der Flockungsgene (FLO1, FLO5, FLO9, FLO10, FLO11) und von Genen, die bestimmte Zellwandkomponenten und Kohlenhydrat-Stoffwechselfaktoren kodieren (AMS1, YDL223W, SKN1, FIT1, YMR317W) sowie einen zugehörigen Transkriptionsaktivator (SSN5). Interessanter Weise sind nicht nur Expressionsstärken verändert. Vielmehr wird die Expressionserhöhung etwa von FLO11 von einer neuen Transkript- Spezies verursacht, wahrscheinlich einem bisher unbekannten Splice-Produkt. Anders als bei den PHO-Genen (s.o.), bleiben Änderungen an den regulatorischen Untereinheiten der CK2 aber ohne Folgen für die Flockung, ebenso die Deletion einer der beiden katalytischen Untereinheiten. Flockung wird nur beobachtet, wenn nicht lebensfähige Doppelmutanten der katalytischen Untereinheiten (cka1 cka2) durch temperatursensitive Allele von CKA1 oder CKA2 gerettet wird und dabei die CK2-Aktivität unterhalb eines bestimmten, das Überleben gerade noch zulassenden Niveaus bleibt. Unsere Daten zeigen, dass der Proteinkinase CK2 im Flockungsregulon eine essentielle Gen-reprimierende Funktion zukommt, ohne die flockungsfreie Verbände nicht existieren können [3]. Unsere Daten weisen ferner aus, dass die CK2-Isoformen = und = funktionell unterschiedliche Rollen spielen können, und dass der Untereinheit ß nicht immer dieselbe Bedeutung zukommt. Während im Falle der FLO-Gene die Expressionskontrolle eher von der Höhe der Kinaseaktivität abhängt als davon, durch welche Isoform sie zustande kommt, und eine Deletion der regulatorischen Untereinheiten folgenlos bleibt [3], ist bei der Expressionskontrolle der PHO-Gene eine deutliche Isofom-Spezifität der katalytischen Untereinheiten und eine starke Abhängigkeit von den regulatorischen Untereinheiten zu finden [2]. Obwohl gegensätzlich in der Wirkung auf die Transkription und unterschiedlich in der Wirkungsqualität auf die FLO- und PHO-Regulone, scheint derselbe zellphysiologische Zweck sichtbar zu werden, der eines Überlebensfaktors

11 (cell survival factor; vgl. auch [Ahmed et al Trends in Cell Biology 12, ]). Hefe ist nicht nur als zelluläres Modell interessant. Vielmehr können Hefezellen auch als biologische Retorte vorteilhaft eingesetzt werden, etwa beim Studium menschlicher Genexpressionsmechanismen unter in vivo-bedingungen im 1H-System (one hybrid system) mittels Reportergen-Expressionen. Wir haben damit beispielsweise die Frage beantworten können, ob der zu beobachtende stimulierende Effekt von CK2= auf die Expression des menschlichen Aromatase-Gens direkt oder indirekt ausgeübt wird [Ackermann and Pyerin 1999 Mol. Cell. Biochem. 191, ]. Die neue Generation von 1H-Systemen verwendet eine Variante des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) als Reporter anstatt HIS3/lacZ. Das ist zeit- und arbeitssparend. Diese Alternative hat in seiner kommerziell erhältlichen Form allerdings das Manko einer fehlenden positiven Bezugsgrösse. Wir haben deshalb ein Kontrollvektor-Konstrukt mit Maus-p53-cDNA und seiner Bindungssequenz sowie Distanz-Modifizierungen zwischen Klonierungsstelle und Reportergen-Promotor entworfen und erfolgreich experimentell umgesetzt. Das Resultat ist eine positive Kontrollvektor-Kombination für GFP-1H-Systeme, eine notwendige Voraussetzung für genaue DNA- Protein-Interaktionsstudien [4]. Die Kontrolle des Kontrolleurs: Die CK2-Gene des Menschen und ihre Transkriptionsregulation. Das menschliche Genom besitzt vier CK2-Gene, zwei Gene für = and je ein Gen für = und > [Pyerin et al in: Protein Phosphorylation. F. Marks ed, VCH Weinheim, ]. Wir konnten bisher drei der vier menschlichen Gene isolieren und ihre Strukturen entschlüsseln, das CK2>-Gen und die beiden CK2=-Gene, von denen allerdings nur eines aktiv ist, während das andere ein prozessiertes Pseudogen darstellt. Im Mittelpunkt unserer Untersuchungen im Berichtzeitraum standen vergleichende Promotoranalysen des aktiven CK2=-Gens und des CK2>- Gens. Darüberhinaus versuchten wir, das noch ausständige CK2= -Gen zu isolieren und zu charakterisieren. Im Promoterbereich des etwa 70 kb grossen und aus 13 Exonen zusammengesetzten CK2=-Gens [Wirkner et al Genomics 48, 71-78] fallen GC-Boxen auf, eine CpG-Insel, zwei Transkriptionsstarts (Positionen +1 and 50) und das Fehlen einer TATA-Box. Das Gen endet 3 - wärts mit sechs potentiellen Poly-A-Stellen, wovon nur zwei verwendet zu werden scheinen. Stark Promotor-aktive Bereiche finden sich zwischen den Positionen -256 und 144 [Wirkner and Pyerin 1999 Mol. Cell. Biochem 191, 59-64]. Wir haben diese Region mit Hilfe eines Bündels von Methoden im Detail analysiert, darunter Reportergen- Assays (Luciferase; HeLa-, JEG-3-, SaOs-Zellen), ortsgerichtete Mutagenese, elektrophoretische Mobilitätsshifts und Supershifts, UV-Quervernetzung, Westernblots und DNA-Affinitätschromatographie. Die höchste Transkriptionsaktivität konnte auf den Abschnitt 9 bis 46 eingeengt und die Transkriptionsfaktoren Sp1, Ets1 und NF- B als Interaktionspartner identifiziert werden. Mutationsanalyse einzelner ihrer Bindestellen und simultane Mutationen von zwei und mehr dieser Stellen, weisen wechselseitige B0200 Biochemische Zellphysiologie funktionsbestimmende Einflussnahmen aufeinander nach, und die Anwesenheit der Faktoren in den Kernen der verwendeten Zellen konnte experimentell bestätigt werden. Interessanterweise stellte sich mindestens einer der Faktoren, Sp1, als phosphorylierbar durch das CK2-Holoenzym (= 2 > 2 ) heraus, nicht jedoch durch individuelles CK2=, dem Genprodukt. Die Phosphorylierung vermindert signifikant die Promotorbindung von Sp1. Bei Verfügbarkeit von CK2> ergibt sich daraus die Möglichkeit einer steuernden Rückwirkung des Genprodukts auf die Expression des eigenen Gens, indem das entstehende CK2= mit CK2> CK2-Holoenzym bildet, das dann Sp1 phosphorylieren und damit dessen Promotor-Bindung und/oder Interaktion mit Ets1 verändern und so die Transkriptionsaktivität des CK2=-Gens absenken kann [5]. Die Verfügbarkeit von CK2> für eine solche Regulation könnte sich aus einer synchronen Steuerung des CK2ß- Gens mit dem CK2=-Gen ergeben. Die vergleichende Analyse des Promotor-Bereichs des CK2>-Gens, das wir als ein 4.2 kb umfassendes und aus 7 Exonen bestehendes Gen charakterisiert haben [Voss et al J. Biol. Chem. 266, ], ergab tatsächlich starke Hinweise dafür. Wie das CK2=-Gen, besitzt auch das CK2>- Gen mehr als nur einen Transkriptionsstart, nämlich drei (Positionen +1, 33 und 113), und der Promotorbereich weist ebenfalls GC-Boxen auf, eine CpG-Insel und besitzt keine TATA-Box. Unter Anwendung des o.g. Methodenbündels fanden wir, dass auch hier den Transkriptionsfaktoren Ets1 und Sp1 herausragende Rollen in der Transkriptionsregulation zukommen. Und noch mehr: Im Bereich maximaler Promotoraktivität findet sich ein 12 Bp- Homologiebereich kompletter Sequenzidentität in beiden Genen, ein Ets1-Doppelmotiv. Mutationen in diesem Motiv haben vergleichbare negative Expressionseffekte auf beide Gene, während die Überexpression von Ets1 in beiden Fällen positive Effekte hat [6,7]. Wie in Fig.1 skizziert, scheinen diese Daten anzuzeigen, dass die Expression humaner CK2= und CK2> transkriptionell koordiniert wird, und dass diese Koordination massgeblich über das Ets1-Doppelmotiv und sein Zusammenwirken mit Sp1-Motiven gesteuert wird, die in den Promotoren der CK2-Gene zu finden sind. Die entstehenden Genprodukte, keines für sich befähigt auf die Transkription des jeweiligen Gens zurückzuwirken, werden nach Komplexierung zu CK2-Holoenzym in die Lage versetzt, Sp1 (und Ets1?) zu phosphorylieren und dadurch die Transkription beider Gene nach unten zu regulieren. Als Folge einer solchen negativen Rückkopplung sollte sich eine stabile zelluläre CK2=- und CK2ß-Transkripte-Situation ergeben. Tatsächlich finden wir zwar unterschiedliche Transkriptespiegel in unterschiedlichen Zelltypen, aber konstante Spiegel in jedem der Zelltypen, und das unabhängig vom Differenzierungs- und Proliferationszustand [6-8]. Im Berichtzeitraum gelang es uns, die Struktur auch des vierten der CK2-Gene des Menschen, CK2=, weitgehend aufzuklären, die in der Literatur vorhandene chromosomale Lokalisierung zu korrigieren und einen ersten Satz an Daten zur Transkriptionskontrolle zu erarbeiten [Manuskript in Vorbereitung]. Ausserdem waren Mitglieder der 63

12 B0200 Biochemische Zellphysiologie 64 Abbildung 1. Hypothese einer Transkriptionskoordination der menschlichen Proteinkinase-Gene CK2= und CK2>. Die Promotoren der Gene, die für die katalytische Untereinheit CK2= und die regulatorische Untereinheit CK2> kodieren, enthalten in den transkriptionsaktivsten Abschnitten (Regionen -9 bis 46 und -42 bis 14) dasselbe Ets1-Bindeelement (gelb; Doppelmotiv) und Ansammlungen benachbarter Sp1-Bindeelemente (grau). Die Transkriptionsaktivierung benötigt Ets1-Sp1-Interaktion. Generierte CK2=- und CK2>-mRNAs werden in die entsprechenden CK2- Untereinheiten translatiert (CK2=, rot ausgefüllter Kreis; CK2>, blau ausgefülltes Oval) und diese komplexieren zu tetramerem CK2-Holoenzym. Das Holoenzym, nicht hingegen katalytische Untereinheit alleine, kann Sp1 (und Ets1?) phosphorylieren und so allmählich die Transkription beider Gene hemmen (negative Rückkopplung). Gruppe an der Analyse von Varianten anderer Proteinkinasen beteiligt [9] sowie an der Strukturaufklärung von Naturstoffen mit karzinogenem Potential [10]. Tumor-assoziierte Knochenerkrankungen K. Ackermann, S. Eisenberger, G. Hoppe, K. Knerr, B. Sorg, W. Pyerin In Kooperation mit: Ch. Kasperk, G. Nöldge, P.J. Meeder, H.J. Bardenheuer, S. Kaul, Universitätsklinik Heidelberg; B. Korn, ResourcenZentrum Heidelberg; W. Weinig, J. Tuckermann, DKFZ; N. Schütze, Universitätsklinik Würzburg; J. Schmidt, GSF München. Gefördert von: Tumorzentrum Heidelberg-Mannheim. Osteomimikry (Metastasierung). Metastasierende Tumorzellen ändern das Verhalten von Knochenzellen und ihr Verhalten wird, umgekehrt, von Knochenzellen verändert. Kolonisierung das Knochens sollte demnach mit metastasierungstypischen Genexpressionsmustern verbunden sein. Wir wollen daher umfassende Genexpressionsprofile (s.o.) an Mikrodissektaten schmerzverursachender und schmerzfreier Metastasen und Osteoporosen erheben und sie vergleichend unter Einbeziehung klinischer Parameter sowie Daten aus Modellversuchen analysieren. Da aus Mikrodissektaten, anders als aus Zellkulturen, nur begrenzte, meist äusserst geringe Mengen an RNA zu gewinnen sind, haben wir Wert darauf gelegt, verschiedene Amplifikationsverfahren zu etablieren und an Hand ausgewählter Gene vergleichend abzuschätzen. Ein Beispiel gibt der RT-PCR-Nachweis von Aromatase-mRNA bei sehr geringen Transkript- Mengen [11]. Knochen ist u.a. bevorzugtes Ziel von Tumorabsiedelungen der Prostata. Damit sie im Knochen überleben und zu Metastasen anwachsen können, nehmen Prostatakarzinomzellen Eigenschaften von Knochenzellen an (Osteomimikry). Wir haben daher primäre Osteoblasten mit Prostatakarzinomzellen co-kultiviert und die Genexpressionsprofile der beiden Zelltypen mit Hilfe von Microarrays (cdna-chips) erfasst. Während das Genexpressionsprofil der Osteoblasten kaum verändert wurde ( erfasste Gene), war das bei Prostatakarzinomzellen auffallend anders. Unabhängig vom Progressionsgrad und Metastasierungspotential der Zellen (LNCaP-Zellen; PC-3-Zellen), war die Expression von 78 Genen in einem Kollektiv von Genen signifikant verändert. Zusätzlich waren weitere, Zelltyp-spezifische Expressionsänderungen zu sehen: 12 Gene waren nur in den LNCaP-Zellen, 39 andere Gene nur in den PC-3-Zellen verändert exprimiert. Unter diesen Genen finden sich solche, die für Adhäsions-spezifische Komponenten des Desmosomen-Adhäsions-Netzwerkes kodieren, beispielsweise desmosomale Cadherine (Desmocollin-1; Desmoglein-2), für das metastasierungs- und tumorprogressionsassoziierte N-Cadherin oder für Zelladhäsionskinasen. Darüberhinaus zeigen die Prostatakarzinomzellen deutliche Expression von Osteoblasten-spezifischen Genen, die beispielsweise für Kollagene, Biglykan, CBFA2, M-CSF-2-Rezeptor, Sonic hedgehog, u.a. kodieren und eindrücklich zeigen, wie das von Osteoblasten erzeugte Mikromilieu zur Osteomimikry-Basis der Prostatakarzinomzellen wird und damit wesentlich zu deren Fähigkeit beiträgt, sich im Knochen anzusiedeln [12]. Zelluläre und molekulare Biologie normaler und entarteter Knochenzellen. Knochenzellen können auch selbst zu Tumorzellen entarten. Um diese Osteotransformation zu charakterisieren, haben wir mit dem Studium unterschiedlicher Proliferations- und Differenzierungsstadien primärer Osteoblasten (Maus) begonnen und Vergleiche zu Osteosarkomzellen in Kultur (SaOS-2) angestellt. Neben morphologischen Parametern und Osteoblasten-spezifischen Markern, haben wir erste Genexpressionsprofile (cdna-arrays, Gene) ermittelt. Es finden sich, wie zu erwarten, deutliche Expressionsunterschiede zwischen proliferierenden und differenzierten Osteoblasten, zwischen verschiedenen Stadien der Differenzierung, und zwischen differenzierten Osteoblasten und Osteosarcomzellen. Die Analysenauswertung ist im Gange. Darüberhinaus untersuchen wir den Einfluss der Proteinkinase CK2 auf Genexpression und Proliferationsverhalten (Zellzyklus-Eintritt; Zellvermehrung) von Osteoblasten und Osteosarkom-Zellen in Perturbationsansätzen (Transfektion katalytisch inaktiver CK2). Die knochenaufbauenden Osteoblasten stehen in permanentem Wechselspiel zu den knochenabbauenden Osteoklasten. Störungen dieses Gleichgewichtes führen zu Knochenerkrankungen, etwa der volkswirtschaftlich hoch signifikanten Osteoporose. Daher interessieren wir uns ex-

13 perimentell auch für diesen Zelltyp. Wir haben bereits Knochenmark-Vorläuferzellen erfolgreich zu Osteoklasten differenziert und charakterisiert (Morphologie; Osteoklasten-spezifische Marker; Knochenmatrix-Resorption), und wir konnten alle drei Untereinheiten der Proteinkinase CK2 auf Transkriptions- und Proteinebene nachweisen [Manuskript in Vorbereitung]. Knochenwachstum und -stabilität hängen wesentlich von der Versorgung mit Östrogenen ab (Östrogenmangel- Osteoporose). Andererseits sind Östrogene Wachstumsfaktoren für Tumoren, die bevorzugt in den Knochen metastasieren, beispielsweise für Mammatumoren. Einfaches Ändern des Körper-Östrogenspiegels kann hier untaugliches therapeutisches Konzept sein. Daher beschäftgen wir uns mit der Transkriptionskontrolle des Aromatase- Gens in der Hoffnung, in Knochenzellen und Mammazellen therapeutisch nutzbare Unterschiede (Antisense-Technologie) in den Kontrollmechanismen zu finden. Das Produkt dieses Gens, Aromatase, ist Schlüsselenzym der Östrogensynthese. Interessanterweise besitzt dieses Gen, im Gegensatz zu den meisten Genen, ein ganzes Bündel von Promotoren (Exone 1), die mehr oder weniger weit vom Transkriptionsstart entfernt liegen und zu gewebsspezifischen 5 -Enden der Transkripte, aber stets demselben Genprodukt führen. Wir haben daher die Promotor- Verwendung des Aromatase-Gens in Proben aus verschiedenen Knochen-Arealen und -Typen analysiert sowie in primären Knochenzell-Kulturen (verschiedene Auswüchse) und permanenten Knochenzelllinien. Die erhaltenen Promotor-Verwendungen haben wir mit denen in Mamma-Zellen verglichen. Wir finden sowohl in Knochen wie auch in Mamma mehrere Promotorverwendungen und -shifts. Im Gegensatz zu Literaturangaben zeigt unsere Analyse, dass die Verwendungsmuster nicht eindeutig Zelltyp-spezifisch sind, sondern eher überlappend und damit nur bedingt als therapeutischer Ansatzpunkt für gegenläufige Aromatase-Expression in Knochen- und Mamma-Zellen taugen [13]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Ackermann, K., Waxmann, A., *Glover, C.V.C., Pyerin, W. (2001) Genes targeted by protein kinase CK2: A genome-wide expression array analysis in yeast. Mol. Cell. Biochem. 227, [2] Barz, T., Ackermann, K., Pyerin, W. (2002) Perturbation of protein kinase CK2 uncouples phosphate maintenance pathway from cyclin-cdk control. [3] Ackermann, K., *Glover C.V.C., *DeRisi, J., Pyerin, W. (2002) Genome-wide transcript profiling of deletion mutants demonstrates protein kinase CK2 to control flocculation-linked gene expression in Saccharomyces cerevisiae. [4] Barz, T., Ackermann, K., Pyerin, W. (2002) A positive control for the green fluorescent protein-based one-hybrid system. Analyt. Biochem. 304, [5] Krehan, A., *Ansuini, H., Böcher, O., Grein, S., Wirkner, U., Pyerin, W. (2000) Transcription factors Ets1, NF B and Sp1 are major determinants of the promoter activity of human protein kinase CK2= gene. J. Biol. Chem. 275, [6] Krehan, A., Schmalzbauer, R., Böcher, O., Ackermann, K., Wirkner, U., Brouwers, S., Pyerin, W. (2001) Ets1 is a common element in directing transcription of the =and > genes of human protein kinase CK2. Eur. J. Biochem. 268, B0200 Biochemische Zellphysiologie [7] Pyerin, W., Ackermann, K. (2001) Transcriptional coordination of the genes encoding catalytic (CK2=) and regulatory (CK2>) subunits of human protein kinase CK2. Mol. Cell. Biochem. 227, [8] Pyerin, W., Ackermann, K. Protein kinase CK2-linked gene expression control. (Review) Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 73, in press [9] Thullner, S., Gesellchen, F., Wiemann, S., Pyerin, W., Kinzel, V., Bossemeyer, D. (2000) The protein kinase A catalytic subunit Cß2: molecular characterization and distribution of the splice variant. Biochem. J. 351, [10] *Zayed, S.M.A.D., *Farghaly, M., *Soliman S.M., *Gotta, H., Sorg, B., Hecker, E. (2001) Dietary cancer risk from conditional cancerogens (tumor promoters) in produce of livestock fed on species of spurge (Euphorbiaceae): V. Skin irritant and tumorpromoting diterpene ester toxins of the tigliane and ingenane type in the herbs Euphorbia nubica and Euphorbia helioscopia contaminating fodder of livestock. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127, [11] Knerr, K., Ackermann, K., Pyerin, W. (2001) RT-PCR detection of aromatase mrna with small amounts of template. QIAGEN News 4, [12] Knerr, K., Ackermann, K., Pyerin, W. (2002) Osteomimicry of prostate carcinoma cells: Co-cultured osteoblasts provoke altered expression of adhesion-related genes. [13] Hoppe, G., Ackermann, K., *Kasperk, Ch., Pyerin, W. (2002) Transcriptional control of the human aromatase gene (CYP19): Comparative promoter usage analysis in cells derived from bone and mamma. 65

14 Abteilung B0300 Biochemie der Zelle 66 Abteilung Biochemie der Zelle (B0300) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Dieter Werner (- 09/01) Wissenschaftliche Mitarbeiter Prof. Dr. med. Christof Granzow Dr. rer. nat. Marijana Kopun-Granzow Dr. rer. nat. Karsten Rothbarth ( - 05/02) Examensarbeiten Tobias Baumbusch, medizinische Dissertation Debora Greco, medizinische Dissertation Michael Heuser, medizinische Dissertation Technische Mitarbeiter Barbara Liebetrau, TA (1/2) Ilona Jung, TA (1/2; - 09/01) Maika Schubert, TA (1/2;-01/02) Hermann Stammer, BTA (-09/01) Die Abteilung bestand aus zwei Gruppen, der Kern-Protein-Gruppe, geleitet von Prof. Werner und der Zellpharmakologie-Gruppe, geleitet von Prof. Granzow. Prof. Werner ist in Ruhestand gegangen. Im Zentrum der Arbeiten der Zellpharmakologie-Gruppe steht die Identifizierung und Modulation der Resistenzentwicklung durch antineoplastische Pharmaka, sowie die Entwicklung eines verlässlichen Tests für Chemoresistenz bzw. Chemosensibilität. Genomveränderungen multidrogenresistenter Tumorzellen (B0301) C. Granzow, M. Kopun In Zusammenarbeit mit Manfred Wiessler, DKFZ Induktion von Glufosfamid-Resistenz in menschlichen Tumorzellen Glufosfamid ist ein neuartiges Zytostatikum, dessen zytostatisch wirkender Anteil zum Zwecke einer spezifischeren Adressierung von Tumorzellen mit Glucose gekoppelt wurde. Der Glucoseanteil wird von glucosetransportierenden Proteinen der Zellmembran erkannt und akzeptiert. Da Tumorzellen mehr Glucose verbrauchen als normale Zellen, nehmen sie auch mehr zytostatische Aktivität auf und werden infolgedessen stärker als normale Zellen geschädigt. Im Rahmen einer klinischen Phase I-Studie zeigte Glufosfamid beträchtliche antineoplastische Wirksamkeit bei guter Verträglichkeit für die Patienten. Es ist zu erwarten, dass diese innovative Substanz in naher Zukunft große klinische Bedeutung erlangen wird. Für eine Beurteilung der klinischen Wertigkeit von Zytostatika ist neben der Toxizität die Neigung zur Resistenzentwicklung besonders bedeutsam, weil diese eine Limitierung der Wirksamkeit zur Folge hat. Üblicherweise werden bei der Resistenzentwicklung starke Transportaktivitäten in den Tumorzellen induziert, die zuvor nicht existierten und imstande sind, die Zytostatika sehr effizient aus den resistent gewordenen Zellen zu entfernen. Im Falle von Glufosfamid dagegen benutzt das Zytostatikum ein vorbestehendes Transportsystem der Zellmembran, auf das die Tumorzellen für ihr Funktionieren angewiesen sind. Insofern fehlen hier die Voraussetzungen für die üblicherweise sehr früh einsetzende und äußerst nachhaltige, transportervermittelte Resistenzentwicklung. Es erschien deshalb sowohl unter zellbiologischen als auch unter klinischen Aspekten interessant, ob und gegebenenfalls mit welchem Aufwand Resistenz gegen Glufosfamid in glufosfamidempfindlichen menschlichen Tumorzellen erzeugt werden kann. Die Experimente wurden unter in vitro-bedingungen durchgeführt. Bei epithelialen KB-Zellen gelang es unter größten Schwierigkeiten nach sechs Monaten Glufosfamidexposition lediglich, ein sehr niedriges Resistenzniveau zu etablieren und aufrechtzuerhalten. Nach Absetzen von Glufosfamid kehrte die ursprüngliche Sensibilität der Zellen gegenüber der Substanz rasch zurück. Bei CEM- Leukämiezellen war die Resistenzinduktion noch weniger effizient. Anfangs wurde bei beiden untersuchten Zellstämmen keine Kreuzresistenz gegenüber weiteren Zytostatika beobachtet. Nach monatelanger Weiterkultivierung mit Glufosfamid entstand jedoch das von Glufosfamidanaloga bekannte Kreuzresistenzmuster. Der molekulare Mechanismus der induzierten low level-resistenz ist noch unbekannt. Der geschilderte Verlauf der Resistenzentwicklung läßt erwarten, daß bei vorübergehender Anwendung von Glufosfamid beim Patienten Resistenzentwicklung keine Rolle spielen dürfte. Falls es dennoch dazu kommt, sind allenfalls geringgradige Minderungen der Sensibilität gegenüber Glufosfamid mit ausgeprägter Rückbildungstendenz zu erwarten. Dadurch unterscheidet sich Glufosfamid sehr vorteilhaft von konventionellen Zytostatika. Publikation: C. Granzow, M. Wiessler, M. Heuser und M. Kopun: Induction of glufosfamide resistance in human tumor cells without development of cross resistance to other cytostatic drugs. Proc. Amer. Ass. Cancer Res. 42, 323 (2001).

15 Abteilung B0400 Molekulare Biologie der Mitose Abteilung Molekulare Biologie der Mitose (B0400) Leiter Prof. Dr. Herwig Ponstingl Wissenschaftliche Mitarbeiter Priv.-Doz. Dr. Ralf Bischoff Dr. Simon Fernandez (BMBF) Dipl.-Ing. Klaus Leibe (BMBF) Dr. Gernot Maier Dr. Hans-Peter Zimmermann Gastwissenschaftler Dr. Alexander Marmé, Universitäts-Frauenklinik Heidelberg Dr. Mikael Sjölinder, Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden Doktoranden Kathrin Dellas-Kloor Lilia Moiseenko (DFG) Kerstin Weigl Weilin Wu Techniker Jürgen Kretschmer Olga Keberlein Antje Koppe Claudia Müller (DFG) Sabine Seib Sekretariat Sabine Hughes Die Forschungsarbeiten der Abteilung haben zum Ziel: Die Aufklärung des Transports von Makromolekülen durch die Hülle des Zellkerns, um zu verstehen, wie Transportdefekte zur Entstehung von Tumoren beitragen, und um Transportwege therapeutisch zu nutzen. Die Identifizierung neuer Tumormarker und Tumorsuppressoren in Ovarialkarzinomen durch systematische Analyse des Ablese-Profils von Genen. Die Entwicklung hochkomplexer Peptid-Arrays zu diagnostischen Zwecken und zur Suche nach therapeutischen Wirkstoffen. Das Ran-System im nucleocytoplasmatischen Transport R. Bischoff, M. Sjölinder, L. Moiseenko, W. Wu, H. Ponstingl In Zusammenarbeit mit: D. Görlich, Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg; E. Hurt, Biochemiezentrum der Universität Heidelberg; U. Kutay, Institut für Biochemie der Eidgenössischen Technischen Hochschule Zürich, Schweiz; I. Mattaj, EMBO Laboratorium Heidelberg; G. Schlenstedt, Institut für Biochemie der Universität des Saarlandes, Homburg. Die kleine GTPase Ran regelt mit ihren Kontrollfaktoren und Bindungspartnern den Transport von Proteinen und Ribonukleinsäuren durch die Porenkomplexe der Kernmembran. Wir haben die Hauptkomponenten des Systems und mehrere Transportfaktoren isoliert und die Rolle von Ran bei der Bildung von Transportkomplexen am Ausgangspunkt und ihrem Zerfall am Ziel untersucht. Danach liegt Ran auf der cytoplasmatischen Seite der Kernmembran vorwiegend als inaktives RanGDP vor, im Kern hingegen als aktives RanGTP. RanGAP, ein Aktivator der Nukleotidhydrolyse, ist verantwortlich für die Inaktivierung im Cytoplasma, die Aktivierung im Kern bewirkt ein Nukleotid-Austauschfaktor, RanGEF [6,7]. Die Transportfaktoren reagieren auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von RanGTP mit der Bildung von Komplexen mit der Fracht oder mit dem Zerfall solcher Komplexe. Importine und Exportine verhalten sich dabei gegensätzlich: Frachtproteine im Cytoplasma mit einem Kernlokalisations-Signal (NLS) binden in Abwesenheit von RanGTP an Importin, das Vehikel für den eigentlichen Import. Der Transport durch die Kernpore folgt einem bisher ungeklärten Mechanismus, der offenbar ohne energieliefernde Nukleotidspaltung auskommt. Im Kern wird der Import durch Zerfall des Komplexes beendet. Dabei bindet RanGTP sehr fest an das Importin und löst dort eine Änderung der Molekülgestalt aus, die das Transportgut freisetzt. Gleichzeitig wird dadurch verhindert, daß sich die Importkomplexe wieder bilden. Es gibt fast zwei Dutzend Transportfaktoren, die sich in ihrer Struktur ähneln [2, 3]. Im Gegensatz zu den Importinen binden Exportine ihre Frachten, die ein nukleäres Exportsignal (NES) besitzen, im Kern unter Ausbildung eines Komplexes mit RanGTP [2, 4]. Dieser sehr feste Exportkomplex wird ohne Hydrolyse des gebundenen GTP ins Cytoplasma befördert. Dort sind die Komplexe zunächst nicht für RanGAP zugänglich, das den Zerfall anregt. Hier greifen das kleine cytoplasmatische RanBP1 [1, 4] und das RanBP2 der cytoplasmatischen Fasern an den Kernporen ein: Sie binden an RanGTP an einer anderen Stelle als die Transportfaktoren und ändern die Gestalt des Exportkomplexes. Nun erst wird die Inaktivierung des Rangebundenen GTP durch RanGAP und damit der Zerfall des Komplexes angeregt. So wird verhindert, daß sich der exportierte Komplex wieder zurückbildet. Damit sind die beteiligten Faktoren wieder für eine neue Transportrunde bereit. Inaktives RanGDP schließlich wird durch einen be- 67

16 68 Forschungsschwerpunkt B sonderen Importfaktor NTF2 in den Kern zurückgebracht, um dort durch Nukleotidaustausch an RanGEF aktiviert zu werden. Während RanBP1 und RanBP2 auf der cytoplasmatischen Seite der Kernporen beim Entladen der Exportkomplexe aktiv sind, haben wir im Zellkern das RanBP1-ähnliche Protein RanBP3 gefunden, das die Bildung von Exportkomplexen steuert: durch Bindung von RanBP3 an den Exportfaktor Expo1 wird dessen Spezifität für unterschiedliche Frachten bestimmt [5]. Wir identifizierten auch ein humanes Homologes zu RCC1, DelGEF, das zwar die wesentlichen bekannten Strukturmerkmale mit diesem Austauschfaktor gemeinsam hat, Ran aber trotzdem nicht aktivieren kann. Es wird im Chromosomenabschnitt 11p14 codiert, auf dem man ein Gen für erbliche Formen von Taubheit und Retinitis pigmentosa vermutet. Mit 2-Hybrid-Studien wurden für DelGEF Bindungspartner gefunden, die auf eine Rolle in intrazellulären Transportprozessen hinweisen. Systematische Analyse der Genexpressionsmuster in Ovarialkarzinomen K. Dellas-Kloor, G. Maier,A. Marmé, K. Weigl, H.-P. Zimmermann, H. Ponstingl In Zusammenarbeit mit G. Bastert, M. Lindner, Universitäts-Frauenklinik Heidelberg; D. Wallwiener, R. Kurek, B. Gückel, Universitäts-Frauenklinik Tübingen. Ovarialkarzinome sind die gefährlichsten unter den gynäkologischen Tumoren, da sie ohne charakteristische Frühsymptome sind und in der Regel erst in Spätstadien erkannt werden. Die Abteilung vergleicht die Genexpressionsmuster von Tumorzellen und gesunden Epithelzellen jeweils derselben Patientin. Anhand wiederkehrender Merkmale werden diese Tumoren molekularbiologisch charakterisiert, mit dem Ziel, neue Kennzeichen von diagnostischer Bedeutung zu finden, Therapien an den Einzelfall anzupassen und die molekularen Ursachen der Tumorentwicklung zu verstehen. Mit Antikörpern gegen charakteristische Strukturen an den Zelloberflächen und mit pharmazeutisch veränderten Signalmolekülen sollen auch der Therapie neue Möglichkeiten eröffnet werden. Das Differential Display ist das bisher empfindlichste Verfahren zur systematischen Analyse von Unterschieden in der Genexpression. Es erlaubt in der Form von cdna- Fragmenten den Vergleich, die Identifizierung und die Isolierung von mrnas, die in Tumorzellen erheblich stärker oder geringer repräsentiert sind als in den entsprechenden gesunden Zellen. Etwa die Hälfte der bisher gefundenen Gene, deren Expressionsspiegel sich um mindestens eine Größenordnung unterschied, codieren für bereits bekannte Proteine [8], darunter einen Tumorsuppressor und Komponenten von Signalwegen. Die übrigen, bisher unbekannten, sind anhand ihrer Strukturmerkmale Signalwegen oder Zell-Zell-Kontakten zuzuordnen. Dieses aufwendige Verfahren kann immer nur mit Material aus einzelnen Patientinnen durchgeführt werden. Um diagnostisch brauchbare Marker zu erhalten, müssen Abteilung B0400 Molekulare Biologie der Mitose Expressionsunterschiede aber rasch und an möglichst vielen Patientinnen bestimmt und mit den histopathologischen Befunden und dem klinischen Verlauf der Erkrankung verknüpft werden. Dies geschieht zur Zeit durch quantitative PCR und durch cdna-chips, die noch in Entwicklung stehen. Gleichzeitig werden die Proteine, die von den interessierenden Genen codiert werden, in Bakterienzellen exprimiert, um gegen sie gerichtete Antikörper für schnellere Diagnosen zu gewinnen. In Tumoren überexprimierte Proteine werden auch auf ihre Eignung als Angriffspunkte für Immuntherapien geprüft. Hochkomplexe Peptid-Arrays zu diagnostischen Zwecken und zur Suche nach therapeutischen Wirkstoffen R. Bischoff, S. Fernandez, K. Leibe In Zusammenarbeit mit Dr. Frank Breitling und Dr. Volker Stadler, DKFZ. Es wird ein Verfahren zur Herstellung von hochkomplexen Peptid-Arrays entwickelt. Es beruht auf einem modifizierten Laserdrucker, der statt des normalen Farbtoners Partikel druckt, in welche die Grundbausteine für die Peptidsynthese eingebettet sind. Durch Zufuhr von Wärme werden die Partikel geschmolzen, die darin eingeschlossenen Monomere freigesetzt und die Kopplungsreaktion gestartet. Die Partikel stellen somit eine stabile Transportform für die Monomere dar und liefern darüber hinaus den Reaktionsraum für die chemische Kopplung am Bestimmungsort. Durch wiederholtes Bedrucken desselben Trägers und nachfolgendes Koppeln der Monomere kann so eine große Zahl von unterschiedlichen Peptiden simultan auf einer Trägerfolie synthetisiert werden. Die Anzahl der nacheinander auszuführenden Druckvorgänge ergibt sich dabei aus der Zahl von Grundbausteinen, welche die fertigen Oligomere enthalten sollen. Die Möglichkeit, alle Teilschritte des Syntheseverfahrens kontrollieren zu können, ergibt eine einfache, robuste, schnelle und auch preiswerte Technologie zur Herstellung von komplexen Peptid- Arrays. Es gibt vielfältige Möglichkeiten, die Gestaltung der Peptid-Arrays an die Bedürfnisse des Anwenders anzupassen. Beispielsweise können Proteine in Form von überlappenden Bruchstücken (15-20mere) auf dem Array präsentiert werden. Es ist gezeigt worden, daß in vielen Fällen die Strukturinformation zur Wechselwirkung mit Bindungspartnern auch in den Peptiden erhalten bleibt. Dies gilt in besonderem Maße für die Bindung von Antikörpern, die oft nur kurze Abschnitte auf dem antigenen Protein erkennen. Ferner ist es möglich, vollständige Bibliotheken von L- und D-Peptiden zu erstellen, die alle theoretisch möglichen Aminosäure-Kombinationen enthalten. Das so geschaffene Repertoire von unterschiedlichen Oberflächen kann für die Bindung von Makromolekülen jeglicher Art genutzt werden. Der Einsatz dieser Arrays kann Muster hervorbringen, die je nach Anwendung auch diagnostisches Potenzial haben [9, 10].

17 Abteilung B0400 Molekulare Biologie der Mitose 69 Abb. Vergleich eines normalen Tonerpartikels mit einem AminosäurenPartikel Publikationen (* = externe Koautoren) und Preise [1] Künzler*, M., Gerstberger*, T., Stutz*, F., Bischoff, F.R. & Hurt*, E. (2000) Yeast Ran-binding protein 1 (Yrb1) shuttles between nucleus and cytoplasm and is exported from the nucleus via a CRM1 (XPO1)-dependent pathway. Mol. Cell. Biol. 20, [2] Lipowsky*, G., Bischoff, F.R., Schwarzmaier*, P., Kraft*, R., Kostka*, S., Hartmann*, E., Kutay*, U. &Görlich*, D. (2000) Exportin 4: a mediator of a novel nuclear export pathway in higher eukaryotes. EMBO J. 19, [3] Kutay*, U., Hartmann*, E., Treichel*, N., Calado*, A., Carmo- Fonseca*, M., Prehn*, S., Kraft*, R., Görlich*, D., & Bischoff, F.R. (2000) Identification of two novel RanGTP-binding proteins belonging to the importin b superfamily. J. Biol. Chem. 275, [4] Maurer*, P., Redd*, M., Solsbacher*, J., Bischoff, F.R., Greiner*, M., Podtelejnikov*, A.V., Mann*, M., Stade*, K., Weis*, K. & Schlenstedt*, G. (2001) The nuclear export receptor Xpo1p forms distinct complexes with NES transport substrates and the yeast binding protein 1 (Yrb1p). Mol. Biol. Cell 12, [5] Englmeier*, L., Fornerod*, M., Bischoff, F.R., Petosa*, C., Mattaj*, I. & Kutay*, U. (2001) RanBP3 influences interactions between CRM1 and its nuclear protein export substrates. EMBO Rep 2, [6] Bischoff, F.R., Scheffzek*, K. & Ponstingl, H. (2001) How Ran is regulated. In Nuclear Transport. K. Weis (Ed.),Results and Problems in Cell Differentiation 35, Springer, Heidelberg, New York. [7] Bischoff, F.R. & Ponstingl, H. (2001) Ran regulation by RanGEF and RanGAP. In The small GTPase Ran. Mark Rush & Peter d Eustachio (Eds.) pp Kluver, Boston, Dordrecht, New York. [8] Weigl, K., Ponstingl, H., Zimmermann, H.-P., Marmé, A., Bastert*, G., Kurek*, R., & Wallwiener*, D. (2001) Ovarial-Karzinom-Marker.Europäische Patentanmeldung [9] Bischoff, F.R., Breitling, F., Saffrich, R., Poustka, A., Hoffmann, Th., Groß, K. & Breitling, F. (2001) Genius Biotech Award des Landes Baden-Württemberg. [10] Bischoff, F.R., Breitling, F., Wallich*, R., Poustka, A., Stadler, V. & Breitling, F. (2001) Förderpreis Medizintechnik für das Projekt Borrelien Peptidomarrays im Rahmen des Innovations-Wettbewerbs 2001 des Bundesministeriums für Bildung und Forschung.

18 B0401 Peptidsyntheseeinheit Zentrale Peptid- und Proteinsyntheseeinheit (B0401) Leiter: Dr. Rüdiger Pipkorn 70 Mitarbeiter Mario Koch Aufgabe der Einheit ist die Synthese unterschiedlichster funktionaler Peptide zur Durchführung von Studien zum Verständnis der Wechselwirkung von Struktur und Aktivität [6,7]. Spezielle Fragen hinsichtlich Identifiaktion von Anti- Epitopen innerhalb Proteinsequenzen können mittels individuell synthetisierter Peptide beantwortet werden. Dynamische zelluläre Prozesse auf DNA-, RNA- und auf Proteinebene [2,3,5] können mittels spezifischer funktionaler Peptideeinheiten simuliert und verstanden werden im Zusammenhang von inter-und intrazellulärem Transport von Proteineinheiten ( Bioshuttle, siehe Schema) [1]. Moderne Diagnostikverfahren wie beispielsweise Molecular Imaging in der MRT bzw. PET sind mittels speziell synthetisierter Peptideinheiten möglich. Molecular Modeling und Biocomputing Methoden an synthetischen Peptiden tragen zum Verständnis für Struktur und Funktion bei. Die Entwicklung von Therapieansätzen auf molekularer Ebene (Antisense- und Anti-Gen) ist in gleicher Weise zu verwirklichen. Die Synthese sämtlicher Peptide erfolgt vollautomatisiert auf dem AMS 422 Multiple Peptide Synthesizer (Abimed Analysentechnik) [4], Charakterisierung und Aufreinigung mit HPLC-, MALDI Massenspektrometrie-Methoden. Publikationen: (* = externe Koautoren) [1] Braun K; Peschke P; Pipkorn R; Lampel S*; Wachsmuth M; Waldeck W; Friedrich E*; Debus J; A biological transporter for the delivery of peptides to the nuclear compartment in living cells. J Mol Biol in press (2002) [2] Schlosser, A., Pipkorn, R., Bossemeyer, D. and Lehmann, W- D. Analysis of protein phosphorylation by combination of elastase digest and neutral loss tandem mass spectrometry. Protein Sci 11: , 2000 [3] Kinzel,V., König, N.,Pipkorn, R., Bossemeyer, D. and Lehmann, W-D. Analysis of isoaspartate in peptides by electrospray mass spectrometry. Prot. Sci 11: , 2000 [4] Pipkorn R, Boenke C*, Gehrke M*, Hoffmann R*. Highthroughput peptide synthesis and peptide purification strategy at the low micromol-scale using the 96-well format. J Peptide Res. 59: , 2002 [5] Lehmann, W-D, Schlosser, A., Erben, G., Pipkorn, R., Bossemeyer, D. and Kinzel, V. Analysis of isoaspartate in peptides by electrospray tandem mass spectrometry. Prot Sci 9: , 2000 [6] Langosch, D*, Brosig, B* and Pipkorn, R. Peptide mimics of the vesicular stomatitis virus G-protein transmembrane segment drive membrane fusion in vitro. J Biol Chem 276: , 2001 [7] Tholey, A, Pipkorn, R, Bossemeyer, D. and Kinzel, V. and Reed, J. Influence of myristoylation, phosphorylation and deamidation on the structural behavior of the N-terminus of the catalytic subunit of camp-dependent protein kinase. Biochemistry 40: , 2001 Bioshuttle - Strukturschema [1] Transport Modul -S%S- Adress Modul Spacer Substanz Transportpeptid, Adresspeptid, Wirk Substanz

19 Abteilung B0500 Biochemie der gewebsspezifischen Regulation Abteilung Biochemie der Gewebsspezifischen Regulation (B0500) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Friedrich Marks ( - 03/02) Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. rer. nat Gerhard Fürstenberger PD Dr. rer. nat. Peter Krieg PD Dr. rer. nat. Karin Müller-Decker Dr. rer. nat. Michael A. Rogers Dr. Kirsten Scholz Dr. rer. nat. habil. Jürgen Schweizer Dr. rer. nat. habil. Hermelita Winter Gastwissenschaftler Dr. Tsevtomir Lukanov (Univ. Sofia, Bulgarien, 04-07/00) Dr. Nao Qiao (Kanazawa University, Kananzawa, Japan, 11/00-11/01) Dr. Svetlana Zoubova (St. Petersburg, Russland, 05/01-05/02) Doktoranden Thorsten Lau Karsten Müller Melanie Neumann Malte Siebert Anette Zagorski Diplomanden Wolfgang Hirschner Gwendolin Manegold Gitta Neufang Jin Kyun Park Lius-Felipe Jave-Suarez Fey-Yin Cheang Technische Mitarbeiter Dagmar Kucher (Teilzeit) Ina Kutschera Sandra Pfrang Andrea Pohl-Arnold (Teilzeit) Brigitte Steinbauer (Teilzeit) IngeborgVogt Ulrike Beckhaus Claudia Ehman Auszubildende (Stand 12/01) Sabrina Balaguer Jutta Bulkescher Sarah Wolf Sekretariat Wiltrud S. Bockemühl Andere technische Dienste Roswitha Epp Die Abteilung war in drei Arbeitsgruppen unterteilt: Gruppe 1: Eisosanoide und Tumorentwicklung (Dr. Gerhard Fürstenberger) Gruppe 2: Proteinkinase C (Dr. Michael Gschwendt, ausgeschieden) Gruppe 3: Differenzierung von normaler und pathologisch veränderter Epidermis (Dr. Jürgen Schweizer) Die Forschungsprojekte gehen auf die langjährigen Arbeiten der Abteilung über die Regulation von Wachstum und Differenzierung sowie Krebsentwicklung in der Haut zurück. In diesem Zusammenhang konzentrieren sich die Untersuchungen auf die Regulation des epidermalen Arachidonsäurestoffwechsels und die molekularen Mechanismen der Eicosanoid-Wirkung bei diesen Prozessen. Als Differenzierungsmarker der normalen Epidermis und ihrer Anhangsorgane, sowie der daraus entstehenden Tumore, dienen die Keratine Nach dem Ausscheiden von Prof. Marks in den Ruhestand werden nur die Gruppen von Dr. G. Fürstenberger und Dr. J. Schweizer als selbständige Einheiten weitergeführt. Eicosanoide und epitheliale Tumorentwicklung Leiter: Dr.rer. nat Gerhard Fürstenberger Unter den aus Arachidonsäure gebildeten Eicosanoiden sowie den entsprechenden Octadecanoiden (aus Linolsäure) finden sich zahlreiche hochaktive Wirkstoffe, die als Agonisten mit spezifischen Oberflächenrezeptoren sowie mit Transkriptionsfaktoren des Typs PPAR reagieren. Eicosanoide sind u.a. Entzündungsmediatoren und Wundfaktoren und werden von gereiztem Gewebe vorübergehend gebildet. Eine dauernde Überproduktion von Eicosanoiden findet man dagegen bei chronisch-degenerativen Prozessen (rheumatische Arthritis, Atherosklerose und Alzheimersche Demenz) sowie bei epithelialen Tumorerkrankungen. Die biologische Aktivität der Eicosanoide und Octadecanoide wird aufgrund ihrer Kurzlebigkeit in der Regel über die Biosynthese reguliert, welche von zwei Enzymfamilien, den Cyclooxygenasen und den Lipoxygenasen, beherrscht wird. Beide Stoffwechselwege können zugleich eine Quelle von reaktiven (gentoxischen) Sauerstoffspezies sein, die bei der enzymatischen Fettsäureoxidation als Nebenprodukte entstehen und zu oxidativem Stress beitragen [1, 16-21]. Wir untersuchen die Rolle von Cyclooxygenasen und Lipoxygenasen in normalen Epithelien und bei der Tumorentwicklung in der Haut, Kolon, Brustdrüse, Pankreas und der Prostata von Mäusen. Durch flankierende Studien an Operationsmaterial versuchen wir eine Brücke vom Tierversuch zur Klinik zu schlagen. Unsere Arbeiten haben das Ziel, das Verständnis der normalen und pathologischen Funktionen des Stoffwechsels ungesättigter Fettsäuren zu vertiefen. Die so gewonnenen Kenntnisse über Mechanismen sollen als rationale Ansätze für die Verbesserung bestehender und die Entwicklung neuer Methoden zur Krebsprävention bzw. -therapie dienen. Für die beschriebenen Untersuchungen kommen transgene Mausmodelle mit gewebs- und differenzierungsspezifischer Überexpression oder Inaktivierung von Cyclooxygenasen und Lipoxygenasen und entsprechende Zellkultursysteme zum Einsatz, um die spezifischen Funktionen dieser Proteine bei der Entwicklung epithelialer Tumore im Kontext der jeweiligen Gewebe bzw. des Gesamtorganismus zu untersuchen. 1. Cyclooxygenasen K. Müller-Decker, W. Hirschner,T. Lau, G. Neufang, M. Neumann, A. Zagorski, F. Marks, G. Fürstenberger Zusammenarbeit mit der dermatologischen Universitätsklinik Mannheim (Dr. C. Bayerl), dem Pathologischen Institut der Universität Heidelberg, (Dr. I. Berger), der Mahodi Universität Bangkok (Prof. V. Sirikulchayanonta), der University of California, Los Angeles (Dr. H.R. Herschman), dem Institut für Pharmakologie der Universität Frankfurt (Dr. M. Kaszkin), dem Institut für Tumorbiologie der Universität Wien (Prof. Dr. B. Marian) und dem M.D. Anderson Cancer Center, Smithville Division (Prof. D. S.M. Fi- 71

20 72 Forschungsschwerpunkt B scher), sowie der Pharmacia, St. Louis, USA und der Bayer AG, Leverkusen. Zusatzfinanzierung: Industrikooperation, Deutsche Krebshilfe Cyclooxygenasen (COX) katalysieren die Oxidation von Arachidonsäure zu einem Prostaglandin-Endoperoxid (PGH ), das durch weitere Enzyme in die eigentlichen 2 Prostaglandine sowie in Prostacycline und Thromboxane umgewandelt wird. Einige dieser Wirkstoffe sind entscheidend an der Tumorentwicklung beteiligt: sie hemmen terminale Differenzierung und Apoptose, fördern Zellproliferation, Angiogenese und Metastasierung und wirken immunsuppressiv. Von den beiden bekannten COX-Isoenzymen wird COX-1 in praktisch allen Organen konstitutiv exprimiert, COX-2 dagegen in der Regel nur vorübergehend bei Stress-Situationen (Verwundung, Infektion, Entzündungen) induziert Eine permanente Überexpression von COX-2 wurde in allen bisher untersuchten epithelialen Neoplasien des Menschen und der Maus beobachtet [1, 8, 21]. Tierversuche und klinische Studien haben eine z.t. dramatische Reduktion der Tumorentwicklung durch Hemmung der COX-2- Aktivität gezeigt. Unseren Untersuchungen am Maushautmodell zufolge geht die konstitutive Überexpression von COX-2 im proliferationsaktiven Kompartiment von prämalignen Tumoren mit einer extremen Überproduktion der Prostaglandine PGE 2 und PGF 2= einher, wobei PGF 2= als endogener Tumorpromotor wirkt [1, 8, 21]. Auch Tumore von Menschen erzeugen erhebliche Mengen an Prostaglandinen, und eine Hemmung der Prostaglandinsynthese durch COX-Inhibitoren unterdrückt die Tumorentwicklung [1, 8, 21]. Hierauf beruht die bereits klinisch angewendete Chemoprävention des kolorektalen Karzinoms durch Entzündungshemmer vom Typ der nicht-steroidalen Antiphlogistika (NSAID) mit Aspirin als Prototyp. COX-Isoenzyme und epitheliale Wundheilung Die Heilung epithelialer Wunden geht einher mit einer transienten Induktion der COX-2-Expression. Im Modell der Maushaut zeigte sich, dass die Heilung von Schnittwunden bei systemischer Verabreichung von COX-1- oder COX-2-selektiven Inhibitoren allein nicht beeinträchtigt wird. Auch die gleichzeitige Hemmung beider Isoenzyme verzögert die Wundheilung nicht [19]. Diese Beobachtung ist von Bedeutung im Hinblick auf den Einsatz von COX- Inhibitoren, insbesondere COX-2-selektiver Inhibitoren zur postoperativen Prävention von kolorektalem Krebs. Zusatzfinanzierung: Industriekooperationen, Deutsche Krebshilfe. COX-Isoenzyme und epitheliale Tumorentwicklung: Untersuchungen an menschlichen Gewebeproben. In Zusammenarbeit mit dem Nationalen Krebsinstitut von Thailand haben wir eine Studie über menschlichen Gallengangkrebs durchgeführt. Dieser Tumor ist besonders häufig in Südostasien und wird vermutlich durch chronische Gewebsschäden, verursacht durch einen Leberegel, promoviert. Dieser Effekt entspricht der tumorpromovierenden Wirkung von chronischer Gewebsirritation im Mäusehautmodell. Gallengangtumoren unterscheiden sich von Hauttumoren dadurch, dass bei ihnen beide COX-Enzyme übermäßig gebildet werden. Im normalen Gallenganggewebe findet sich jedoch auch hier keine COX-2 [9,20]. Abteilung B0500 Biochemie der gewebsspezifischen Regulation Eine Überexpression von COX-2 wurde auch in hepatozellulären Leberkarzinomen, die in Südostasien ebenfalls sehr häufig sind, beobachtet. Diese Untersuchungen sollen zur Klärung der Frage beitragen, ob eine generelle Prävention von Gallengang- und Leberkrebs mit Hilfe von Entzündungs-hemmern in Südostasien möglich ist. Funktion von COX-2 in Maushaut in vivo: Transgene Mausmodelle. Um einerseits die normalen Funktionen von COX-2, andererseits die Rolle dieses Enzyms bei der Tumorentwicklung genauer analysieren zu können, haben wir transgene Mauslinien entwickelt, die COX-2 unter Kontrolle des Keratin-5-Promotors im proliferativen Kompartiment der Epidermis und verwandter Epithelien konstitutiv exprimieren [13]. Der ausgeprägte transgene Phänotyp dieser Tiere hängt von der Expressionsstärke des Transgens und der COX-2-Aktivität ab und wird durch selektive COX-2-Inhibitoren vollständig unterdrückt. Auffallend sind Störungen der Haarfollikelentwicklung, eine starke Talgdrüsenhyperplasie und eine massive epidermale Hyperplasie als Folge einer gestörten epidermalen Differenzierung und Kompartimentalisierung. Die epidermalen Dysplasien gleichen präneoplastischen Veränderungen bei der chemisch induzierten Maushautkarzinogenese und bei seborrhoischen Keratosen des Menschen. Eine starke Gefäßneubildung in der unmittelbaren Umgebung der Dysplasien zeigt zudem einen proangiogenen Effekt des Transgens, der mit einer verstärkten Bildung des proangiogenen Prostaglandins PGE 2 bei gleichzeitiger Verminderung des anti-angiogenen 15-Desoxy-PGJ 2 korreliert. Durch das COX-2-Transgen wird die Krebsanfälligkeit extrem erhöht. So bilden sich Hauttumore allein nach Initiation, d.h. unter Bedingungen, bei denen bei Wildtyp-Tieren überhaupt keine Tumore entstehen. Dieser Befund belegt einen Kausalzusammenhang zwischen COX-2 und Tumorpromotion, indem er zeigt, dass die Haut COX-2-transgener Mäuse auto-promoviert ist. Darüber hinaus entwickeln transgene Tiere - nicht aber Wildtyp-Tiere - im Karzinogeneseexperiment zahlreiche Tumore in anderen das Transgen exprimierenden Epitehlien (unveröffentliche Ergebnisse). Die äußerst niedrigen Karzinogendosen, die bei COX-2- Überexpression für eine Krebsentstehung ausreichen, dürften denen in unserer täglichen Umwelt entsprechen. Danach wäre eine aberrante COX-2-Überexpression, wie sie sich nicht nur in manifesten Neoplasien sondern auch in zahlreichen Präneoplasien des Menschen findet, ein Krebsrisikofaktor ersten Ranges, zugleich aber auch ein vielversprechender Angriffspunkt für Chemoprävention. Ziele zukünftiger Untersuchungen sind: 1. die Charakterisierung der COX-2-abhängigen Tumorentwicklung in der Brustdrüse, der Prostata und dem Pankreas der transgenen Mauslinien 2. die Identifizierung und Charakterisierung von stromaufwärts und stromabwärts von COX-2 plazierten Enzymen des Arachidonsäurestoffwechsels und Prostanoid-Rezeptoren, die an der COX-2-regulierten Prostaglandinsynthese bzw. der Prostanoidfunktion beteiligt

21 sind und deren Expression mit der COX-2-Überexpression gekoppelt ist (z.b. Phospholipasen vom A 2 -Typ (Freisetzung von Arachidonsäure) und Prostaglandinsynthasen sowie G-Protein-gekoppelte Oberflächenrezeptoren für Prostaglandine und Kernrezeptoren der PPAR-Transkriptionsfaktorfamilie. 3. die Analyse COX-2-abhängiger Protein-Expression 2. Lipoxygenasen P. Krieg, M. Heidt, K. Müller, M. Siebert, A. Zagorski, F. Marks, G. Fürstenberger Kooperation mit Prof. Dr. H. Bartsch und Dr. Nair, Prof. Dr. W. D. Lehmann, Dr. von der Lieth, DKFZ sowie Prof. Dr. B. Marian, Institut für Tumorbiologie der Universität Wien, Österreich; Prof. Dr. Hartmut Kühn, Institut für Biochemie der Charité, Berlin; Prof. A. Brash, Vanderbilt University, Nashville, USA; Prof. K. Honn, Wayne State University, Detroit, USA; Dr. P.L. Grover, Institute of Cancer Research, Haddow Laboratories, Sutton, UK und der Firma L Oreal, Paris, Frankreich. Zusatzfinanzierung DFG, Deutsche Krebshilfe Lipoxygenasen (LOX) katalysieren die Oxidation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren und stellen so zusammen mit weiteren Enyzmen eine Reihe von bioaktiven Lipidmediatoren wie Hydroxyeicosatetraensäuren (HETE), Leukotriene u.a. bereit [1, 6, 18]. Die LOX- Reaktion ist zugleich eine Quelle für reaktive (gentoxische) Sauerstoffspezies und damit eine mögliche Ursache für oxidativen Stress [1, 2].Im Maushautmodell zeigen Lipoxygenasehemmstoffe eine ähnliche Antitumorwirkung wie die Cyclooxygenaseinhibitoren. Damit werden auch die Lipoxygenasen zu potentiellen Angriffspunkten für Krebschemoprävention. Charakterisierung epidermaler Lipoxygenasen Ausgehend von cdna aus normaler, hyperplastischer und neoplastischer Haut haben wir sechs verschiedene LOX- Formen kloniert und charakterisiert. Zwei davon, die Blutplättchen- und die Leukozyten-12S-LOX (p12s-lox und l12s-lox) waren bereits bekannt, die anderen wurden erstmals von uns beschrieben. Dabei handelt es sich um eine e12s-lox, eine 8S-LOX, eine 12(R)-LOX (die erste Säuger-LOX mit R-Chiralität!) und eine Epidermis-LOX-3. Mit diesen LOX haben wir eine Unterfamilie der LOX, die sog. Epidermis-Typ LOX (elox) entdeckt [1, 6, 12, 18]. Die entsprechenden Gene dieser Unterfamilie befinden sich eng benachbart in einem Cluster auf dem zentralen Abschnitt des Mauschromosoms 11, die orthologen menschlichen Gene auf dem syntenen Locus 17p13.1 [12]. Den epidermalen LOX gemeinsam ist, dass sie die konventionellen LOX-Substrate Arachidonsäure und Linolsäure nur mit sehr geringer Effizienz umsetzen [3, 11]. Vermutlich sind komplexere Lipide, wie sie speziell in der Haut vorkommen, Substrate dieser LOX-Familie. Expression epidermaler Lipoxygenasen. Die Haut von Mäusen zeigt ein charakteristisches, von der terminalen Keratinozyten-Differenzierung abhängiges Expressionsmuster von LOX, das sich bei Gewebsreizung und Tumorbildung ändert [6, 8]). So werden z.b. nach TPA-Behandlung die konstitutiv exprimierten p12s-lox, e12s-lox, 12R-LOX und Epidermis-LOX-3 sowie die in Abteilung B0500 Biochemie der gewebsspezifischen Regulation normaler Epidermis nicht nachweisbare 8S-LOX transient induziert, und in Hauttumoren sind 8S- und p12s-lox aberrant exprimiert und für die massiv erhöhten Spiegel der Eicosanoide 8- und 12-HETE im Tumorgewebe verantwortlich [1, 8, 18]. Diese hohen HETE-Spiegel korrelieren mit der Bildung von Nukleotid-Etheno-Addukten in der DNA der Tumore [2] und in primären Keratinozyten induzieren 8- und 12-HETE chromosomale Aberrationen [1, 18]. Danach wären 8S- und Blutplättchen-12S-LOX gentoxische und somit evtl. prokarzinogene Enzyme. Im Gegensatz dazu wird die Expression von e12-lox, Epidermis-LOX-3 und 12R-LOX bei der Tumorgenese unterdrückt. Hierbei könnte es sich also um antikarzinogene Enzyme handeln. Funktion epidermaler LOX in vivo: Transgene Mausmodelle Hinweise auf pro- und antikarzinogene LOX-Wirkungen haben wir bei der Analyse von transgenen Tieren erhalten, die e12s-lox unter Kontrolle des Keratin-6-Promotors konstitutiv überexprimieren. Bei solchen Tieren hängt die Tumorentwicklung von der Expressionsstärke des Transgens und einer dadurch veränderten Expression anderer LOX-Isoenzyme ab. So kommt es bei niedriger Transgen- Expression zu einer Induktion der l12s-lox und zu einer Akkumulation ihres Linolsäure-Produktes 13-Hydroxyoctadecadiensäure (13-HODE), was mit einer im Vergleich zum Wildtyp geringeren Tumorbildung korreliert. Dagegen führt eine hohe Expression des Transgens zu einer verstärkten Expression der p12s-lox gepaart mit einer Akkumulation des Arachidonsäure-Produktes 12-HETE. Dieses korreliert mit einer verstärkten Tumorbildung. Unsere Beobachtungen unterstützen damit nicht nur Berichte anderer Autoren über eine antagonistische Wirkung von 12- HETE und 13-HODE bei der epithelialen Tumorentwicklung, sondern auch zahlreiche Untersuchungen, denen zufolge eine Linolsäure-reiche (pflanzliche) Ernährung eher krebsverhütend, eine Arachidonsäure-reiche (tierische) Diät dagegen eher krebsfördernd wirkt. Wie es zu dem beobachteten Cross-talk zwischen den verschiedenen LOX-Formen kommt, ist allerdings noch völlig unklar [22]. Zu den potentiell antikarzinogenen LOX könnte auch die 12R-LOX gehören, da deren Expression bei der Tumorentwicklung ebenfalls unterdrückt wird. Die Rolle dieser Isoform bei der Karzinogenese soll mit Hilfe von Mauslinien untersucht werden, bei denen das 12R-LOX-Gen gewebsspezifisch (in der Epidermis) ausgeschaltet werden kann. Das entsprechende konditionale12r-lox-knockout- Konstrukt wurde bereits hergestellt. Ziele künftiger Untersuchungen sind: 1 Identifizierung der Substrate und Produkte der epidermalen LOX 2. Analyse der LOX-Funktion in Keratinocyten mit Hilfe von induzierbaren Expressionsystemen (TET-on/off) 3. Charakterisierung des Cross-talk zwischen LOX- Isoenzymen in vivo nach gewebesspezifischer Überexpression oder Ausschaltung individueller LOX in der Epidermis von Mäusen 4. Identifizierung von LOX-Isoenzymen als potentielle Targets für Krebschemoprävention. 73

22 74 Forschungsschwerpunkt B Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Marks, F., Fürstenberger, G.: Cancer chemoprevention through interruption of multistage carcinogenesis: The lessons learned by comparing mouse skin carcinogenesis and human large bowel cancer. Europ. J. Cancer 36, (2000). [2] Nair, J., Fürstenberger, G., Bürger, F., Marks, F., Bartsch, H.: Promutagenic etheno-dna adducts in multistage mouse skin carcinogenesis: correlation with lipoxygenase-catalyzed arachidonic acid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 13, (2000). [3] Bürger, F., Krieg, P., Marks, F., Fürstenberger, G.: Positional and stereo selectivity of fatty acid oxygenation catalyzed by murine 12S-lipoxygenase isozymes. Biochem. J. 348, (2000). [4] Müller, K., Krieg, P., Marks, F., Fürstenberger, G.: Expression of PGF 2? receptor mrna in normal, hyperplastic, and neoplastic skin, and in other mouse tissues. Carcinogenesis 21, (2000). [5] *Schadow, A., *Scholz-Pedretti, K., *Scholz, K., *Lambeau, G., *Gelb, M.H., Fürstenberger, G., *Pfeilschifter, J., *Kaszkin, M.: Characterization of group X phospholipase A 2 as the major enzyme secreted by human keratinocytes and its regulation by the phorbol ester TPA. J. Invest. Dermatol. 116, (2001). [6] Heidt, M., Fürstenberger, G., Vogel, S., Marks, F., Krieg, P.: Diversity of murine lipoxygenases: identification of subfamily of epidermal isozymes exhibiting a differentiation-dependent mrna expression pattern. Lipids 35, (2000). [7] Manzow, S., Richter, K.H., Stempka, L., Fürstenberger, G., Marks, F.: Evidence against a role of general protein kinase C downregulation in skin tumor promotion. Int. J. Cancer 85, (2000). [8] Marks, F., Müller-Decker, K., Fürstenberger, G.: A causal relationship between unscheduledeicosanoid signaling and tumor development: cancer chemoprevention by inhibitors of arachidonic acid metabolism. Toxicology 153, (2000) [9] *Chariyalertsak, S., *Sirikulchayanonta, V., Mayer, D., Kopp- Schneider, A., Fürstenberger, G., Marks, F., Müller-Decker, K.: Aberrant cyclooxygenase isozyme expression in human intrahepatic cholangiocarcinoma. Gut 48, (2001) [10] *Richter, M., *Weiss, M., *Weinberger, I., Fürstenberger, G., *Marian, B.: Growth inhibition and induction of apoptosis in colorectal tumor cells by cyclooxygenase inhibitors. Carcinogenesis 22, (2001). [11] Siebert, M., Krieg, P., Lehmann, W.D., Marks, F., Fürstenberger, G.: Enzymatic characterization of epidermisderived 12-lipoxygenase isoenzymes. Biochem J. 355, (2001). [12] Krieg, P., Marks, F., Fürstenberger, G.: A gene cluster encoding human epidermis-type lipoxygenases at chromosome 17p13.1: Cloning, physical mapping, and expression. Genomics, 73, (2001). [13] Neufang, G., Fürstenberger, G, *Heidt, M., Marks, F., Müller- Decker, K.: Abnormal differentiation of epidermis in transgenic mice constitutively expressing cyclooxygenase-2 in skin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 98, (2001). [14] Breitenbach, U., Tuckermann, J.P., Gebhardt, C., Richter, K.H., Fürstenberger, G., *Christofori, G., Angel, P.: Keratinocytespecific onset expression in experimental of serine protease BSSP carcinogenesis. J. Invest. Dermatol. 117, (2001). [15] Marks, F.: Cancer-linked genes. Meeting Report. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 126, (2000). [16] Marks, F.: Der Stoffwechsel der Arachidonsäure: ein riskantes Bravourstück der biochemischen Evolution. Biologie in unserer Zeit 30, (2000). [17] Marks, F.: Krebs- und Alzheimer-Prävention mit nichtsteroidalen Entzündungshemmern. Deutsche Medizin. Wschr. 126, (2001). Abteilung B0500 Biochemie der gewebsspezifischen Regulation [18] Fürstenberger, G., Marks, F., Krieg, P.: Arachidonate 8(S)- Lipoxygenase. Prostaglandins and other lipid mediators. J. Lipid Med. Cell Signalling, in press [19] Müller-Decker, K., Hirschner, W., Marks, F., Fürstenberger, G.: The effects of COX isozyme inhibition on incisional wound healing in mouse skin. J. Invest. Dermatol., in press [20] Müller-Decker, K., Chariyalertsak, S., Albert, C., Reinerth, G., Marks, F., Fürstenberger, G.: Cyclooxygenase-2: A molecular target for chemoprevention of epithelial tumors of skin and colon. In: Eicosanoids and other bioactive lipids in cancer, inflammation and related diseases, 6 (Ed. Honn et al.) Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. In press [21] Marks, F., Fürstenberger, G., Müller-Decker, K.: COX-2, an endogenous tumor promoter and target for the chemoprevention of colorectal cancer and other neoplastic diseases. In: Hormone Replacement Therapy and Cancer. In press. [22] Müller, K. Siebert, M., Heidt, M., Marks, F., Krieg, P., Fürstenberger, G.: Modulation of epidermal tumor development caused by targeted overexpression of epidermis-type 12Slipoxygenase. Cancer Res., in press Differenzierung von normaler und neoplastischer Epidermis Leiter: Dr.rer. nat. habil. Jürgen Schweizer Die Proteinfamilie der Keratine umfaßt die epithelialen Keratine, die in Zellen der verschiedenen Epitheltypen das 10 nm Intermediärfilamentnetz ausbilden, und die Haarkeratine, die am Aufbau von Haaren und Nägeln beteiligt sind. Im Mittelpunkt unserer Untersuchungen steht die Charakterisierung der komplexen Multigenfamilien menschlicher Haarkeratine sowie Untersuchungen zu deren Expression und Regulation im normalen und pathologisch veränderten Haarfollikel. Darüberhinaus beginnen wir mit der Charakterisierung der Multigenfamilien Haarkeratin-assoziierter Proteine, KAP, die die Matrix für Haarkeratin-IFs bilden. In beiden Fällen untersuchen wir ebenfalls die Beziehungen zwischen erblichen Haaranomalien und Mutationen in den Mitgliedern der Multigenfamilien. 1. Aufklärung der humanen Haarkeratin- und KAP-Multigenfamilien J. Schweizer, M.A. Rogers, H. Winter In Zusammenarbeit mit Dr. L. Langbein, DKFZ; Drs. N. Aoki, Y. Shimomura, Hautklinik Niigata, Japan Zusatzfinanzierung DFG. Der Haarfollikel ist das morphologisch komplexeste Anhangsorgan der Epidermis. Am Aufbau seiner unterschiedlichen Gewebekompartimente spielen sowohl epitheliale Keratine als auch Haarkeratine als zelluläre Strukturproteine eine wesentliche Rolle. Mit Hilfe genomischer und cdna-banken konnten wir die gesamte Multigenfamilie der humanen Haarkeratine aufklären. Sie umfasst insgesamt 20 Gene, die in zwei Subfamilien auf Chromosom 12q13 (Typ II: 6 funktionelle Gene, 4 Pseudogene) bzw. Chromosom 17q12-21 (Typ I: 9 funktionelle Gene, 1 transkribiertes Pseudogen) geklustert sind [1, 2, 3]. Mit Hilfe spezifischer Antikörper und cdna-sonden konnten wir die exakte Abfolge der Haarkeratinexpression im haarbildenden Kompartiment des Follikels ermitteln und einen Katalog humaner Haarkeratine erstellen [1, 2, 3]. Im Verlauf der genomischen Untersuchungen gelang es uns, mehre-

23 re neue Gene epithelialer Keratine zu identifizieren, von denen einige spezifisch in der inneren Wurzelscheide des Haarfollikels exprimiert werden [4]. Darüberhinaus konnten wir innerhalb der Typ I Keratingendomäne auf Chromosom 17 fünf KAP-Multigenfamilien charakterisieren und die Expression ihrer Mitglieder im Haarkortex nachweisen [5]. 2. Haarkeratin- und KAP-Mutationen und Haaranomalien J. Schweizer, H. Winter, M.A. Rogers In Zusammenarbeit mit Dr. P. Vabres, Hautklinik Poiters, Frankreich; Dr. A. Taieb, Hautklinik Bordeaux, Frankreich; Dr. D. Schissel, US Army Hospital, Heidelberg; Drs. M. Krawczak, D.N. Cooper, Humangenetik Cardiff, UK; Dr. P.Heidt, Primatenzentrum Nijmwegen, Niederlande. Zusatzfinanzierung DFG. In klinischen Kooperationsprojekten über Mutationen in Haarkeratingenen und erbliche Haaranomalien wurden die Untersuchungen der Haaranomalie Monilethrix abgeschlossen. Monilethrix stellt bisher die einzige bekannte Haarkeratinkrankheit dar [6]. Untersuchungen an Patienten, die am sogenannten Loose Anagen Hair Syndrom leiden, ergaben Hinweise für die mögliche Involvierung eines mutierten epithelialen Keratins der inneren Wurzelscheide, das für die gestörte Verankerung des Haarschaftes im Follikel verantwortlich sein könnte [8]. Die Untersuchungen an der Haaranomalie Pseudofollicultis barbae, die in Zusammenarbeit mit der US Army Heidelberg erfolgen, stehen kurz vor dem Abschluß. An der Ausbildung der für diese Anomalie typischen entzündlichen Prozesse im Gesichtsbereich, die durch einwachsende Haare verursacht werden, scheint neben dem Haarphänotyp, die Beteiligung einer Mutation im epithelialen Keratin K6hf gesichert. Letzteres wird im sogenannten Companion layer, zwischen der äußeren und inneren Wurzelscheide exprimiert. In mutierter Form könnte es zu einer Destabilisierung des wachsenden Haares beitragen. Schließlich konnten wir nachweisen, daß das im Typ I Haarkeratin-Genlokus auftretende Pseudogen hhaa, das durch eine Punktmutation inaktiviert wurde, im Schimpansen und Gorilla intakt ist. Augenblicklich untersuchen wir ob es in den Primatenhaaren auch zur Expression eines funktionellen Haarkeratins kommt. Abteilung B0500 Biochemie der gewebsspezifischen Regulation 3. Regulation der Haarkeratinexpression L.F. Jave-Suarez, H. Winter, J. Schweizer In Zusammenarbeit mit Dr. B. Cribier, Hautklinik Strassburg, Frankreich Mit der Aufklärung der Gene der humanen Haarkeratine waren die Voraussetzungen für Studien zur Regulation der Hairkeratinexpression gegeben. Ihm Rahmen einer Doktorarbeit konnten wir nachweisen, daß des das Homöobox-Protein HOXC13 an der Expressionskontrolle von Haarkeratingenen beteiligt ist, die während der frühen Differenzierungsphase im haarbildenden Kompartimente exprimiert werden. Die Expressionskontrolle verläuft dabei über mehrere Bindungselemente im proximalen Promotorbereich der Gene, von denen eines nicht von anderen HOX13 Paralogen erkannt wird. Es bestehen Evidenzen, daß der ß-Catenin/LEF-1 Transkriptionskomplex an der Regulation der Expression von Kortexkeratin-Genen beteiligt ist. Die Untersuchungen über die Expressionskontrolle eines in der Medulla von Sexualhaaren exprimierten Keratins durch den Androgenrezeptor stehen kurz vor dem Abschluß. Im engen Zusammenhang mit diesen Studien stehen Untersuchungen zur Expression von Haarkeratingenen und Transkriptionsfaktoren in humanen haarfollikelabgeleiteten Tumoren, die in Zusammenarbeit mit der Hautklinik Straßburg durchgeführt werden und deren Ziel eine verbesserte Klassifizierung dieser Tumoren ist [7]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Rogers M. A, Winter H, Langbein L, Schweizer J. Characterization of a 300 kpb region of human DNA containing the type II hair keratin gene locus. J. Invest. Dermatol. 114, , 2000 [2] Langbein L, Rogers M. A, Winter H, Praetzel S, Schweizer J. The catalog of human hair keratins - II. Expression of the six type II members in the hair follicle and the combined catalog of human type I and II keratins. J. Biol. Chem. 276, , 2001 [3] Rogers M. A. Keratins and keratin diseases. In: Encyclopaedia of the Human Genome, Nature Publishing Group, Macmillan Press, Hampshire, England. Im Druck [4] Langbein L, Rogers M. A, Praetzel S, Winter H, Schweizer J. A novel epithelial keratin, hk6irs1, is expressed differentially in all layers of the inner root sheath, including specialized Huxley cells ( Flügelzellen ) of the human hair follicle. J. Invest. Dermatol, Im Druck [5] Rogers M. A, Langbein L, Winter H, Ehmann C, Praetzel S, Korn B, Schweizer J. Characterization of a cluster of human high/ ultrahigh sulfur keratin-associated protein genes embedded in the type I keratin gene domain on chromosome 17q J. Biol. Chem. 276, , 2001 [6] Winter H, Rogers M A, Vabres, P *. Larrègue M *, Schweizer J. A novel missense mutation, A118E, n the the helix initiation motif of the type II cortex keratin hhb6 causing monilethrix. Hum. Heredity 50, , 2000 [7] Cribier B*, Peltre B*, Langbein L, Winter H, Schweizer J, Grosshans E*. Expression of type I hair keratins in follicular tumors. Brit. J. Dermatol. 144, , 2001 [8] Chapalain, V, Winter H, Langbein L, LeRoy JM,* Labrèze C*, Nikolic M*, Schweizer, J, Taieb A*. Is the loose anagen hair syndrome a keratin disorder? A clinical and molecular study. Arch. Dermatol. Im Druck 75

24 Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro Abteilung Differenzierung und Carcinogenese (B0600) Leiter: Prof. Dr. med. Norbert E. Fusenig 76 Wissenschaftliche Mitarbeiter PD. Dr. Dirk Breitkreutz Dr. Nicole Maas-Szabowski Dr. Margareta Müller Dr. Hans-Jürgen Stark Dr. Silvia Vosseler Gastwissenschaftler Dr. Nicole Mirancea, Rumänien (01-12/00; 06-12/01) Doktoranden Nicole Daum Lars Langeloh Joachim Mertens Martina Oehme Anja Stärker Diplomanden Martina Koci Claudia Gutschalk Wiltrud Lederle Eva Obermüller Cathrine Schmidt Michael Willhauck Technische Angestellte Regina Beck (50%) Silke Haid (25%) Angelika Krischke Iris Martin Heinrich Steinbauer Elke Tomakidi Eva Goedecke Alexandra Krämer Sekretariat Martina Kegel Im Mittelpunkt der Untersuchungen der Abteilung stehen zelluläre und molekulare Mechanismen der Zell-Zell und Zell-Matrix-Wechselwirkungen von Hautzellen und ihre steuernde Rolle für die Regeneration und Differenzierung des normalen Hautepithels einerseits und andererseits für die Entwicklung und Progression von epithelialen Hauttumoren. Die ebenfalls durchgeführten Arbeiten zum Mehrstufenprozess der Hautcarcinogenese sind im Bericht der Abteilung B0900 von der ehemaligen Mitarbeiterin Frau PD Dr. Petra Boukamp dargestellt. Ziel der Forschungsarbeiten ist ein besseres Verständnis der molekularen Vorgänge der Transformation humaner Epithelzellen zu Carcinomzellen und deren veränderter Wachstumsregulation im Vergleich zu den Steuerungsmechanismen im normalen Gewebe. Für diese überwiegend in Zellkultur durchgeführten Studien haben wir zelluläre Modelle und komplexe Kultursysteme entwickelt, die der natürlichen Situation im Organismus weitgehend entsprechen. Ausgehend von normalen Epithelzellen der adulten menschlichen Haut (Keratinozyten) wurde eine spontan immortalisierte Zellinie (HaCaT) entwickelt und als weitestgehend normal funktonierende Keratinozytenlinie charakterisiert. Ihre überwiegend regulären epidermalen Eigenschaften qualifizierten diese Zellen i) als Paradigma für humane Keratinozyten und machten sie ii) auch auf Grund ihrer vielfältigen Manipulierbarkeit zu einem weltweit begehrten Modellsystem, das derzeit in weit mehr als 2000 Laboratorien für verschiedene Fragestellungen verwandt wird. Nach genetischen (Transfektion des Ha-ras Onkogenes und von Wachstumfaktoren) und epigenetischen Manipulationen der HaCaT- Zellen (Stresseinwirkung, extensive Passagierung in vitro) konnten tumorigene Klone mit benignen, malignen und metastasierenden Wachstumseigenschaften identifiziert werden. Wenn auch die Entstehung von Tumoren sowie ihr autonomes Wachstumsverhalten ursächlich auf genetischen Veränderungen einer Einzelzelle begründet sind, ist das komplexe Phänomen des Tumorwachstums (mit Invasion und Metastasierung) nur im Rahmen der veränderten Wechselwirkung von Tumorzellen und ihrem umgebenden Gewebe im Organismus zu verstehen. Ohne die spezifische Interaktion mit Bindegewebe und Blutgefäßen ist das Wachstum auch der aggressivsten Tumorzellen auf mikroskopisch kleine Tumor-Knoten limitiert. Ebenso wird die Homöostase eines normalen Gewebes wie der Epidermis, d.h. die Balance zwischen Wachstum und Differenzierung der Epithelzellen, über komplexe Zell-Zell und Zell-Matrix- Wechselwirkungen gesteuert. Die zellulären und molekularen Mechanismen dieser epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen, durch die Wachstum, Differenzierung und Gewebestrukturierung normaler Keratinozyten, aber auch das Wachstumsverhalten von Tumorzellen gesteuert werden, waren und sind Gegenstand der Untersuchungen in den einzelnen Arbeitsgruppen der Abteilung.

25 I. Mechanismen der Epithel-Mesenchym- Wechselwirkungen zur Steuerung von Wachstum und Differenzierung normaler Keratinozyten Für den Erhalt der Funktion und Struktur von Geweben ist das Gleichgewicht zwischen Wachstum und Differenzierung, die Gewebe-Homöostase, unabdingbare Voraussetzung. Dies wird maßgeblich über Zell-Zell und Zell-Matrix Interaktionen gesteuert, wobei insbesondere den Epithel- Mesenchym-Wechselwirkungen eine herausragende Rolle zukommt. Im Fall der Haut erfolgt dieser Austausch zwischen der Epidermis und der Dermis als dem zugehörigen Bindegewebe über die Basalmembran, einer speziellen Struktur der extrazellulären Matrix. Entsprechend hatten unsere bisherigen Untersuchungen gezeigt, daß zur Kontrolle epidermaler Wachstums- und Differenzierungs-Vorgänge zwischen beiden Gewebekompartimenten äußerst komplexe Regelkreise existieren. Als experimentelle Basis zur Analyse dieser Wechselwirkungen waren zunächst epidermale Keratinozyten und Fibroblasten aus verschiedenen Hautbereichen isoliert und die Expressionsprofile von relevanten Cytokinen und zugehörigen Rezeptoren in konventionellen Mono- und Kokulturen erfaßt worden [1, 2]. Im Gegensatz zu diesem herkömmlichen Ansatz konnte in organotypischen Zellkulturen eine der Haut ähnliche Situation rekonstruiert werden. Hierbei wachsen Epithelzellen auf einer extrazellulären Matrix (Kollagen Typ 1) in enger Nachbarschaft zu hierin eingebetteten Bindegewebszellen. So bilden unter dem Einfluß dermaler Fibroblasten die epidermalen Keratinozyten geschichtete und differenzierende Oberflächenepithelien, die im Gegensatz zu konventionellen Kulturen eine definierte Struktur und Polarität aufweisen. Dabei werden spezifische Gewebecharakteristika in Struktur und Funktion augebildet, vergleichbar mit dem Ursprungsgewebe der Epidermis [3, 4, 5]. Als experimentelles Bezugssystem für das Wachstumsund Differenzierungspotential individueller Zellpopulationen unter in vivo Bedingungen diente standardmäßig das etablierte Oberflächen-Transplantations-Modell auf der Nacktmaus. Mit retransplantierten normalen Keratinozyten hatten wir eine vollständige Wiederherstellung der epidermalen Gewebestruktur und Funktion erzielen können [6]. Dieser Prozeß erfolgte ähnlich der Wundregeneration über definierte Stadien und offensichtlich ohne direkte mesenchymale Zellkontakte, war also weitgehend über diffusible Faktoren reguliert. Während hierbei die Evidenz noch überwiegend morphologisch gestützt war, ermöglichten in neueren Arbeiten die organotypischen Kokulturen einen direkten funktionellen Nachweis von Regelkreisen über lösliche Mediatoren. Die getrennte Analytik des Epithelbzw. Bindegewebeanteils der dreidimensionalen organotypischen Kokulturen erlaubte hierbei eindeutige Aussagen über den wechselseitigen Steuerungsprozess zwischen Keratinozyten und Fibroblasten auf molekularer Ebene und damit über die regulatorische Bedeutung des dermalen Parts für die Steuerung der Epidermis-Struktur und -Funktion. Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro 1. Paracrine Regulation der Proliferation und Differenzierung normaler Keratinozyten N. Maas-Szabowski, H.-J. Stark, A. Stärker, M. Willhauck Kooperationen mit P. Angel, DKFZ; R. Wolber, Beiersdorf AG, Hamburg; Fidia Advanced Biopolymers, Abano Terme, Italien Nach früheren ersten Hinweisen, daß die Steuerung der epidermalen Proliferation und Differenzierung maßgeblich über diffusible Faktoren aus dermalen Zellen erfolgt, konnten wir in Kokulturen epidermaler Keratinozyten mit dermalen Fibroblasten einen neuen Mechanismus von doppelt-parakrinen Regelkreisen aufzeigen [6]. So konnte in organotypischen Kokulturen ein bisher nicht bekanntes Zusammenspiel einiger diffusibler Faktoren identifiziert werden. In Kultur sezernieren Keratinozyten verstärkt Interleukin 1 (IL-1), in etwa vergleichbar der Wundsituation in vivo. IL-1 induziert dann in Fibroblasten, neben Proliferation, die vermehrte Expression seines Signalempfängers, des IL-1-Rezeptors, sowie die Expression und Synthese verschiedener Wachstumsfaktoren und Interleukine. Unter anderem werden KGF (keratinocyte growth factor) und GM-CSF (granulocyte macrophage colonie stimulating factor) verstärkt exprimiert [7]. Während die Stimulation der Keratinozyten-Proliferation durch KGF bereits bekannt war, konnten wir in unserem System dies auch für den hämatopoietischen Faktor GM-CSF zeigen. Wie wir weiter in heterologen Kokulturen mit Mausfibroblastenlinien, die Defizienzen in AP-1-Transkriptionsfaktor-Untereinheiten aufwiesen, zeigen konnten, wird die Expression von KGF und GM- CSF nach IL-1-Induktion antagonistisch von den AP-1-Untereinheiten c-jun und Jun-B gesteuert. Hierbei induziert c-jun die Transkription beider Cytokine, wohingegen Jun- B die transkriptionelle Aktivität von KGF und GM-CSF unterdrückt. In Hautäquivalenten konnte eindeutig nachgewiesen werden, daß KGF und GM-CSF die Proliferation der Keratinozyten stimulieren und GM-CSF zusätzlich in den Differenzierungsprozess der Epithelregeneration eingreift [8, 9]. Neben KGF und GM-CSF spielen jedoch noch weitere Cytokine eine essentielle Rolle bei der Epithelbildung sowie der Aufrechterhaltung der Hautstruktur, da beide Faktoren gemeinsam die Abwesenheit von Fibroblasten in organotypischen Kulturen nicht kompensieren konnten. In heterologen Kokultursystemen mit genetisch veränderten Fibroblasten werden deshalb zur Zeit weitere Faktoren der dermal-epidermalen Kommunikation identifiziert. Darüberhinaus werden die molekularen Mechanismen eingehend analysiert, die KGF und GM-CSF in den Keratinozyten auslösen, insbesondere die von ihnen induzierten Zielgene, die für die Entwicklung einer normalen Epidermisstruktur verantwortlich sind. Der derzeitige Stand bei der Herstellung organotypischer Keratinozyten-Fibroblasten-Kokulturen erlaubt ihre reproduzierbare Bereitstellung für experimentelle Zwecke und hat es somit ermöglicht, grundlegende Phänomene der epidermalen Regeneration in vitro zu untersuchen. Wichtige Standardisierungsmaßnahmen an diesem Kulturmodell 77

26 78 Forschungsschwerpunkt B waren hierbei einmal die Einstellung auf definiertes Kulturmedium und zum anderen die Kontrolle der Fibroblastenpopulation durch Verwendung postmitotischer Zellen erreicht werden, ohne daß funktionelle Einbußen eintraten [3]. Weiterhin konnten neuerdings durch Verwendung von biokompatiblen Gerüstmaterialien und dermalen Fibroblasten Dermisäquivalente in vitro produziert werden, die sich durch autonome Produktion extrazellulärer Matrix auszeichnen und eine gut geeignete mesenchymale Unterlage für Keratinozyten in Kokultur bieten. Neben verbesserter mechanischer Stabilität liegt ihr Vorteil auch darin, daß sie im Hinblick auf klinische Anwendung (Tissue Engineering von Hautersatz) ein immunologisch völlig humanisiertes System ohne artfremdes Strukturprotein wie tierisches Kollagen darstellen. In derartigen Hautäquivalenten werden derzeit die Einflüsse des Epithels auf die ECM-Synthese untersucht, was auch im Kontext der Charakterisierung von (Wund- und Tumor-) Stromabildung in vivo von Bedeutung ist. Aufgrund ihrer genetischen Veränderungen, aber auch ihres in vitro Wachstumsverhaltens repräsentieren die Zellen der immortalen humanen Keratinozytenlinie HaCaT ein Frühstadium der Hautcarcinom-Entwicklung. Die detaillierte Analyse ihrer funktionellen Kompetenz unter optimalen, d.h. in vivo Bedingungen, hatte eine weitgehend normale Epithelbildung, allerdings mit verzögerter Kinetik gezeigt. Alle Differenzierungsmarker wurden regelrecht exprimiert, wobei allerdings der strukturelle Aufbau des neu gebildeten Epithels weniger geordnet war und erst nach drei Wochen eine weitgehend normale (othokeratotische) Hornschicht erkennen ließ [10]. Diese regulatorischen Defizite wurden in dem in vitro Modell der organotypischen Kokultur noch deutlicher. Obwohl HaCaT Zellen in konventionellen Kulturen eine größere Wachstumspotenz zeigen als normale Keratinozyten, war dies bei Kultivierung auf Kollagenmatrix und in Anwesenheit von Fibroblasten reduziert [11]. Die Analyse der molekularen Mechanismen dieser gestörten Epithel-Mesenchym-Wechselwirkung, insbesondere der für die Proliferation normaler Keratinozyten aufgezeigten Regelkreise, ist von großem Interesse und wird derzeit intensiv verfolgt. 2. Epithel-mesenchymale Wechselwirkungen in der Produktion der Basalmembran D. Breitkreutz, C. Schmidt, N. Daum, N. Mirancea Kooperation R. Nischt und T. Krieg, Dermatologie, Universität Köln; U. Werner und M. Gerl, Aventis Deutschland Entsprechend der Wachstumsregulation von Keratinozyten konnte auch die postulierte interaktive Bildung der Basalmembran (BM) durch Keratinozyten und Fibroblasten in organotypischen Kokulturen schlüssig demonstriert werden. Die separate Analyse beider Gewebekompartimente auf mrna und Proteinebene hatte bereits die wechselseitige Induktion und Dynamik der Synthese der BM-Komponenten gezeigt [12]. Zellspezifisch erfolgte hierbei lediglich die Synthese der Laminin-Isoform LN-5 in Keratinozyten und von Nidogen in Fibroblasten. Darüberhinaus konnten wir unter Verwendung definierter Medien (ohne Serum Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro oder Gewebeextrakte) direkte Effekte externer Faktoren nachweisen. Dabei zeigte sich ein ausgeprägter Synergismus zwischen TGFß und Vitamin A-Säure, die beide auf der Regulation der epithelialen Differenzierung eher antagonistisch wirken. Eine weitere Regulationsebene bei der BM-Bildung stellt die reguläre Verknüpfung ihrer Einzelkomponenten zu stabilen Co-Polymeren (BM-Assembly) dar, ein wesentlicher Vorgang für die funktionelle BM-Stabilität. Mit einem definierten Laminin-Fragment konnten wir gezielt die Interaktion von Laminin-10 mit der Quervernetzungs-Komponente Nidogen unterbinden und damit die Polymerisation einzelner BM-Komponenten völlig blockieren. Konventionelle sowie Immun-Elektronenmikroskopie machten dabei deutlich, daß neben dem Verlust distinkter BM-Strukturen und der aberranten Lokalisation von BM- Molekülen auch Matrix-Verankerungsstrukturen (Hemidesmosomen) der basalen Keratinozyten völlig fehlten. Entsprechend war ebenfalls die Organisation des Keratin- Cytoskeletts erheblich gestört. Die Effekte waren dosisabhängig und reversibel. Außerdem waren Epithelwachstum und epidermale Differenzierung nicht nachhaltig beeinflußt, was die Spezifität dieses Eingriffs in BM-Organisation und Zell-Matrix-Interaktion klar unterstreicht. Spätere Stadien der Zelltransformation in Richtung Krebszelle, wie sie nach Onkogen-Transfektion an dem HaCaT- Modellsystem in Form von benignen und malignen Tumorzellen charakterisiert werden konnte, zeigten weitergehende Veränderungen in der Mesenchym-Wechselwirkung und extrazellulären Matrixproduktion. Besonders deutlich wurde dies in Oberflächentransplantaten auf der Nacktmaus, bei denen benigne Zellen differenzierte, leicht dysplastische Epithelien auf aktiviertem Granulationsgewebe bildeten, während maligne Zellen invasives Tumorwachstum zeigten. Dies korrelierte mit einem massiven Verlust der Zellpolarität, erkenntlich an der stark expandierten Zone von proliferierenden Zellen mit Basalzell- Charakter sowie aberranten Keratinmustern [13]. Ein weiterhin typisches Merkmal maligner Zellen waren erhebliche Störungen in der Produktion von BM-Strukturen, wobei BM-Komponenten auch diffus in das benachbarte Tumorstroma diffundierten (bestätigt durch Immun-Elektronenmikroskopie). Entsprechend waren im Elektronenmikroskop nur marginal BM-Strukturen sichtbar, einschließlich defekter Zellverankerungs-Komplexe (Hemidesmosomen) an der Zell-Matrix-Interphase. In Analogie zur Keratinozyten-Rekrutierung bei der Wundheilung mit ähnlichen Veränderungen dürften diese wesentlich zur erhöhten Mobilität der Tumorzellen - vor allem bei invasivem Wachstum - beitragen. Eine Schlüsselrolle fällt hierbei den Matrixrezeptoren der Integrin-Familie, insbesondere Integrin =6>4 zu, das ein integraler Bestandteil der Hemidesmosomen ist. Der Beitrag dieses Integrins zur normalen sowie gestörten Signaltransduktion in Tumoren unter Protein Kinase C ist Gegenstand derzeitiger Untersuchungen.

27 3. Parakrine und autokrine Mechanismen in Tumorprogression und Stromamodulation M. Müller, C. Gutschalk, E. Obermüller, M. Oehme, M. Koci Kooperation mit Ch. Herold-Mende, HNO Klinik (Dr. C. Reisser) und Neurochirurgie Heidelberg (Dr. H.-H. Stein); A. Marmé, Universitätsfrauenklinik, G. Neufeld, Technion Haifa, Israel Tumorprogression, d.h. die Entwicklung zunehmend malignerer Varianten, ist durch eine verstärkte Wachstums-Unabhängigkeit der Tumorzellen von ihrer Umgebung (Stroma) charakterisiert, großteils bedingt durch eine veränderte Wachstumsfaktorexpression. In dieser Gruppe ist es kürzlich gelungen, einen bisher unbekannten Weg der autonomen Wachstumsregulation von besonders aggressiven (metastasierenden) HaCaT Tumorzellen zu entschlüsseln und auch dessen Bedeutung für humane Tumore, wie Glioblastome, Meningiome und Kopf-Hals-Tumore zu belegen. Unabhängig von der Art der tumorigenen Transformation der HaCaT Zellen (H-ras Onkogen oder Kultur-Stress) konnte, durch in vivo Passage als s.c. Nacktmaustumore, reproduzierbar die Malignität (Aggressivität) von HaCaT Tumorzellen bis hin zur Metastasierung gesteigert werden [14]. Mit dieser Tumorprogression geht stets eine de novo Expression der hämatopoietischen Wachstumsfaktoren G-CSF und GM-CSF einher [15]. Beide, ursprünglich als regulierende Faktoren des hämatopoietischen Systems identifizierte Proteine, wurden von uns erstmals als Progressions-assoziierte Faktoren für epitheliale und neuronale Tumorzellen nachgewiesen. Während die Expression der Rezeptoren für G-CSF und GM-CSF bereits in nicht tumorigenen HaCaT Zellen zu finden ist, werden die Faktoren ausschließlich in hochgradig malignen Zellen exprimiert. Benigne Tumorzellen, die normalerweise zystische Tumore bilden, konnten durch die Transfektion mit beiden Faktoren zu malignen Tumorzellen transformiert werden. Die Neoexpression von G-CSF und GM-CSF steuert die Tumorprogression durch eine autokrine Stimulation von Tumorzellproliferation und Migration, aber auch über eine verstärkte Induktion von Tumorstroma und Angiogenese in vivo. Darüberhinaus wirken beide Faktoren chemotaktisch für Leukozyten und könnten auf diesem Wege auch für die Expression und Aktivierung von Matrix-Metalloproteinasen in Makrophagen und Granulozyten und damit für die Gewebedegradation im Rahmen der Invasion eine entscheidende Rolle spielen. In Weiterführung dieses Projekts gilt unser Interesse jetzt besonders den Veränderungen in der Tumor-Stroma-Interaktion, die in den hochgradig malignen Zellen durch die de novo Expression von G-CSF und GM-CSF bewirkt werden. Zur weiteren Analyse der veränderten Wachstumsregulation in Früh- versus Spät-Stadien der HaCaT-Tumorzellen finden derzeit cdna-array Studien zur Identifizierung zusätzlicher verändert exprimierter Wachstumsfaktoren statt. Den Daten zur Wirkung von G-CSF und GM-CSF auf Tumorwachstum und Progression steht die zunehmende klinische Verwendung beider Faktoren in der adjuvanten Tumortherapie zur Vermeidung von Strahlen und Chemotherapie-induzierter Neutropenie und Mucositis gegenüber, die daher möglicherweise kritisch bewertet werden Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro muß. Dies wird unterstützt durch die von uns nachgewiesene funktionelle Rolle von G-CSF und GM-CSF als autokrine Stimulatoren von Tumorzell-Proliferation und - Migration in humanen Gliomen und Meningiomen [16, 17]. Der Beitrag beider Faktoren zur Tumorprogression spiegelt sich außerdem in einer statistisch signifikanten Korrelation der Expression beider Faktoren in Gliomen und Kopf-Hals-Tumoren mit einer kürzeren Überlebenszeit für die Patienten sowie in einem Überlebensnachteil mancher Patienten bei G-CSF unterstützter Therapie von Kopf- Hals-Tumoren. Daher wollen wir in Fortführung dieser Studien die funktionelle Bedeutung von G-CSF und GM-CSF für Tumorprogression, Invasion und Metastasierung dieser Tumortypen in vivo im Nacktmausmodell verifizieren. 4. Tumor-Stroma-Wechselwirkungen steuern Invasion und Angiogenese S. Vosseler, H.-J. Stark, W. Lederle, M.M. Müller, M. Willhauck, J. Mertens In Kooperation mit J.M. Foidart, Universität Lüttich, Belgien; E. Fink, Universität München, V.M. Kähäri, Universität Helsinki, Finnland, W. Hartschuh, Universität Heidelberg Zahlreiche Arbeiten aus jüngster Zeit belegen die entscheidende Rolle von stromalen Zell- und Matrix-Elementen für Tumorentstehung, Invasion und Metastasierung. Neben der bekannten induzierenden Rolle von Tumorzellen auf Stromaveränderungen wird die Bedeutung von stimulierenden und hemmenden stromalen Einflüssen auf das Tumorwachstum zunehmend erkannt. Epitheliale Tumore wie Hautcarcinome weisen große Ähnlichkeiten mit der Wundheilungssituation auf, bei der sich der mesenchymale Gewebeanteil in spezifischer Weise zu Granulationsgewebe umbildet. Daher liegt ein Schwerpunkt unserer Forschungsaktivitäten auf der Analyse und funktionellen Charakterisierung solchen Granulationsgewebes. Erste Ergebnisse zeigten, daß die Stroma-Modulation durch Induktion einer Fremdkörperreaktion das invasive Wachstum maligner Tumorzellen entscheidend beeinflußt, je nach chemischer Zusammensetzung der verwendeten Materialien. Von der weiteren eingehenden Untersuchung dieses Phänomens sind wertvolle Erkenntnisse über stromale Parameter, die den Tumorphänotyp kontrollieren, zu erwarten. In vitro Ansätze, bei denen Tumor-Stroma-Äquivalente durch dreidimensionale Kultivierung von isolierten Zellen aus dem Stroma von Plattenepithelkarzinomen hergestellt und mit malignen und prämalignen Zellen kombiniert werden, sollen über die tumorregulierenden Mechanismen der stromalen Zellen Aufschluß geben und diese einer detaillierten Analyse zugänglich machen. Eines der wesentlichsten Elemente der veränderten Tumor-StromaWechselwirkung ist die durch Tumorzellen induzierte Angiogenese. Neben ihrer Bedeutung für die Ernährung und Sauerstoffversorgung des Tumorgewebes werden der Gefäßneubildung zusätzliche, für das Tumorwachstum wesentliche Funktionen zugesprochen. Dementsprechend konnten wir im Transplantationssystem eine 79

28 80 Forschungsschwerpunkt B bisher nicht bekannte Interaktion von Angiogenese und Tumorinvasion nachweisen. Durch Blockade der Tumor-induzierten Angiogenese mittels Antikörper-vermittelter Inaktivierung eines Rezeptors (VEGF-R2) des potentesten Angiogenesefaktors VEGF (vascular endothelial growth factor) wurde nicht nur ein Einsprossen der Gefäße in den Tumor (Vaskularisierung), sondern überraschenderweise auch die Invasion der Tumorzellen unterbunden. Dieser bedeutende Befund einer so entscheidenden Wechselwirkung zwischen Gefäßsystem und Tumorinvasion ließ sich inzwischen auch an aggressiven Tumorvarianten, sowohl im Transplantationssystem als auch nach konventioneller subcutaner Injektion, erhärten. Wenn auch die mechanistischen Zusammenhänge noch unklar sind, belegen diese Ergebnisse eindeutig die essentielle Rolle der Gefäßneubildung, d.h. von aktivierten Endothelien, für die Tumorinvasion [18]. In einer Kooperationsstudie mit Prof. Hartschuh (Universitätshautklinik, Heidelberg) konnten wir zeigen, daß eine verstärkte Vaskularisierung von epithelialen Hauttumoren erst in Spätstadien auftritt [19]. Erst bei einem größeren Tumordurchmesser erfolgt die verstärkte Induktion von Angiogenese in diesen Tumoren, nicht jedoch in Frühstadien (aktinische Keratose), wie dies bei anderen Organtumoren berichtet wurde. Interessanterweise korreliert die verstärkte Vaskularisierung von Plattenepithelcarcinomen der Haut mit der ansteigenden Metastasierungshäufigkeit. Ein weiterer bedeutender funktioneller Aspekt der Tumor- Stroma-Interaktion ist die Produktion und Regulation von Matrix-degradierenden Proteinasen, denen eine besondere Rolle bei der Tumorinvasion zukommt. So konnte die Expression verschiedener Proteasen, insbesondere Matrix Metalloproteinasen (MMPs) in unterschiedlichen Transformationsstadien von HaCaT Zellen nachgewiesen und ihre Induktion über verschiedene Signalwege belegt werden [20-23]. Eine funktionelle Korrelation zu dem Transformations-Stadium der Zellen, d.h. zu ihrem invasiven Verhalten, war jedoch nicht zu belegen. Andererseits konnten wir zeigen, daß die Expression von MMPs in benignen und malignen Tumorzellen durch Stromazellen in vitro und in vivo reguliert wird [24]. Außerdem scheinen nur maligne Tumorzellen in der Lage, bestimmte MMPs im benachbarten Stroma zu induzieren, nicht jedoch benigne, wie derzeit laufende Studien zeigen. Weitere Befunde aus einer Kooperation weisen darauf hin, daß nicht die Proteaseproduktion an sich Invasions-fördernd ist, sondern ihre balancierte Expression und Aktivierung. In Fortführung dieser Zusammenarbeit konnte nachgewiesen werden, daß das Fehlen eines natürlichen Inhibitors des Plasmin-Protease-Systems (PAI-1) sowohl Tumorvaskularisierung wie Invasion völlig hemmt [25]. Die in drei verschiedenen Systemen mit unterschiedlichen Komponenten nachgewiesene Rolle der einsprossenden Gefäße für die Tumorinvasion spricht für einen komplexen multifaktoriellen Mechanismus der Wechselwirkung, wobei Wachstumsfaktoren, Proteasen und ECM-Komponenten synergistisch wirken, um Tumorinvasion zu ermöglichen [18, 25, 26]. Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro Alle diese Befunde lassen erkennen, daß nicht nur in normalen, sondern auch in Tumorgeweben wechselseitige Interaktionen zwischen Epithelzellen und Zellen des Bindegewebes stattfinden, die Proliferation, Differenzierung und möglicherweise Migration von normalen und Tumorzellen, aber auch die Synthese und Aktivierung von Proteasen steuern. Die detaillierte Analyse dieser Wechselwirkungen und ihrer Rolle bei der Regulation der Invasion ist Aufgabe laufender Untersuchungen, die sowohl an in vivo (Oberflächentransplantaten) wie an in vitro Modellen (organotypischen Hautkulturen) erfolgen. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Maas-Szabowski, N., *Shimotoyodome, A, Fusenig, N.E.: Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. Journal of Cell Science 12: (1999) [2] Fusenig, N.E.: Culture of specific cell types: keratinocytes. In: Culture of animal cells (R.A. Freshney, ed.) Wiley, New York, Chichester, pp (2000) [3] Stark, H.-J., *Baur, M., Breitkreutz, D., *Mirancea, N., Fusenig, N.E.: Organotypic keratinocyte cocultures in defined medium with regular epidermal morphogenesis and differentiation. Journal of Investigative Dermatology 112: (1999) [4] *Tomakidi, P., *Schuster, G., Breitkreutz, D., *Kohl, A., *Ottl, P., *Komposch, G.: Organotypic cultures of gingival cells: an epithelial model to assess putative local effects of orthodontic plate and occlusal splint materials under more tissue-like conditions. Biomaterials 21: (2000) [5] Stark, H.-J., Maas-Szabowski, N., *Smola, H., Breitkreutz, D., *Mirancea, N., Fusenig, N.E.: Organotypic keratinocyte-fibroblast cocultures: in vitro skin equivalents to study the molecular mechanisms of cutaneous regeneration. In: Cultured human keratinocytes and tissue engineered skin substitutes (R.E. Horch, A.M. Munster, B.M. Achauer, eds.), Thieme Verlag, Stuttgart, New York, pp (2001) [6] Maas-Szabowski, N., Stark, H.-J., Fusenig, N.E.: Cell interaction and epithelial differentiation. In: Culture of epithelial cells. Second Edition. (R.I. Freshney, M.G., Freshney, eds.) Wiley, New York, in press (2002) [7] Maas-Szabowski, N., Stark, H.-J., Fusenig, N.E.: Keratinocyte growth regulation in defined organotypic cultures through IL-1- induced keratinocyte growth factor expression in resting fibroblasts. Journal of Investigative Dermatology 114: (2000) [8] Szabowski, A., Maas-Szabowski, N., Andrecht, S., Kolbus, A., Schorpp-Kistner, M., Fusenig, N.E., Angel, P.: c-jun and JunB antagonistically control cytokine-regulated mesenchymalepidermal interaction in skin. Cell 103: (2000) [9] Maas-Szabowski, N., Szabowski, A., Stark, H.-J., Andrecht, S., Kolbus, A., Schorpp-Kistner, M., Angel, P., Fusenig, N.E.: Organotypic cocultures with genetically modified mouse fibroblasts as a tool to dissect molecular mechanisms regulating keratinocyte growth and differentiation. Journal of Investigative Dermatology 116: (2001) [10] Breitkreutz, D., Schoop, V.M., *Mirancea, N., *Baur, M., Stark, H.-J., Fusenig, N.E.: Epidermal differentiation and basement membrane formation by HaCaT cells in surface transplants. European Journal of Cell Biology 75: (1998) [11] Schoop, V., *Mirancea, N., Fusenig, N.E.: Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. Journal of Investigative Dermatology 112: (1999) [12] Smola, H., Stark, H.-J., Thiekötter, G., Mirancea, N., Krieg, T., Fusenig, N.E.: Dynamics of basememt membrane formation by keratinocyte-fibroblast interactions in organotypic skin culture. Experimental Cell Research 239: (1998)

29 Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro [13] Tomakidi, P., *Mirancea, N., Fusenig, N.E., *Herold-Mende, C., *Bosch, F.X., Breitkreutz, D.: Defects of basement membrane and hemidesmosome structure correlate with malignant phenotype and stromal interactions in HaCaT-ras transplants. Differentiation 64: (1999) [14] Müller, M., Fusenig, N.E.: Constitutive expression of G-CSF und GM-CSF in human skin carcinoma cells with functional consequence for tumor progression. International Journal of Cancer 83: (1999) [15] Müller, M.M., Peter, W., Mappes, M., Hülsen, A., Steinbauer, H., Boukamp, P., *Vaccariello, M., *Garlick, J., Fusenig, N.: Tumor progression of skin carcinoma cells in vivo promoted by clonal selection, mutagenesis, and autocrine growth regulation by granulocyte colony-stimulating factor and granulocytemacrophage colony-stimulating factor. American Journal of Pathology 159: (2001) [16] Müller, M.M., *Herold-Mende, C.C., *Riede, D., *Lange, M., *Steiner, H.-H., Fusenig, N.E.: Autocrine growth regulation by granulocyte colony-stimulating and granulocyte macrophage colony-stimulating factor in human gliomas with tumor progression. American Journal of Pathology 155: (1999) [17] *Braun, B., *Lange, M., *Oeckler, R., Müller, M.M.: Expression of G-CSF and GM-CSF in human meningiomas correlates with increased tumor proliferation and vascularization and thus with tumor progression. Submitted (2002) [18] Fusenig, N.E., Skobe, M., Vosseler, S., Hansen, M., Lederle, W., Airola, K., *Tomakidi, P., Stark, H.-J., Boukamp, P., Breitkreutz, D.: Tissue models to study tumor-stroma interactions. In: Proteases and their inhibitors in cancer metastasis. (R.J. Muschel, J.-M. Foidart, eds.) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, in press (2002) [19] Strieth, S., Hartschuh, W., Pilz, L., Fusenig, N.E.: Angiogenic switch occurs late in squamous cell carcinomas of human skin. British Journal of Cancer 82: (2000) [20] *Ala-aho, R., *Johansson, N., *Grénman, R., Fusenig, N.E., *Foschi, M., *López-Otín, C., *Kähäri, V.-M.: Inhibition of collagenase-3 (MMP-13) expression in transformed human keratinocytes by interferon-c is associated with activation of extracellular signal-regulated kinase-1,2 and STAT1. Oncogene 19: (2000) [21] *Bachmeier, B.E., Boukamp, P., *Lichtinghagen, R., Fusenig, N.E., *Fink, E.: Matrix metalloproteinases-2, -3, -7, -9, and -10, but not MMP-11, are differentially expressed in normal, benign tumorigenic and malignant human keratinocyte cell lines. Biological Chemistry 381: (2000) [22] *Johansson, N., *Ala-aho, R., *Uitto, V.-J., *Grénman, R., Fusenig, N.E., *López-Otín, C., *Kähäri, V.-M.: Expression of collagenase-3 (MMP-13) and collagenase-1 (MMP-1) by transformed keratinocytes is dependent on the activity of p38 mitogen-activated protein kinase. Journal of Cell Science 113: (2000) [23] *Baumann, P., *Zigrino, P., *Mauch, D., Breitkreutz, D., *Nischt, R.: Membrane-type 1 matrix metalloproteinase-mediated progelatinase activation in non-tumorigenic and tumorigenic human keratinocytes. British Journal of Cancer 83: (2000) [24] *Airola, K., Fusenig, N.E.: Differential stromal regulation of MMP-1 expression in benign and malignant keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology 116:85-92 (2001) [25] *Bajou, K., *Masson, V., *Gerard, R.D., *Schmitt, P.M., *Albert, V., *Praus, M., *Lund, L.R., *Frandsen, T.L., *Brunner, N., *Dano, K., Fusenig, N.E., *Weidle, U., *Carmeliet, G., *Loskutoff, D., *Collen, D., *Carmeliet, P., *Foidart, J.M., *Noel, A.: The plasminogen activator inhibitor PAI-1 controls in vivo tumor vascularization by interaction with proteases, not vitronectin: implications for anti-angiogenic strategies. Journal of Cell Biology 152: (2001) [26] Fusenig, N., Vosseler S.: Bedeutung der Angiogenese für die Tumorinvasion. Med-Report 21:2 (2000) 81

30 Abteilung B0700 Tumorbiochemie 82 Abteilung Tumorbiochemie (B0700) Leiter: Prof. Dr. med. Dietrich Keppler Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. sc. hum. Yunhai Cui Dr. med. Markus Donner (- 01/01) Prof. Dr. rer. nat. Wolfgang Hagmann Dr. sc. hum. Gabriele Jedlitschky Dr. rer. nat. Jörg König Dr. sc. hum. Inka Leier (U12/00) Dr. rer. nat. Anne Nies Gastwissenschaftler/Stipendiaten Dr. med. H. Kojima (Japan, Humboldt-Stipendium, 08/01 -) Dr. M. Komatsu (Ph.D.) (Japan, Forschungsstipendium der Kagoshima Universität Japan, 10/01 -) Doktoranden/innen Renata Gologan (- 03/00) Verena Keitel Young-Min Lee (07/01 -) Christoph Michalski (04/01 -) Dipl. Pharmazeut. Maria Rius Montraveta (12/00 -) Dipl. Biol. Birgit Stöckel (- 03/00) Technische Assistentinnen Manuela Brom Ulrike Buchholz (halbtags) (- 09/00) Johanna Hummel-Eisenbeiß (halbtags) Marion Pfannschmidt (Gast) Jana Schubert (03/00 -) Bettina Walter (halbtags) (11/00 -) Sekretariat Friederike Kremp Der Transport körpereigener und körperfremder Substanzen über Zellmembranen wird durch Transportproteine kontrolliert. Zahlreiche Gene kodieren für die Proteine, welche die Aufnahme von Substanzen in die Zelle und die Abgabe aus der Zelle vermitteln. ATP-abhängige Membranproteine transportieren körpereigene Substanzen, Toxine, Kanzerogene, Zytostatika und deren Konjugate über die Plasmamembran aus normalen und malignen Zellen in den extrazellulären Raum. Untersuchungen in der Abteilung Tumorbiochemie haben zur Entdeckung der molekularen Identität von ATP-abhängigen Transportern für Konjugate und Komplexe lipophiler Verbindungen mit Glutathion, Glucuronat oder Sulfat geführt. Eine Überexpression dieser Transportproteine der Plasmamembran, zu denen die Mitglieder der Multidrug Resistance-Proteine (MRP- Proteine) zählen, kann zur Resistenz von Tumoren gegenüber verschiedenen Zytostatika führen. Die Proteine der MRP-Familie (MRP1-9) unterscheiden sich erheblich in ihrer Sequenz und Substrat-Spezifität vom MDR1-P-Glykoprotein, welches ebenfalls eine Zytostatika-Resistenz bewirken kann. Hemmstoffe des Transports von Zytostatika- Konjugaten und -Komplexen durch MRP-Proteine können dazu dienen, diese neuen Formen der Zytostatika-Resistenz zu überwinden. Zu den physiologischen Substraten von Konjugat-Exportpumpen der MRP-Familie zählen unter anderem das Glutathionkonjugat Leukotrien C 4, Glucuronide von Bilirubin, Gallensäuren und Steroidhormonen, sowie zyklische Nukleotide (cgmp und camp). Die fehlende Lokalisation der MRP2-kodierten Konjugat-Exportpumpe in der apikalen Membran der Hepatozyten ist die Ursache des erblichen Dubin-Johnson-Syndroms des Menschen, das durch eine konjugierte Hyperbilirubinämie charakterisiert ist. Die Klonierung von MRP2, MRP3, MRP5 und MRP6 ermöglichte die Herstellung stabil transfizierter Zellen und spezifischer Antikörper. Durch Immunfluoreszenz- und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie wurde die dynamische intrazelluläre Verteilung von MRP2, die basolaterale Lokalisation von MRP3 und die apikale Lokalisation von MRP2 in verschiedenen Geweben bestimmt. Die MRP2-Expression und Lokalisation wurde auch im klarzelligen Nierenzellkarzinom und im hepatozellulären Karzinom nachgewiesen. Unsere Untersuchungen zeigen, dass MRP2 zur lange bekannten Chemoresistenz dieser malignen Tumoren beitragen kann. Zusatzfinanzierung: DFG über SFB 352 und SFB 601; Forschungsschwerpunkt Transplantation; Tumorzentrum Heidelberg-Mannheim; Deutsch-Israelische Zusammenarbeit (DKFZ/ NCRD); Fonds der Chemischen Industrie. Homepage:

31 Identifikation und genomische Organisation von hepatozellulären Aufnahmetransportern für organische Anionen J. König, Y. Cui, A. Nies, D. Keppler Auf Grund der Ähnlichkeit mit der Sequenz eines bekannten Aufnahmetransporters für organische Anionen konnten wir die gesamte cdna eines neuen Aufnahmetransporters, OATP2 (Gensymbol SLC21A6), klonieren. Die OATP2- cdna ist 2073 Basenpaare lang, was einem Translationsprodukt von 691 Aminosäuren entspricht [1]. Ausgehend von dieser DNA-Sequenz konnte eine weitere homologe Sequenz identifiziert werden, welche 85 % Nukleotidsequenz-Identität mit der OATP2-Sequenz aufwies. Das entsprechende Protein wurde als OATP8 (Gensymbol SLC21A8) bezeichnet. Die Identität zwischen OATP2 und OATP8 auf Proteinebene beträgt 80 % [7]. Weitere bekannte Familienmitglieder der SLC21A-Familie (OATP-A; OATP-B; OATP-D; und OATP-E) weisen eine Aminosäure- Identität von weniger als 40 % im Vergleich zu OATP2 und OATP8 auf [7]. Mit Hilfe von Antikörpern, welche gegen verschiedene Epitope der Transporter gerichtet waren, konnten sowohl OATP2 als auch OATP8 in der basolateralen Membran humaner Hepatozyten nachgewiesen werden. Diese Lokalisation stimmte überein mit der vorhergesagten Funktion dieser Proteine als Aufnahmetransporter für anionische Substanzen aus dem Blut in die Hepatozyten [1, 7, 12, 19]. In Cholangiozyten, den Epithelzellen der Gallenwege, konnten beide Transporter nicht nachgewiesen werden. Mittels molekularbiologischer Techniken konnte die Messenger-RNA für beide Transporter nur in Hepatozyten nachgewiesen werden. Die genomische Organisation von OATP2 und OATP8 konnte zusammen mit der genomischen Organisation von OATP-A, dem dritten, gut charakterisierten Aufnahmetransporter der SLC21A-Familie mit Hilfe von Sequenz-Datenbanken etabliert werden. Trotz der geringen Aminosäure-Identität zwischen den Transportern (40 % zwischen OATP8 und OATP-A) zeigten sich bei der Analyse der genomischen Organisation erstaunliche Übereinstimmungen [7]. Alle drei Gene wurden auf Chromosom 12 lokalisiert. Ein Vergleich der genomischen Organisationen zeigte, dass alle drei Transportergene aus 14 Exons bestehen und die mittlere Exonlänge 150 Basenpaare beträgt. Zwischen allen drei Genen stimmen 9 Exons in der Länge überein, zwischen OATP2 und OATP8 sind sogar 13 der 14 Exons in der Länge identisch. Werden die Exon-Intron-Grenzen auf die entsprechende Aminosäure-Sequenz übertragen, so zeigt sich, dass sich alle Grenzen an identischen Stellen in dieser Anordnung der drei Sequenzen befinden. Dies deutet auf ein hohes Maß an evolutionärer Verwandtschaft hin. Abteilung B0700 Tumorbiochemie Funktionelle Charakterisierung der Aufnahme-Transporter OATP2 und OATP8 Y. Cui, J. König, D. Keppler Die funktionelle Charakterisierung der Aufnahme-Transporter OATP2 (SLC21A6) und OATP8 (SLC21A8) wurde mit Hilfe von stabil transfizierten Zellen durchgeführt [1, 7, 12]. Beide Transportproteine weisen ein breites Spektrum an Substraten auf. Das humane OATP2 transportiert sowohl endogene Metaboliten, wie z. B. Bilirubin, Mono- und Bis-glucuronosyl-bilirubin, 17>-Glucuronosyl-estradiol, Dehydroepiandrosteronsulfat, Triiodthyronin, Cholyltaurin, Leukotrien C4 und Prostaglandin E 2 als auch Arzneimittel wie Pravastatin, einem Inhibitor der Cholesterol-Biosynthese, und Enalapril, einem ACE-Hemmer. Sulfobromophthalein, eine zur Testung der Transport-Funktion der Leber verwendete Substanz, ist ein hoch-affines Substrat für OATP2 mit einer Michaelis-Menten-Konstanten (K m ) von 140 nm. Die Substrat-Spezifität des humanen OATP8 ist ähnlich wie die des OATP2, was der nahe verwandten Aminosäuren-Sequenz beider Proteine entspricht. Wir haben jedoch deutliche Unterschiede der Transportkinetik und in der Substrat-Spezifität festgestellt [12]. Von physiologischer Bedeutung ist der Unterschied beim Bilirubin- Transport: Im Gegensatz zu OATP2, kann OATP8 unkonjugiertes Bilirubin nicht transportieren [12]. Regulation der apikal lokalisierten Exportpumpe MRP2 (ABCC2) und der basolateral lokalisierten Exportpumpe MRP3 (ABCC3) B. Stöckel, J. König, A. Nies, Y. Cui, M. Brom, D. Keppler Einige Mitglieder der MRP-Familie werden zwar in Hepatozyten synthetisiert, sind aber in verschiedenen Membrandomänen lokalisiert: MRP2 (ABCC2) befindet sich in der apikalen Domäne und transportiert Substanzen in die Galle, wogegen MRP3 (ABCC3) in der basolateralen Membran lokalisiert ist und Substanzen aus dem Hepatozyten zurück ins Blut pumpt. Da das Substratspektrum beider Transporter überlappend ist, kommt einer Regulation der Transporterexpression für eine geordnete Funktion große Bedeutung zu. Untersuchungen an den homologen Transportern der Ratte zeigten, dass unter normalen Bedingungen MRP2-mRNA hoch exprimiert ist, MRP3-mRNA aber nur schwach nachweisbar ist. Unter Bedingungen einer gestörten Transportfunktion von MRP2, mit verminderter Expression der MRP2-mRNA, wird die MRP3-Expression induziert. Zur genaueren Untersuchung dieser Regulation klonierten wir die 5 -reglatorischen Bereiche des MRP2-Gens und des MRP3-Gens in ein Reportergenplasmid und untersuchten die Promotoraktivitäten beider Transportergene unter Normalbedingungen und nach Zugabe verschiedener Substanzen [4]. Unter Normalbedingungen ist die basale MRP2-Promotoraktivität hoch, jedoch beträgt die basale Aktivität des MRP3-Promotors unter den gleichen Bedingungen nur 4 % der MRP2-Promotoraktivität. Nach der Behandlung der transfizierten Zellen mit Nocodazol, einem Inhibitor der 83

32 84 Forschungsschwerpunkt B Bildung der Mikrotubuli, vermindert sich die Aktivität des MRP2-Promotors um 50 %, die Aktivität des MRP3-Promotors hingegen verstärkt sich um mehr als 1000 %. Unsere Ergebnisse zeigen eine geregelte, jedoch inverse Regulation der Aktivität beider Promotoren. Vektorieller Transport durch doppel-transfizierte polarisierte Zellen Y. Cui, J. König, D. Keppler Rekombinante Transportproteine wurden bisher einzeln untersucht. Der vektorielle Transport durch Epithelzellen erfordert aber sowohl Protein-vermittelte Aufnahme-Prozesse als auch Export-Prozesse. Um diesen vektoriellen Transport besser verstehen zu können, haben wir eine doppel-transfizierte Zell-Linie hergestellt [19]. In polar wachsende MDCK-Zellen wurden die cdnas von MRP2 und OATP8 stabil transfiziert. Immunfluoreszenz-Untersuchungen zeigten, dass OATP8 in der basolateralen Membran, MRP2 dagegen in der apikalen Membran der transfizierten MDCK-Zellen lokalisiert ist. Der Vergleich von doppel-transfizierten Zellen mit einzel-transfizierten Zellen zeigte, dass ein transzellulärer Transport von Sulfobromophthalein, einem Substrat für OATP8 und MRP2, nur dann mit ausreichender Geschwindigkeit stattfand, wenn der Aufnahme-Transporter OATP8 und die Exportpumpe MRP2 gleichzeitig in den Zellen exprimiert wurden. Auch andere Substrate beider Transportproteine wurden nur durch die doppel-transfizierten MDCK-Zellen vektoriell transportiert. Die doppel-transfizierten MDCK-Zellen stellen ein zelluläres Modellsystem dar, um Arzneimittel und Arzneimittelkandidaten auf deren Wechselwirkung mit dem vektoriellen Transport von organischen Anionen zu untersuchen. Ferner kann dieses Modellsystem die Suche nach Inhibitoren für MRP2, einem Zytostatika-Resistenz-vermittelnden Transporter, erleichtern. Abteilung B0700 Tumorbiochemie Funktionelle Rekonstitution von gereinigtem MRP2 W. Hagmann, J. Schubert, J. König, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: M. Schnölzer und T. Kempf, Zentrale Proteinanalytik, DKFZ Die Reinigung von MRP2 ist eine unabdingbare Voraussetzung zur genauen Charakterisierung der funktionellen Eigenschaften dieses Transporterproteins. Nach erfolgreicher Klonierung und Reinigung von MRP2 mit Hilfe einer carboxy-terminal eingefügten His 6 -Sequenz konnten wir zeigen, dass dieses gereinigte Protein nach Rekonstitution in Proteoliposomen funktionell insoweit intakt war, als es Substrat-stimulierbare ATPase-Aktivität aufwies (Hagmann et al., Eur. J. Biochem. 265: , 1999). Die intakte Rekonstitution von transport-aktivem MRP2 erforderte eine Optimierung der Solubilisations- und Rekonstitutionsbedingungen. Damit konnten wir zeigen, dass MRP2 als Protein allein in der Lage ist, in der geeigneten Lipidvesikelumgebung als Transporter zu funktionieren. Die Transportrate für LTC 4 in rekonstituierten MRP2-Proteoliposomen betrug 2.7 pmol x min -1 x mg MRP2-1 [26], die K m - Werte für ATP und LTC 4 beliefen sich dabei auf 560 µm bzw. 450 nm. Dieser Transport durch gereinigtes MRP2 war durch den Inhibitor MK571 hemmbar (IC 50 = 12 µm). Bindungs- und Immunpräzipitationsstudien zeigten, dass MRP2 mit dem Chaperon Calnexin assoziieren kann. Allerdings konnten wir in Rekonstitutionsversuchen mit gereinigtem Calnexin und MRP2 keinen Einfluss dieses Chaperons auf die Transportfunktion von MRP2 feststellen [26]. Das gereinigte MRP2 wird in weiteren Studien eingesetzt, um mögliche Partner zu finden, die in Wechselwirkung mit MRP2 dessen zelluläre Lokalisation und Funktion als Transporter beeinflussen. Apical Tight junction MDCK-Control MDCK-OATP8 Basolateral Transwell membrane OATP8 MDCK-MRP2 MRP2 MRP2 MDCK-MRP2/ OATP8 OATP8 Substrat-Transport durch doppel-transfizierte Zellen [19].

33 Expression und Lokalisation von MRP-Isoformen im Hepatozellulären Karzinom des Menschen A. Nies, J. König, M. Pfannschmidt, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: W. J. Hofmann, Universität Heidelberg und E. Klar, Universität Heidelberg Die ausgeprägte Resistenz des hepatozellulären Karzinoms (HCC) des Menschen gegenüber verschiedensten Zytostatika ist ein wichtiger Grund für das häufige Versagen einer Chemotherapie dieses bösartigen und weltweit sehr häufigen Tumors. Wir konnten durch semi-quantitative RT-PCR zeigen, dass MRP2 und MRP3 mrna im HCC stark exprimiert werden [18]. Beide MRP-Isoformen können Resistenz gegenüber Zytostatika vermitteln, indem sie diese über die Plasmamembran aus den Zellen heraustransportieren, so dass keine wirksamen Zytostatikakonzentrationen erreicht werden [11, 21]. Durch Immunfluoreszenz-Untersuchungen mit Isoform-spezifischen Antikörpern lokalisierten wir MRP2 in der apikalen Membran von Tumorzellen; hierbei wurden häufig trabekuläre oder pseudoglanduläre Strukturen beobachtet. MRP3 war hingegen in der basolateralen Plasmamembran lokalisiert [18]. In einigen HCC-Proben wurde auch MRP1 mrna detektiert, allerdings wurde MRP1-Protein ausschließlich in intrazellulären Membranstrukturen nachgewiesen. Unsere Untersuchungen zeigen, dass die Lokalisation von MRP2 in der apikalen und MRP3 in der basolateralen Membran von Tumorzellen zur Zytostatika-Resistenz des HCC beitragen kann. Expression und Lokalisation von MRP2 und MRP3 wurde auch in HepG2-Zellen nachgewiesen [2]. Zellbiologische Charakterisierung eines MRP2-Proteins mit einer Mutation, die zum Dubin-Johnson Syndrom führt V.Keitel, A. Nies, M. Brom, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: J. Kartenbeck, Zellbiologie, DKFZ (Immun-Elektronenmikroskopie von MRP2); H. Spring, Strukturanalyse, DKFZ (Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie) Mutationen im MRP2-Gen, die zum Verlust des MRP2- Proteins in der apikalen Membran führen, sind die molekulare Basis für das Dubin-Johnson Syndrom, welches mit einer konjugierten Hyperbilirubinämie einhergeht [21], da MRP2 die ATP-abhängige Exportpumpe für Bilirubin-Konjugate in der apikalen Membran von Hepatozyten ist [10, 11, 21, 24]. Eine 6-Nukleotide umfassende Deletion im MRP2-Gen führt zum Verlust von Arg1392 und Met1393 (MRP2DR,M) in der carboxy-proximalen ATP-Bindungsdomäne und zum Fehlen des MRP2-Proteins in der apikalen Membran von Hepatozyten des Menschen (Tsujii et al., Gastroenterology 117: , 1999). Wir haben diese 6- Nukleotide umfassende Deletion in die MRP2-cDNA eingebracht und nach Expression der mrna die Lokalisation des mutierten MRP2-Proteins in polarisierten HepG2-Zellen untersucht [9]. HepG2-Zellen, die von einem Hepatoblastom des Menschen abgeleitet sind, eignen sich gut für die Untersuchung der domänenspezifischen Sortierung Abteilung B0700 Tumorbiochemie von MRP-Isoformen [2]. Die mrna wurde in HepG2-Zellen exprimiert und führte zur Synthese eines mutierten MRP2DR,M-Proteins, welches nur unvollständig glykosyliert war. Das mutierte Protein akkumulierte im endoplasmatischen Retikulum und wurde nicht zur apikalen Membran transportiert [9]. Der Abbau des unreifen MRP2-Proteins erfolgte in Proteasomen. Unsere Untersuchungen klärten erstmalig den Pathomechanismus einer MRP2-Mutation auf, die zum Verlust von MRP2 in der apikalen Membran von Hepatozyten des Menschen und zum Dubin-Johnson Syndrom führt. Charakterisierung von MRP5 (ABCC5) als ATP-abhängige Exportpumpe für zyklische Nukleotide G.Jedlitschky, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: B. Burchell, University of Dundee, Schottland, UK Der zelluläre Export von zyklischen Nukleotiden (3'-5'- cgmp und 3'-5'-cAMP) wurde in einer Vielzahl von Geweben und Zellen beobachtet und kann zur Regulation der intrazellulären Konzentration der zyklischen Nukleotide beitragen. Unsere Untersuchungen haben erstmals die physiologische Funktion von rekombinantem MRP5, das in V79-Zellen exprimiert wurde, identifiziert [8]. Dementsprechend ist MRP5 eine ATP-abhängige Exportpumpe für 3'- 5'-zyklisches GMP mit einem K m -Wert von 2,1 µm [8]. Der ATP-abhängige Export von 3'-5'-zyklischem AMP erfolgt mit niedrigerer Affinität (K m = 379 µm). Verschiedene Substanzen, die als Hemmstoffe der Zyklonukleotid-Phosphodiesterase bekannt waren, wurden als wirksame Hemmstoffe des MRP5-vermittelten Transports von cgmp identifiziert, wobei die Hemmkonstante K i für Sildenafil 267 nm und für Trequinsin 250 nm betrug [8]. MRP5 könnte demnach ein neues pharmakologisches Zielmolekül sein, um durch dessen Hemmung die intrazellulären Konzentrationen an zyklischem GMP zu steigern [8]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] König, J.; Cui Y.; Nies, A.T.; Keppler, D.: A novel human organic anion transporting polypeptide localized to the basolateral hepatocyte membrane. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology 278 (2000) G156-G164. [2] Cantz, T.; Nies, A.T.; Brom, M.; *Hofmann, A.F.; Keppler, D.: MRP2, a human conjugate export pump, is present and transports Fluo 3 into apical vacuoles of Hep G2 cells. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology 278 (2000) G522-G531. [3] Leier, I.; Hummel-Eisenbeiss, J.; Cui, Y.; Keppler, D.: ATP-dependent para-aminohippurate transport by apical multidrug resistance protein MRP2. Kidney International 57 (2000) [4] Stöckel, B.; König, J.; Nies, A.T.; Cui, Y.; Brom, M.; Keppler, D.: Characterization of the 5'-flanking region of the human multidrug resistance protein 2 (MRP2) gene and its regulation in comparison with the multidrug resistance protein 3 (MRP3) gene. European Journal of Biochemistry 267 (2000) [5] Uemura, M.; Lehmann, W.-D.; *Schneider, W.; *Seitz, H.K.; Benner, A.; *Keppler-Hafkemeyer, A.; *Hafkemeyer, P.; *Kojima, H.; *Fujimoto, M.; *Tsujii, T.; *Fukui, H.; Keppler, D.: Enhanced urinary excretion of cysteinyl leukotrienes in patients with acute alcohol intoxication. Gastroenterology 118 (2000)

34 86 Forschungsschwerpunkt B [6] *Timár, J.; *Rásó, E.; *Döme, B.; *Li, L.; *Grignon, D.; *Nie, D.; *Honn, K.V.; Hagmann, W.: Expression, subcellular localization and putative function of platelet-type 12-lipoxygenase in human prostate cancer cell lines of different metastatic potential. International Journal of Cancer 87 (2000) [7] König, J.; Cui, Y.; Nies, A.T.; Keppler, D.: Localization and genomic organization of a new hepatocellular organic anion transporting polypeptide. Journal of Biological Chemistry 275 (2000) [8] Jedlitschky, G.; *Burchell, B.; Keppler, D.: The multidrug resistance protein 5 functions as an ATP-dependent export pump for cyclic nucleotides. Journal of Biological Chemistry 275 (2000) [9] Keitel, V.; Kartenbeck, J.; Nies, A.T.; Spring, H.; Brom, M.; Keppler, D.: Impaired protein maturation of the conjugate export pump multidrug resistance protein 2 as a consequence of a deletion mutation in Dubin-Johnson syndrome. Hepatology 32 (2000) [10] Keppler, D.; Kamisako, T.; Leier, I.; Cui, Y.; Nies, A.T.; Tsujii, H.; König, J.: Localization, substrate specificity, and drug resistance conferred by conjugate export pumps of the MRP family. Advances in Enzyme Regulation 40 (2000) [11] Keppler, D.; König, J.: Hepatic secretion of conjugated drugs and endogenous substances. Seminars in Liver Disease 20 (2000) [12] Cui, Y.; König, J.; Leier, I.; Buchholz, U.; Keppler, D.: Hepatic uptake of bilirubin and its conjugates by the human organic anion transporter SLC21A6. Journal of Biological Chemistry 276 (2001) [13] *Hirrlinger, J.; König, J.; Keppler, D.; *Lindenau, J.; *Schulz, J.B.; *Dringen, R.: The multidrug resistance protein MRP1 mediates release of glutathione disulfide from rat astrocytes during oxidative stress. Journal of Neurochemistry 76 (2001) [14] Kamisako, T; Leier, I.: Characterization of ATP-dependent monoglucuronosyl bilirubin transport across rat canalicular membrane vesicles. Hepatology Research 19 (2001) [15] *Cuff, R.L.; *Wade, L.T.; *Rychlik, B.; Jedlitschky, G.A.; *Burchell, B.: Characterization of glucuronidation and transport in V79 cells co-expressing UGT1A1 and MRP1. Toxicology Letters 120 (2001) [16] *Beuers, U.; * Bilzer, M.; *Chittattu, A.; *Kullak-Ublick, G.A.; Keppler, D.; *Paumgartner, G.; *Dombrowski, F.: Tauroursodeoxycholic acid inserts the apical conjugate export pump, Mrp2, into canalicular membranes and stimulates organic anion secretion by protein kinase C-dependent mechanisms in cholestatic rat liver. Hepatology 33 (2001) [17] Donner, M.G; Keppler, D.: Up-regulation of basolateral multidrug resistance protein 3 (Mrp3) in cholestatic rat liver. Hepatology 34 (2001) [18] Nies, A.T.; König, J.; Pfannschmidt, M.; Klar, E.; *Hofmann, W.J.; Keppler, D.: Expression of the multidrug resistance proteins MRP2 and MRP3 in human hepatocellular carcinoma. International Journal of Cancer 94 (2001) [19] Cui, Y.; König, J.; Keppler, D.: Vectorial transport by doubletransfected cells expressing the human uptake transporter SLC21A8 and the apical export pump ABCC2. Molecular Pharmacology 60 (2001) [20] Rost, D.; König, J.; *Weiss, G.; *Klar, E.; *Stremmel, W.; Keppler, D.: Expression and localization of the multidrug resistance proteins MRP2 and MRP3 in human gallbladder epithelia. Gastroenterology 121 (2001) [21] Keppler, D.; König, J.; Nies, A.T.: Conjugate export pumps of the multidrug resistance protein (MRP) family in liver. In: The Liver: Biology and Pathobiology. Eds: I. M. Arias et al. New York: Lippincott Williams & Wilkins (2001) Abteilung B0700 Tumorbiochemie [22] König, J.; Cui, Y.; Nies, A.T.; Keppler, D.: New organic aniontransporting polypeptides in the human hepatocyte basolateral membrane. In: Biology of Bile Acids in Health and Disease. Eds.: G.P. van Berge Henegouwen et al. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. (2001) [23] *Beuers, U.; *Bilzer, M.; *Chittattu, A.; *Kullak-Ublick, G.A.; Keppler, D.; *Paumgartner, G.; *Dombrowski, F.: Effects of tauroursodeoxycholic acid on protein kinase C isoforms and on canalicular Mrp2 in experimental cholestasis. In: Biology of Bile Acids in Health and Disease. Eds.: G. P. van Berge Henegouwen et al. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. (2001) [24] Keppler, D.; Cui, Y.; Keitel, V.; Nies, A.T.; König, J.: Canalicular conjugate export and the hepatobiliary elimination of bilirubin. In: Hepatobiliary Transport: From Bench to Bedside. Eds.: S. Matern, J. Boyer, D. Keppler, P.J. Meier-Abt. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. (2001) [25] *Burchell, B.; *Ethell, B.; *Coffey, M.J.; *Findlay, K.; Jedlitschky, G.; *Soars, M.; *Smith, M.; *Hume, R.: Interindividual variation of UDP-glucuronosyltransferases and drug glucuronidation. In: Interindividual Variability in Human Drug Metabolism. Eds.: G.M. Pacifici, O. Pelkonen. London: Taylor & Francis (2001) [26] Hagmann, W; Schubert, J; König, J; Keppler, D.: Reconstitution of transport-active multidrug resistance protein 2 (MRP2;ABCC2) in proteoliposomes. Biological Chemistry, Juni Schlagworte (alphabetisch) Aufnahmetransporter cgmp Dubin-Johnson-Syndrom Membrantransport MRP1 MRP2 MRP3 MRP5 Multidrug Resistance-Proteine OATP2 OATP8 Promotor-Regulation Transportproteine vektorieller Transport zyklische Nukleotide Zytostatika-Resistenz

35 Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle Abteilung Signaltransduktion und Wachstumskontrolle (B0800) Leiter: Peter Angel, Ph.D. Wissenschaftliche Mitarbeiter: Dr. Marina Schorpp-Kistner Dr. Hartmut Richter Dr. Bettina Hartenstein (07/99 -) * Dr. Jochen Hess (01/00 -) Dr. Niamh Keon (- 07/00) * Dr. Ute Breitenbach (- 03/01) Dr. Sabine Gack (03/01 -) Doktoranden Christine Munz *(- 08/00) Sven Andrecht * (- 11/01) Axel Szabowski Dirk Schmidt * (- 01) Hanna Bierbaum* Nicola Viebig (04-10/00) Bernd Dittrich (11/00 -)* Regina Müller (11/01 -) Lore Florin (12/01 -) Medizin Studenten Christoffer Gebhardt (- 06/00) Christian Krause (08-12/00) Diplomanden: Jens Eberlein (- 04/00) Technische Angestellte Sibylle Teurich Susanne Adams (- 09/00) Melanie Sator-Schmitt Auszubildende Tanja Raubinger (09/00 -) Daniel Sandmaier (- 08/00) Sven Rüffer (10/00 -) Nicole Echner (10/01 -) Steffen Baumert (10/01 -) Zentral Sabrina Zahner, Sekretärin (halbtags) *) Drittmittel Die Funktion und Regulation von Transkriptionsfaktoren und deren Zielgene in der Regulation von physiologischen und pathologischen Prozessen In der Abteilung Signaltransduktion und Wachstumskontrolle werden die Reaktionen von Organismen und ihren Zellen auf Umwelteinflüsse (Strahlung, chemische Karzinogene) untersucht und mit den Reaktionen auf körpereigene Substanzen verglichen. Ziel dieser Arbeiten ist es, verstehen zu lernen, über welche Mechanismen die Zellen auf diese äußeren Signale mit Veränderungen in der Expression spezifischer Gene reagieren, und welche Funktion die dabei involvierten Genprodukte spielen. Dies beinhaltet auch das Verständnis der molekularen Ereignisse auf der Ebene der Genregulation, die eine normale Zelle in eine Krebszelle umwandelt. Die Arbeiten der Abteilung konzentrieren sich in erster Linie auf die Funktion und Regulation des Transkriptionsfaktors AP-1 und der Identifizierung AP-1-regulierter Zielgene. AP-1 ist der Sammelbegriff für verschiedene homound heterodimere Proteinkomplexe, deren Untereinheiten sich aus den Mitgliedern der Fos, Jun und CREB/ATF Proteinfamilien zusammensetzten. Da sich zum einen die Sequenzspezifität der verschiedenen Dimere leicht unterscheidet, und zum anderen die Transkription der fos und jun Gene als auch die Transaktivierungsfunktion der davon abgeleiteten Proteine Unterschiede aufweist, geht man heute davon aus, daß die verschiedenen Dimer-Kombinationen spezifische Funktionen bei komplexen biologischen Prozessen wie Zellproliferation, Transformation, Differenzierung, Angiogenese, Immunantwort, Apoptose und Protektion gegenüber DNA-schädigenden Substanzen spielen [1,2]. Schwerpunkte der Arbeiten der Abteilung sind das Verständnis der: a) Mechanismen der Aktivitätskontrolle von AP-1 in Abhängigkeit von extrazellulären Signalen b) Aufklärung der Funktion der verschiedenen Jun und Fos Proteine bei physiologischen und pathologischen Prozessen c) Isolierung, Regulation und Funktionsanalyse von AP-1- abhängigen Zielgene d) Klonierung und Charakterisierung neuer Tumor-assoziierter Gene Für die beschriebenen Fragestellungen kommen sowohl in vivo Mausmodelle als auch in vitro Zellkultursysteme zum Einsatz, um die spezifischen Funktionen dieser zellulären Regulatoren der Genexpression und deren Zielgene im Gesamtorganismus bei komplexen Prozesse zu definieren und um informative Modelle für menschliche Krankheiten zu entwickeln. 87

36 88 Forschungsschwerpunkt B Zell-autonome Funktionen von c-jun bei der Regulation von Zellproliferation und Antwort auf genotoxische Substanzen A. Kolbus, A. Szabowski, P.Angel In Kollaboration mit Ingrid Herr, Klaus-Michael Debatin, Sven Baumann, Sören Eichhorst, Sabine Kirchhoff, Peter Krammer, DKFZ Heidelberg; Martin Schreiber und Erwin F. Wagner, Institut für Molekulare Pathologie Wien, Österreich; Stefan Scherer, Manfred Schartl, Universität Würzburg; Michael Karin, UC San Diego, La Jolla, USA Die Synthese der Fos und Jun Proteine wird nach Behandlung von Zellen mit DNA-schädigenden Substanzen (Strahlung, chemische Karzinogene, z.b. alkylierende Agenzien) stark erhöht [1,2]. Dies läßt darauf schließen, daß diese Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle bei der zellulären Antwort auf solche Streßfaktoren spielen könnten. Durch Untersuchungen mit Fibroblasten, die aus c-jun oder c-fos Knockout-Mäusen etabliert wurden, konnte diese Annahme experimentell bestätigt werden. Während c-fos-defiziente Zellen eine Hypersensitivität gegenüber UV Strahlung und chemischen Mutagenen (z.b. Alkylantien) aufweisen, verlieren c-jun-defiziente Zellen die Fähigkeit, nach Behandlung mit UV Strahlung oder chemischen Mutagenen in Apoptose zu gehen [3]. Obwohl c-jun, in Kooperation mit p53, für die UV-induzierte Expression des DNA Reparaturgens MSH2 benötigt wird [4], können die Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutantenzelle nicht durch Unterschiede in der Fähigkeit der Zellen, die entstandenen DNA Schäden zu reparieren, erklärt werden [3]. Vielmehr beruht dies auf dem Verlust der Induktion von Fos/Jun-abhängigen Genen, was am Beispiel der fehlenden transkriptionellen Aktivierung zweier bekannter AP-1 Zielgene, Kollagenase und Stromelysin, exemplarisch sichtbar wurde [3]. Neben diesen bekannten Zielgenen konnten wir das CD95-L Gene als neues c-jun/ap- 1 Zielgen definieren. CD95-L bindet an das Zelloberflächenantigen CD95 und es kommt nachfolgend zur Aktivierung einer Serie von Caspasen, an deren Ende die DNA Fragmentierung und Zelltod steht. Die Induktion der CD95-L Expression und die nachfolgende autokrine oder parakrine Aktivierung des CD95 Signalwegs scheint in den untersuchten Zellen für die Induktion der Apoptose durch UV und chemische Mutagene essentiell zu sein, da neutralisierende CD95-L Antikörper mit diesem Prozess interferieren, und in c-jun-defizienten Zellen durch die Zugabe von rekombinantem CD95-L sehr effizient Apoptose ausgelöst werden kann. Dies bedeutet, daß c-jun eine essentielle Rolle bei der Synthese von Apoptose-auslösenden Proteinen (z.b. CD95-L) spielt. Die Komponenten des CD95-spezifischen Signalwegs, der zur Auslösung von Apoptose führt, werden jedoch unabhängig von c-jun exprimiert [3]. Neben der Stress -induzierten Apoptose in Fibroblasten spielt AP-1-abhängige Induktion von CD95-L auch bei der (durch Chemotherapeutika) induzierten Apoptose in Hepatokarzinomzellen [5] und in aktivierten T- Zellen [6] eine wichtige Rolle. Mit Hilfe der c-jun-defizienten Fibroblasten konnten wir auch die Funktion von c-jun bei der Regulation der Zellproliferation aufklären. Es zeigt sich, daß der Verlust von Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle c-jun zu einer erhöhten Rate von p53 und p21 führt, wodurch die Aktivität von Cyclin-assoziierten Protein Kinasen gehemmt wird und die Zellen nur sehr ineffizient durch die G1/S Phase des Zellzyklus gehen. Alle diese Effekte werden durch zusätzliche Deletion des p53 Gens revertiert. Dies bedeutet, daß die Hauptfunktion von c-jun bei der Regulation der Proliferation in der Repression der p53 Expression liegt [7]. Die Repression der p53 Expression wird dabei über eine AP-1-ähnliche Erkennungssequenz im p53 Promotor vermittelt, an die c-jun mit einem bisher noch nicht genau definierten Partner bindet und als Inhibitor agiert [7,8]. Funktion von JunB in vivo und in vitro S. Andrecht, D. Schmidt, B. Hartenstein, N. Keon, S. Gack, H. Bierbaum, M. Sator-Schmitt, T. Raubinger,S. Adams, P.Angel, M. Schorpp-Kistner In Kollaboration mit Zhao-Qi Wang, Emanuelle Passegue und Erwin F. Wagner, Institut für Molekulare Pathologie Wien, Österreich Die Ergebnisse unserer bisherigen Arbeiten ergaben deutliche Hinweise darauf, daß die verschiedenen Mitglieder der Jun Proteinfamilie (c-jun, JunB, JunD) spezifische, zum Teil nicht-überlappende Funktionen in AP-1-abhängigen Prozessen spielen. Diese Annahme wurde durch den spezifischen Phänotyp der JunB knockout Mäuse unterstrichen, der sich deutlich von denjenigen unterscheidet, die durch den Verlust anderer AP-1 Untereinheiten (z.b. c-jun, JunD, Fos Proteine) hervorgerufen werden [2]. Tiere mit einem heterozygoten JunB Genotyp (junb +/- ), bei denen in allen Zellen noch eine intakte Kopie des junb Gens vorhanden ist, zeigten beim Vergleich mit Wildtyp Mäusen keine offensichtlichen phänotypischen Unterschiede. Die genotypische Analyse der Nachkommen aus der Rückkreuzung von junb+/- Tieren ergab, daß keine lebensfähigen junb -/- Tiere auftraten. Dies bedeutet, daß das Fehlen des JunB Proteins einen letalen Phänotyp der Embryogenese verursacht [9]. Die junb -/- Embryonen entwickeln sich normal bis zum Tag 7.5 der Embryogenese und sterben dann innerhalb von zwei Tagen. Die histologischen und biochemischen Analysen ergaben, daß es zu Fehlentwicklungen bei der Blutgefäßbildung der extraembryonalen Gewebe (Dottersack, Plazenta) kommt, und dadurch der notwendige Transport von Nährstoffe von der Mutter zum Embryo nicht im ausreichenden Umfang stattfindet. Um die kritischen Zielgene zu identifizieren, deren Expression von JunB reguliert wird, und deren Genprodukte eine entscheidende Funktion bei der Entwicklung von extraembryonalen Geweben spielen, haben wir vor allem ein in vitro Differenzierungssystem mit JunB-defizienten embryonale Stammzellen (ES) einsetzten, das die in vivo Defekte bei der Ausbildung von Blutgefäßen widerspiegelt. Mit Hilfe dieser in vitro generierten sog. embryoid bodies, konnten wir VEGF (ein Hauptregulator der Vaskulogenese und Angiogenese) als JunB-abhängiges Zielgen identifizieren, wobei die exogene Zugabe von VEGF die beobachteten Defekte zum großen Teil kompensieren kann [10]. Vorläufige Daten lassen darauf schließen, daß JunB direkt an den VEGF Promotor bindet, und zusammen mit dem Transkrip-

37 Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle Abb. 1: AP-1 abhängige Regulation der Keratinozytenproliferation und Differenzierung. Links: Histologische und Immunfluoreszenzfärbung von in vitro Hautmodellen mit genetisch veränderten Fibroblasten. Rechts: Schematische Darstellung der c-jun- und JunBabhängigen Regulation der doppelt parakrine Interaktion zwischen Fibroblasten und Keratinozyten. Details siehe [14]. tionsfaktor HIF1= die VEGF Expression positiv reguliert [10]. MEF wt MEF c-jun-/- MEF junb-/- HE Durch Einkreuzen einer junb transgenen Mauslinie kann der embryonal letale Phänotyp wieder revertiert werden, was die Spezifität des Phänotyps aufzeigt. Diese sog. rescue Linie weist ein weitgehend ubiquitäres Muster der junb Transgen Expression auf. In Zellen der myeloiden Subklasse von Immunzellen sind in diesen Tieren jedoch nur geringe Menge an JunB Transgen nachweisbar. Dieser Verlust an JunB ist mit der Entwicklung eines myeloproliferativen Defekts verbunden, der einer chronischen myeloiden Leukämie (CML) beim Menschen ähnelt [11]. Der pathologische Phänotyp ist durch eine erhöhte Anzahl von Granulozyten Vorläuferzellen und reifen neutrophilen Granulozyten gekennzeichnet. Diese Daten weisen JunB als kritischer Regulator der Differenzierung von Blutzellen aus und sind ein weiterer Beleg für die postulierte Funktion von JunB als Tumorsupressor [11]. Obwohl junb -/- Embryonen in der frühen Phase der Embryonalentwicklung sterben, ist es uns gelungen daraus primäre Fibroblasten zu isolieren und durch spontane Immortalisierung permanente Linien zu generieren [12-14]. Diese Zellen wurden dann, analog zur Analyse von c-jundefizienten Fibroblasten [3,7] für die Aufklärung der Rolle von JunB in der Proliferationskontrolle und Antwort auf Strahlung und Oncoproteine untersucht. JunB greift an zwei Stellen im Zellzyklus regulatorisch ein: zum einen führt das Fehlen von JunB zu einem beschleunigten Übergang der Zellen von der G1 in die S-Phase. Dies beruht sehr wahrscheinlich auf einer reduzierten Expression des CDK Inhibitors p16 ink und einer spontan erhöhten Expression von c-jun. Im weiteren Verlauf der Zellzyklusprogression kommt es in junb-defizienten Zellen zu einem verzögerten Übergang von S nach G2/M was mit einer verringerten Expression und Kinaseaktivität von Cyclin A assoziiert ist. Alle Defekte können durch Einbringen eines JunB- ER Expressionsvektors Hormon-abhängig revertiert werden [12,13]. Durch den Nachweis i) der Bindung von JunB in vitro an eine CRE Sequenz im Cyclin A Promotor, ii) der CRE-abhängigen transkriptionellen Aktivierung des Zyklin A Promotors durch Überexpression von JunB (zusammen mit ATF2) und iii) der verringerten AP-1 Bindungsaktivität Loricrin KGF GM-CSF Keratinozyt Proliferation & Differenzierung gm-csf kgf Fibroblast c-jun JunB il-1 IL-1 an das CRE Element in JunB-defizienten Zellen konnten wir erstmals Cyclin A als direktes und positiv reguliertes JunB Zielgen identifizieren [12,13]. Trans-regulatorische Funktion der Jun Proteine in Zellproliferation und Differenzierung A. Szabowski, S. Andrecht, A. Kolbus, M. Schorpp-Kistner,P.Angel In Kollaboration mit Nicole Maas-Szabowski und Norbert Fusenig, DKFZ Neben der Aufklärung der Zell-autonomen Funktion der Jun Proteine in der Zellzykluskontrolle und bei positiven oder negativen Interaktionen mit anderen Transkriptionsfaktoren (z.b. Smad Proteine, 15; Glucocorticoid Rezeptor, 16] konnten wir durch Verwendung der junb -/- Fibroblasten erstmals den Einfluß von c-jun und JunB bei der Regulation der Proliferation und Differenzierung in trans identifizieren [8,14,17,18]. Dabei haben wir uns im besonderen mit dem Zytokin-abhängigen regulatorischen Wechselspiel zwischen dem dermalen und epidermalen Kompartiment der Haut beschäftigt. Unter Verwendung eines Co-Kultursystems mit primären menschlichen Keratinozyten und murinen Fibroblasten und eines 3-dimensionalen organotypischen in vitro Hautmodells haben wir die Fibroblastenabhängige Proliferation und Differenzierung von primären Keratinozyten untersucht. Durch Verwendung der genetisch veränderten c-jun -/- und junb -/- Fibroblasten wird die Proliferation und Differenzierung der Keratinozyten massiv verändert. Dies beruht darauf, daß c-jun und JunB gegenläufig die Expression von KGF und GM-CSF regulieren (s. Abb. 1). Im Gegensatz zu GM-CSF und KGF war die Zugabe anderer Zytokine (EGF, bfgf) nicht ausreichend, den Phänotyp der verringerten Epithelbildung in Gegenwart von c-jun-defizienten Fibroblasten zu kompensieren [17]. Andererseits sind Zytokine, die c-jun-unabhängig exprimiert werden, ebenfalls in diesem Regelkreis involviert [8,14,17]. Den direkten Nachweis der kausalen Rolle dieser AP-1-abhängigen Zytokine konnten wir durch Ver- 89

38 90 Forschungsschwerpunkt B wendung von neutralisierenden GM-CSF Antikörper erbringen, die die Epithelbildung in Gegenwart von Wildtyp Fibroblasten drastisch reduzierte und den pathologischen Phänotyp der junb -/- Co-Kulturen fast völlig aufhob. In Übereinstimmung mit früheren Vermutungen führt die Verwendung von neutralisierenden Antikörper gegen Il-1 ebenfalls zu einer partiellen Reversion des Phänotyps der junb -/- Fibroblasten organotypischen Kultur und Kulturen, die auf Wildtyp Fibroblasten basieren, zeigen nur noch eine geringe Epithelbildung [8,14,17]. Diese Daten unterstreichen noch einmal das Modell des doppelt-parakrinen Wirkmechanismus z.b. bei der Wundheilung, wo durch Synthese und Ausschüttung von Il-1 durch Keratinozyten die Produktion von Zytokinen in Fibroblasten (darunter KGF und GM-CSF) gesteuert wird, die dann parakrin wieder auf Keratinozyten wirken und Proliferation und Differenzierung regulieren. Wir glauben, daß die weiteren Analysen der Jun-defizienten Fibroblasten (und hier vor allem die junb -/- Fibroblasten) in diesem in vitro Hautmodell neben dem Verständnis der physiologischen Prozesse der Haut (Differenzierung, Wundheilung) auch die Etablierung molekularbiologischer Werkzeuge zur Analyse von pathologischen Veränderungen der Haut (Psoriasis, chronische Entzündungen, verzögerte Wundheilung; Tumorerkrankungen) bringen wird. Regulation und Funktion des AP-1-abhängigen Zielgens Kollagenase: ein Modell zur Analyse regulatorischer Mechanismen der Protein/Protein Wechselwirkung zwischen AP-1, Cbfa1 und dem Glucocorticoid Rezeptor Arbeiten aus unserem Labor und zahlreicher anderer Labors haben Metalloproteinasen (vor allem die interstitielle Kollagenase, Kollagenase-3) als Modellsystem für AP-1- abhängige Genexpression in Zellkultur und im Tier etabliert [18-22]. Das Gen der interstitiellen Kollagenase-3 (MMP-13) kodiert für eine Proteinase, die im Zusammenspiel mit anderen Mitglieder der Matrix Metalloproteinase (MMP) Familie und in Abhängigkeit von der Expression von Inhibitoren von MMPs (TIMPs; [23,24] und darin angegebene Referenzen) eine essentielle Rolle bei physiologischen Prozessen (Gewebeumbau bei der Embryogenese, Organogenese) und beim pathologischen Gewebeumbau (chronische Entzündung, Tumor Progression) zugeschrieben wird. Positive Interferenz zwischen AP-1 und Cbfa1 J. Hess, J. Tuckermann, M. Becker, C. Munz, S. Teurich, P.Angel iin Kollaboration mit Michael Owen, ICRF, London, UK; J. Labrador und Rüdiger Klein, EMBL Heidelberg; Karen Pittois und J. Merregaert, Universität Antwerpen, Belgien; Jörg Schmidt, Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit Neuherberg, Oberschleißheim; Agamemnon Grigoriadis Guy s Hospital, London UK; Gillian Murphy and Rosalind Hembry, Strangeways Research Laboratory, Cambridge, UK. Durch den Nachweis der zelltyp-spezifischen Expression von Kollagenase-3 in osteoblastoiden Zellen während der Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle Embryonalentwicklung der Maus und in adulten Mäusen [19,21,22] konnten wir starke Evidenzen für eine Funktion dieses Proteins bei der Knochenentwicklung und Metabolismus erhalten. In transgenen Mäusen, die das c-fos Gen überexprimieren, korreliert die Lokalisation der verstärkten Kollagenase Expression mit den pathologischen Veränderungen, vor allem der Ausbildung von Knochentumoren (Osteosarkome), die als Konsequenz einer lang anhaltenden Fos Expression auftreten [24]. Da Kollagenase-3 spontan fast ausschließlich im Knochen [21,22,24], die Jun und Fos Proteine jedoch noch in vielen anderen Geweben exprimiert werden, stellt sich die Frage nach dem Mechanismus der Zelltyp-Spezifität. Diese könnte durch Osteoblasten-spezifische Aktivatoren vermittelt werden, die mit AP-1 funktionell kooperieren. Durch Untersuchungen der Aktivierung des Kollagenase Promotors durch Parathormon (PTH, einer der wichtigsten Regulatoren des Knochenmetabolismus) konnten wir zwei ciswirkende Elemente definieren, die zusammen mit AP-1 für die Induktion notwendig sind [19,26]. Diese Elemente dienen als Erkennungssequenz für den Transkriptionsfaktor Cbfa-1. Dieser Faktor wurde kürzlich als essentielle Komponente der Osteoblasten-Differenzierung und der endochondralen Ossifikation beschrieben. Unsere Arbeiten zeigten, dass AP-1 und Cbfa1 direkt miteinander in Wechselwirkung treten, und dass dies über den Leucine zipper (Fos, Jun Proteine) bzw. die Runt -Domäne (Cbfa1) vermittelt wird [26]. Diese Daten weisen darauf hin, daß neben seiner Funktion bei der Differenzierung von Osteoblasten Cbfa1 im Zusammenspiel mit AP-1 auch eine wichtige Rolle beim Knochenmetabolismus zu spielen scheint. Negative Interferenz zwischen AP-1 und dem Glucocorticoid Rezeptor J. Tuckermann, J. Eberlein, H. Richter In Kollaboration mit Holger Reichardt, Günther Schütz, G. Fürstenberger, DKFZ; Martin Göttlicher, Falk Weih, Peter Herrlich, Institut für Genetik, Forschungszentrum Karlsruhe Neben der positiven Regulation von AP-1 durch übergeordnete Proteinkinasen (JNKs) und der Wechselwirkung mit anderen zellulären Proteinen (Smads, Cbfa1; siehe oben) erfährt aber auch die negative Regulation von AP-1 durch Protein/Protein Interaktionen eine zunehmende Beachtung. Bei letzterem gilt unser Interesse vor allem der physiologischen Relevanz der negativen Regulation von AP-1 Aktivität durch aktivierte Glucocorticoid Rezeptoren (GR) im Gesamtorganismus. Anhand einer knock-in Maus, die einen mutierten GR exprimiert (GR dim, im Labor von Günther Schütz generiert), konnten wir nachweisen, daß für die Repression von AP-1-abhängiger Kollagenase Expression in primären embryonalen Mausfibroblasten nur die reprimierende, jedoch nicht die aktivierende Funktion des GR (mittels DNA Bindung an Glucocorticoid-responsive-elements, GREs) notwendig ist [16,21]. Die Signifikanz dieses Regulationsmechanismus im Gesamtorganismus konnten wir durch die Unterdrückung der TPA-induzierte Expression von Kollagenase-3 in der Maushaut durch gleichzeitige Applikation des synthetischen Gluco-

39 corticoids Dexamethason bestätigen. Dabei fanden wir, daß Glucocorticoid Gabe die TPA-vermittelte Induktion von Kollagenase-3 in Wildtyp und GR dim Mäusen mit gleicher Effizienz unterdrückt [20,21]. Wir haben dieses experimentelle System auch benutzt, um die ersten Gene in Haut zu klonieren, deren Expression durch Glucocorticoide induziert werden. In Übereinstimmung mit den Eigenschaften des mutierten GR in der GR dim Maus wird die Expression beider Gene, Plasmaglutathion Peroxidase-3 (PGX-3) und Heat Shock Protein-27 (HSP-27), nur in der Haut von Wildtyp Mäusen, jedoch nicht GR dim Mäusen durch Dexamethason induziert [20,21]. Durch diese Daten konnte belegt werden, daß die Repression der AP-1 Aktivität durch Glucocorticoide in vivo tatsächlich keine Expression von GRE-gesteuerten Gene benötigt. Parallel zu AP-1 wird die Aktivität des Transkriptionsfaktors NF B in ähnlicher Weise durch den GR negativ reguliert. Da NF B eine wichtige regulatorische Rolle bei der Immunantwort zugeschrieben wird, haben wir TPA-induzierten Entzündungsreaktionen in der Haut untersucht. Es zeigte sich, dass sowohl diese Reaktion, als auch andere Parameter (z.b. Zytokin Expression in T-Zellen und Makrophagen) in Wildtyp und GR dim Mäusen mit gleicher Effizienz durch Glucocorticoide unterdrückt werden [27]. Dies bedeutet, dass Glucocorticoid-vermittelte Immunsuppression vor allem durch die DNA Bindungs-unabhängige Funktion des GR vermittelt wird. Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle von zum Teil völlig unbekannten Genen haben wir als neue Tumor-assoziierte Gene die noch wenig charakterisierte Serin Protease BSSP [28] und Mitglieder der S100 Proteine [29] identifiziert. Zur Zeit wird das Expressionsmuster dieser Gene und der spezifische Transkript-positive Zelltyp in verschiedenen Stadien der chemisch induzierten Hautkarzinogenese (Papillome, Karzinome) bestimmt, um mögliche Anhaltspunkte über die Funktion dieser Proteine im Verlauf der Tumorgenese zu bekommen. In Kollaboration mit Dr. Peter Steinlein, IMP Wien, und Prof. Peter Lichter (DKFZ Heidelberg) haben wir mittlerweile die isolierte cdna Kollektion auf DNA-Chips aufgebracht und damit die Methodik des large-scale gene expression profiling in der Abteilung etabliert. Ziel ist es, zum einen das Expressionsmuster diese cdnas in Tumoren aus anderen Geweben zu untersuchen. Zum anderen wollen wir die Expression der bisher isolierten, neuen Tumor-assoziierten Gene der Maus in menschlichen Tumoren bestimmen, um mögliche neue, spezifische Markergene für diese Tumore zu etablieren. 91 Klonierung neuer tumor-assoziierter Gene in der Maus U. Breitenbach, C. Gebhardt, H. Richter, J. Hess, P.Angel In Kollaboration mit Gerhard Fürstenberger, Gunnar Wrobel, Jörg Schlingemann, Peter Lichter, DKFZ; Peter Steinlein, Institut für Molekulare Pathologie, Wien, Österreich; Zena Werb, University of California, San Francisco, USA Sequentielle Behandlung der Maushaut mit TPA führt zur Ausbildung von Papillomen und nachfolgend zum Auftreten von Karzinomen (Mehrstufenmodell der chemisch-induzierten Hautkarzinogenese). In Zellinien, die sich von den verschiedenen Tumorstadien ableiten, wurde eine Korrelation zwischen basaler Expression von Kollagenase- 3 und zunehmender Malignität der Tumorzellen gefunden. Dies läßt vermuten, daß dieses Enzym auch zur Ausbildung und Ausbreitung von Hauttumoren beitragen könnte. Durch Herstellung von konditionalen ( floxed ) Kollagenase-3 Maus Mutanten, in denen spezifisch die Expression in Keratinozyten ausgeschaltet werden kann, versuchen wir zur Zeit diese Frage zu beantworten. Basierend auf den experimentellen Bedingungen, die zu einer deutlich erhöhten Expression des Kollagenase-3 Gens in TPA-behandelter Maushaut führen, haben wir im Berichtszeitraum die Anwendung der Methode der subtraktiven cdna Klonierung (SSH) zur Isolierung differentiell exprimierter Gene im Labor etabliert. Wir haben die isolierte Kollektion von etwa 3000 TPA-induzierten cdnas auf solche Gene untersucht, die eine konstitutiv hohe Expression in den Hauttumoren aufweisen. In dieser Subgruppe

40 92 Forschungsschwerpunkt B Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Angel, P. (2001) AP-1. In: Encyclopedic Reference of Cancer. M. Schwab (Ed.) pp Springer Verlag, Heidelberg. [2] Schorpp-Kistner, M., *Herrlich, P. and Angel, P. (2002). The AP-1 family of transcription factors: Structure, regulation and functional analysis in mice. N.LeThangue (Ed.) In press [3] Kolbus, A., Herr, I., *Schreiber, M., Debatin, K.M., *Wagner, E.F. and Angel, P. (2000) c-jun-dependent induction of CD95L is critically involved in the induction of apoptosis by alkylating agents. Mol. Cell. Biol.20, [4] *Scherer, S., *Maier, S., *Seidert, M., *Hanselmann, R., *Zang, K.D., *Müller-Hermelink, H.K., Angel, P., *Welter, C. and *Schartl, M. (2000) p53 and j-jun functionally synergize in the regulation of the DNA repair gene hmsh2 in response to UV. J. Biol. Chem. 275, [5] Eichhorst, S., Müller, M., Li-Weber, M., Schulze-Bergkamen, H., Angel, P. and Krammer P. (2000) A novel AP-1 element in the CD95 ligand promotor is required for induction of apoptosis in hepatocellular carcinoma cells upon treatment with anticancer drugs. Mol. Cell Biol. 20, [6] Baumann, S., Eichhorst, S., Hess, J., Krüfer, A., Angel, P., Krammer, P. and Kirchhoff, S. (2002) A novel function for FosB in activation-induced cell death in T cells. Oncogene, submitted for publication. [7] *Schreiber, M., Kolbus, A., *Piu, F., Szabowski, A., *Möhle- Steinlein, U., *Tian, J., *Karin, M., Angel, P. and *Wagner, E. F. (1999) Control of cell cycle progression by c-jun is p53 dependent. Genes Dev., 13, [8] Szabowski, A. (2001) Identifikation einer trans-regulatorischen Funktion von c-jun und JunB bei der Regulation von Zellproliferation und differenzierung. Dissertation, Universität Saarbrücken [9] Schorpp-Kistner, M., *Wang, Z.Q., Angel, P. and *Wagner, E.F. (1999) JunB is Essential for the Formation of the mammalian Placenta. EMBO J.,18, [10] Schmidt, D. (2002) Role of JunB in Hypoxia-mediated Cell Response and Tumour Angiogenesis. Dissertation, Universität Freiburg. [11] *Passegue, E., *Jochum, W., Schorpp-Kistner, M., *Möhle- Steinlein, U. and *Wagner, E.F. (2001) Chronic myeloid leukemia with increased granulocyte progenitors in mice lacking JunB expression in the myeloid lineage. Cell, 104, [12] Andrecht, S. (2001) Identifikation von positiven und negativen Funktionen des Transkriptionsfaktors JunB bei der Zellzyklusregulation. Dissertation, Universität Hannover. [13] Andrecht,S., Kolbus,A., Hartenstein, B., Angel,P. and Schorpp-Kistner,M. (2002). Positive and Negative Functions of JunB in Cell Cycle Progression. J. Biol. Chem., zur Publikation eingereicht [14] Szabowski, A., Maas-Szabowski, N., Andrecht, A., Kolbus, A., Schorpp-Kistner, M., Fusenig, N. und Angel, P. (2000) c-jun and JunB antagonistically control cytokine-regulated mesenchymalepidermal interaction in skin. 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Collagenase-3 (MMP-13) and integral membrane prtoein 2a (Itm2a) are marker genes of chondrogenic/osteoblastic cells in bone fromation: sequential temporal, and spatial expression of Itm2a, alkaline phosphatase, MMP-13, and osteocalcin in the mouse. J. Bone Res. 15, [23] *Vallon, R. and Angel, P. (2000). Expression of human collagenase I (MMP-1) and TIMP-1 in a Baculovirus based expression system. Meth. Mol. Biol. 151, [24] *Dew, G., *Murphy, G., *Stanton, H., *Vallon, R., Angel, P., *Reynolds, J.J. and *Hembry, R.M. (2000) Localisation of matrix metalloproteinases and TIMP-2 in resorbing mouse bone. Cell Tissue Res., 299, [25] Tuckermann, J., *Vallon, R., Gack, S., *Grigoriadis, A.E., Porte, D., *Lutz, A., *Wagner, E.F. *Schmidt, J. and Angel, P. (2001) Expression of collagenase-3 (MMP-13) in c-fos-induced osteosarcomas and chondrosarcomas is restricted to a subset of cells of the osteo/chondrogenic lineage. Differentiation 69, [26] Hess, J., Porte, D., Munz, C. and Angel, P. (2001) AP-1 and Cbfa/Runt physically interact and regulate PTH-dependent MMP13 expression in osteoblasts through a new OSE2/AP-1 composite element. J. Biol. Chem. 276, [27] Reichardt, H., Tuckermann, J., *Göttlicher, M., Vujic, M., *Weih, F., Angel, P., *Herrlich, P. and Schütz, G. (2001) Immunosuppression in the absence of DNA-binding by the glucocorticoid receptor in vivo. EMBO J., 20, [28] Breitenbach, U., Tuckermann, J., Gebhardt, C., Richter, K.H., Fürstenberger, G., Christofori, G. and Angel, P. (2001) Keratinocyte-specific onset expression in experimental of serine protease BSSP carcinogenesis. J. Inv. Dermatol., 117, [29] Gebhardt, C., Breitenbach, U., Tuckermann, J., Richter, K.H. and Angel, P. (2002) Calgranulins S100A8 and S100A9 are negatively regulated by glucocorticoids in a c-fos-dependent manner and overexpressed throughout skin carcinogenesis, Oncogene, in press.

41 B0810 Hormonwirkung und Signaltransduktion AG Hormonwirkung und Signaltransduktion (B0810) Leiterin: PD Dr. rer. nat. Doris Mayer Wissenschaftlicher Mitarbeiter Dr. rer. nat. Bernd Schnarr ( - 09/00) * Doktoranden Barbara De Servi (07/01 - ) * Kathrin Kopplow ( - 12/00) Yongde Liao (10/01 - ) * Senad Medunjanin (01/01 - ) Martina Schmitt (- 2/00) Kathrin Strunz (- 12/00) Diplomanden Alexandra Dreuw (10/00-05/01) Stephanie Geiger (10/01 - ) Gastwissenschaftler Yun Niu (China, 04/00-05/01) Technischer Angestellter Jürgen Ohsam (- 04/01) * Sonderfinanzierung Hormone sind körpereigene Substanzen, die bei einer Vielzahl von Wachstums- und Differenzierungsprozessen eine wichtige Rolle spielen. Synthetisiert in endokrinen Organen erreichen sie ihre Zielorgane auf dem Blutweg. Nach Bindung an spezifische Rezeptoren, die auf der Plasmamembran bzw. im Cytosol oder im Zellkern der Zielzellen lokalisiert sind, wird eine Vielzahl von Signalübertragungsprozessen aktiviert, die u.a. in der Stimulation der Zellproliferation enden. Aufgrund dieser wachstumsfördernden Eigenschaften gelten zahlreiche Hormone als Tumorpromotoren. Dies gilt sowohl für Steroidhormone als auch für Peptidhormone. Die von Steroiden und Peptidhormonen aktivierten Signalkaskaden sind prinzipiell unterschiedlich, Peptidhormone binden an Rezeptoren in der Plasmamembran und setzen dadurch eine Kaskade von Phosphorylierungsreaktionen an Proteinen in Gang. Steroidhormone binden an Rezeptoren, die entweder im Cytoplasma oder im Zellkern lokalisiert sind. Nach Aktivierung und Translokation in den Zellkern werden sie primär als Transkriptionsfaktoren bei der Regulation der Expression von Zielgenen wirksam. Jüngste Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass es vielfältige Interaktionen zwischen Peptidhormon- und Steroidhormon-vermittelten Signalwegen gibt. Die Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit Mechanismen der Tumorentstehung unter dem Einfluß von Peptid- und Steroidhormonen sowie mit deren Wechselwirkung in epithelialen Mamma- und Leberzellen. I. Der Insulin / IGF-I Rezeptor-Signalweg in Brustkrebszellen Expression von IRS-1 und IGF-I Rezeptor in Mamma-Carcinomen D. Mayer, B. Schnarr, K. Strunz, Y. Niu, J. Ohsam, A. Dreuw In Kooperation mit J. Wacker, Universitätsfrauenklinik, Heidelberg; A. Benner, Zentrale Einheit Biostatistik, DKFZ Zusatzfinanzierung: Organtumorsystem Mammacarcinom des DKFZ Der Insulin / IGF-I Rezeptor-Signalweg wird aktiviert durch die beiden Wachstumsfaktoren IGF-I und IGF-II sowie durch das Hormon Insulin. IGF-I und IGF-II können von verschiedenen Gewebekomponenten menschlicher Brusttumoren, dem Stroma (Bindegewebe) und den epithelialen Carcinomzellen synthetisiert werden. Sie können das Wachstum der Krebszellen parakrin oder autokrin stimulieren. Auch wurden hohe Insulin-Blutspiegel (z.b. bei Typ II-Diabetikerinnen) mit einer erhöhten Brustkrebsinzidenz in Verbindung gebracht. Nach Bindung der Liganden an den Insulinrezeptor bzw. den IGF- I Rezeptor werden diese dimerisiert und durch Autophosphorylierung verschiedener Tyrosinreste durch die intrinsische Rezeptor-Tyrosinkinase aktiviert. Beide Rezeptor-Tyrosinkinasen phosphorylieren das Insulinrezeptor-Substrat-1 (IRS-1), eines der wichtigsten Signalproteine der Zelle. Aus Zellkulturexperimenten ist bekannt [1], dass die Expression des IGF-I Rezeptors und des IRS-1 durch das Steroidhormon Estradiol (E2) induziert werden. Estradiol stimuliert außerdem das Wachstum normaler Brustdrüsenepithelzellen sowie von Brustkrebszellen, sofern diese den Estrogenrezeptor exprimieren. Wir haben uns die Frage gestellt, ob es einen Zusammenhang gibt zwischen dem Differenzierungsgrad von Brusttumoren und der Expression des IGF-I Rezeptors, des Insulinrezeptors und IRS-1 sowie des Estrogenrezeptors. An 69 Brustkrebsproben verschiedenen Differenzierungsgrades und 21 normalen Brustdrüsengeweben wurde immunhistochemisch die Expression von Insulinrezeptor, IGF-I Rezeptor, IRS-1 und Estrogenrezeptor sowie die Zellproliferation (% Ki-67 positive Zellen) bestimmt. IGF-I Rezeptor und IRS-1 wurden in hohen Spiegeln in gut und mäßig differenzierten Carcinomen (Grad I und II) und in geringen Mengen in niedrig differenzierten Tumoren (Grad III) nachgewiesen [Abb.1]. Vorläufige durch in situ- Hybridisierung der entsprechenden mrna gewonnene Ergebnisse zeigen, dass die Expression der Proteine transkriptional reguliert wird. Die Expression des Insulinrezeptors zeigte keine eindeutige Korrelation mit dem Grad der Tumordifferenzierung. Genaue statistische Analyse zeigte, daß der Verlust an IGF-I Rezeptor und IRS-1 einen genaueren Marker für die Entdifferenzierung der Carcinome darstellt als die bekannte Reduktion der Estrogenrezeptor- Expression und die Zunahme der Zellproliferation. Die Befunde zeigen eindeutig, daß die Progression von Brustkrebs von einer Reduktion an IGF-I Rezeptor und IRS-1 begleitet wird, und daß die IGF-I Rezeptor / IRS-1 Expres- 93

42 94 Normalgewebe G1 G3 Forschungsschwerpunkt B H&E IRS-1 IGF-IR Abb. 1.: Expression von IRS-1 und IGF-I Rezeptor in Brustgewebe und in Mamma-Carcinomen unterschiedlichen Differenzierungsgrades A-C: normales Brustdrüsenläppchen. D-F: gut differenziertes intraduktales Carcinom (Pfeile) umgeben von Bindegewebe. G-I: niedrig differenziertes duktales Carcinom. A, D, G: Hämatoxilin- Eosin gefärbte Schnitte. Immunhistochemischer Nachweis von IRS-1 (B, E, H) und IGF-IR (C, F, I) in Serienschnitten von A, D und G. Starke Expression von IRS-1 (B) und etwas geringere Expression von IGF-IR (C) in allen epithelialen Zellen des normalen Drüsenläppchens. D-F: Grad-1 Carcinom (Pfeile) zeigt starke Expression von IRS-1 (E) und mäßige bis starke Expression von IGF-IR (F). G-I: Grad-3 Carcinom mit schwacher Expression von IRS-1 (H) und IGF-IR (I). K. Perinukleäre Lokalisation von IRS-1 in Tumorzellen (Pfeile). L und M sind Kontrollen zur Dokumentation der Spezifität der Antikörper. sion negativ mit der hohen Proliferationsrate in niedrig differenzierten Mammacarcinomen korreliert ist [2]. Aus diesem Grund wurde vorgeschlagen, IGF-I Rezeptor und IRS-1 als neue Marker für das (oft schwierige) Grading von Tumoren einzusetzen. II. DHEA- Effekt auf Brustkrebszellen D. Mayer, M. Schmitt, B. Schnarr In Kooperation mit R. Morfin, Laboratoire de Biotechnologie, Conservatoire National des Arts et Métiers, Paris, Frankreich ; K. Klinga, Hormonlabor der Universitätsfrauenklinik, Heidelberg; A. Benner, Biostatistik, DKFZ B0810 Hormonwirkung und Signaltransduktion Das Nebennierenrindenhormon Dehydroepiandrosteron (DHEA) stellt in vivo eine Vorstufe in der Biosynthese von Testosteron und Estradiol in peripheren Organen dar. Epidemiologische Studien haben gezeigt, daß Frauen mit hohem DHEA-Blutspiegel in der Postmenopause ein erhöhtes Brustkrebsrisiko aufweisen. Die Substanz kann in Brustgewebe und Brusttumoren aus dem Blut angereichert werden. Wir haben untersucht, ob DHEA auf Brustkrebszellen proliferationssteigernd wirkt und wenn ja, ob diese Wirkung auf die Konversion zu Estrogenen zurückgeführt werden kann. Wir konnten zeigen, daß estrogenabhängige MCF-7 Brustkrebszellen DHEA in physiologisch relevanten Mengen zu Estradiol umwandeln (~200 pm im Medium nach 4-tägiger Inkubation mit 100 nm DHEA). Außerdem wurden Estron und Testosteron identifiziert [3, 4]. Sowohl Estradiol (1 nm) als auch DHEA (100 nm) wirkten proliferationsstimulierend auf MCF-7 Zellen, letzteres mit einer Verzögerung von 2 ½ Tagen, was für eine Notwendigkeit der Konversion des DHEA zu Estrogen spricht. Estrogenunabhängige Brustkrebszellen (MDA-MB-436) wurden nicht stimuliert. Eine von MCF-7 abgeleitete Zellinie, die mit einem Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle des Estrogen Responsive Elements und des >-Globulinpromotors (EREluc) stabil transfiziert wurde, wurde eingesetzt, um Effekte von DHEA auf die estrogenabhängige Genexpression zu messen. DHEA zeigte eine deutliche Induktion der Luciferase. Sowohl die Stimulation der Zellproliferation und als auch die Induktion der Luciferase-Expression durch DHEA konnte durch die Anti-Estrogene ICI 182,780 und Tamoxifen gehemmt werden, ebenso durch den Aromatase-Hemmer 4-Hydroxyandrostendion, was die Notwendigkeit der Konversion von DHEA zu Estrogen unterstreicht [4]. Ein androgener Effekt von DHEA auf MCF-7 Zellen konnte durch ein negatives Ergebnis nach Doppeltransfektion von MCF-7 Zellen mit dem Androgenrezeptor und einem ARE- Luc Reportergen-Konstrukt ausgeschlossen werden. Aus den Ergebnissen wurde geschlossen, daß DHEA auf Brustkrebszellen mitogen wirkt, daß es in erheblichen Mengen zu Estrogenen, insbesondere Estradiol konvertiert wird, und daß die Konversion eine Voraussetzung für den proliferationssteigernden Effekt von DHEA darstellt. III. DHEA-Effekt auf Leberzellen D. Mayer, K. Kopplow In Kooperation mit: G. Hobe, Hans-Knöll-Institut, Jena; J. Swierczynski, Dept. Biochemistry, Medical University Gdansk, Polen; P. Bannasch, Cytopathologie, DKFZ; A. Benner, Biostatistik, DKFZ; K. Forstner, FIMT Asperg. Die Untersuchungen zur carcinogenen und tumorpromovierenden Wirkung von DHEA auf die Rattenleber wurden fortgesetzt [5-10]. Dabei stand der Befund im Vordergrund, daß DHEA tumorpromovierend wirkt, obwohl es insgesamt die Proliferation präneoplastischer Läsionen hemmt. Die Identifizierung der Tumorvorstufe, die möglicherweise durch DHEA spezifisch promoviert wird, ist Gegenstand aktueller Untersuchungen. Weiterhin wurde der biochemische und molekulare Mechanismus der proliferationshemmenden Wirkung von DHEA weiteruntersucht. Vorläufige Ergebnisse dokumentieren einen Einfluß von DHEA auf die Cytokin- und Wachstumsfaktor-Produktion in der Rattenleber [11].

43 B0810 Hormonwirkung und Signaltransduktion Publikationen (* = externer Koautor) [1] Dreuw, A.: Wirkung von IGF-I und Estradiol auf die Tyrosin- Phosphorylierung des Insulin-like Growth Factor-I Rezeptors und auf die estragonabhängige Genexpression in Mammakarzinomzellen. Diplomarbeit, Biologische Fakultät, Universität Heidelberg (2001) [2] Schnarr, B., Strunz, K., Ohsam, J., Benner, A., *Wacker, J., Mayer, D.: Downregulation of insulin-like growth factor-1 receptor and insulin receptor substrate-1 in advanced human breast cancer. Int. J. Cancer (Pred. Oncol.) 89, (2000) [3] Schmitt, M., *Klinga, K., Mayer, D.: Dehydroepiandrosterone (DHEA) stimulates proliferation of of MCF-7 cells after being metabolized to estrogens. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 41, 139 (2000) [4] Schmitt, M., *Klinga, K., Schnarr, B., *Morfin, R., Mayer, D.: Dehydroepiandrosterone stimulates proliferation and gene expression in MCF-7 cells after conversion to estradiol. Mol. Cell. Endocrinol. 173, 1-13 (2001) [5] Bannasch, P., Metzger, C., Mayer, D.: Hepatocarcinogenesis by dehydroepiandrosterone. I. Sequential cellular changes during neoplastic develoment. In: Dehydroepiandrosterone (DHEA). Biochemical, physiological and clinical aspects (W. Regelson, M. Kalimi, eds.) Walter de Gruyter, Berlin, (2000) [6] *Hobe, G., *Hillesheim, H.-G., *Schön, R., *Undisz, K., *Valentin, U., *Reddersen, G., *Ritter, P., Bannasch, P., Mayer, D.: Studies on the metabolism of DHEA in rats and mice. In: Dehydroepiandrosterone (DHEA). Biochemical, physiological and clinical aspects (W. Regelson, M. Kalimi, eds.) Walter de Gruyter, Berlin, (2000) [7] Mayer, D., Metzger, C., Bannasch, P.: Hepatocarcinogenesis by dehydroepiandrosterone. II. Biochemical and molecular changes during neoplastic development. In: Dehydroepiandrosterone (DHEA). Biochemical, physiological and clinical aspects (W. Regelson, M. Kalimi, eds.) Walter de Gruyter, Berlin, (2000) [8] Mayer, D., Metzger, C., Nehrbass, D., Bannasch, P.: Characteristics of dehydroepiandrosterone-induced hepatocarcinogenesis in the rat. In: Hormonal Carcinogenesis III (Eds. Li, J.J., J.R. Daling, S.A. Li) Springer-Verlag, New York, pp (2000) [9] *Swierczynski, J., *Slominska, E., *Smolenski, R.T., Mayer, D. : Increase in NAD but not ATP and GTP concentrations in rat liver by dehydroepiandrosterone feeding. Pol. J. Pharmacol. 53, (2001) [10] Mayer, D.: Hormonal and carcinogenic effects of dehydroepiandrosterone on liver. In: Surgical Pathology, Update 2001, 18 th European Congress of Pathology (Eds. S. Hauptmann, M. Dietel, M. Sobrinho-Simões), ABW Wissenschaftsverlag Berlin, pp (2001) [11] Kopplow, K. Untersuchung des Einflusses von Dehydroepiandrosteron auf die Proliferationsaktivität von Hepatozyten und die Expression von Zellzyklusparametern in der Rattenleber. Dissertation, Naturwissenschaftlich-Mathematische Gesamtfakultät, Universität Heidelberg (2002) 95

44 Abteilung B0900 Genetik der Hautcarcinogenese Abteilung: Genetik der Hautcarcinogenese (B0900) Leiterin: Priv.-Doz. Dr. Petra Boukamp 96 Wissenschaftler: Dr. Susanne Popp Dr. Sabine Rosenberger (05/00 - ) Dr. Vera Vormwald Dogan (05-12/00) Dr. Reynel Figueroa ( - 07/00) Dr. Karin Greulich-Bode (10/00 - ) Dr. Sascha Beneke (09/01 - ) Doktoranden: Ana Cerezo Heike Lindenmaier ( - 04/01) Sharareh Moshir (07/01/ - ) Sibylle Ermler (08/01 - ) Techniker: Alena Jirschik (05/01-) Hermann Stammer (10/01 - ) Hautcarcinome (Basalzell- [BCC] und Plattenepithelcarcinome [SCC]) sind nicht nur bereits heute die häufigsten Tumortypen, die Zahl steigt auch ständig und dies speziell in immunsupprimierten Patienten. Darüber hinaus kehrt sich das Verhältnis von nahezu nie metastasierenden Basalzell Carcinomenen zu den malignen Plattenepithel Carcinomen um, so dass auch die Mortalitätsrate steigt. Obwohl schon seit langer Zeit bekannt ist, dass übermäßige Sonnenbestrahlung (Sonnenbrände) bei der Entstehung von Hautcarcinomen eine wesentliche Rolle spielt, ist noch wenig über die molekularen Mechanismen bekannt. Das Ziel unserer Studien ist es deshalb, die Rolle von Risikofaktoren (UV-A, erhöhte Temperatur) besser verstehen zu lernen, neue genetische Aberrationen zu identifizieren und deren Funktion aufzuklären. Dies soll einerseits dazu beitragen, die Differentialdiagnose unterschiedlicher Hauttumortypen zu verbessern und andererseits sollen dadurch die molekularbiologischen Grundlagen für neue Behandlungsmöglichkeiten geschaffen werden. Mit Hilfe experimenteller Modellsysteme werden in der Abteilung 2 Hauptthemen bearbeitet: 1) Molekularund funktionelle genetische Studien, um relevante Onkogene und Tumorsuppressorgene zu identifizieren und deren Funktion in der Entstehung bzw. Progression von Hautcarcinomen aufzuzeigen. 2) Eine spezifische Aberration, die für nahezu alle Tumore gilt, ist die erhöhte Expression der Telomerase. Ziel unserer Studien ist es, die Rolle und Regulation der Telomerase und ihre Rolle in der Telomerlängenregulation bei der Hautcarcinomentstehung und in der Hautalterung zu definieren. 1. Genetische Mechanismen der Hautcarcinogenese P. Boukamp, S. Popp, B. Jelinek, A. Jirschik In Kooperation mit: Prof. W. Hartschuh, Dermatologie Heidelberg; Prof. Irenen Leigh, Dermatologie London, UK; Prof. Ingrid Moll, Dermatologie Hamburg; Dr. A. Bürkle, DKFZ Heidelberg (jetzt Newcastle upon Tyne, UK); Dr. A. Jauch, Humangenetik Heidelberg; Dr. Frank de Gruijl (Utrecht, Niederlande); Prof. Karin Scharffetter-Kochanek Dermatologie Köln, Wesentliche Erkenntnisse der letzten zwei Jahre waren: 1. Zugewinn von 11q13 wird durch erhöhte Temperatur sowie UV-A Strahlung induziert und ist ein wichtiges genetisches Ereignis in Hautcarcinomen 2. Die genetische Analyse über CHG und M-FISH erlaubt die Aufstellung eines genetischen Stammbaums und damit die direkte Ableitung von Metastasen. Erhöhte Temperatur und UV-A als potentielle Carcinogene für die Entstehung von Hautcarcinomen Um die Rolle der Umweltfaktoren bei der Entstehung von Hautcarcinomen experimentell untersuchen zu können, verwenden wir das von uns etablierte HaCaT in vitro Hautcarcinogenese Modell. Diese Modell repräsentiert unterschiedliche Stadien (Fusenig, N.E. Boukamp, P. Molecular Carcinogenesis, 23: (1998)) und erlaubt es somit, gezielt Fragen zur tumorigenen Transformation oder auch malignen Konversion anzugehen. So war es uns möglich, mit Hilfe der HaCaT Zellen zu zeigen, daß Langzeitkultivierung bei 40 C statt 37 C ausreichte, um die Zellen tumorigen zu transformieren [1] d.h. nach s.c. Injektion der Zellen in Thymus-aplastische Nacktmäuse entstanden Tumore. Wie schon zuvor für HaCaT Zellen demonstriert, die das Harvey-ras Onkogen enthielten, war der Tumorphänotyp abhängig von dem Alter der Ausgangskultur (frühe versus späte Passagen der HaCaT Zellen korreliert mit benignem bzw. malignem Tumorphänotyp). Zudem wiesen die rekultivierten Tumorzellen eine erhöhte Tumorigenitätsrate auf, was für eine weitere Selektion durch die in vivo Passage spricht [2]. Mittels Vergleichender genomischer Hybridisierung (CGH) und Multiplex Fluoreszenz in situ Hybridisierung (M-FISH) der rekultivierten Tumore konnten wir zeigen, dass in allen tumorigenen Varianten eine gemeinsame genetische Aberration vorlag, nämlich eine Amplifikation von 11q13 [1]. Erste Versuche, in denen HaCaT Zellen für mehrere Wochen mit UV-A bestrahlt wurden, haben ebenfalls zur tumorigenen Transformation der Zellen geführt. Interessanterweise weisen auch diese tumorigenen Varianten einen Zugewinn von 11q13 auf. Es ist deshalb unsere jetzige Arbeitshypothese, dass erhöhte Temperatur bzw. UV-A Strahlung in den Epidermiszellen der Haut über DNA Strangbrüche für eine bestimmte Art von genetischen Schäden (Amplifikation, Deletionen, Translokation) verantwortlich sind.

45 Ein erster Hinweis, daß es sich bei dem Zugewinn von 11q13 um ein für Hautcarcinome häufigeres genetisches Ereignis handelt, kamen durch die genetische Charakterisierung eines neuen in vivo Hautcarcinogenese Modells. Mit dieser, von dem selben Patienten stammenden Tumorsequenz, bestehend aus dem Primärtumor, zwei Rezidiven und einer Lymphknotenmetastase, konnten wir dann zweifelsfrei belegen, dass die Metastase genetisch aus dem Primärtumor hervorgegangen war, während sich die Rezidive parallel dazu und jeweils unabhängig voneinander entwickelt hatten [3]. Dies könnte bedeuten, daß sich die Metastase bereits sehr früh während der Tumorprogression gebildet hatte. Darüber hinaus lag auch hier ein Zugewinn von 11q13 vor und diese Aberration blieb in allen Tumorstadien erhalten, was dafür spricht, daß die Tumorzellen durch sie einen Selektionsvorteil hatten. Derzeit untersuchen wir an einer größeren Zahl von Hautcarcinomen und benignen Hauttumoren i) ob der Zugewinn von 11q13 ein generell relevantes genetisches Ereignis ist, ii) für welches Stadium der Tumorentwicklung er charakteristisch ist und iii) und welche anderen genetischen Aberrationen häufig zu beobachten sind, um damit neue diagnostische und möglicherweise prognostische Marker für die Hautcarcinogenese zu definieren. Der angiogene Switch, eine wesentliche Voraussetzung für die maligne Konversion: zur Rolle von Thrombospondin (TSP-1) Zusätzlich zur Amplifikation von 11q13, die für das uneingeschränkte Wachstum aller Tumorzellen (benigne und maligne) wesentlich ist, konnten wir den Verlust von Chromosom 15 als wichtiges genetisches Ereignis für die maligne Progression der HaCaT Zellen und der SCL-I Plattenepithelcarcinomlinie der Haut definieren. Wiedereinführung einer Kopie von Chromosom 15 in die SCL-I Zellen führte nach s.c. Injektion der Zellen in Nacktmäusen zu einer signifikanten, wenn auch temporären Tumorsuppression [4]. Als potentielles Tumorsuppressorgen identifizierten wir TSP-1, ein Matrixglycoprotein, das auf 15q15 lokalisiert ist. Überexpression dieses Gens induzierte die gleiche Tumorsuppression wie das gesamte Chromosom 15 und verursachte eine massive Ablagerung von TSP-1 Matrix an der Tumor/Stroma Grenze um den Tumor herum. Diese Matrix verhinderte das Einwachsen von Blutgefäßen und damit das Expandieren der Tumorzellen in das umgebende Stroma. Diese Tumorsuppression war aber nur temporär und nach 8-10 Wochen wurde Tumorwachstum beobachtet. Da das Tumorwachstum mit der Auflösung der TSP-1 Matrix korrelierte, ist es Ziel weiterer Studien, zu ermitteln, welche Proteasen für die Degradation verantwortlich waren und ob dieses kausal für das Tumorwachstum waren. Erste Studien zur Proteaseexpression der Tumorzellen zeigten, daß die malignen Tumorzellen signifikant mehr Proteasen exprimieren als die benignen bzw. nicht-tumorigenen HaCaT Zellen [5, 6]. Ein wesentlicher Anteil der Proteasen wird zusätzlich aber auch von den Tumor-umgebenden Stromazellen synthetisiert. Wir sind deshalb derzeit dabei die Proteaseexpression im Tumorstroma in vivo zu charakterisieren. Darüber hinaus ist aus der Literatur bekannt, Abteilung B0900 Genetik der Hautcarcinogenese daß der Transformierende Wachstrumsfaktor TGF-ß1and die TSP-1 Matrix bindet und dadurch aktiviert wird. Da TGF->1 bekanntermaßen die Expression von Proteasen in Stromazellen induzieren kann, ist es ein weiteres Ziel unserer Studien, die Rolle der Interaktion von TGF->1 und TSP-1 für dieses Hautcarcinogenese Modell zu ermitteln. 2. Telomeraseaktivierung eine besondere Form der genetischen Aberration: Telomerase-, und Telomerlängenregulation in normalen and transformierten humanen Keratinozyten P. Boukamp, S. Beneke, A. Cerezo, S. Ermler, K. Greulich-Bode, S. Moshir, S. Rosenberger, H. Stammer In Kooperation mit: Dr. J. R. Bickenbach, University of Iowa, Iowa City, USA; Dr. M. Hergenhahn, DKFZ; Kirsten Vang Nielsen, DAKO Dänemark, Prof. Holger Kalthoff, Universität Kiel, Prof. Sabine Werner, ETH Zürich, Schweiz Wesentliche Erkenntnisse der letzten zwei Jahre waren: 1. Das Mass der Telomerverkürzung während der zellulären Alterung ist abhängig vom Spenderalters, d.h. es muß Faktoren geben, die die Rate der Telomerverkürzung modulieren können. 2. Der Telomer-bindende Faktor TRF-2 spielt eine Rolle in der zellulären Alterung Regulation der Telomeraseaktivität und Telomerlänge Ein Enzymkomplex, der als essentiell für das uneingeschränkte Wachstum von Tumorzellen gilt, ist der Ribonucleoproteinkomplex Telomerase. Normale Zellen verlieren Replikations-bedingt kontinuierlich Sequenzen am Ende der Chromosomen, den Telomeren und man geht davon aus, daß dieser Telomerverlust für die begrenzte Lebensspanne normaler Zellen verantwortlich ist. D.h der Verlust von Telomersequenzen ist der Zählmechanismus, die innere Uhr der zellulären Alterung. Würde dies auch für Tumorzellen gelten, so würden diese durch ihre Vielzahl von Teilungen eine so kritische Telomerlänge erreichen, dass dies einem Wachstumsstop und schlussendlichen das Absterben der Zellen zur Folge hätte. Telomerase ist nun in der Lage, de novo Sequenzen an die Telomere zu hängen und so eine Stabilisierung der Telomerlänge zu gewährleisten. Im Gegensatz zur ursprünglichen Annahme konnten wir aber schon sehr früh zeigen, dass Telomerase nicht nur in Tumorzellen exprimiert wird, sondern Aktivität auch in der normalen Epidermis der Haut nachweisbar ist [Härle-Bachor, C, Boukamp, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: (1996)]. Inzwischen ist klar, dass alle regenerativen Gewebe auch im adulten menschlichen Organismus Telomerase-positiv sind [7]. In der Epidermis, wie auch in anderen Geweben, ist die Telomeraseaktivität eng mit der Proliferation verknüpft und wird mit Beginn der Differenzierung abgeschaltet. Erste Studien zur Telomeraseregulation hatten gezeigt, dass Calcium ein wichtiger Inhibitor der Telomeraseaktivität ist (Bickenbach, J.R. et al. J. Invest. Dermatol., 111: (1998)). 97

46 98 Forschungsschwerpunkt B Die intrazelluläre Erhöhung des Calciumspiegels führt somit nicht nur zur Induktion der epidermalen Differenzierung, sondern scheint auch vorgeschaltet, die Telomeraseaktivität zu inhibieren. Wir sind derzeit dabei, den Telomerasekomplex im Detail zu charakterisieren, um die Faktoren zu identifizieren, die für die Calcium-bedingte Regulation verantwortlich sind. Im Gegensatz zu den Keratinozyten der Epidermis sind die Fibroblasten der Dermis Telomerase-negativ. Erwartungsgemäß findet man auch bei Langzeitkulturen eine kontinuierliche Abnahme der Telomerlänge. Überraschenderweise beobachteten wir jedoch einen vom Spenderalter abhängigen Grad des Telomerverlusts [8]. So war dieser bei Zellen von Kleinkindern deutlich vermindert und die Zellen hörten trotz relativ langer Telomere auf zu proliferieren (Seneszenz). D.h. der Grad der Telomerverkürzung kann moduliert werden und somit ist die Telomerlänge per se kein striktes Mass für die replikative Historie der Zellen. Darüber hinaus scheint auch die Telomerase der Keratinozyten nicht in der Lage zu sein, den Replikationsbedingten Telomerverlust auszugleichen. Da dies gleichermaßen für das hematopoietische System gilt, bleibt nun zu klären, warum Telomerase speziell in diesen Geweben exprimiert wird [9]. TRF2, ein wichtiger Faktor für die zellulären Alterung Ein Faktor, der bei der Telomerlängenregulation eine wichtige Rolle spielen soll und dessen Anwesenheit Voraussetzung für die Chromosomenintegität ist, ist der Telomerrepeat-bindende Faktor TRF-2. Es wird postuliert, dass TRF2 eines der Proteine ist, die das Telomerende vor Degradation schützt. Wir konnten nun zeigen, dass TRF2 im Laufe der zellulären Alterung signifikant hochreguliert wird. Dieses ist offensichtlich von funktioneller Relevanz, da Verminderung des TRF2 Spiegels in alten Zellen mittels anti-sense Oligonucleotiden zu einer verbesserten Proliferation und einer morphologischen Verjüngung der Kulturen führte [8]. Wir sind deshalb derzeit dabei, die Rolle von TRF2 für die zelluläre Alterung im Detail zu charakterisieren. Abteilung B0900 Genetik der Hautcarcinogenese Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Boukamp, P., Popp, S., Bleuel, K., Tomakidi, E., Bürkle, A., Fusenig, N.E.: Tumorigenic conversion of immortal human skin keratinocytes (HaCaT) by increased temperature. Oncogene, 18: (1999) [2] 3. Müller MM, Peter W, Mappes M, Huelsen A, Steinbauer H, Boukamp P, Vaccariello M, Garlick J, Fusenig NE.: Tumor progression of skin carcinoma cells in vivo promoted by clonal selection, mutagenesis, and autocrine growth regulation by G- CSF and GM-CSF. Am. J. Pathol., 159: (2001) [3] 4. Popp, S., *Waltering, S., *Holtgreve-Grez, H., *Jauch, A., *Proby, C., *Leigh, I.M., Boukamp, P.: Genetic characterization of a human skin carcinoma progression model: from primary tumor to metastasis. J. Invest. Dermatol., 115: (2000) [4] 5. Bleuel, S., Popp, S., Fusenig, N.E., *Stanbridge, E.J., Boukamp, P.: Tumor suppression in human skin carcinoma cells by chromosome 15 transfer or TSP-1 overexpression through halted tumor vascularization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: (1999) [5] 6. *Bachmeier, B.E., *Nerlich, A.G., Boukamp, P., *Lichtinghagen, R., *Tschesche, H., *Fritz, H., *Fink, E.: Human keratinocyte cell lines differ in the expression of the collagenolytic matrix metalloproteinases-1,-8, and -13 and of TIMP-1. Biol Chem. 381: (2000) [6] 7. *Bachmeier, B.E., Boukamp, P., *Lichtinghagen, R., Fusenig, N.E., *Fink, E.: Matrix metalloproteinases-2,-3,-7,-9 and- 10, but not MMP-11, are differentially expressed in normal, benign tumorigenic and malignant human keratinocyte cell lines. Biol. Chem. 381: (2000) [7] 9. Bachor, C., *Bachor, O.A., Boukamp, P.: Telomerase is active in normal gastrointestinal mucosa and not upregulated in precancerous lesions. J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125: (1999) [8] 11. Figueroa, R., Lindenmaier, H., Hergenhahn, M., *Vang Nielsen, K., Boukamp, P.: Telomere erosion varies during in vitro aging of normal human fibroblasts from infant and adult donors. Cancer Res. 60: (2000) [9] 12. Boukamp P.: Ageing mechanisms: the role of telomere loss. Clin Exp Dermatol. 26: (2001)

47 R0400 Zentrale Spektroskopie Zentrale Spektroskopie (R0400) Leiter: Dr. William E. Hull, Spezialist für Kernspinresonanz (NMR) Wissenschaftliche Mitarbeiter Prof. Dr. Wolf-Dieter Lehmann, Spezialist für Massenspektrometrie (MS) Dr. Claus-Wilhelm von der Lieth, Spezialist für EDV und Modeling Technisches Personal Gabriele Schwebel-Schilling ( ), CL für NMR-Dienstleistung Gerhard Erben ( ), CTA für Dienstleistung (IR, UV, MS) und Methodenentwicklung (MS, HPLC) Sekretariat Sabrina Zahner (1/2) Im Zeitraum waren folgende zusätzliche Personen über Haus- oder Drittmittel-Zeitverträge (H oder D) in der ZS an verschiedenen Forschungsprojekten tätig: Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Dieter Albert (D 09/98-12/00; H 01/01-12/02) Dr. Andreas Bohne-Lang (D 01/01-12/02) Dr. Martin Frank (D 06/01-05/03) Gastwissenschaftler Jaroslav Tóth, Lehrstuhl für Pharmakognosie und Botanik, Fakultät für Pharmazie, Comenius Universität, Bratislava, Slowakische Republik (DFG-Stipendium für Netzbasierte Forschungskooperationen: 10-12/01) Doktoranden Andreas Bohne (D - 12/00) Klaus Lohmann (D 05/01 - ) Alexander Loß (D 01/01 - ) Thomas Lütteke (H 10/01 - ) Mogjiboraliman Salek (H 02/01 - ) Andreas Schlosser (H - 03/02; mit Abt. B0100) Mathias Wind (H 01/00 -) Technisches Personal Gerda Baumann, CTA (D 06/98-12/00, 1/2) Neben der vielfältigen analytischen Dienstleistung (Auftragsmessungen zur Bestätigung bzw. Aufklärung von Molekülstrukturen mittels NMR, IR, UV, und MS) wird in der Zentralen Spektroskopie (ZS) an die Einführung bzw. Entwicklung neuer Meß- bzw. Analyse-Verfahren und ihre Anwendung in der Krebsforschung intensiv gearbeitet. Diese Methoden werden bei eigenständigen bzw. kooperativen Forschungsaktivitäten in den Bereichen Biochemie, molekulare Struktur, Dynamik, und Wechselwirkung, sowietumormetabolismus und Tumortherapie eingesetzt. Die Schwerpunkte der MS-Anwendungen liegen in Protein- und Peptidanalytik mit nano- bis picomol Mengen (präzises Molgewicht, Charakterisierung mittels eines enzymatischen Verdau, Sequenzierung, Bestimmung von Phosphorylierung und anderen post-translationalen Modifikationen) sowie quantitative Bestimmung von zellulären Phospholipidenprofilen. Mit der Hochfeld-MR-Spektroskopie wird die Entwicklung neuartiger Pharmaka und die Identifikation von Naturstoffen mit krebspräventiver Wirkung unterstützt. Mit der 31 P-MR-Spektroskopie werden metabolische Eigenschaften von Tumorzellen in Kultur sowie in vivo (Tiermodell) untersucht (Korrelation des Tumorwachstum mit Phospholipid-Metabolitenprofilen). Die nichtinvasive Hochfeld-MR-Bildgebung wird eingesetzt, um das Wachstum von Tumoren und Metastasen in inneren Organen von tumortragenden Mäusen zu visualisieren und die Wirkung einer Therapie zu untersuchen. Im Internet-Zeitalter ist die Bereitstellung von spektroskopischen Daten und Molekülstrukturen in Form von benutzerfreundlichen Datenbanken und Informationssystemen eine zunehmend wichtige Arbeit. Schwerpunkte in molecular modeling sind die Oligosaccharide (Konformation und Dynamik), Glykoproteine, sowie Protein-Oligosaccharide-Wechselwirkungen (Lektine, Virusinfektion) und die Entwicklung neuer Pharmaka. Die Forschungsaktivitäten der ZS sind in vier Bereichen gegliedert, die im Folgenden näher beschrieben werden. Unsere Internet-Addresse: 99

48 100 Forschungsschwerpunkt B Entwicklung von WWW-basierten Anwendungen und Datenbanken für strukturbiologische Fragestellungen (Schwerpunkt Glykobiologie) (R0401) C.-W. von der Lieth, A. Bohne-Lang, K. Lohmann, A. Loß In Zusammenarbeit mit: Prof. E. Schwarzer, Universität Hildesheim; Prof. Dr. E. Lang, Fachhochschule Darmstadt; Prof. Dr. R. Geyer, Universität Giessen; PD. Dr. U. Zähringer, Forschungszentrum Borstel. Zusatzfinanzierung: DFG-Projekt (D376); Konzeption und Entwicklung einer Web-basierten Arbeitsumgebung von glykowissenschaftliche Fragestellungen und Bereitstellung von fachbasierten Informationsangeboten; für C.-W. von der Lieth; 1 Postdoc (A. Bohne-Lang), 2 Doktoranden (A. Loß, K. Lohmann) Die rasche Entwicklung der Möglichkeiten des Internet hat sowohl die Art und Weise, wie Wissenschaftler weltweit miteinander kommunizieren als auch die Möglichkeiten der wissenschaftlichen Informationsbeschaffung entscheidend verändert. Über das WWW sind jetzt auch viele Datenbanken mit strukturellen, biologischen und spektroskopischen Daten mittels standardisierter, graphisch orientierter Benutzerführungen verfügbar. Vorteile sind: der Zugriff auf die aktuellsten Daten, eine für viele Anwendungen sehr ähnliche, graphisch orientierte und intuitiv bedienbare Benutzeroberfläche sowie eine weitgehende Unabhängigkeit von der jeweils vorhandenen Hardware-Konfigurationen, so daß die Anwendungen von praktisch jedem Arbeitsplatzrechner aus durchgeführt werden können. Die inhaltliche Verknüpfung von verteilten, wissenschaftlichen Datenbanken, die im Bereich der biologischen Makromoleküle zumeist über die Sequenzinformation realisiert wird, erlaubt mit hoher Effizienz und aus unterschiedlichen und weltweit verteilten Quellen die rasche Zusammenführung von Informationen, die zu einem Molekül gehören. Aus diesen Gründen sondieren und testen wir kontinuierlich die über das WWW verfügbaren Angebote an spektroskopischen, strukturellen und biologischen Daten und machen sie in Form von Linksammlungen verfügbar [1]. Als Schwerpunkt betreiben wir eigenständige Entwicklungen im Bereich der Glykobiologie, in dem bisher nur wenige Angebote weltweit verfügbar sind [2]. Da Oligosaccharide wesentlich komplexere Strukturen bilden (unterschiedliche Verknüpfungen der Residuen, Verzweigungen) als Oligonukleotide bzw. Proteine, erwies es sich als notwendig, eine einfache, eindeutige lineare Codierung von Kohlenhydratenstrukturen abzuleiten, die der üblichen Sprache der Glykowissenschaftler sehr nahe kommt und die eine einfache Verknüpfung von Einträgen in verschiedenen, verteilten Datenbanken ermöglicht [3] (LINUCS : LInear Notation for Unique description of Carbohydrate Sequences. linucs/). Exemplarisch wurde die Verwendung der LINUCS-Codierung in der SWEET-DB [4] realisiert ( in der momentan Daten aus vier verschiedenen Quellen miteinander über die chemische Struktur miteinander verknüpft werden. R0400 Zentrale Spektroskopie Oligosaccharide sind hochgradig flexible Verbindungen. Während das Programm SWEET-II die Erzeugung einer möglichen Konformation eines Oligosacchariden erlaubt, kann die Anwendung GLYDICT [5,6] ( glydict/) ein komplettes Ensemble von möglichen Konformationen von N-Glykanen berechnen. Dieses Verfahren beruht auf einem wissensbasiertem Ansatz, bei dem zunächst der konformationelle Raum aller Teilstrukturen (Tri-, Tetra- und Pentasaccharide), aus denen sich N-Glykane aufbauen lassen, durch Langzeit-Molekulardynamik Simulationen systematisch abgetastet werden. Die erhaltenen Konformationskarten für jede glykosidische Bindung im Oligomer werden analysiert und für jeden stabilen Konformer die entsprechende Torsionswinkeln und dazugehörenden Energien in der Wissensbasis abgelegt. Die erzeugten 3D-Strukturen können mittels eines automatisch auf dem lokalen Rechner startenden Programms (Plugins) visualisiert und abgespeichert werden. Ein Algorithmus, der die automatische Verknüpfung der generierten N-Glykan Strukturen mit bestimmten Glykosylierungstellen eines Protein vornimmt (siehe Abb. 1), befindet sich in der Entwicklung [7]. Weitere seit längeren verfügbare und weltweit intensiv genutzte Anwendungen sind: SWEET-II: Erzeugung von verläßlichen räumlichen Strukturen für Oligosacchariden auf der Basis der in der Literatur standardisierten Schreibweise für Kohlenhydratketten ( PDB2MultiGIF: Darstellung von sich bewegenden bzw. drehenden Molekülen in Standard Web-Browsern. ( Abb. 1: In silico Glykosylierung eines Proteins. Laut Röntgenstruktur hat die Neuraminidase Hemaglutin (Influenza Virus, PDB-Eintrag 1INY) drei Glykosylierungsstellen, aber die Röntgen-Diffraktionsdaten reichen nicht, um die gesamten Zuckerketten darzustellen. Daher wurden neun repräsentativen N-Glykanstrukturen (Konformationen) mit dem Programm GLYDICT erzeugt und an einem der Glykosylierungsstellen verknüpft. Die relativ starre Proteinteile der Strukturen (Band Darstellung links) wurden genau überlagert, so daß der erreichbare konformationelle Raum der flexiblen N-Glykanstrukturen (Stabmodell rechts) dargestellt wird. GLYPEPS: nutzt die Möglichkeiten mittels MALDI-TOF und ESI MS-Techniken, die Präzisionsmassen von Pep-

49 tiden mit hoher Genauigkeit bestimmen zu können, und verwendet die Information zur Auffinden Peptidmodifikationen (z.b. Glykosylierungen).( Die aktuelle Nutzungsstatistiken unserer WWW-Datenbanken und Anwendungen können abgerufen werden unter ( In den Jahren 2000/ 2001 hatten wir im Durchschnitt täglich mehr als 500 Aufrufe mit steigender Tendenz zu verzeichnen. Es ist geplant, weitere Anwendungen über WWW-basierte Zugriffe verfügbar zu machen. Dies gilt insbesondere für die den Bereich glykowissenschaftlicher Fragestellungen. Mit unseren WWW-basierten Anwendungen im Bereich der Glykobiologie beteiligen wir uns an dem US amerikanischen Consortium for Functional Glycomics (glycomics.scripps.edu/). Ziel dieses Konsortiums ist, die Funktion von kohlenhydrat-bindenden Proteine bei der inter- und intrazellulären Kommunikation bzw. Signaltransduktion zu entschlüsseln. Aufbauend auf unseren Methoden verschiedene Datenbanken über eine eindeutige Strukturbeschreibung der Kohlenhydrate zu verknüpfen, sind wir intensiv an der konzeptionelle Arbeit für die neu zu schaffenden Datenbanken des Konsortiums beteiligt. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Bohne, A.; *Lang, E.; von der Lieth, C.-W.: Molecular visualization programs on the web. Drugs of the Future 25 (2000) [2] Bohne, A.; *Wetter, T.; *Lang, E.; von der Lieth, C.-W.: Glykowissenschaften, ein neuer Einsatzbereich in der Bioinformatik. In: Informatik Neue Horizonte im neuen Jahrhundert. K. Mehlhorn, G. Snelting (Eds.), Springer, Berlin, pp (2000). [3] von der Lieth, C.-W.; Expanding Proteomics to Glycobiology, In: Pacific Symposium on Biocomputing, Vol 7. R.B. Altman, A.K. Dunker, L. Hunter, K. Lauderdale T.E. Klein (Eds.), World Scientific Publishing, London (2002) pp [4] Bohne-Lang, A.; *Lang, E.; *Forster, T.; von der Lieth, C.-W.: LINUCS: Linear Notation for Unique Description of Carbohydrate Sequences. Carbohydrate Res. 336 (2001) [5] Loss, A.; *Bunsmann, P.; Bohne, A.; *Loss, A.; *Schwarzer, E.; *Lang, E.; von der Lieth, C.-W.: SWEET-DB: an attempt to create annotated data collections for carbohydrates. Nucleic Acids Res. 30 (2002) [6] Bohne, Andreas: Ein wissensbasiertes System zur schnellen Erzeugung von 3D-Strukturen biologisch relevanter N-Glykane sowie ihrer mimikrierenden Glykoclusterstrukturen. Dissertation: Medizinischen Fakultät, Univ. Heidelberg (2001). [7] Bohne A. and von der Lieth, C.-W.: Glycosylation of proteins: a computer-based method for the rapid exploration of the comformational space of N-Glycans. In: Pacific Symposium on Biocomputing, Vol 7. R.B. Altman, A.K. Dunker, L. Hunter, K. Lauderdale T.E. Klein (Eds.), World Scientific Publishing, London (2002) pp Methodenentwicklung und Anwendung der Massenspektrometrie in der Krebsforschung (R0402) W.D. Lehmann, A. Schlosser, M. Wind, A. Salek, G. Erben R0400 Zentrale Spektroskopie In Zusammenarbeit mit: D. Bossemeyer, D. Kübler, V. Kinzel, H. Wesch, A. Alonso, G. Füstenberger, F. Marks, D. Keppler, M. Eisenhut, A. Bohne, W. von der Lieth, R. Pipkorn (DKFZ). B. Brügger, J. B. Helms, F. Wieland, Biochemiezentrum, Universität Heidelberg; E. Mayatepek, Kinderklinik, Universität Heidelberg; N. Jakubowski, Inst. f. Angewandte Spektroskopie (ISAS), Dortmund; M. Linscheid, Humboldt-Universität Berlin; E. Nigg, MPI für Biochemie, Martinsried. Polare Lipide und speziell modifizierte Proteine sind essentielle Bestandteile von zellulären Signalübertragungs- Prozessen (Kaskaden) und kontrollieren damit zahlreiche zentrale Zellfunktionen. Ihre molekulare Charakterisierung und Quantifizierung ist daher ein essentieller Baustein bei der Erforschung ihrer Funktionen. Aufgrund der technologischen Fortschritte sind in den letzten Jahren viele Signal-aktive Verbindungen der direkten molekularen Analytik mit Massenspektrometrie zugänglich geworden, so daß diese Technik mittlerweile die Methode der Wahl für die Spurenanalytik von polaren Lipiden und modifizierten Peptiden/Proteinen darstellt. Wir haben im Berichtszeitraum dazu die folgenden Ergebnisse erarbeitet. Analytik Polarer Lipide Hochempfindliche Charakterisierung und Quantifizierung von oxidierten Lipiden in Körperflüssigkeiten [1,2], in in vitro Lipoxygenase-Assays [3] sowie von Membranlipiden [4]. Diese Arbeiten wurden mit Electrospray (ESI) Tandem MS-Methoden durchgeführt, die zuvor überwiegend im eigenen Labor entwickelt wurden. Damit gelingt es z.b. in Membranen von isolierten Zellorganellen, das Cholesterin/ Sphingomyelin-Verhältnis zu bestimmen [4], ein analytischer Parameter bei der Charakterisierung z.b. von sogenannten lipid rafts in Zellmembranen. Weiter wurde mit diesen Methoden eine Strukturanalytik von iodierten lipophilen nuklearmedizinischen Markern durchgeführt [5]. Erkennung und Lokalisation von kovalenten Proteinmodifikationen Theoretische und Mechanistische Arbeiten Bestimmte kovalente Proteinmodifikationen wie Glykosylierung oder Lipidierung sind anhand der Präzisionsmasse eines entsprechend modifizierten Peptidfragments erkennbar. Dieses Phänomen wurde beschrieben und eine Internet-Suchmaschine zur Erkennung abweichender Peptid- Präzisionsmassen geschaffen [6]. Bei Kollisions-induziertem Zerfall von modifizierten Peptiden in der Tandem Massenspektrometrie (die MS-Methode zur Strukturanalytik) wurde die Bildung von 5-Ring Strukturen als zentrales Element bei vielen Schlüsselfragmentierungen erkannt [7]. Isoaspartat-Bildung und Racemisierung Die Isoaspartat-Bildung ist eine weit verbreitete spontan ablaufende kovalente Proteinmodifikation, die mit zunehmender Proteinalterung zunimmt und in der Regel zu Funktionsbeinträchtigung oder Funktionsverlust des Proteins führt. Bislang sind nur wenige Analysenmethoden zur Analytik von Isoaspartat in Proteinen verfügbar. Wir haben die Tandem Massenspektrometrie als neue Methode für diesen Zweck erfolgreich eingesetzt [8] und in Rinder-Proteinkinase A neben der Isoaspartat-Bildung am N-terminus zusätzlich eine Racemisierung von L-Aspartat zu D-Aspartat nachweisen können [9]. N-terminale Myristoylierung Eine N-terminale Myristoylierung konnte mit Tandem MS- Methoden an einem Golgi-Membranprotein (rekombinant und nativ) eindeutig nachgewiesen werden [10]. 101

50 102 Forschungsschwerpunkt B N-terminale Oxalyl-Modifikation Eine Sauerstoff-induzierte Proteinspaltung mit Nachweis einer N-terminalen Oxalyl-Modifikation am abgespaltenen Peptid-Bruckstück wurde mit Tandem MS nachgewiesen [11]. Phosphorylierung Die reversible Phosphorylierung an Serin, Threonin und Tyrosin ist eine der häufigsten und funktionell wichtigsten kovalenten Proteinmodifikationen. Die Verbesserung der Analytik der Proteinphosphorylierung und deren Anwendung steht seit einigen Jahren Im Mittelpunkt unserer Forschungsaktivitäten. Eine vollständige Erfassung aller Phosphorylierungsstellen der Proteinkinase A wurde durch Kombination von Tandem Massenspektrometrie und proteolytischem Abbau durch Elastase erreicht [12]. Der Neutralverlust-Scan Modus wurde systematisch für den Nachweis von Serin- und Threonin-Phosphorylierung optimiert [12]. Die Element-Massenspektrometrie mit Phosphor-Detektion wurde als neue Methode zum Nachweis von Phosphopeptiden eingeführt und erprobt [13]. Mit gleichzeitiger Bestimmung von Schwefel und Phosphor wurde der Phosphorylierungsgrad von Phosphoproteinen bestimmt [14]. Mittlerweile wurde diese neue Methodik zur Charakterisierung bislang unbekannter Phosphorylierungsstellen eingesetzt. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Uemura, M.; Lehmann, W.D.; *Schneider, W.; *Seitz, H.K.; Benner, A.; *Keppler-Hafkemeyer, A.; *Hafkemeyer, P.; *Kojima, H.; *Fujimoto, M.; *Tsujii, T.; *Fukui, H.; Keppler, D.: Enhanced urinary excretion of cysteinyl leukotrienes in patients with acute alcohol intoxication. Gastroenterology 118 (2000) [2] *Mayatepek, E.; *Zelezny, R.; Lehmann, W.D.; *Hammond, J.W.; *Hoffmann, G.F.: Defects of the synthesis of cysteinyl leukotrienes: a new group of inborn errors of metabolism. J. Inherit. Metab. Dis. 23 (2000) [3] Siebert, M.; Krieg, P.; Lehmann, W.D.; Marks, F.; Fürstenberger, G.: Enzymic characterization of epidermis-derived 12- lipoxygenase isoemzymes. Biochem J. 355 (2001) [4] *Brügger, B.; *Sandhoff, R.; *Wegehingel, S.; *Gorgas, K.; *Malsam, J.; *Helms, J.B.; Lehmann, W.D.; *Nickel, W.; *Wieland, F.T.: Evidence for segregation of sphingomyelin and cholesterol during formation of COPI-coated vesicles. J. Cell Biol. 151 (2000) [5] Eisenhut, M.; Hull, W.E.; *Mohammed, A.; *Mier, W.; Lay, D.; *Just, W.; *Gorgas, K.; Lehmann, W.D.; Haberkorn, U.: Radioiodinated N-(2-diethylaminoethyl)benzamide derivatives with high melanoma uptake: structure-affinity relationships, metabolic fate, and intracellular localization. J. Med. Chem. 43 (2000) [6] Lehmann, W.D.; Bohne, A.; von der Lieth, C.-W.: The information encrypted in the accurate mass of peptides - improved protein identification and assistance in glycopeptide identification and characteriization. J. Mass Spectrom. 35 (2000) [7] Schlosser, A.; Lehmann, W.D.: Five-membered ring formation in unimolecular reactions of peptides: a key structural element controlling low-energy collision-induced dissociation of peptides. J. Mass Spectrom. 35 (2000) [8] Lehmann, W.D.; Schlosser, A.; Erben, G.; Pipkorn, R.; Bossemeyer, D.; Kinzel, V.: Analysis of isoaspartate in peptides by electrospray tandem mass spectrometry. Prot. Sci. 9 (2000) R0400 Zentrale Spektroskopie [9] Kinzel, V.; König, N.; Pipkorn, R.; Bossemeyer, D.; Lehmann, W.D.: The amino terminus of the PKA catalytic subunit - a site for introduction of postranslational heterogeneities by deamidation: D- Asp2 and D-isoAsp2 containing isozymes. Prot. Sci. 9 (2000) [10] *Eberle, H.B.; *Serrano, R.L.; *Radke, S.; *Füllekrug, J.; Schlosser, A.; Lehmann, W.D.; *Lottspeich, F.; *Kaloyanova, D.; *Wieland, F.T.; *Helms, J.B.: Identification and characterization of a novel human plant-pathogenesis related protein that localizes to lipid-enriched microdomains in the Golgi complex, J. Cell Sci. 115 (2002) [11] *Wagner, A.F.V.; *Schultz, S.; *Bomke, J.; *Pils, T.; Lehmann, W.D.; *Knappe, J.: YfiD of E. coli and Y061 of bacteriophage T4 as autonomous glycyl radical cofactors reconstituting the catalytic center of oxygen-fragmented pyruvate formate-lyase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 285 (2001) [12] Schlosser, A.; Pipkorn, R.; Bossemeyer, D.; Lehmann, W.D.: Analysis of protein phosphorylation by combination of elastase digestion and neutral loss tandem mass spectrometry. Anal. Chem. 73 (2001) [13] Wind, M.; *Edler, M.; *Jakubowski, N.; *Linscheid, M.; Wesch, H.; Lehmann, W.D.: Analysis of protein phosphorylation by capillary liquid chromatography coupled to element mass spectrometry with 31 P detection and to electrospray mass spectrometry. Anal. Chem. 73 (2001) [14] Wind, M.; Wesch, H.; Lehmann, W.D.: Protein phosphorylation degree - Determination by capillary liquid chromatography and inductively coupled plasma mass spectrometry. Anal. Chem. 73 (2001) Methodische Entwicklung und Anwendung der Hochfeld-Kernmagnetischen-Resonanz- (MR)-Spektroskopie und Bildgebung (R0403) W.E. Hull, D. Albert In Zusammenarbeit mit: M. Wießler, R. Owen, H. Bartsch, J. Debus, P. Krammer, H. Walczak, R. Pipkorn (DKFZ); M. Eisenhut, Abt. Nuklearmedizin der Universität Heidelberg; S. Lebedkin, Forschungszentrum Karlsruhe; T.K. Lindhorst, Universität Hamburg; H. Kunz, Universität Mainz; I. Walter-Sack, Innere Medizin VI, Klinische Pharmakologie und Pharmakoepidemiologie, Universitätsklinikum Heidelberg. Zusatzfinanzierung: BMBF Glycobiotechnology Program (B256); Synthese und Molekulardynamic neuer Saccharid-basierten Dendrimere als Basis für neue Medikamente; für C.-W. von der Lieth und W.E. Hull in Kooperation mit M.Wießler (DKFZ) and Beiersdorf AG; 1 Postdoc (D. Albert), 1/2 CTA (G. Baumann), In der ZS werden die MR-Forschungsaktivitäten mittels drei Großgeräten durchgeführt: ein 14-Tesla 4-Kanal Spektrometer (600 MHz 1 H-Frequenz), hauptsächlich für Strukturforschung im Bereich Proteomics und Glycomics; ein 11,7-Tesla Spektrometer (500 MHz 1 H-Frequenz) für die analytische in vitro NMR-Spektroskopie (MRS); ein multifunktionelles 7,0-Tesla System mit 15-cm Magnetbohrung für in vitro Analytik, z.b. an Bioflüssigkeiten, und in vivo MRS und MR-Bildgebung am Tiermodell. Für die routine MR-Analytik steht ein 5.8-Tesla (250 MHz) Gerät zur Verfügung. Die sogenannte in vitro MRS wird für analytische Aufgaben und Molekül-Strukturforschung eingesetzt; sie befaßt sich üblicherweise mit reinen Substanzen in Lösung, Chromatographie-Fraktionen oder Reaktionsgemischen. Es können aber auch biologische Flüssigkeiten wie Urin und

51 Plasma (Pharmakokinetik-Studien) oder Suspensionen intakter Zellen bzw. Zellextrakte untersucht werden. Die sogenannte in vivo MRS wird hauptsächlich für nichtinvasive metabolische Untersuchungen an soliden Tumoren im Tiermodell eingesetzt. Mit MR-Bildgebung kann das Wachstum von Tumoren bzw. Metastasen im lebenden Tier visualisiert werden. Einige der aufwendigeren kooperativen Forschungsprojekte, die über die Routine-Analytik hinausgehen, werden im Folgenden beschrieben. Struktur-Analytik mittels MRS In verschiedenen Kooperationen wurden die Methoden der hochauflösenden 1 H- und 13 C-MRS intensiv für die Strukturbestimmung und Charakterisierung einzelner Moleküle eingesetzt. Fulleren-Chemie. Fullerene sind exotische Kohlenstoff- Moleküle, die auf mögliche Anwendungen in der Nanotechnologie und Pharmakologie intensiv untersucht werden. Die wichtigsten analytischen Techniken sind Ramanund 13 C-NMR-Spektroskopie. Eine dreijährige Kooperation mit dem MPI für Kernphysik, der Universität Heidelberg, und das Forschungszentrum Karlsruhe ging vorläufig zu Ende mit einer Arbeit über den C 70 -Dimer C 140 [1]. Neue Radiodiagnostika. Die Früherkennung von aggressiven, metastasierenden Krebserkrankungen bleibt ein wichtiges Ziel der Diagnostik. Weil Hautkrebs (Melanom) eine steigende Frequenz in der Bevölkerung zeigt, wird intensiv an die Entwicklung neuer melanom-spezifischer Radiodiagnostika für den Nachweis von Tumoren und Metastasen mittels bildgebender Verfahren wie Szintigraphie und SPECT (single-photon emission computed tomography). In der Abt. Nuklearmedizin der Universität Heidelberg wurden eine Reihe neuer radioiodinierter N-(2-Diethylaminoethyl)-Benzamid-Derivate entwickelt und ihre Aufnahme in Melanom-Gewebe untersucht. Für die Charakterisierung und Strukturbestätigung der verschiedenen Substanzen wurden zahlreiche 1 H- und 13 C-NMR-Spektren analysiert [2]. MGMT Inhibitoren. Eine große Reihe potentieller Inhibitoren des DNA-Repair Proteins O 6 -Methylguanin-DNA- Methyltransferase (MGMT) wurden synthetisiert (Abt. Wiessler, C0300); die Strukturen und ihre Reinheit wurden durch NMR charakterisiert, und ihre in vitro Aktivitäten wurden getestet [3]. Zu dem wurden ausführliche Molekular-Dynamik Studien (siehe R0404 unten) der Protein-Inhibitor-Komplexe unternommen, um die Struktur-Aktivitätsbeziehungen aufzuklären. Die effektivste Substanzen waren M-[O 6 -Bromthenyl-Guan-9-yl]-(CH 2 ) n ->-D-Glucoside mit n = 8,10,12. Entwicklung eines synthetischen Antitumorvakzins. In der Arbeitsgruppe von H. Kunz (Uni Mainz) wird ein 12-mer Peptid, GVTSAPDTRPAP, einer Teilsequenz der tumorassoziierten Glykopeptid MUC1 (überexprimiert bei Epithelkarzinomen), über einem Alkyläther-Spacer mit einem T-Zell-Epitop YSYSPFV gekoppelt. Das Konjugat soll eine tumorspezifische T-Zell-Proliferation stimulieren, d.h. als synthetisches Vakzin wirken. Unser Beitrag zu diesem R0400 Zentrale Spektroskopie Projekt war die Bestimmung der für die immunogene Wirkung wichtigen konformationellen Eigenschaften des 12- mer MUC1-Peptides mittels zweidimensionaler 1 H-NMR Messungen bei 500 MHz und Molecular Modeling. Dazu wurde ein Sialyl-GalNAc-O-Threonin-Derivat dieses Peptids auch untersucht. Die Ergebnisse der Studie (die noch zu veröffentlichen sind) zeigen, daß der MUC1-Peptid eine offene, relativ flexible Struktur besitzt, ohne Bevorzugung einer bestimmten Konformation. Dagegen zeigt das glykosylierte Peptid eine deutlich eingeschränktere Konformation, insbesondere um die Glykosylierungsstelle, (eine geknickte Struktur mit zwei half turns ). Diese letzteren Eigenschaften könnten für die immunogene Wirkung des Vakzins von Bedeutung sein (siehe Abb. 2). Abb. 2: Energie-minimierte und durch NMR bestätigte Struktur des glykosylierten MUC1-Peptides mit Wasserstoffbrücken in den half-turns T1-A3 und D5-R7; P4-P10 ist das antigene Epitop. Chemoprävention Krebspräventive Substanzen in Olivenöl. Das Ernährungsschema im Mittelmeerraum (hohe Anteile von Früchten, Gemüse, Fisch, und Olivenöl) bietet, laut Statistik, eine breite protektive Wirkung gegen Krebs (insbesondere Kolorektalekarzinom und Mammakarzinom) und Herz- Kreislauf-Erkrankungen. Es gibt zunehmende Hinweise, daß Olivenöl, insbesondere das kaltgepresste extravirgin Produkt, eine große gesundheitsfördernde Rolle spielen kann [4]. In der Abt. Toxikologie und Krebsrisikofaktoren (C0200: Abt. Bartsch, Gruppe Owen) wird die chemopräventive Wirkung des Mittelmeerdiäts untersucht, und seit 1998 wird die MR-Analytik intensiv eingesetzt, um eine detaillierte Bestandsaufnahme der Antioxidantien (Phenole und Derivate) in Olivenöl zu erstellen [5,6]. Es könnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß, zusätzlich zu den einfachen Phenolen und Secoiridoiden, auch die Lignane (+)-1- Acetoxypinoresinol and (+)-Pinoresinol als Hauptkomponenten in nativem Olivenöl vorhanden sind [7]. Die Lignane wirken protektiv gegen Brust-, Kolon-, und Prostatakrebs, sind aber nicht in raffiniertem Olivenöl oder anderen Kern-Ölen vorhanden. Neben Olivenöl wurde das Olivenfruchtfleisch (brined olive drupes) auch untersucht. Durch die NMR-Analytik konnten mehrere phenolische Antioxidantien identifiziert werden [8]. Grüne Oliven enthalten hauptsächlich Hydroxytyrosol während schwarze Oliven eine Vielzahl von interessanten 103

52 104 Forschungsschwerpunkt B Verbindungen aufweisen (Abb. 3): die einfache Phenole tyrosol, dehydrocaffeic acid, dehydro-p-coumaric acid; das Disaccharid Acteosid, sowie die Flavonoide Luteolin und Apigenin. Die Konzentrationen dieser potentiell krebspräventiven Substanzen waren im Fruchtfleisch sogar höher als in den entsprechenden geernteten Ölen. Zimtsäure ist auch ein wichtiger Inhaltstoff in Früchten, Gemusen und chinesischen Medikamenten und zeigt protektive Wirkung gegen reaktiver Sauerstoff in in vitro Assays. Die resultierende hydroxylierten Spezies (Coumarinsäuren) wurden mittels NMR identifiziert. Glykobiotechnologie: Thioharnstoff-Zucker- Derivate Die Entdeckung von Harnstoff-gekoppelten Sacchariden in Breitbandantibiotika hat das Interesse an diesen Substanzen und ihren Schwefel-Analoga (Thioharnstoff-Derivaten) geweckt. Solche Moleküle haben interessante chemische und biologische Eigenschaften und können als Bausteine für multivalente Glykodendrimere dienen. Die Thioharnstoff-Verbindungen R-NH-C(=S)-N H-R besitzen N-C und C-N Bindungen mit Doppelbindungscharakter (eingeschränkte Rotation) so daß vier Kombinationen von cis (E) oder trans (Z) Bindungen möglich sind (EE, EZ, ZE, ZZ). Die Populationen der verschiedenen Thioharnstoff-Isomeren (Konformationen) sind abhängig von den Substituenten R und R (z.b. Methyl, Phenyl, Glucosyl, Mannosyl, usw.), der Temperatur und dem Lösungsmittel und beeinflussen daher die chemischen Reaktionen dieser Substanzen. Abb. 3: Wichtige Antioxidantien im Fruchtfleisch von schwarzen Oliven. Eine Reihe Modellsubstanzen mit R,R = Methyl, Ethyl, oder Phenyl wurden mittels 1 H- und 13 C-MRS untersucht. Bei Temperaturen unter -50 C ist die Umwandlung der Isomeren langsam, so daß einzelne Konformationen nachweisbar sind. Bei den symmetrischen Molekülen mit R,R = Methyl wird die EZ = ZE Konformation (bevorzugt) aber R0400 Zentrale Spektroskopie die EE Form auch beobachtet; bei R,R = Ethyl oder Phenyl wurde ZZ statt EE als zweite Konformation festgestellt. In einer Kooperation mit T.K. Lindhorst (Uni. Kiel) wurden verschiedene C1-Thioharnstoff-Zucker-Derivate mit der Struktur Pyranose-NH-C(=S)-N H-R mit ein- und zweidimensionaler MRS untersucht (Pyranose = 2,3,4,6-Tetra-Oacetyl Glucose, Mannose, oder Galactose). Bei =-Mannose mit Thioharnstoff in axialer Position wird die EZ Konformation bevorzugt aber EE und ZE wurden auch nachgewiesen. Besonders interessant ist die Tatsache, daß bei ZE die Mannose-Ringkonformation von der gewöhnlichen 4 C 1 Sesselform in den selten beobachteten 1 C 4 Sessel mit equatorialem Thioharnstoff umklappt. Um den stereoelektronischen Effekten hinter diesem Verhalten besser zu verstehen wurden intensiven Molecular Modeling Studien (semi-empirischen sowie ab initio Methoden) durchgeführt - u.a. unter die Nutzung der erweiterten Parallelrechner-Kapazitäten der ZDV. Die Arbeiten an diesem Projekt sind weitgehend abgeschlossen und die Ergebnisse werden im Jahr 2002 veröffentlicht. 19 F-MR-Studien zur Fluorpyrimidin-Chemotherapie Fluorpyrimidin Chemotherapie (z.b. mit 5-Fluoruracil, 5-FU) ist eine der ältesten aber noch weitverbreiteten Behandlungsmethoden, insbesondere für Kolonkarzinom und Lebermetastasen. 19 F-MRS bietet die einmalige Möglichkeit die zahlreichen Metaboliten eines Medikamentes wie Fluoruracil z.b. in Blutplasma, Urin, oder Tumorgewebe nachzuweisen und zu quantifizieren. Mehrere Studien dieser Art wurden seit 1986 in der Abteilung erfolgreich durchgeführt. Nach einem Hilferuf aus der Pharmakologie der Universitätsklinikum Heidelberg, haben wir unsere Erfahrung und Meßmethodik zur Verfügung gestellt, um zum ersten Mal eine detaillierte Pharmakokinetik für 5-FU in Blutplasma bei einem Krebspatient mit terminaler Niereninsuffizienz (Hämodialyse-Patient) aufzuzeichnen [9]. Die Behandlung solcher Patienten ist äußerst schwierig weil sie, durch die fehlende Nierenfunktion, keine selbständige Ausscheidung (Clearance) der anfallenden, zum Teil giftigen 5-FU Metaboliten zeigen und daher sehr anfällig für systemische toxische Nebenwirkungen sind. Die NMR-Daten zeigten, daß nach 5 täglichen Bolus-Infusion von 5-FU, und trotz Hämodialyse jeden zweiten Tag, bedenklich hohe Konzentrationen von dem Hauptkatabolit =-Fluor->-Alanine (FBAL) in Plasma erreicht wurden. Auch eine Langzeitinfusion führte zu einem sehr hohen FBAL- Spiegel. Nach weitergehenden NMR-Analysen konnte sogar die FBAL-Metaboliten Fluorhydroxypropionsäure (FHPA) und das Neurotoxin Fluoracetat (FAC) in mikromolare Konzentrationen (Abb. 4) bei den zwei bis jetzt untersuchten Patienten nachgewiesen werden. Beide Patienten zeigten deutliche systemische Nebenwirkungen der Therapie, einer zeigte starke neurologische Störungen. Hier konnte zum ersten Mal die 19 F-MRS die Grenzen der 5-FU Therapie bei Dialyse-Patienten deutlich machen. Es

53 wurde damit klar, daß die Anwendung dieser problematischen Therapie eine noch gründlichere, tägliche Dialyse verlangt. R0400 Zentrale Spektroskopie Produktion und der Export von 5-FU wiederum begrenzt wird. Interessanterweise, funktioniert diese CD/5-FC Gentherapie mit Bystander Effect in einigen anderen Zell- bzw. Tiermodellen doch ausgezeichnet. Unsere MRS-Studie zeigt aber klar und deutlich, warum die Therapie für die gewählte Prostatekarzinom-Linie nicht funktionierte und wie wichtig es ist, die metabolischen Bedingungen einer möglichen Gentherapie durch entsprechende Untersuchungen abzuklären. 105 Abb. 4: 282 MHz 19 F-MRS of Blutplasma eines Dialyse-Patienten mit Kolonkarzinom, 26 Std. nach Ende einer 5-FU Behandlung (2.9 g Infusion über 21 Std) und vor der Hämodialyse. Durch die fehlende Nierenfunktion wird eine sehr hohe Konzentration von FBAL (311 µm) erreicht; bedenkliche Menge von den FBAL-Metaboliten, die neurotoxische Substanzen FHPA und FAC, werden auch nachgewiesen. Der Patient zeigte starke neurologische Nebenwirkungen. 19 F-MRS Untersuchungen zu einem Gentherapie- Modell In einer Kooperation mit der Abt. Debus (E0500) wurde die 19 F-MRS eingesetzt, um metabolische Fragen zu einem Gentherapie-Modell zu beantworten (Cytosin-Deaminase/ 5-Fluorcytosin Therapie des Dunning Prostatekarzinoms der Ratte). Die Prostatekarzinom Zell-Linie AT-1 wurde mit dem Gen für Cytosindeaminase (CD von E. coli) transfiziert. Diese CD + -Zellen waren empfindlich gegenüber Behandlung mit dem Prodrug 5-Fluorcytosin (5-FC), das intrazellulär durch CD in das hochwirksame Zytostatikum 5- Fluoruracil (5-FU) umgewandelt wird. Es wurde aber in Zellkultur und Tierexperimenten festgestellt, daß bei diesem Modell der für eine praktische Therapie so wichtige Bystander Effect (die wirksame Tötung benachbarter, nicht-transfizierter CD - -Zellen durch den in den CD + -Zellen produzierten 5-FU) nicht funktionierte. Um den Grund dieser Fehlschlag zu entdecken, wurde 19 F- MRS Messungen an Suspensionen von intakten CD + -Zellen nach Inkubation mit 5-FC durchgeführt. Die spektroskopische Daten zeigten, daß die Aufnahme des 5-FC in die CD + -Zellen und seine Umwandlung in 5-FU relativ langsam abläuft. Dagegen war die Aktivierung des 5-FU durch Anabolismus zu zytotoxischen Fluor-Nukleotiden (F- Nuctd) wie FUTP (die die Zelle nicht verlassen) relativ schnell; der Export des produzierten 5-FU in das Medium (notwendig für einen Bystander Effect) war wiederum sehr langsam. Ein hoher negativer Konzentrationsgradient zwischen intra- und extrazellulärem 5-FU blieb erhalten, auch nach 16-Std. Inkubation (Abb. 5). Diese effektives trapping des intrazellulären 5-FU in den CD + -Zellen verhindert einen effiizienten Bystander Effect; durch die Wirkung der in CD + -Zellen produzierten F-Nuctd werden diese Zellen (die 5-FU Fabrik) relativ schnell getötet, so daß die Abb. 5: 19 F-MRS (470 MHz, 4 C) von (A) einer Suspension intakter CD + -Zellen, geerntet nach 16-Std. Inkubation with 774 µm 5- FC (4-Std. MRS-Meßzeit) und (B) dem Inkubationsmedium zur Zeit der Ernte (1-Std. Meßzeit). In der Zellsuspension werden drei Signale für intrazelluläres 5-FC (314 µm), 5-FU (52 µm) und eine nicht-aufgelöste Mischung von Fluor-Nukleotiden (163 µm) detektiert. In dem Kulturmedium wird, neben 5-FC, nur eine sehr niedrige Konzentration von 5-FU (6.4 µm) nachgewiesen (sehr schwache Bystander Effect). NMR-basiertes Screening von Liganden für den TRAIL-R2 Rezeptor In einer Kooperation mit der Abt. Krammer (G0300) und der Gruppe Walczak (G0310) wird seit dem 3. Quartal 2001 mit Hilfe der außerordentlichen Leistung des neuen 600 MHz NMR-Spektrometer an einem neuen Strukturforschungsprojekt im Bereich Apoptose gearbeitet. Durch die NMR-Spektroskopie können die Wechselwirkungen von Liganden und Rezeptoren (Struktur und Dynamik) detailliert auf der molekularen Ebene untersucht werden. NMR-Screening bietet die Möglichkeit, niedermolekularen, peptidischen oder nicht-peptidischen Liganden, welche z.b. die Einleitung der Apoptose beeinflussen können, zu entdecken bzw. zu optimieren, mit folgenden Vorteilen: - hohe Empfindlichkeit, auch für die Erkennung schwach bindender Liganden; - Bestimmung der 3D-Struktur des Liganden im gebundenen Zustand (im Komplex); - Bestimmung der beteiligten Bindungsstellen am Rezeptor; - gezielte, rationale Optimierung der Ligandstruktur. Bei den typischen NMR-Screening Anwendungen werden etwa 0,1-1 µmol eines Proteines oder seiner Rezeptor-

54 106 Forschungsschwerpunkt B domäne benötigt. In der Arbeitsgruppe Walczak werden z.z. entsprechende Mengen eines wasserlöslichen Fusionsproteins, gebildet aus der extrazellulären Domäne von TRAIL-R2 und der Fc-Region des menschlichen IgG, aufbereitet. TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand oder APO-2L), ein neulich identifiziertes Mitglied der TNF-Familie von Liganden kann Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzellen hervorrufen mit minimaler Toxizität gegen normale Zellen. TRAIL induziert Apoptose über zwei Rezeptoren, die eine Todesdomäne enthalten: TRAIL-R1 (DR4) und TRAIL-R2 (DR5). Das Fusionsprotein TRAIL-R2-Fc hemmt spezifisch die TRAIL-induzierte nicht aber die CD95L-induzierte Apoptose. TRAIL-R2-Fc ist daher ein geeignetes Modellsystem, um passende Liganden für den membrangebundenen TRAIL-R2 Rezeptor zu finden. Mit Hilfe der vorliegenden Röntgenstruktur des TRAIL/ TRAIL-R2 Komplexes wurden durch Molecular Modeling kurze Abschnitte (Teilsequenzen) im Ligand gefunden, welche für die Affinität und Spezifizität von TRAIL verantwortlich sein könnten. Die entsprechende Oligopeptide sind bereits synthetisiert (Gruppe Pipkorn) und werden zur Zeit mittels 1 H-NMR vollständig charakterisiert. So bald das TRAIL-R2-Fc Fusionprotein bereitgestellt wird, kann das Screening beginnen und die Eigenschaften, die für die Affinität und die Spezifizität der TRAIL/TRAIL-R2 Wechselwirkung verantwortlich sind, näher definiert werden. Zur weiteren Optimierung der Liganden müssen die günstigsten bzw. aktivsten Konformationen der gefundenen Peptide stabilisiert werden, z. B. durch intramolekulare Verknüpfungen. Ein Kandidat-Sequenz ist der 19-mer aus dem Bereich Tyr189 - Val207 der TRAIL-Sequenz - ein Bereich, der wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Spezifizität des Liganden spielt. Im TRAIL-TRAIL-R2 Komplex ist dieser 19-mer in einem konformativ fixierten Loop oder hairpin - ähnlicher Struktur angeordnet und geht gleichzeitig Wechselwirkungen mit zwei Rezeptormolekülen ein (Abb. 6), wobei die dreidimensionale Ausrichtung der Seitenketten eine entscheidende Rolle spielt. Abb. 6: Wechselwirkung zwischen der Teilsequenz Tyr189 - Val207 in TRAIL (mitte) mit zwei Molekülen des TRAIL-R2 Rezeptorproteins (Oberflächen). R0400 Zentrale Spektroskopie Um die Bindungsaffinität eines Modell-Peptides zu erhöhen, muß der zugängliche Konformationsraum der relativ flexiblen Peptidkette eingeschränkt werden, z.b. durch das Einbringen jeweils einen Cystein-Rest am Anfang und Ende der Teilsequenz und die Zyklisierung durch eine Disulfid-Brücke. Zusätzliche Stabilisierung soll durch Wechselwirkungen zwischen den Aminosäureseitenketten erfolgen. Nach einer in der Literatur aufgestellten These, bildet TRAIL-R2 in Abwesenheit des TRAIL-Liganden einen selbstassoziierten Trimer (mittels sogenannten PLAD-Domäne), der die Apoptose nicht im Gange setzen kann. Die Komplexierung des TRAIL-R2 Trimers mit einem TRAIL- Trimer führt zu einer Trennung der PLAD-Kontakte und löst schließlich die Apoptose aus. Eine ähnliche Wechselwirkung zwischen dem TRAIL-R2 Trimer und drei Moleküle unseres bivalenten zyklischen Peptides ist evtl. auch möglich. Mit diesem Projekt sollen hochaffine und selektive Liganden für den TRAIL-R2 Rezeptor aufgebaut werden, wobei die Struktur (Konformation) der Liganden (frei und im Komplex mit dem Rezeptor) bezüglich der Bindungsaffinität, -spezifizität und biologischer Wirkung gezielt optimiert werden soll. Dadurch erhoffen wir niedermolekulare Substanzen liefern zu können, die die Apoptose in Krebszellen auslösen und von therapeutischem Interesse sind. Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Lebedkin, S.; Hull, W.E.; *Soldatov, A.; *Renker, B.; *Kappes, M.M.: Structure and properties of the fullerene dimer C 140 produced by pressure treatment of C 70. J. Chem. Phys. 104 (2000) [2] *Eisenhut; M., Hull, W.E.; *Mohammed, A.; *Mier, W.; *Lay, D.; *Just, W.; *Gorgas, K.; Lehmann, W.D.; Haberkorn, U.: Radioiodinated N-(2-diethylaminoethyl)benzamide derivatives with high melanoma uptake: structure-affinity relationships, metabolic fate, and intracellular localization. J. Med. Chem. 43 (2000) [3] Reinhard, J.; Hull, W.E.; von der Lieth, C.-W.; *Eichhorn, U.; Kliem, H.-C.; *Kaina, B.; Wiessler, M.: Monosaccharide-linked inhibitors of O 6 -methylguanine-dna methyltransferase (MGMT): synthesis, molecular modeling and structure-activity relationships. J. Med. Chem. 44 (2001) [4] Owen, R.W.; *Giacosa, A.; Hull, W.E.; Haubner, R.; Würtele, G.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H.: Olive oil consumption and health: the possible role of antioxidants. Lancet Oncology 1 (2000) [5] Owen, R.W.; *Giacosa, A.; Hull, W.E.; Haubner, R.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H.: The antioxidant/anticancer potential of phenolic compounds isolated from olive oil. Eur. J. Cancer 36 (2000) [6] Owen, R.W.; Mier, W.; *Giacosa, A.; Hull, W.E.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H.: Phenolic compounds and squalene in olive oils: the concentration and antioxidant potential of total phenols, simple phenols, secoiridoids, lignans and squalene. Food Chem. Toxicol. 38 (2000) [7] Owen, R.W.; Mier, W.; *Giacosa, A.; Hull, W.E.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H.: Identification of lignans as major components in the phenolic fraction of olive oil. Clin. Chem. 46 (2000) [8] Owen, R.W.; Haubner, R.; Mier, W.; *Giacosa, A.; Hull, W.E.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H.: The isolation, structure elucidation and antioxidant potential of the major phenolic and flavonoid compounds in brined olive drupes. Clin. Chem. (2002), submitted.

55 [9] *Rengelshausen, J.; Hull, W.E.; *Schwenger, V.; *Göggelmann, C.; *Walter-Sack, I.; *Bommer, J.: Pharmacokinetics of 5-FU and its Catabolites Determined by 19 F- MRS for a Patient on Chronic Hemodialysis. Am. J. Kidney Dis. 39 (2002) U30 - U36. [10] Corban-Wilhelm, H.; Hull, W.E.; Becker, G.; Bauder-Wüst, U.; Greulich, D.; Debus, J.: Cytosine deaminase gene therapy in a Dunning rat prostate tumour model: characterisation of 5-fluorocytosine metabolism and the bystander effect with 19 F-NMR spectroscopy. Gene Therapy (2002) submitted. Molecular Modeling (R0404) C.-W. von der Lieth, M. Frank, A. Bohne-Lang In Zusammenarbeit mit: M. Wießler, H.-C. Kliem, M. Pawlita, P. Altevogt (DKFZ); J.F.G. Vliegenthart, Bijvoet Center for Biomolecular Research, Universität Utrecht, Niederlande; H.-J. Gabius, H.-C. Siebert, Tierärtzliche Fakultät, LMU München, T.K. Lindhorst, Universität Kiel. Zusatzfinanzierung: BMBF Glycobiotechnology Program (B256); Synthese und Molekulardynamik neuer Saccharid-basierten Dendrimere als Basis für neue Medikamente; für C.-W. von der Lieth und W.E. Hull in Kooperation mit M. Wießler (DKFZ) and Beiersdorf AG; 1 Doktorand (A. Bohne); 1 Workstation; Zusatzfinanzierung: DFN-Projekt (B919); Dynamische Moleküle: Darstellung und Analyse der Dynamik von biologischen Makromolekülen per Internet; für C.-W. von der Lieth; 1 Postdoc (M. Frank), versch. HiWis; 1 Linux-Cluster (Teilfinanzierung); D Struktur in Lösung Die möglichst genaue Kenntnis der dreidimensio-nalen (3D) Struktur von biologisch aktiven Verbind-ungen und deren Flexibilität und Dynamik in Lösung ist oft der entscheidende Schlüssel zu einem tieferen Verständnis ihrer Wirksamkeit. Röntgenstrukturanalyse und Neutronenbeugung liefern verläßliche 3D Strukturen von chemischen Verbindungen im kristallinen Zustand. Mit multidimensionalen NMR-Techniken und effektiven Modellierungsprogrammen ist es möglich, die räumliche Strukturen und Dynamik von Molekülen in Lösung zu untersuchen. Die NMR-Daten liefern geometrische Informationen (Atomabstände, Diederwinkel, Stereochemie), die als Eingangsinformationen und/oder Nebenbedingungen z.b. in einer geometrischen Optimierung oder in einer Kraftfeldberechnung verwendet werden können. Die rasche Entwicklung der Computertechnologien erlaubt es, das dynamische Verhalten von zunehmend größeren molekularen Ensembles unter Berücksichtigung der jeweiligen physiologischen Bedingungen zu simulieren. Zur Auswertung werden effiziente Werkzeuge benötigt, die eine weitgehend automatische Analyse der anfallenden riesigen Datenmengen erlaubt. Das in der Arbeitsgruppe entwickelte Programm CAT (Conformational Analysis Tools) [1] ermöglicht eine detaillierte Analyse dynamischer Vorgänge innerhalb von biologischen Markomolekülen und deren Wechselwirkungen untereinander. R0400 Zentrale Spektroskopie Intensive Studien zum Abtasten des konformationellen Raumes von flexiblen Molekülen wurden mittels Molekular-Dynamik Simulationen an Glykodendrimeren und N- Glykanen durchgeführt [2,3]. Um aussagekräftige Beschreibungen des dynamischen Verhaltens von sehr beweglichen Molekülen zu erhalten, erwies es sich als notwendig, neue Möglichkeiten zur Beschreibung der Aufenthaltswahrscheinlichkeiten von funktionellen Gruppen zu entwickeln. Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen Die Untersuchung biologischer Kommunikations -prozesse stellt einen vielversprechenden Ansatz dar, um Erkenntnisse aus der Grundlagenforschung in eine rationale Entwicklung von neuen Strategien zur Diagnose und Therapie von Krebserkrankungen einzubringen. Zunehmend zeigt sich auch die Bedeutung von Kohlenhydraten (Oligosaccharide) heraus. Diese Moleküle werden kovalent an Proteine oder Lipide gebunden, die in der Zellmembran verankert sind. Solche Glykoproteine bzw. Glykolipide stellen wesentliche Komponenten der Zelloberfläche dar und sind somit besonders exponiert, um an Zell-Zell und Zell-Matrix Erkennungs- bzw. Signalprozessen mitzuwirken [4,5]. So wird z.b. der erste Schritt des Anheftens von Leukozyten an die Endothelzellen der Blutgefäße - ein entscheidender Schritt im Entzündungsprozeß - durch Selektine vermittelt, die spezifische Oligosaccharide auf der Zelloberfläche erkennen. Die Bindung von Kohlenhydraten an Modell-Lektinen wurde mittels Transfer-NOE-NMR-Experimenten und verschiedenen Methoden des Molecular Modeling (Homologie-Modelierung, Berechnung der Wechselwirkungsenergien, systematische Konformationssuche, usw.) in verschiedenen Lösungsmitteln untersucht [5,6,7]. Dabei stellte sich heraus, dass aprotische Lösungsmittel, in denen zusätzlich NOE-Kontakte gemessen werden können, einen starken Einfluß auf die Entropie des Komplexes hat und insgesamt zur Verminderung der Bindungsstärke führen [7]. Intensiven Molekular-Dynamik Simulationen für Komplexe der O 6 -Methylguanin-DNA Methyltransferase mit einer Familie neuer synthetischen Inhibitoren wurden durchgeführt. Die Inhibitoren waren Guanin-Derivate, die über unterschiedlich lange Alkylketten mit Glucose gekoppelt wurden. Es gelang uns, ein 3D-Modell zu entwickeln, dass auf atomarer Ebene die unterschiedliche Bindeverhalten der verschiedenen Inhibitoren quantitativ beschreiben konnte [8]. Angewandt wurde hierzu eine neue methodische Entwicklung, die es erlaubt, die Interaktionen zwischen Ligand und Rezeptor (Abb. 7) auf der Basis der einzelnen Aminosäurereste in der Bindungstasche und einzelner Teile des Ligands zu analysieren, d.h. die Wechselwirkung in individuellen Bestandteile zu zerlegen. Dazu konnte auch die interne Dynamik sowohl des Proteins als auch des Inhibitors berücksichtigt werden. Die durch Modeling errechneten Bindungsenergien zeigten eine gute Korrelation mit den gemessen Inhibitionskonstanten. 107

56 108 Forschungsschwerpunkt B Abb. 7: Das Bild zeigt einen sogenannten Snapshot aus einer Molekular-Dynamik Simulation für den Komplex zwischen MGMT und dem Inhibitor M-[O 6 -Bromthenyl-Guan-9-yl]-(CH 2 ) 8 ->-D-Glucoside. Die Röntgenstruktur des MGMT (PDB entry: 1QNT) wurde als Templat verwendet. Der Inhibitor (Stabmodell) und die wasserzugängliche Oberfläche des Proteins werden dargestellt (Seitenketten der Aminosäuren sind beschriftet). Die Bromthenyl-Gruppe und Teil des Guanins sind in dem tunnel-ähnlichen Bereich der Bindungstasche zu sehen (vorne, rechts; Arg135, Ser159, Gly160); die Alkylkette und Glucose-Einheit liegen entlang einer hydrophobischen Mulde (nach hinten, links). Modellieren Sequenz-homologer Proteine Die Zahl der experimentell gelösten 3D Proteinstrukturen hat in den letzten Jahren stark zugenommen, so dass auch für viele in der Krebsforschung relevante Moleküle verläßliche Strukturen mit einem wissensbasierten Ansatz modelliert werden können. Zudem hat sich auch die Qualität der verwendeten Algorithmen kontinuierlich verbessert. Da zudem praktisch alle notwendigen Daten und ein Großteil der Programme über das Internet abgerufen werden können, entwickelt sich eine ständig steigende Nachfrage, diese Möglichkeiten auch für Fragestellungen aus dem DKFZ zu nutzen. Aus diesem Grunde bieten wir einerseits Fortbildungskurse an, andererseits versuchen wir in Form von Linksammlungen den interessierten Kollegen einen einfachen Zugang zu den Datenbanken und Programmen zu eröffnen. Werden neben den Standardanwendungen zusätzliche, komplexe Modellierungsschritte [9] erforderlich, so führen wir diese in Kooperation durch. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Frank, Martin: Konformationsanalyse von Oligosacchariden im freien und gebundenen Zustand. Dissertation: Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät, Univ. Heidelberg (2000). < [2] von der Lieth, C.-W.; Frank, M.; *Lindhorst, T.K.: Molecular dynamics simulations of glycoclusters and glycodendrimers, Reviews in Molecular Biotechnology 90 (2002) [3] Frank, M.; Bohne, A.; *Wetter, T., von der Lieth, C.-W.: Knowledge-Based Approach for the Rapid Generation of a Representative Ensemble of N-Glycan Conformations, In Silico Biology (2002), in press. [4] *Rüdiger, H.; *Siebert, H.-C.; *Solís, D.; *Jiménez-Barbero, J.; *Romero, A.; von der Lieth, C.-W.; *Diaz-Mauriño, T.; *Gabius, H.- J.: Medicinal chemistry based on the sugar code: fundamentals of lectinology and experimental strategies with lectins as targets. Current Medicinal Chemistry 7 (2000) R0400 Zentrale Spektroskopie [5] *Solís, D.; *Jiménez-Barbero, J.; *Kaltner, H.; *Romero, A.; *Siebert, H.-C.; von der Lieth, C.-W.; *Gabius, H.-J.: Towards defining the role of glycans as hardware in information storage and transfer: basic principles, experimental approaches and recent progress. Cells Tissues Organs 168 (2001) [6] *Asensio, J.L.; *Siebert, H.-C.; von der Lieth, C.-W.; *Laynez J.; *Bruix, M.; *Soedjanaamadja, U.M.; *Beintema J.J.; *Cañada, F.J.; *Gabius, H.-J.; *Jiménez-Barbero, J.: NMR investigations of protein-carbohydrate interactions: studies on the relevance of Trp/ Tyr variations in lectin binding sites as deduced from titration microcalorimetry and NMR studies on hevein domains. Determination of the NMR structure of the complex between pseudohevein and N,N*,N(-triacetylchitotriose. Proteins: Structure, Function, and Genetics 40 (2000) [7] *Siebert, H.-C.; *André, S.; *Asensio, J.L.; *Cañada, F.J.; *Dong, X.; *Espinosa, J.F.; Frank, M.; *Gilleron, M.; *Kaltner, H.; *Kozár, T.; *Bovin, N.V.; von der Lieth, C.-W.; *Vliegenthart, J.F.G.; *Jiménez-Barbero, J.; *Gabius, H.-J.: A new combined computational and NMR-spectroscopic strategy for the identification of additional conformational constraints of the bound ligand in an aprotic solvent. ChemBioChem 1 (2000) [8] Reinhard, J.; Hull, W.E.; von der Lieth, C.-W.; *Eichhorn, U.; Kliem, H.-C.; *Kaina, B.; Wiessler, M.: Monosaccharide-linked inhibitors of O 6 -methylguanine-dna methyltransferase (MGMT): synthesis, molecular modeling and structure-activity relationships. Journal of Medicinal Chemistry 44 (2001) [9] Oleszewski, M.; Gutwein, P.; von der Lieth, W.; *Rauch U.; Altevogt, P.: Characterization of the L1-neurocan-binding site. Implications for L1-L1 homophilic binding. Journal of Biological Chemistry 275 (2000)