Die Blutgerinnung stellt ein hochkomplexes

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1 6/ Schattauer GmbH Bedeutung der Mutationsdiagnostik bei Patienten mit Hämophilie A J. Oldenburg 1, 2, 4, J. Schröder 2, J. Graw 3, V. Ivaskevicius 1, H. H. Brackmann 4, W. Schramm 5, C. R. Müller 3, E. Seifried 1, R. Schwaab 2 1 Institut für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie des DRK-Blutspendedienstes Baden Württemberg Hessen, Frankfurt am Main, 2 Institut für Humangenetik, Würzburg, 3 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, Institut für Entwicklungsgenetik, Neuherberg, 4 Institut für Experimentelle Hämatologie und Transfusionsmedizin, Bonn, 5 Medizinische Klinik, Ludwig-Maximilians-Universität München Schlüsselwörter Faktor VIII, Hämophilie A Zusammenfassung Die Hämophilie ist die häufigste genetisch bedingte Form einer schweren Blutungsneigung. Ursächlich für die Erkrankung sind Defekte im Faktor-VIII-Gen, die zu verminderter Faktor-VIII-Aktivität mit einer vom Ausmaß der Störung abhängigen Blutungsneigung führen. Die ursächlichen Gendefekte können inzwischen routinemäßig identifiziert werden. Trotz der Vielfalt der Mutationen lassen sich mehrere Hotspots feststellen, z.b. Inversion im Intron 22, kleine Deletionen/Insertionen an Poly-A und Punktmutationen an CpG-Dinukleotiden. Bereiche geringer Mutationshäufigkeit sind z.b. im mittleren Abschnitt des Exons 14, der für die funktionell wenig bedeutende B-Domäne kodiert und praktisch keine Missense-Mutationen enthält. Die Mutationsdiagnostik verbesserte die Diagnostik und das Verständnis der Pathogenese der Hämophilie- A-Erkrankung. Nach Identifizierung des Gendefekts in einer Familie ist eine schnelle und sichere Konduktorinnendiagnostik möglich. Die Korrelation zwischen Gendefekt und klinischem Verlauf zeigte, dass die Art der Mutation einen wichtigen genetischen Prädispositionsfaktor für die zurzeit schwerste therapeutische Komplikation bei Hämophilie, die Hemmkörperbildung, darstellt. Ein relativ leichter Verlauf bei eigentlich schwerer Hämophilie A lässt sich mit speziellen Mutationen oder gleichzeitig vorliegenden thrombophiliefördernden Mutationen erklären. Molekulare Modelle des Faktor-VIII-Moleküls erlauben gezielt Auswirkungen von Mutationen zu untersuchen und so neue Struktur/ Funktionsbeziehungen zu erkennen. Dies könnte die Entwicklung zukünftiger rekombinanter Gerinnungspräparate mit veränderten Eigenschaften (z.b. höherer Wirkungsgrad, verlängerte Halbwertszeit, geringere Immunogenität) anstoßen. Keywords FVIII, haemophilia A Summary Haemophilia A represents the most frequent hereditary bleeding disorder in humans. The disease is caused by mutations within the factor VIII gene leading to decreased or absent factor VIII activities with a bleeding tendency depending on the degree of factor VIII deficiency. Nowadays, the causative mutations can be routinely detected and have substantially improved diagnostic and understanding of the pathophysiology of haemophilia A. Identification of the gene defects in haemophilic families have enabled fast and save carrier diagnosis. The correlation of the genetic defects with the clinical course revealed that the type of mutation represents the most important genetic predisposing factor for inhibitor formation, the most severe complication of treatment with factor VIII concentrates. Mitigated clinical courses of haemophilia A were shown to be due to special types of mutations or the presence of concomitant thrombophilic mutations. Molecular models of the factor VIII protein allowed to investigate the effects of specific mutations thus giving new insights in the structure/function relationship of the factor VIII molecule. These findings might promote the development of novel recombinant factor VIII concentrates with higher efficacy, longer half life and reduced immunogenicity. Significance of mutation analysis in patients with haemophilia A Hämostaseologie 2003; 23: 6 12 Die Blutgerinnung stellt ein hochkomplexes Netzwerk von mehr als 100 Proteinen dar, die einerseits die Fließfähigkeit des Bluts garantieren und zum anderen seine unmittelbar einsetzende Gerinnung bei Gefäßverletzung sicherstellen. Praktisch alle Gerinnungsfaktoren können von Mutationen betroffen sein, die je nach Funktion des entsprechenden Gerinnungsfaktors entweder zu einer erblichen Form der Blutungsneigung (Hämophilie) oder Thromboseneigung (Thrombophilie) führen. Die Hämophilie A ist mit einer Inzidenz von 1:5000 der männlichen Neugeborenen die häufigste schwere Hämophilie-Form. Sie wird X-chomosomal rezessiv vererbt. Ursächlich für die Erkrankung sind Mutationen im Faktor-VIII(FVIII)-Gen, die zu einer Verminderung oder völligem Fehlen des Gerinnungsfaktors VIII führen. Schweregrad und Häufigkeit der Blutungen, die meistens Muskulatur und Gelenke betreffen, sind abhängig vom Ausmaß der FVIII-Verminderung. Im Falle einer unzureichenden Behandlung kommt es zu fortschreitenden arthropathischen Gelenkveränderungen. Durch prophylaktische Gaben von aus Plasma oder gentechnisch hergestellten FVIII-Konzentraten lassen sich Blutungsfolgen (z. B. Gelenkveränderungen) weitgehend vermeiden, so dass junge Hämophilie-A-Patienten praktisch eine durchschnittliche Lebenserwartung und auch -qualität aufweisen.

2 7/19 Mutationsdiagnostik bei Hämophilie A für ein 2351 Aminosäurereste (AS) großes Protein (Abb. 2). Zwei besondere Charakteristika des FVIII-Gens sind hervorzuheben: Exon 14, das etwa 40% der cdna umfasst und für die funktionell wenig bedeutsame B-Domäne des FVIII-Proteins kodiert (18), Intron 22, das die beiden Gene F8A und F8B enthält mit unbekannter Bedeutung (9, 10). Abb. 1 Markierung des FVIII-Gens mittels FISH-Technik: Übersichtsaufnahmen (A, B) und drei Metaphasen (C) mit markiertem X-Chomosom im Bereich des Zentromers und FVIII-Gens am äußersten Ende des langen Arms (Pfeile) Mutationsanalyse des FVIII-Gens Abb. 2 Struktur des Faktor-VIII-Gens und -Proteins Das FVIII-Gen wurde 1984 von Toole et al. (22) und Vehar et al. (23) auf dem X-Chromosoms in der Xq28-Region (Telomerende des langen Arms) entdeckt (Abb. 1). Es besteht aus 26 Exons in einem Bereich von 186 kb und gehört damit zu den großen Genen des menschlichen Genoms (0,1% des X-Chromosoms). Die mrna kodiert Die treibende Kraft der Mutationsdiagnostik war anfänglich das Ziel, potenzielle Überträgerinnen aus Hämophilie-Familien adäquat beraten zu können. Aufgrund der hohen Neumutationsrate erlaubten die herkömmlichen Kopplungsanalysen oft keine sichere Diagnose. Allerdings erschwerten die Größe des FVIII-Gens und die Vielfalt der genetischen Defekte deren Aufklärung jahrelang. Inzwischen gibt es eine Reihe von effizienten Mutationsscreening- und automatisierten Sequenziermethoden zur routinemäßigen Analyse auch relativ großer Gene (16). Hierdurch wurde die Mutationsanalyse bei den Hämophilien zur Grundlage vieler diagnostischer und wissenschaftlicher Fragestellungen. Abbildung 3 zeigt eine Übersicht zu den Bereichen der Hämophilie A, die sich durch die Mutationsdiagnostik erschlossen. Die Vielfalt der Mutationen bei der Hämophilie A ist außerordentlich groß. Etwa ein Drittel der neu diagnostizierten Punktmutationen bei Hämophilie-A-Familien sind in der Literatur nicht beschrieben. Tabelle 1 zeigt ein aus eigenen Daten für die schwere Verlaufsform der Hämophilie A erstelltes Mutationsprofil. Die häufigste Mutation mit einem Anteil von fast 50% ist die Intron-22-Inversion. Sie beruht auf einer intragenen Rekombination des FVIII-Gens, die zwischen einem 9 kb langen homologen Bereich des Introns 22 und zwei damit identischen Kopien am Telomerende stattfindet (8). Dieses Mutationsprinzip ist bisher nur für sehr wenige Gene beschrieben. Bei der Hämophilie A ist es einer der wesentlichen Gründe für die hohe Neumutationsrate und damit die relative Häufigkeit der Erkrankung. Da in der Meiose weiblicher Keimzellen die homologe Paarung der X-Chromosomen die intragene Rekombination erschweren, hat die

3 8/20 Oldenburg et al. Intron-22-Inversion ihren Ursprung ganz überwiegend in männlichen Keimzellen (3). Weitere wichtige Mutationstypen mit einem Anteil von je 10 bis 15% sind Nonsense-Mutationen, die zu einem Stopp bei der Translation führen, Missense-Mutationen, bei denen es zum Austausch einer Aminosäure kommt, und kleine Deletionen oder Insertionen, bei denen einzelne Nukleotide fehlen oder zusätzlich eingefügt werden. Andere Mutationstypen wie große Deletionen, Spleißstellen-Mutationen und die im vergangenen Jahr beschriebene Intron- 1-Inversion sind vergleichsweise selten (2). Bei den wenig schweren Verlaufsformen kommen fast ausschließlich Missense-Mutationen vor (19, 20). Alle bekannten Mutationen sind in einem internationalen Mutationsregister aufgeführt ( csc.mrc.ac.uk). Grundsätzlich sind die Mutationen abgesehen von der häufigen Intron-22-Inversion über das gesamte FVIII-Gen verteilt. Dennoch sind einige Besonderheiten festzustellen. So kommen Missense-Mutationen in den mittleren zwei Dritteln der B-Domäne praktisch nicht vor (Abb. 4). Offensichtlich führen Missense-Mutationen in diesem Bereich nicht zu einem hämophilen Phänotyp, da die B-Domäne nicht Bestandteil des enzymatisch aktiven FVIII-Proteins ist (18). Abgesehen von der häufigen Intron-22- Inversion lassen sich zwei weitere eindeutige Hotspots identifizieren. Dies sind kleine Deletionen/Insertionen in Serien von Adeninnukleotiden im Exon 14 und Punktmutationen an CpG-Dinukleotiden. Abbildung 5 zeigt anhand eigener Mutationsdaten, dass Del-A- bzw. Ins-A-Mutationen den weitaus größten Teil der kleinen Deletionen/Insertionen im FVIII-Gen ausmachen. 29 der 32 Del-A/Ins-A-Mutationen liegen im Exon 14, 23 davon kommen an drei Folgen von 6, 8 und 9 Adeninresten vor (Abb. 6). Die Ursache für diese Mutationen sind Slippage-Fehler der Polymerasen bei der DNA-Replikation bzw. RNA-Transkription. Unsere Daten belegen ebenfalls den Hotspot an CpG-Dinukleotiden. 148 (36,6%) von 402 Missense- bzw. Nonsense- Abb. 5 Kleine Deletionen und Insertionen im FVIII-Gen Abb. 3 Bedeutung der Mutationsdiagnostik für verschiedene Bereiche der Hämophilie A Tab. 1 Mutationsprofil bei Patienten mit schwerer Hämophilie A (n = 645) Abb. 4 Verteilung von Missense- Mutationen im FVIII-Gen

4 9/21 Mutationsdiagnostik bei Hämophilie A Abb. 6 Verteilung der kleinen A-Insertionen und A-Deletionen an den verschiedenen Codonpositionen im Exon 14 Mutationen entstanden an 30 CpG-Dinukleotiden (Abb. 7), obwohl diese nur 1% aller Nukleotide des FVIII-Gens ausmachen. An weiteren 40 CpG-Dinukleotiden, überwiegend solche im Exon 14, das für die B-Domäne kodiert, wurden keine Mutationen gefunden, wahrscheinlich, weil hier Missense-Mutationen nicht wie bereits beschrieben zur Hämophilie A führen. Da Codons mit CpG-Dinukleotiden vor allem für die Aminosäure Arginin kodieren, ist diese mit Abstand am häufigsten von Mutation betroffen (Abb. 8). Bei etwa 1,5% der Hämophilie-Patienten werden keine Mutationen in der FVIIIcDNA gefunden, so dass anzunehmen ist, dass bei diesen Patienten entweder Mutationen in nicht kodierenden Regionen liegen oder aber andere Gene betroffen sind, die für Proteine kodieren, die mit FVIII zu irgendeinem Zeitpunkt während der Biosynthese, Sekretion, Funktion oder Clearance interagieren (7). Genotyp-Phänotyp- Beziehungen Abb. 7 Verteilung der Missense- und Stopp-Mutationen innerhalb von CpG-Dinukleotiden (Angabe der Codonposition) Abb. 8 Anzahl der mutierten Aminosäuren. Der helle Anteil der Balken stellt Mutationen ohne CpG-, der dunkle Anteil Mutationen mit Beteiligung von CpG-Dinukleotiden dar. In den vergangenen Jahren zeigte sich, dass der Typ der Mutation ganz entscheidend für das Risiko der Hemmkörperbildung ist, die immer noch die gravierendste Komplikation der Hämophiliebehandlung darstellt und bei etwa 20-30% der schwer von Hämophilie Betroffenen auftritt (19, 20). Schwere molekulare Gendefekte haben ein 7- bis 10fach höheres Risiko als weniger schwere molekulare Gendefekte, obwohl alle mit einer klinisch schweren Verlaufsform der Hämophilie A einhergehen. Abbildung 9 zeigt eine Übersicht zu den verschiedenen Mutationsgruppen und den damit verbundenen Hemmkörperrisiken. Die Hemmkörperprävalenzen reichen von 88% bei großen, mehrere FVIII-Proteindomänen umfassenden Deletionen bis zu 3% bei z. B. Spleißstellen-Mutationen. Bisher wurden zehn Mutationsgruppen mit deutlich verschiedenen Hemmkörperrisiko identifiziert (15). Diese Zusammenhänge sind bisher nur teilweise bekannt. Eine wichtige Ursache für die verschiedenen Hemmkörperprävalenzen sind zweifelsfrei

5 10/22 Oldenburg et al. Unterschiede in der Menge an endogenem FVIII-Protein, das bei einigen Mutationsgruppen vollständig fehlt (z. B. bei großen Deletionen und Intron-22-Inversionen), während bei anderen Mutationstypen (z. B. Missense-Mutationen) ein wenn auch funktionsloses FVIII-Protein gebildet wird, das offensichtlich ausreicht, um eine natürliche Immuntoleranz gegen den therapeutisch gegebenen FVIII zu erzeugen. Ein weiterer wichtiger Pathomechanismus für die Inhibitorbildung wird deutlich anhand der Verteilung der Missense-Mutationen, die mit einem Hemmkörper assoziiert sind. Unabhängig vom Schweregrad der Hämophilie A werden Hemmkörper vor allem bei Missense-Mutationen in der C1- und C2-Domäne des FVIII-Proteins gefunden. Dieser Zusammenhang deutet darauf hin, dass diese Proteinbereiche, die die Bindung an von-willebrand-faktor (vwf) und Phospholipide vermitteln, besonders wichtig für die Immunogenität des FVIII-Moleküls sind. Eine im Zusammenhang mit der Hemmkörperbildung sehr wichtige Entdeckung war die Wiederherstellung des Leserasters bei kleinen Deletionen/Insertionen innerhalb zweier Serien von Adenin-Nukleotiden in Exon 14 durch natürliche Fehler des Polymeraseenzyms bei der DNA-Replikation und RNA-Transkription (24). Die beiden Serien von 8 bzw. 9 Adeninnukleotiden provozieren offensichtlich Fehler der Polymerase, die als Slippage-Errors bezeichnet werden. Diese führen einerseits zur Entstehung der kleinen Deletions- bzw. Insertions-Mutationen, andererseits im Falle einer Mutation aber auch zu einer kleinen Zahl von mrna-transkripten mit normalem Leseraster. Als Folge dieser Polymerasefehler entsteht eine sehr kleine Zahl von funktionsfähigen FVIII-Molekülen, die sowohl das niedrige Hemmkörperrisiko bei diesem Mutationstyp als auch die klinische Beobachtung erklären, dass einige Patienten mit schwerer Verlaufsform eine signifikant geringere Blutungsneigung aufweisen (14). Ein weitere Mechanismus, der zu mildem klinischen Verlauf beitragen kann, ist das gleichzeitige Vorliegen thrombophiler Mutationen. Es gibt Hinweise, dass zwei Abb. 9 Abb. 11 Einfluss des Mutationstyps auf die Hemmkörperprävalenz Me + Liganden des Faktor-VIII-Proteins Abb. 10 Cartoon des Tenasekomplexes

6 11/23 Mutationsdiagnostik bei Hämophilie A häufige thrombophile Polymorphismen in der kaukasischen Bevölkerung (FV-Leiden- und Prothrombin Mutation) klinisch schwere Verläufe der Hämophilie abmildern (4). Nicht alle Hämophilie-Phänotypen sind durch Mutationen im FVIII-Gen verursacht. Bei der vwe Typ 2N liegt ein Bindungsdefekt am vwf für FVIII vor. Da FVIII nicht an den vwf binden kann, reduziert sich die FVIII-Halbwertszeit von normalerweise 12 auf eine Stunde (12). Beim kombinierten FVIII-FV-Mangel liegen Mutationen in einem für das intrazelluläre Processing beider Proteine wichtigen Chaperon vor, dem ERGIC53 (Endoplasmatic reticulum Golgi intermediate compartment protein). Hierdurch wird die Sekretion beider Proteine beeinträchtigt (13). Struktur/Funktionsbeziehungen des FVIII-Proteins Das in den Kupffer-Sternzellen der Leber gebildete FVIII-Protein besteht aus mehreren sich wiederholenden Domänen in der Reihenfolge A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2. Die C1- und C2-Domäne verankern das Faktor-VIII-Protein in der Phospholipidmembran der verletzten Gefäßoberfläche bzw. der Thrombozyten. Die drei A-Domänen stellen die Bindungsstellen für die enzymatisch aktiven Zentren der Faktoren FIXa und FX dar, wodurch diese räumlich zusammengeführt werden und miteinander reagieren können (Abb. 10). Hierdurch beschleunigt das Faktor-Protein die Aktivierung von FX durch FIXa um das fache. Die große B-Domäne wird bei der Aktivierung des FVIII proteolytisch durch Thrombin herausgeschnitten und ist nicht Bestandteil des aktiven FVIII-Proteins. Die Funktion der B-Domäne, die immerhin über ein Drittel der Größe des FVIII-Proteins ausmacht, ist noch weitgehend unbekannt. Die Inaktivierung von FVIII erfolgt durch aktiviertes Protein C und Dissoziation der einzelnen Untereinheiten (5). Abbildung 11 zeigt eine Übersicht der FVIII-Liganden. Die Interaktion zwischen FVIII und vwf wird über mehrere Bereiche des FVIII-Moleküls vermittelt. Die Bindung an vwf schützt FVIII vor proteolytischer Spaltung und ermöglicht ihm so eine Halbwertszeit von 12 Stunden. (Ohne Bindung würde die Halbwertszeit etwa eine Stunde betragen.) Zuletzt wurde die Wechselwirkung zwischen FVIII-Protein, LRP (Abk für low density lipoprotein receptor related protein) und HSPGs (Heparinsulfatproteoglykane) entdeckt. Die Bindung an diese beiden Liganden ist ein wichtiger Mechanismus für die FVIII- Protein-Clearance. Durch Blockierung dieser Bindung lässt sich die FVIII-Halbwertszeit um das 5,5fache verlängern (1). Bis vor kurzem blieben Kristallisationsstudien des FVIII-Proteins wegen dessen Labilität und geringer Plasmakonzentration ohne Erfolg wurde ein Proteinmodell für die A-Domänen publiziert, das vom Caeruloplasmin abgeleitet war und überraschend gute Angaben dazu erlaubte, welche Aminosäurereste auf der Oberfläche bzw. im Inneren des FVIII-Moleküls lagen (17). In den vergangenen zwei Jahren wurde die Röntgenkristallstruktur der C1- und C2-Domänen aufgeklärt. Diese zeigte, dass die Verankerung des FVIII- Proteins auf der Phospholipidoberfläche der Thrombozyten durch eine kleine Zahl von hydrophoben Aminosäureresten der C2-Domäne und zusätzlich durch elektrostatische Bindungskräfte erfolgt (21). Patienten mit Missense-Mutationen in der C1-C2-Domäne weisen ein relativ erhöhtes Hemmkörperrisiko auf, so dass diese Bereiche offensichtlich sehr wichtig für die Immunogenität des FVIII-Proteins sind (11). Basierend auf den Erkenntnisse zur Struktur/Funktionsbeziehung der einzelnen Bereiche des FVIII-Moleküls entstanden verschiedenen Ansätze zur Entwicklung neuer FVIII-Moleküle. Diese Ansätze umfassen die Veränderung von FVIII- Aktivierungs- bzw. -Inaktivierungsstellen (6) und die Blockierung der oben beschriebenen LPR-HSPG-Interaktion zur Herstellung von FVIII-Molekülen mit einer verlängerten Halbwertszeit sowie auch die Herstellung von human-porcinen FVIII- Hybridmolekülen, die bei weitgehend erhaltener Funktion eine geringere Immunogenität bzw. Reaktivität mit FVIII-Antikörpern aufweisen (1). Ausblick Die Arbeiten zu den molekularen Grundlagen des FVIII-Gens und -Proteins waren die Voraussetzung für die rekombinante Herstellung von FVIII-Gerinnungskonzentraten. Darüber hinaus haben sie das Verständnis der klinischen Verläufe bei Hämophilie A, insbesondere bei Inhibitorbildung, und der komplexen Interaktionen des FVIII-Moleküls mit anderen Proteinen/Rezeptoren wesentlich erweitert. Neue funktionell wichtige Domänen dieser Proteine werden entschlüsselt und sind Ausgang für die Entwicklung von zukünftigen Generationen rekombinanter Gerinnungspräparate, die bestimmte Proteineigenschaften (z. B. höherer Wirkungsgrad, verlängerte Halbwertszeit, geringere Immunogenität) gezielt stärken bzw. neu erzeugen. Literatur 1. Ananyeva NM, Kouiavskaia DV, Shima M, Saenko EL. Catabolism of the coagulation factor VIII. Can we prolong life time of factor VIII in circulation? Trends Cardiovasc Med 2001; 11: Bagnall RD, Waseem N, Green PM, Gianelli F. Recurrent inversion breaking intron 1 of the factor VIII gene is a frequent cause of severe hemophilia A. Blood 2002; 99: Becker J, Schwaab R, Möller-Taube A, Schwaab U, Schmidt W, Brackmann HH, Grimm T, Olek K, Oldenburg J. Characterization of the factor VIII defect in 147 patients with sporadic hemophilia A: Family studies indicate a mutation type dependent sex ratio of mutation frequencies. 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