Untersuchungen zur Expression und Lokalisation von Arabidopsis thaliana Cryptochrom 3

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1 Untersuchungen zur Expression und Lokalisation von Arabidopsis thaliana Cryptochrom 3 DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) dem Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von Julia Sommer (geb. Kopecky aus Kassel) Marburg/Lahn 2010

2 Vom Fachbereich Biologie der Philipps-Universität als Disseration angenommen am: Erstgutachter: Prof. Dr. Alfred Batschauer Zweitgutachter: Prof. Dr. Uwe Maier Tag der mündlichen Prüfung:

3 INHALT 3 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Photorezeptoren Phytochrome Phototropine ZTL/ADO-Familie Putative UV-B Rezeptoren Cryptochrome Cryptochrome in Tieren Cryptochrome in Pflanzen Bifunktionelle Photolyasen/ Cryptochrome Die cry-dash Familie Zielsetzung Material Chemikalien Puffer und Lösungen Geräte Organismen Arabidopsis thaliana Escherichia coli Agrobakterium tumefaciens Antikörper Plasmide Oligonukleotide Primer für real-time PCR Primer zur Amplifikation des CRY3-Promotors Primer zur Amplifikation des CRY3-Gens Primer zur Amplifikation des Transitpeptids der Ferrodoxin-NADP + - Oxidoreduktase Primer zur Amplifikation des Signalpeptids der Isovaleryl-CoA Dehydro- genase Primer zur Amplifikation der NES aus RanBP1a Primer zur Deletion der α-helix aus cry Methoden Arbeiten mit Arabidopsis thaliana Pflanzen und Zellkulturen Pflanzenanzucht in Erde Sterilanzucht auf Phytoagar... 41

4 INHALT Flüssigkultur Zellkultur Herstellung von Protoplasten aus Zellkultur Herstellung von Protoplasten aus Blättern oder Wurzeln von Arabidopsis thaliana PEG vermittelte Transformation von Arabidopsis thaliana Protoplasten Agrobakterien-vermittelte Transformation von Arabidopsis Pflanzen durch floral dip Proteinbiochemische Methoden Herstellung von Protein-Gesamtextrakt aus Arabidopsis thaliana Kernproteinisolation aus Arabidopsis Zellkultur Konzentrationsbestimmung von Proteinen mit Amidoschwarz SDS-Page nach Lämmli Coomassie-Färbung von Polyacrylamid-Gelen Immobilisierung von Proteinen auf Nitrocellulose-oder PVDF-Membran Immunodetektion von Proteinen Rehybridisierung einer Membran Molekularbiologische Methoden Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli Isolation genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana Isolation von mrna aus Arabidopsis thaliana cdna Herstellung aus Arabidopsis RNA Amplifikation von DNA durch PCR Aufarbeitung der real-time PCR Rohdaten Agarosegelelektrophorese Restriktion und Ligation von DNA-Fragmenten Sequenzierung Datenbankanalysen Fluoreszenzmikroskopie Konfokale Laserscanning-Mikroskopie Epifluoreszenz-Mikroskopie Ergebnisse Cryptochrom 3 Expression in Organen von Arabidopsis thaliana Cryptochrom 3 Proteingehalt in Organen von Arabidopsis thaliana Chloroplasten-Import des cry3 Proteins Möglicher Einfluss von Licht auf den Import von cry3 in Chloroplasten Die Rolle der N-terminalen α-helix für den Plastidenimport cry3-gfp wird in transgenen Pflanzen in Chloroplasten importiert Künstlicher Organellen-Import von cry

5 INHALT Das FNR-Transitpeptid adressiert cry3 an die Chloroplasten Das Targeting-Signal der IVD dirigiert cry3 in Mitochondrien Das cry3 Protein lokalisiert im Nucleolus cry3-gfp-nes lokalisiert nicht im Nucleolus cry3-gfp lokalisiert im Zellkern in transgenen 35S:cry3-GFP Pflanzen Diskussion Das cry3 Protein liegt vermehrt in Wurzeln und Blüten vor Die Chloroplasten-Lokalisation von cry3 ist lichtunabhängig Cry3 ist auch im Nucleolus lokalisiert Zusammenfassung Literatur Anhang Plasmide Datenbankanalyse

6 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 6 Abkürzungsverzeichnis μl Mikroliter μm Mikrometer Abb. Abbildung A.dest. destilliertes Wasser AK Antikörper At Arabidopsis thaliana bp Basenpaare Bph Bakterielle Phytochrome BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumine) cdna complementary DNA CPD Cyclobutan-Pyrimidin- Dimer Cph cyanobakterielle Phytochrome CRY Cryptochrom-Apoprotein cry Cryptochrom-Holoprotein CRY Wildtyp Cryptochrom-Gen cry mutiertes Cryptochrom- Gen DAS D-Motiv, saure Aminosäuren, Serin-reiche Sequenz; DIC Differential Interference Contrast DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DTT Dithiothreithol E. coli Escherichia coli ECL Enhanced Chemiluminescence EDTA Ethylendiamintetraacetat EtOH Ethanol FAD Flavinadenindinukleotid fg Femtogramm FMN Flavinmononukleotid FNR Ferrodoxin-NADP- Oxidoreduktase Fph Phytochrome in Pilzen g Gramm GFP Green Fluorescent Protein Gl Gleichung GUS b-glucuronidase h Stunde(n) HIR HKRD HRP Hz i.d.r. IgG IVD kda L LFR LOV M Mbp min mm MTHF N 2 NES NB NLS NoLS nm OD p() PCR Phy Phot PHR RNA rpm RRM RT s SCN SDS SDS-PAGE TEMED Tris/HCl Hochintensitätsreaktion Histidinkinase-related Domain Horseradish Peroxidase Hertz in der Regel Immunglobulin G Isovaleryl-CoA- Dehydrogenase Kilo Dalton Liter Low Fluence Response Light, Oxygen, Voltage mol pro Liter Megabasenpare Minute(n) millimolar Methenyltetrahydrofolat Stickstoff Nucleus Export Sequenz Nuclear Bodies Nucleus Import Sequenz Nucleolus Import Sequenz Nanometer optische Dichte Precursor Polymerase Chain Reaction Phytochrome Phototropin Photolyase related Ribonukleinsäure rounds per minute RNA recognition motif Raumtemperatur oder Reverse Transkription Sekunde(n) suprachiasmatische Nuklei Natriumdodecylsulfat SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese N,N,N,N,- Tetramethylendiamin Tris-(hydroxymethyl)- aminoethanhydrochlorid

7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 7 u ubi UV v VLFR Unit Ubiquitin Ultraviolett Volumen Very Low Fluence Response w WT (x) g Gewicht Wildtyp Vielfaches der Erdbeschleunigung

8 EINLEITUNG 8 1. Einleitung 1.1. Photorezeptoren Pflanzen sind als sessile, photoautotrophe Organismen abhängig von der Lichtqualität bzw. quantität, die an ihrem Standort herrscht. Um sich diesen Bedingungen optimal anzupassen und z.b. die zur Photosynthese benötigte optimale Lichtmenge zu absorbieren, besitzen Pflanzen Photorezeptoren. Mit diesen können sie die einfallende Lichtenergie sowie die Wellenlängen wahrnehmen und daraus Rückschlüsse auf ihre Position (z.b. im Wald unter einem Blätterdach) ziehen und mit verändertem Wachstum reagieren. Lichtqualität bezieht sich auf die Wellenlänge (λ, angegeben in nm) und wird vom menschlichen Auge im Bereich von nm wahrgenommen. Pflanzen können darüber hinaus Licht im nahen UV-Bereich sowie im Dunkelrotbereich perzipieren (Batschauer, 1998). Die Lichtquantität wird auch als Fluenzrate bezeichnet und gibt die Photonenmenge pro Fläche und Zeit (µmol/m 2 s) an. Phototropin Cryptochrom Phytochrom Phototropismus Deetiolierung Photoperiodismus Abb. 1.1: Die Photorezeptoren der Pflanzen. Funktion der (Blau-)Lichtrezeptoren in Arabidopsis thaliana für den Phototropismus, Photomorphogenese und photoperiodisches Blühen (gestrichelte Pfeile). Die Mitglieder der Zeitlupe Familie sind hier nicht berücksichtigt (aus Lin, 2002).

9 EINLEITUNG 9 Alle höheren Pflanzen verfügen über mehrere Klassen von Photorezeptoren. Dies sind die UV-A/Blaulicht absorbierenden Cryptochrome, Phototropine sowie die Zeitlupe- (ZTL) Proteinfamilie, und die Rot und Dunkelrot absorbierenden Phytochrome (Übersichtsartikel Banerjee und Batschauer 2005). Auch Licht im UV-B Bereich kann von Pflanzen wahrgenommen werden. Der hieran beteiligte Photorezeptor konnte jedoch noch nicht molekular identifiziert werden Phytochrome Phytochrome (im Folgenden als phy bezeichnet) sind dimere Proteine, die durch Absorption von rotem bzw. dunkelrotem Licht einer reversiblen Konformationsänderung unterliegen, die ihre Absorptions-Eigenschaften verändern. Sie liegen in der Zelle in der sog. Pr oder Pfr Form vor, wobei die Pr-Form rotes (660 nm, red), die Pfr-Form dunkelrotes (730 nm, far-red) Licht absorbiert und das Protein damit in die jeweils andere Form überführt (Übersichtsartikel Batschauer, 1998; Rockwell et al., 2006). Daraus ergibt sich ein Equilibrium aus Pr- und Pfr-Form, das der Pflanze die Lichtbedingungen am Standort reflektiert. Phytochrome steuern verschiedene Prozesse in der Pflanzenentwicklung (Keimung, De-Etiolierung, Blütenentwicklung), die zusammen als Photomorphogenese bezeichnet werden. Phytochrome von Arabidopsis thaliana haben ein MW von ~125 kda und tragen N-terminal den Chromophor Phytochromobilin - ein offenkettiges, lineares Tetrapyrrol, welches kovalent gebunden ist. Die cis-trans Isomerisierung des Chromophors (Mancinelli, 1994), die die Absorptionseigenschaften des Photorezeptors verändert, ist auch Auslöser für die lichtinduzierte Konformationsänderung des Proteins (Park et al., 2000). Phytochrome besitzen eine photosensorische Domäne (Nterminal) und einer regulatorischen Domäne (C-terminal), die für die Dimerisierung zuständig ist. Die photosensorische Region ist aus einem PAS-ähnlichen Motiv, einer GAF- Domäne (entfernt verwandt mit PAS, kommt vor in pflanzlichen Phytochromen und cgmpspezifischen Phosphodiesterasen), die den Chromophor trägt, und einer Phytochromspezifischen Domäne aufgebaut. Im C-Terminus sind zwei PAS-Domänen (in pflanzlichen Phytochromen) sowie eine Histidin-Kinase ähnliche Domäne (HKRD) konserviert (Abb. 1.2). Der C-Terminus vermittelt die Homodimerbildung und ist obligat für die Bildung von Nuklear Bodies (siehe unten, Oka et al., 2004), von denen man annimmt, dass sie den Ort der Degradation von Transkriptionsfaktoren (den PIFs) darstellen (Chen et al., 2005). In Arabidopsis thaliana hat die Genfamilie der Phytochrome fünf Mitglieder (Phy A-E, Clack et al., 1994), in Oryza sativa drei (Takano et al., 2005) und in Pinus vier. Grundsätzlich

10 EINLEITUNG 10 lassen sich die Phytochrome in TypI und II einteilen: PhyA gehört zu TypI und kommt in großen Mengen in etiolierten Pflanzen vor, seine Pfr-Form ist lichtinstabil (Quail et al., 1995). PhyA kontrolliert Schwachlicht-Antworten (VLFR, Very Low Fluence Response) sowie Starklicht-Reaktionen im dunkelroten Bereich (FR-HIR, Far-Red High-Irradiance Response). TypII kommt hauptsächlich in grünen Pflanzen vor, aber auch in etiolierten Keimlingen. Die Schwachlicht-Reaktion (LFR) und die Starklicht-Antwort auf hellrotes Licht (HIR) werden durch PhyB-E gesteuert. Sie gehören zu TypII (Quail, 2002). Photosensorische Regulatorische Domäne Abb. 1.2: Domänenstruktur der Phytochrom-Familie. Alle Mitglieder besitzen N- terminal eine photosensorische Region und eine regulatorische C-terminale Domäne, verwandt mit Zwei-Komponenten Histidin-Kinasen (HKRD). Nur pflanzliche Phytochrome (Phy) verfügen über zwei zusätzliche PAS-Domänen in der regulatorischen Region. Phytochrome aus Pilzen (Fph) gleichen in ihrer Struktur den bakteriellen (Bph) und cyanobakteriellen (Cph) Phytochromen, tragen aber C-terminal eine regulatorische Empfängerdomäne (RR, Response Reguator, weitere Abk. siehe Text). (Aus Rockwell et al., 2006.) Die Pfr-Formen der TypII Phytochrome sind im Gegensatz zu phya stabil und werden konstitutiv exprimiert (Somers et al., 1991). Die verschiedenen Mitglieder dieser Genfamilie haben sowohl spezielle als auch gemeinsame Funktionen bei der Kontrolle der Pflanzenentwicklung (Smith et al., 1997; Franklin et al., 2003; Monte et al., 2003). Bei Dunkelheit lokalisieren die Phytochrome hauptsächlich im Cytosol, (phyb-e zeigen ein schwaches Kernsignal als GFP-Fusionsprotein), bei Belichtung werden sie jedoch in den Kern transportiert, wo sie sich zu sog. Nuclear Bodies formieren (NBs, Hisada et al., 2000; Kircher et al., 2002). In etiolierten Keimlingen wird phya sehr schnell in den Kern transloziert und die maximale Bildung von NBs ist nach 10 min Belichtung erreicht. Dabei ist Licht jeder Wellenlänge wirkungsvoll und phya wird vermutlich in diesen Körperchen ubiquitiniert und anschließend abgebaut. PhyB wird bei Belichtung wesentlich langsamer

11 EINLEITUNG 11 in den Kern importiert, die sich dort formierenden NBs sind stabil und in Dunkelheit nach etwa 24 h wieder aufgelöst (Gil et al., 2000). Nur Dauerrot- oder Weißlicht können den Kernimport von phyb bewirken, während dunkelrotes oder blaues Licht sowie einzelne Lichtpulse wirkungslos sind. PhyC-E werden ebenfalls im Weißlicht in den Kern transloziert und eine maximale Formation von NBs ist nach 2 h zu beobachten (Kircher et al., 2002). Die Anzahl und Größe der NBs ist abhängig von der Fluenzrate. Nach dem Transport in den Kern können die Phytochrome dort mit anderen Proteinen ihrer Signalkette interagieren, die auch Teil der NBs sein können. So konnten Bauer et al. (2004) zeigen, dass PIF3 (ein basischer Helix-Loop-Helix Transkirptionsfaktor, Phytochrome Interacting Factor) mit den frühen NBs von phya, B und D co-lokalisiert, jedoch nicht mit den sich spät bildenden NBs. Durch Deletionskonstrukte konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus von phyb allein konstitutiv in den Kern transportiert wird (Nagy und Schafer, 2000; Nagy et al., 2001; Chen et al., 2005). Die PAS-Motive im C-Terminus sind für den Transport von phyb in den Kern notwendig (Chen et al., 2005). Sie enthalten eine NLS, die in der Pr-Form von phyb von der N-terminalen Domäne des Proteins maskiert wird. Lichtabhängig ändert sich die Konformation und gibt in der Pfr-Form die PAS-Domäne und damit die NLS frei. Der Kernimport von phya ist von den kleinen, pflanzenspezifischen Proteinen FHY1/FHL abhängig (Hiltbrunner et al., 2005; Hiltbrunner et al., 2006; Rösler et al., 2007). Beide Proteine haben eine klassische NLS (und NES) und eine Interaktion mit phya wurde im Pull-down nachgewiesen. Neben den pflanzlichen Phytochromen gibt es verwandte Proteine in vielen Organismen. In Cyanobakterien wurden bereits Ende der 90er Jahre prokaryotische Phytochrome entdeckt, die als chromophore Gruppe Phycocyanobilin tragen (Kehoe und Grossman, 1996; Hughes et al., 1997; Yeh et al., 1997). In filamentösen Pilzen existieren die Fphs (Blumenstein et al., 2005; Froehlich et al., 2005), die ebenso wie die in Eubakterien gefundenen Bphs (Jiang et al., 1999; Bhoo et al., 2001) Biliverdin als Chromophor tragen. Damit sind die Absorptionseigenschaften dieser Phytochrome mehr in den blauen (Synechocystis) bzw. in den dunkelroten Bereich des sichtbaren Lichts verschoben. Diese Phytochrome tragen C-terminal keine PAS und HKRD-Domäne (siehe Abb. 1.2), sondern eine Histidin-Kinase, deren Autophosphorylierungsfunktion in Synechocystis gezeigt werden konnte (Yeh et al., 1997). Die Histidin-Kinasen der bakteriellen und pilzlichen Phytochrome arbeiten als Rezeptoren in einem Zwei-Komponenten-System. Eine Response-Regulator Domäne ist im entfernten C-Terminus der Cphs, Bphs und Fphs konserviert, in pflanzlichen Phytochromen gibt es diese nicht (Abb. 1.2).

12 EINLEITUNG 12 Eine Ausnahme zu dieser konservierten Domänenstruktur gibt es in Grünalgen und Farnen; der dort gefundene Photorezeptor wird Neochrom genannt: er kombiniert den lichtsensorischen N-Terminus der Phytochrome mit einer LOV (Light/Oxygen/Voltage) Domäne, die für Phototropine typisch ist (Suetsugu et al., 2005) Phototropine Seit dem Jahr 1817 sind große Mengen an Daten über physiologische Antworten von Pflanzen auf Blaulicht gesammelt worden (Historischer Review: Briggs, 2006). Dazu gehören die Inhibition des Längenwachstums von Keimlingen, die sich im Dunkel entwickelt haben, sowie der Phototropismus (Wachstum des Sprosses (i.d.r.) hin zum Licht, bzw. von Wurzeln weg vom Licht), die Öffnung der Stomata, das Blattwachstum und die Chloroplastenbewegung (Übersichtsartikel Briggs, 2007; Christie, 2007). Das Phänomen des positiven (Spross) und negativen (Wurzel) Phototropismus wurde zur Erforschung der Blaulicht-Perzeption und Signalweiterleitung genutzt. Von Arabidopsis thaliana gibt es eine Reihe Mutanten, die einen verminderten Phototropismus des Hypokotyls als Antwort auf schwaches Blaulicht zeigen. Einigen dieser Mutanten fehlt die aktive Form eines Proteins, das Blaulicht-abhängig phosphoryliert wird (Liscum und Briggs, 1995). Dieses Protein wurde zunächst nph1 (non phototropic hypocotyl) genannt. Nachdem nachgewiesen war, dass es sich dabei um den Lichtrezeptor des Phototropismus handelt, wurde es in phototropin1 (phot1) umbenannt (Christie et al., 1999). In Arabidopsis thaliana wurde noch ein zweites Phototropin gefunden (phot2, Jarillo et al., 2001). Beide vermitteln den Phototropismus unter starkem einseitigem Blaulicht, während unter Schwachlichtbedingungen allein phot1 als Photorezeptor für die Hypokotylkrümmung fungiert (Sakai et al., 2000). Phototropin LOV1 LOV2 Neochrom Phytochrom photosens. Domäne LOV Domäne Jα-Helix Serin/Threonin Kinase Domäne Flavin Mononukleotid Phytochromobilin Abb. 1.3: Proteinstrukturen von Phototropin und Neochrom Photorezeptoren. Die Domänen mit ihren zugehörigen Chromophoren sind farblich dargestellt (Abb. aus Christie, 2007).

13 EINLEITUNG 13 Phototropine können in zwei Bereiche unterteilt werden: den N-terminalen photosensorischen Teil und den C-terminalen Teil, welcher eine Serin/Threonin-Kinase- Domäne enthält. Der photo-sensorische N-Terminus trägt zwei LOV-Domänen (Light Oxygen Voltage), die mit den PAS-Domänen eng verwandt sind. Die LOV-Domänen binden den Cofaktor FMN (Flavinmononukleotid) und dienen dem Protein als Blaulichtsensoren (Christie et al., 1999, Abb. 1.3). Die Lichtanregung dieser Domänen führt zur Autophosphorylierung des Proteins. Blaulicht-Antworten wurden auch in Kryptogamen untersucht und so wurden im Farn Adiantum capillus-veneris zwei Phototropine (Nozue et al., 1998; Kagawa et al., 2001) und das bereits oben genannte Neochrom (Neo) gefunden. Dieser Photorezeptor gleicht einem Phototropin, an das N-terminal eine photosensorische Phytochrom-Domäne fusioniert ist (Nozue et al., 1998; Suetsugu et al., 2005) (Abb. 1.3). Das Neochrom (auch Acphy3 genannt) steuert den Phototropismus und die Chloroplastenbewegung, beides wird durch Rot- und Blaulicht vermittelt (Kawai et al., 2003). Auch in Algen wurden Phototropine und Neochrome gefunden (z.b. Mougoetia scalaris: 2 phot, 2 Neo). Ein Vergleich der NEO Gene zeigte, dass die Neochrome von Adiantum capillus-veneris und Mougeotia scalaris unabhängig voneinander entstanden sind (konvergente Evolution) (Suetsugu et al., 2005). Die LOV-Domänen der Phototropine bestehen aus fünf ß-Strängen verbunden durch zwei α-helices. Das Chromophor wird durch Hydrogen- und Van-der-Waals-Kräfte in einer Mulde gehalten (Crosson und Moffat, 2001). Bei Bestrahlung mit blauem Licht wird eine kovalente Bindung zwischen dem C(4)-Atom des FMN und einem konservierten Cysteinrest in der LOV-Domäne ausgebildet (FMN-Cysteinyl Addukt). Im Dunkel löst sich diese Bindung sehr schnell und es findet eine Dunkelreversion statt. Somit gibt es einen Photozyklus der LOV-Domänen, der auch an der Veränderung der Absorptionseigenschaften beobachtet werden kann (Salomon et al., 2000; Kasahara et al., 2002). Es konnte durch gezielte Mutagenese gezeigt werden, dass LOV2 für die Autophosphorylierung von phot1 und die dadurch vermittelte Hypokotyl-Krümmung notwendig ist, nicht jedoch LOV1 (Christie et al., 2002). NMR Studien mit LOV Fragmenten aus Hafer zeigten, dass die C-terminal von LOV2 befindliche α-helix (Jα) bei Dunkelheit mit LOV2 assoziiert ist. Die lichtbedingte FMN-Cysteinyl-Bildung führt zu einer Konformationsänderung des Proteins und verhindert dadurch diesen Kontakt (Harper et al., 2004). Es wird daher vermutet, dass diese Jα-Helix als eine Art Gelenk fungiert, die den Kinase-Teil des Proteins lichtabhängig freigibt.

14 EINLEITUNG 14 Die Autophosphorylierung des Plasmamembran-assoziierten Phototropins auf der belichteten Seite des Sprosses führt zum Auxin-abhängigen Wachstum auf der Schattenseite (Salomon et al., 1997a; Salomon et al., 1997b). Es wurde daher ein Modell vorgeschlagen, bei dem die Signalweiterleitung auf einem Phosphorylierungsgradienten des Phototropins basiert. Die Auxin-Empfindlichkeit der Pflanze ist für den Phototropismus notwendig: ohne die Auxin-regulierten Transkriptionsfaktoren NPH4 und MSG2 findet keine phototrophe Krümmung statt (Stowe-Evans et al., 1998; Harper et al., 2004; Tatematsu et al., 2004). Transkriptomanalysen zeigten einen Anstieg der NPH4 (Non Phototropic Hypocotyl) regulierten Gene α Expansin1 und 8 in Brassica oleracea während der phototropischen Hypokotylkrümmung. Mitglieder der α-expansin Familie vermitteln das Zellwand Wachstum (Esmon et al., 2006). NPH3 ist ein Protein, das für den lateralen Auxingradienten und den Phototropismus notwendig ist (Liscum und Briggs, 1995; 1996). Es konnte gezeigt werden, dass NPH3 mit phot1 interagiert und auch mit der Plasmamembran assoziiert ist (Motchoulski und Liscum, 1999; Haga et al., 2005). NPH3 liegt in Dunkelheit phosphoryliert vor und wird im Blaulicht dephosphoryliert. Sowohl NPH3 als auch phot1 werden von PKS1 (Phytochrom Kinase Substrat1) gebunden. Da die phototropische Krümmung auch von Phytochromen beeinflusst wird, stellen PKS-Proteine evtl. eine gemeinsame Komponente der Phytochrom und Phototropin-Signalwege dar (Iino, 2006; Lariguet et al., 2006) ZTL/ADO-Familie Eine weitere Klasse putativer Blaulichtrezeptoren bilden Proteine, die ebenfalls LOV- Domänen besitzen. Ihr gehören drei Mitglieder an: ZTL (Zeitlupe, auch ADO für Adagio genannt), FKF1 (Flavin-binding, Kelch Repeat, F-box1) und LKP2 (LOV Kelch, Protein2) (Übersicht in Banerjee und Batschauer, 2005). Diese Proteine sind für die Funktion der circardianen Rhythmik und die Steuerung des Blühzeitpunktes in Arabidopsis thaliana notwendig (Übersichtsartikel Christie, 2007; Demarsy und Fankhauser, 2009). Die Proteine haben drei Domänen gemeinsam: eine N-terminale LOV-Domäne, ein F-Box Motiv und C-terminal sechs Kelch Motiv Wiederholungen. F-Box Proteine gehören zu den SCF-Typ (Skp1, Culin, F-box) E3-Ubiquitin-Ligasen. Diese Enzyme führen Proteine für ihren Abbau dem Proteasom zu. Erste Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Funktion der ZTL-Proteine darin besteht, andere regulatorische Komponenten für ihre Proteolyse zu markieren (Mas et al., 2003; Imaizumi et al., 2005). Die Kelch-Domänen formen eine ß- Propeller-Struktur, die vermutlich Protein-Protein Interaktionen vermittelt. Die LOV-

15 EINLEITUNG 15 Domänen der ZTL-Proteine wurden in E. coli exprimiert und hatten den Cofaktor FMN gebunden. Wie bei den Phototropinen findet eine lichtabhängige Cysteinyl-Addukt Bildung statt, jedoch keine Dunkelreversion. Ein Photozyklus wie der der Phototropine fehlt somit (Imaizumi et al., 2003; Nakasako et al., 2005). Nur von FKF1 wurde die Photorezeptor- Funktion nachgewiesen. Seine Transkriptmengen oszillieren mit circadianer Rhythmik, es ist aber selbst nicht an der Funktion der endogenen Uhr beteiligt. FKF1 reguliert die Stabilität von CDF1 (Cycling Dof Factor1), wodurch die Expression des Blühinduktion-Gens CONSTANS (CO) unterdrückt wird (Imaizumi et al., 2005). CO wiederum induziert die Expression von FT (Flowering Locus T) in der Abenddämmerung. Die LOV-Domäne von FKF1 interagiert mit GI (GIgantea). Dieses Protein ist ebenfalls wie FKF1 ein positiver Regulator der CO Expression. Diese Interaktion findet nur Blaulicht-abhängig statt und hängt von der Lichtanregung der LOV-Domäne ab. GI interagiert auch direkt mit CDF1 in einem Komplex mit FKF1. Dieser Komplex bewirkt die Degradation von CDF1 (Sawa et al., 2007). ZTL interagiert ebenfalls lichtabhängig mit GI wodurch es sich selbst stabilisiert. Da GI in Abhängigkeit von der endogenen Uhr exprimiert wird, führt diese Interaktion zu einer tageszeitabhängigen Akkumulation des ZTL-Proteins, obwohl das Gen konstitutiv exprimiert wird (Somers, 2001; Kim et al., 2007). Die Akkumulation von ZTL führt über den ZTL-SCF Komplex zu hohen Amplituden in der TOC1 Menge. TOC1 ist Zielprotein des ZTL-SCF Komplexes und ist einer von fünf Regulatoren, die die Funktion des endogenen Oszillator gewährleisten (Somers, 2001; Kim et al., 2007; Fujiwara et al., 2008). Photosensorische Domäne Regulatorische Domäne FMN LOV1 F-BOX KELCH GI Interaktion SCF Interaktion Abb. 1.4: Schema der Zeitlupe Protein-Familie. Die Photorezeptoren tragen eine N- terminale LOV Domäne, gefolgt von einem F-Box Motif und sechs Kelch Wiederholungen in der C-terminal Region. Analog zu anderen Proteinen könnten die Kelch Motive der Protein Protein Interaktion dienen (nach Demarsy & Fankhauser 2007).

16 EINLEITUNG Putative UV-B Rezeptoren UV-B-Licht ( nm) kann die Pflanze schädigen oder als Signal für ihre Entwicklung dienen, abhängig von der Intensität der UV-B Strahlung. Die Mechanismen, durch die starke UV-B-Strahlung die Pflanze schädigt und ihr Reparatur-System aktiviert, sind gut untersucht. Über die Perzeption und Signalweiterleitung von schwachem (low fluence) UV-B-Licht ist dagegen nur wenig bekannt. In Arabidopsis thaliana gibt es verschiedene Reaktionen auf die Einstrahlung von schwachem UV-Licht: die Inhibition des Hypokotylwachstums in etiolierten Keimlingen, die Synthese von UV-B-Licht absorbierenden Sekundärmetaboliten (Flavonoide und andere) sowie eine Veränderung im Genexpressionsmuster (Fuglevand et al., 1996; Kim et al., 1998; Boccalandro et al., 2001). Suesslin und Frohnmeyer (2003) suchten in einer Bank von T-DNA Linien nach einer Mutante, die in dieser Reaktion beeinträchtigt ist und identifizierten so das ULI3 Gen (UV- B Light Insensitive). Das Protein ist ~80 kda groß und trägt eine putative Häm- und Diacylglycerol-Bindestelle. Es wird hauptsächlich in den äußersten Gewebeschichten exprimiert und nicht in Wurzeln. UV-B Licht steigert die Expression des ULI3-Gens. Phylogenetische Untersuchungen zeigten, dass ULI-Proteine Brassicaceen-spezifisch sind (Lariguet und Dunand, 2005). Tong et al. (2008) isolierten eine Mutante, deren Wurzeln hypersensitiv auf UV-B Strahlung reagieren, wenn die Pflanzen auf Agar-Platten angezogen werden. Nach der Keimung wachsen die Wurzeln nicht und der Keimling bildet keine post-embryonalen Blätter aus. Ohne UV-B Strahlung kann die Pflanze normal wachsen. Für die Reaktion ist der Ausfall des in den Wurzeln exprimierten Proteins RUS1 (Root UV-B-Sensitiv) verantwortlich. Dies ist 66 kda groß und trägt eine DUF647 Domäne von unbekannter Funktion, die in Proteinen der meisten Eukaryoten vorkommt. Da die Reaktion auf das UV-B-Licht extrem sensitiv ist, spekulieren Tong et al., dass der verantwortliche Rezeptor einen speziellen Chromophor trägt; die bekannten Photorezeptoren sind an dieser Reaktion nicht beteiligt. UV-B abhängige Änderungen der Genexpression betreffen u.a. den Transkriptionsfaktor HY5 (Brown et al., 2005a), an dessen UV-Regulierung die Proteine COP1 (COnstitutive Photomorphogenic) und UVR8 beteiligt sind. UVR8 (UV Response Locus) ist ein 47 kda großes Protein, dessen Nullmutante nicht auf UV-B Licht reagiert (Favory et al., 2009). Die Autoren konnten zeigen, dass UVR8 und COP1 Schlüsselkomponenten der UV-B Signalweiterleitung darstellen. Die Funktion von COP1 ist hier eine andere als die als Repressor der Photomorphogense in Dunkelheit. Auch ein funktionierender Brassino-

17 EINLEITUNG 17 steroid-biosyntheseweg ist für die Signalweiterleitung notwendig (Brassinosteroide sind wichtig für das Wachstum und die Entwicklung der Pflanzen und steigern die Stress- Toleranz, Savenstrand et al., 2004). Pflanzen, in denen dieser Biosyntheseweg gestört ist, zeigten ein verändertes Genexpressionmuster einiger Markergene (CHS, PYROA, PR-5, MEB5.2) als Antwort auf UV-B Licht im Vergleich zum Wildtyp Cryptochrome Cryptochrome (cry) sind Flavoproteine, die für ein breites Spektrum an UV-A- und Blaulicht-Antworten in Organismen aller Reiche bis auf Archeen verantwortlich sind. Sie bilden zusammen mit den Photolyasen die Cryptochrom/ Photolyase-Familie (CPF), die in mehrere Untergruppen eingeteilt werden kann (siehe Abb. 1.7). Ihr gehören drei Klassen von Photolyasen an, die entsprechend ihrer Substrate unterschieden werden: CPD- Photolyasen reparieren Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere und kommen in Organismen aller Reiche vor (Sancar et al., 1984), (6-4)-Photolyasen katalysieren die Reparatur von (6-4)- Photoprodukten und konnten nur in Eukaryoten gefunden werden (Todo et al., 1993). Anhand unterschiedlicher Proteinsequenzen werden die CPD-Photolyasen weiter unterschieden in Klasse I, II (Kanai et al., 1997) und III (Ozturk et al., 2008). Die Cryptochrom-Vertreter der CPD-Familie setzen sich zusammen aus den pflanzlichen Cryptochromen, die den CPD Klasse I Photolyasen sehr nahe stehen, den tierischen Cryptochromen, die den (6-4)-Photolyasen näher sind (Cashmore et al., 1999) und der cry-dash Klasse (Brudler et al., 2003). In Säugern sind die Cryptochrome Bestandteil der inneren Uhr und steuern das circardiane Verhalten, als Photorezeptoren wie in Drosophila synchronisieren sie die circardiane Uhr durch Perzeption von Lichtsignalen (Lin und Todo, 2005). In Vögeln sind sie möglicherweise für die Wahrnehmung des Magnetfeldes zuständig (Wiltschko und Wiltschko, 2005), diese Funktion konnte kürzlich auch in Drosophila gezeigt werden (Gegear et al., 2008). In Pflanzen kontrollieren Cryptochrome zusammen mit anderen Photorezeptoren die De-Etiolierung von Keimlingen, den Blühzeitpunkt und ebenfalls das Synchronisieren der inneren Uhr (Übersichtsartikel Li & Yang, 2007) sowie das Öffnen der Stomata (Mao et al., 2005). In allen Reichen einschließlich der Archeen konnten außerdem Vertreter der cry-dash Familie gefunden werden, für die neben der Blaulicht-Perzeption (Brudler et al., 2003) die Reparaturfunktion von Thymindimeren in einzelsträngiger DNA und in Loop-Strukturen von Duplex-DNA charakteristisch ist (Selby und Sancar, 2006; Pokorny et al., 2008).

18 EINLEITUNG 18 Cryptochrome haben große Sequenzähnlichkeit mit den DNA Photolyasen, weisen aber (mit Ausnahme von cry-dash) keine Reparaturaktivität auf. Die beiden Familien zeigen viele Gemeinsamkeiten, wie ähnliche Proteinstrukturen und FAD als Kofaktor (Essen, 2006). Der N-Terminus, der den Photolyasen ähnlich ist, besteht aus einer α/β-domäne, gefolgt von einer Interdomänenschleife und daran anschließend C-terminal einer helikalen Domäne, die FAD bindet (siehe Abb. 1.6 und 1.8). Der zweite Kofaktor, der in Cryptochromen vermutlich wie in vielen Photolyasen Methenyltetrahydrofolat ist, ist in der Spalte zwischen N-terminalem und C-terminalem Teil der PHR-Domäne gebunden (Klar et al., 2007). Der Cryptochrom-spezifische C-Terminus fehlt den Photolyasen und trägt das sog. DAS-Motiv (D-motif, Acidic amino acids, Serine rich Sequence; Lin, 2002). Es konnte gezeigt werden, dass die C-terminale Extension für Protein-Protein-Interaktionen notwendig ist. Z.B. konnte für Arabidopsis CRY1 und CRY2 eine Interaktion mit COP nachgewiesen werden (Yang et al., 2000; Wang et al., 2001). Zusätzlich wurde eine Blaulicht-abhängige Phosphorylierung der C-terminalen Extension gezeigt (AtCRY1 und hcry1 in vitro (Ahmad et al., 1998a; Bouly et al., 2003, Shalitin et al., 2003) Cryptochrome in Tieren In Tieren gibt es eine zentrale circardiane Uhr, die im Gehirn lokalisiert ist. In Drosophila melanogaster gibt es ein Cryptochrom, Dmcry und dieses ist für die Lichtregulation der inneren Uhr zuständig (Stanewsky et al., 1998). Dmcry interagiert lichtabhängig mit TIM (TIMeless) und unterdrückt somit die negative Regulation der Uhr (Ceriani et al., 1999). Die Bildung eines Dimers aus TIM und PER (PERiod) wird verhindert und die Ubiquitinierung und damit der Abbau der Proteine eingeleitet (s. Abb. 1.5). Das PER-TIM Dimer wird selbst in den Kern transportiert und verhindert dort die Transkription der eigenen Gene sowie des CRY Gens. Dmcry ist jedoch nicht der einzige Photorezeptor, der in Drosophila für das Stellen der inneren Uhr notwendig ist, da Drosophila cry-mutanten einen lichtabhängigen circardianen Rhythmus zeigen, solange noch Sehpigmente vorhanden sind. Kürzlich wurde das Drosophila Cryptochrom als lichtabhängiger Magnetorezeptor nachgewiesen (Gegear et al., 2008). Dmcry defiziente Fliegen zeigten kein magnetosensitives Verhalten im Weißlicht. Es wurde schon zuvor diskutiert, dass Blaulichtrezeptoren an der Wahrnehmung des Erdmagnetfelds in Vögeln beteiligt sein könnten (Ritz et al., 2000). Das FAD-Tryptophan-Radikal Paar, dessen Entstehung für Atcry1 unter Belichtung gezeigt wurde (Zeugner et al., 2005), könnte der hierbei beteiligte Rezeptor sein (Rodgers und Hore, 2009). In Säugern scheinen die Cryptochrome keine direkte lichtabsorbierende Funktion zu haben. So gibt es z.b. in

19 EINLEITUNG 19 Mäusen und auch im Menschen zwei Cryptochrome (Lin und Todo, 2005). Sie funktionieren als Repressoren der BMAL1/CYCLE und CLOCK Transkriptionsfaktoren, die als Heterodimere die transkriptionnelle negative Feedback-Schleife zum Stellen der inneren Uhr darstellen (in allen bisher untersuchten Tieren). Die zentrale circardiane Uhr sitzt im SCN (SupraChiasmatischer Nukleus) an der Basis des Hypothalamus im Gehirn der Säugetiere und ist u.a. direkt von der Retina innerviert (Übersichtsartikel Hastings et al., 2007). Der Gehalt an PER1-, PER2-, CRY1- und CRY2-mRNA steigt im Laufe des Tages in den Neuronen des SCN an und mit einigen Stunden Verzögerung auch ihre Proteinpegel. Am Ende des Tages haben die Proteingehalte ihr Maximum erreicht und aufgrund der negativen Feedbackschleife wird die Transkription der PER und CRY Gene inhibiert. Für den Lichteingang zur inneren Uhr ist das Photopigment Melanopsin verantwortlich. Es wurde in einer Gruppe photorezeptiver retinaler Ganglionzellen in Mäusen gefunden (Qiu et al., 2005) und ist alleinig für das Synchronisieren der innern Uhr mit der Tageslänge verantwortlich. Clock-Gene werden ebenso in vielen peripheren Geweben exprimiert, man spricht hier von peripheren circardianen Uhren. Die peripheren Uhren werden u.a. in Abhängigkeit von der Nahrungsaufnahme synchronisiert und dafür konnte die AMPaktivierte Proteinkinase (AMPK) verantwortlich gemacht werden (Lamia et al., 2009). Sie phosphoryliert zwei Serinreste im cry1 Protein und bewirkt so dessen Abbau, wodurch es zur Transkription der Clock-Gene kommt (bei Nahrungsaufnahme). Entgegen der Annahme, dass eine gestörte Funktion der inneren Uhr zu einem erhöhten Krebsrisiko führt, konnte gezeigt werden, dass der Verlust von Cryptochromen in p53-mäusen (einer Linie, die schnell und häufig Krebs entwickelt) zu einer Verlängerung der Lebenszeit um 50% führt (Ozturk et al., 2009). Möglicherweise werden von Krebs befallene Zellen, die keine Cryptochrome aufweisen, besser apoptotisch abgebaut. Im Gegensatz dazu stehen die Daten von Hoffmann et al., (2010), die zeigen, dass in Brustkrebszellen signifkant häufig die hcry2 Expression vermindert ist. Dies ist auf die vermehrte Methylierung des CRY2-Promotors zurückzuführen. Die verringerte hcry2 Expression bewirkt eine veränderte Expression einiger Krebs-relevanter Gene. Die Autoren postulieren, dass das circardiane System eine wichtige Rolle bei der Hormon-gesteuerten Tumorbildung spielt.

20 EINLEITUNG 20 Abb. 1.5: Regulation der circardianen Uhr durch Cryptochrome. (a) In Drosophila: Cryptochrome unterdrücken die negative Feedback Schleife der circardianen Uhr durch lichtabhängige Bindung an TIM. Dies führt zur Ubiquitinierung und zum Abbau von TIM, wodurch die Bildung eines PER-TIM Dimers verhindert wird. Dieser würde im Kern die Bindung von Clock-Proteinen an die Promotorregion von PER und CRY und damit deren Transkription inhibieren. (b) In Säugetieren sind Cryptochrome interner Teil der negativen Feedback Schleife. CRY und PER interagieren und inhibieren die Funktion der Transkriptionsfaktoren CLK und BMAL1. Eine Rolle bei der Synchronisation der Uhr mit Lichtsignalen über die Retina konnte für Cryptochrome nicht nachgewiesen werden, diese Aufgabe wird dem Photosensor Melanopsin zugeschrieben (Qiu et al., 2005, Abb. aus Lin & Todo 2005) Cryptochrome in Pflanzen Cryptochrome wurden in vielen Pflanzen gefunden. Beispielsweise gibt es in Oryza sativa und Solanum lycopersicum wie in Arabidopsis thaliana zwei Cryptochrom-Gene, in Solanum und Arabidopsis und weiteren Pflanzen außerdem ein CRY-DASH Gen (Übersichtsartikel Lin und Todo, 2005; Facella et al., 2006). Auch niedere Pflanzen wie der Farn Adiantum capillus-veneris, das Moos Physcomitrella patens und die Alge Chlamydomonas reinhardtii besitzen Cryptochrome. Aufgrund der wesentlichen Unterschiede zwischen den pflanzlichen Cryptochromen und den Cryptochromen der cry-dash Familie werden diese

21 EINLEITUNG 21 im Folgenden getrennt besprochen, wenngleich auch beide in Arabidopsis thaliana vorkommen. Arabidopsis cry1 und cry2 CRY1 aus Arabidopsis wurde durch eine Mutation des hy4 Gens gefunden (Koorneef et al., 1980). Diese Mutante zeigte keine De-Etiolierung im Blau-/UV-A Licht (Ahmad und Cashmore, 1993). Später wurde hy4 in cry1 umbenannt. Cry2 wurde durch eine spät blühende Mutante gefunden, die anfangs fha genannt wurde (Koornneef et al., 1991, Guo et al., 1998). Cry2 ist lichtlabil und es spielt bei der De-Etiolierung unter schwachem Blaulicht eine Rolle (Ahmad et al., 1998). Cryptochrome interagieren mit den Phytochromen bei der Photomorphogenese, der Blühinduktion sowie dem Stellen der circardianen Uhr (Somers et al., 1998; Mockler et al., 2003), diese Interaktion konnte auch physikalisch nachgewiesen werden (Ahmad et al., 1998; Tatematsu et al., 2004). Kang et al., (2008) konnten positive wie negative Interaktionen von Cryptochrom- und Phototropin-abhängigen Signalwegen zeigen. Es wurden synergistische Effekte bei der phototropistischen Hypokotylkrümmung (Whippo und Hangarter, 2003), der Photomorphogenese und der Anthocyan-Akkumulation nachgeweisen. Außerdem hemmen Cryptochrome Blaulicht-abhängig die Expression des Phot1-Gens (Kang et al., 2008). Atcry1 1 MTHF PHR- Domäne FAD 50 DAS 681 Atcry2 1 MTHF PHR- Domäne FAD 50 DAS 612 Atcry-DASH Signal MTHF FAD DAS PHR- Domäne = NLS Abb. 1.6: Vergleich der Domänen der drei Cryptochrome aus Arabidopsis thaliana. Der Photolyase-verwandte Bereich (PHR-Domäne) ist bei allen Cryptochromen hoch konserviert, dieser bindet auch die beiden Chromophore FAD und MTHF nicht kovalent. cry1 und cry2 tragen auf ihrem C-Terminus das Cryptochrom-spezifische DAS-Motiv. Dieses Motiv ist bei Arabidopsis cry-dash N-terminal lokalisiert. Auf dem C-Terminus von cry2 ist eine zweiteilige Zielsteuerungssequenz für den Zellkern (NLS) lokalisiert. Im C-Terminus von Arabidopsis cry-dash konnte eine pat7 NLS gezeigt werden (diese Arbeit). Die ersten 40 AS von cry-dash fungieren als Transitpeptid, um das Protein in Mitochondrien und Chloroplasten zu dirigieren.

22 EINLEITUNG 22 Die physiologischen Funktionen der Cryptochrome im Einzelnen: Photomorphogenese Die Photomorphogenese umfasst die Prozesse der De-Etiolierung, die in der Pflanze nach der Keimung bei Belichtung ablaufen: die Öffnung des Hypokotyl-Hakens und der Kotyledonen, reduziertes Hypokotylwachstum, die Förderung des Blatt- und Wurzelwachstums, die Bildung von Pigmenten wie Anthocyanen, die Ausbildung von Seitenwurzeln, die Chlorophyllbiosynthese und die Entwicklung von Etioplasten und Proplastiden zu Chloroplasten. Studien an Photorezeptor-Mutanten konnten cry1 eine Hauptrolle bei der Photomorphogenese zuschreiben, cry2 spielt hierbei nur im schwachen Blaulicht eine Rolle (Lin et al., 1998). Die Inhibition des Hypokotylwachstums wird von cry1 und cry2, die Anthocyan-Akkumulation von cry1 gesteuert (Ahmad und Cashmore, 1993; Ahmad et al., 1995; Wu und Spalding, 2007). Cry1 liegt in Dunkelheit in der Zelle überwiegend im Kern vor, bei Belichtung wird es in das Cytoplasma exportiert (Cashmore et al., 1999). Cry2 zeigt dagegen eine lichtunabhängige konstitutive Zellkernlokalisation, was durch den Nachweis einer Kernlokalisationssequenz (NLS) in der CCT-Domäne bestätigt wurde (Guo et al., 1999, Kleiner et al., 1999, Abb. 1.6). Im Gegensatz zu cry2 wurde in cry1 keine NLS gefunden. Wu und Spalding (2007) transformierten die cry1 Mutante mit cry1nes oder cry1nls und untersuchten die Licht-Antworten im Vergleich zum Wildtyp. Es konnte gezeigt werden, dass im Kern lokalisiertes cry1nls das Hypokotyl- und Wurzelwachstum im Blaulicht hemmt und die Anthocyanbildung fördert. Cry1NES dagegen fördert das Kotyledonen- und Wurzel-Wachstum. Die Lokalisation von cry1 hängt also direkt mit seiner Funktion zusammen: die Regulation der Expression des Chalconsynthase-Gens sowie der Anionenkanäle in der Zellmembran setzt eine Kernlokalisation von cry1 voraus. Cytoplasmatisches cry1 reguliert das Wurzel- und Kotyledonenwachstum im Blaulicht. Die Expression von Genen, die an der Photomorphogenese beteiligt sind, wird von Transkriptionsfaktoren reguliert, von denen einige bekannt sind: HY5 (Oyama et al., 1997), HYH (Holm et al., 2002), LAF1 (Seo et al., 2003), HFR1 (Kim et al., 2002). Die Aktivität dieser Transkriptionsfaktoren hängt von COP1 ab: in Dunkelheit ist COP1 im Zellkern lokalisiert und fungiert als E3 Ligase. Transkriptionsfaktoren wie HY5 und LAF1 werden durch COP1 ubiquitiniert und im Proteasom abgebaut (Osterlund et al., 2000). Bei Belichtung wird COP1 ins Cytosol transloziert und die Transkriptionsfaktoren können sich im Kern ansammeln (Osterlund und Deng, 1998). Die Blaulicht-abhängige Anreicherung von HY5 im Zellkern führt zur Induktion vieler lichtregulierter Gene (Partch et al., 2005). Der lichtabhängige Transport von COP1 zwischen den Zellkompartimenten wird von

23 EINLEITUNG 23 Phytochromen und Cryptochromen gesteuert. Cry1 und cry2 interagieren direkt mit COP1 (Yang et al., 2000; Wang et al., 2001). Regulation des Blühzeitpunktes Arabidopsis ist eine fakultative Langtagpflanze. Sie blüht schneller im Langtag (16 h Licht), kommt jedoch auch im Kurztag (<10 h Licht/Tag) zur Blütenbildung. Die photoperiodische Regulation des Blühzeitpunktes wird von der circardianen Uhr gesteuert und CONSTANS (CO) spielt dabei eine zentrale Rolle (Putterill et al., 1995; Coupland et al., 1998). Die CO-mRNA akkumuliert im Langtag nach der Abenddämmerung. Cry2, phya und cry1 stabilisieren das CO-Protein am Tagesende, phyb dagegen fördert seinen Abbau. Diese antagonistische Funktion führt zu einer circardianen Rhythmik in der CO-Proteinmenge. CO aktiviert die Transkription der FT (Flowering locus T) Gene, die das Blühen fördern (Mockler et al., 2003). Einen Überblick über die ganze Komplexizität der Regulation des Blühzeitpunktes gibt der Review von Turck et al., (2008). Mit CIB1 (Liu et al., 2008) wurde ein direkter Interaktionspartner von cry2 identifiziert, der durch Bindung an die E-Box Elemente des FT-Gens dessen Expression und damit die Blühinduktion fördert. CIB1 (Cryptochrome Interacting Basic helix-loophelix) ist ein Transkriptionsfaktor mit einem basischen Helix-Loop-Helix Motiv, dessen physikalische Interaktion mit cry2 durch Co-Immunipräzipitation in Blau- und Weißlicht bestrahlten Proben nachgewiesen wurde, nicht jedoch in Rotlicht-bestrahlten. Die Autoren postulieren, dass die Interaktion von Cryptochromen mit CIB1 und anderen CIB-Proteinen ein frühes Element der Signalperzeption und weiterleitung darstellt. Stellen der circardianen Uhr Unter der Kontrolle der circardianen Uhr sind in Pflanzen u.a. die Genexpression, Blattbewegungen und die Photosynthese. An dem Synchronisieren der inneren Uhr mit den aktuellen Lichtbedingungen sind neben den Phytochromen auch die Cryptochrome beteiligt. Die cry1 Mutante zeigt eine verlängerte Periodenlänge (ursprünglich gemessen in Expression des Luciferase-Reporters unter Kontrolle der regulatorischen Region eines circadian exprimierten Gens) im Vergleich zum Wildtyp unter starker und geringer Blaulicht-Intensität. Die cry2 Mutante zeigte eine schwache Periodenverlängerung unter starkem Blaulicht, bei geringer Lichtintensität dagegen eine Verkürzung der Periodenlänge. Im Weißlicht hat cry2 keinen Einfluss auf die Periodenlänge (Somers et al., 1998). Cry1 und cry2 agieren redundant im Blaulicht-Input zur inneren Uhr. Die cry1cry2 Doppelmutante verliert jedoch ebenso wie die phyaphybcry1cry2 Quadrupelmutante die

24 EINLEITUNG 24 endogene Rhythmik nicht vollständig (Yanovsky et al., 2000). Cry1 und cry2 sind somit nicht Teil des zentralen Oszillators, wie es in Tieren der Fall ist, und auch andere Photorezeptoren können den Lichteingang zur inneren Uhr vermitteln. Struktur und Funktion von Arabidopsis thaliana cry1 und cry2 In ihrer aktiven Form liegen cry1 und cry2 als Dimer vor (Sang et al., 2005; Rosenfeldt et al., 2008). Wie bereits oben beschrieben, sind Cryptochrome aus zwei Domänen aufgebaut: der N-terminalen, Photolyase-ähnlichen PHR-Domäne, die die Chromophore MTHF und FAD trägt, sowie der C-terminalen Domäne, die den Photolyasen fehlt und bei cry1 und cry2 unterschiedlich lang ist (Abb. 1.6). Die PHR-Region von Atcry1 konnte kristallisiert werden (Brautigam et al., 2004). Die PHR-Domänen haben bei allen Mitgliedern der Photolyase/Cryptochrom-Familie den gleichen Aufbau: eine α/β-domäne und eine helikale Domäne, die miteinander über eine Interdomänen-Schlaufe verbunden sind (Park et al., 1995; Brudler et al., 2003; Brautigam et al., 2004; Huang et al., 2006; Klar et al., 2007). Die α/β-domäne nimmt eine Dinukleotid-Bindungs-Faltung ein, die aus fünf parallelen ß-Faltblättern seitlich flankiert von α-helices besteht. Die helikale Domäne formt eine Tasche, in der FAD nicht kovalent gebunden wird. FAD liegt in der für Photolyasen charakteristischen U-förmigen Konformation vor, das Adenin und die Isoalloxazin-Ringe zeigen zum Boden der Tasche. Neben den Gemeinsamkeiten unterscheiden sich die Pflanzen-Cryptochrome von den Photolyasen und cry-dash in einigen Punkten: cry1 hat im Gegensatz zu den zwei letztgenannten Proteinen keine positiv geladene Oberfläche in der Rinne, die bei Photolyasen für die Bindung von DNA erforderlich ist (Mees et al., 2004). Die Oberfläche von cry1 ist überwiegend negativ geladen, bis auf einige positive Reste nahe der FAD-Bindetasche. Außerdem ist die FAD- Bindetasche von cry1 größer und tiefer. Im Gegensatz zu den Photolyasen bindet cry1 kein Pyrimidin-Dimer in dieser Tasche, die Bindung eines ATP-Analgos konnte jedoch nachgewiesen werden (Brautigam et al., 2004). Der Reaktionsmechanismus der Cryptochrome konnte teilweise aufgeklärt werden und FAD spielt dabei eine zentrale Rolle. Die verwandten CPD-Photolyasen besitzen in vivo den vollständig reduzierte katalytischen Cofaktor FADH (Übersichtsartikel Essen, 2006). Sie binden lichtunabhänig an ein Pyrimidin-Dimer (einen DNA-Schaden, der zwischen zwei Pyrimidinen entsteht). Die lichtabhängige Reparatur erfolgt durch Anregung des vollständig reduzierten FADH. Im angeregten Zustand überträgt das FADH * ein Elektron auf den CPD-Schaden, die Spaltung des Dimers erfolgt spontan und nach Rückgabe des Elektrons wird das vollständig reduzierte FADH wieder regeneriert. Eine

25 EINLEITUNG 25 effizientere Nutzung der Lichtenergie erfolgt durch den Antennenchromophor (MTHF oder Deazaflavin), der mittels Förster-Energie-Transfer FADH in den angeregten Zustand bringen kann, jedoch für die Katalyse nicht essentiell ist (Übersichtsartikel Sancar, 2003). Im Gegensatz zu den Photolyasen befindet sich der Flavin-Cofaktor in pflanzlichen Cryptochromen im Grundzustand in der oxidierten FAD-Form (Ahmad et al., 2002) und das lichtinduzierte neutrale, semireduzierte FADH o Radikal spiegelt die aktive Form (signaling state) des Photorezeptors wider (Banerjee et al., 2007; Bouly et al., 2007). Eine Gruppe von drei Tryptophanen ist in vitro für den Transport der Elektronen bei der Photoreduktion der E. coli Photolyase notwendig: W382, W359, und W306 (Aubert et al., 2000). In Atcry1 ist diese Tryptophan-Triade konserviert und für die Funktion des Rezeptors auch in vivo notwendig (Zeugner et al., 2005). Die weitere Signaltransduktion der Cryptochrome ist noch nicht geklärt. Atcry1 wird C-terminal und möglicherweise auch an anderen Stellen Blaulicht-abhängig phosphoryliert (Shalitin et al., 2002, 2003). Teil dieser Phosphorylierung ist Autophosphorylierung (Bouly et al., 2003) und dieser Prozess führt zu einer Konformationsänderung (Partch und Sancar, 2005; Kottke et al., 2006) des Proteins. Diese wurde auch für Atcry1 durch eine lichtunabhängige ATP-Bindung gezeigt (Burney et al., 2009). Die Signalweiterleitung der Cryptochrome erfolgt zumindest teilweise durch Interaktion mit anderen Proteinen, die durch den C-Terminus vermittelt wird (siehe oben). Der erwähnte basische Helix-Loop-Helix Transkriptionsfaktor HFR1 (long Hypocotyl in Far-Red) stellt eine Komponente der Signalkaskade von cry1 dar und ist außerdem ein positiver Regulator phya-abhängiger Signalwege (Duek und Fankhauser 2003). Die direkte Interaktion von HFR1 und COP1 konnte von Yang et al., (2005) gezeigt werden. Der N-Terminus von HFR1 wird von COP1 ubiquitiniert und über das 26S- Proteasom abgebaut. In vivo verhindert Belichtung den Abbau von HFR1. Ein Vergleich der Expression Blaulicht-induzierter Gene in den hfr1- und cry1-knockout Pflanzen zeigt eine Co-Regulation von 70% der Gene (Zhang et al., 2008). Die Autoren postulieren eine globale Rolle in der Genregulation für HFR1, die durch cry1 feinabgestimmt wird. Im Gegensatz zu diesem positivem Regulator ist SUB1 ein negativer Regulator der Cryptochrom- und Phytochrom A-Signalwege (Guo et al., 2001). SUB1 (Short Under Blue light) ist ein Ca 2+ -bindendes Protein, das die lichtabhängige Akkumulation von HY5 verhindert. Es ist im Cytosol lokalisiert und liegt vorwiegend in Assoziation mit der Kernhülle vor. Ein weiterer positiver Regulator Blaulicht-abhängiger Prozesse (Inhibierung des Hypokotylwachstums, Kotyledonen-Öffnung) ist PP7, eine Serin/Threonin- Phosphatase (Møller et al., 2003). Das Protein ist im Zellkern lokalisiert, eine direkte Interaktion mit Cryptochromen konnte jedoch nicht gezeigt werden. Vermutlich ist es an

26 EINLEITUNG 26 der Signalweiterleitung der Cryptochrome durch die Blaulicht-abhängige Dephosphorylierung einer kernlokalisierten Signalkomponente beteiligt Bifunktionelle Photolyasen/ Cryptochrome Die molekulare Funktion von Photolyasen und Cryptochromen in Pilzen ist bislang kaum untersucht. Verschiedene Proteine der Cryptochrom/Photolyase-Familie, die in jüngster Zeit in Pilzen identifiziert wurden, stellen die Trennung von Photolyasen (nur Reparaturfunktion) und Cryptochromen (nur Rezeptorfunktion) in Frage. Die Expression von PHR1 (CPD-Photolyase) aus Trichoderma atroviride (ein mykoparasitischer Pilz) wird Blau- und UV-A-Licht abhängig induziert und sowohl PHR1 selbst als auch Blaulicht-Regulator-Proteine (BLRs) spielen dabei eine Rolle (Berrocal-Tito et al., 2007). Der Knockout des PHL1-Gens (Cryptochrome-(6-4)-PHotolyase-Like) im pathogenen Pilz Cercospora zeae-maydis führt zur abnormalen Entwicklung in Zellkultur sowie zum kompletten Verlust der Photoreaktivierung nach UV-Bestrahlung (Bluhm und Dunkle, 2008). Die Expression der CPD-Photolyase sowie zwei weiterer Gene, die in DNA- Reparatur-Mechanismen involviert sind (RAD2 und RVB2), ist in phl1-defizienten Stämmen vermindert. Wie PHL1 UV-Licht absorbiert und das Signal weiterleitet, ist noch nicht geklärt. Die Autoren spekulieren, PHL1 könnte als Photorezeptor, als Regulator der lichtabhängigen Genexpression oder als multifunktionales Enzym mit DNA-Reparatur- und Signalweiterleitungs-Funktion fungieren. Aspergillus nidulans hat nur einen Vertreter der Cryptochrom/Photolyase-Familie, der als crya bezeichnet wird. CryA zeigt sowohl eine regulatorische Funktion der lichtabhängigen Entwicklung des Pilzes als auch DNA-Reparaturfunktion (in E. coli Reparatur-definzienten Stämmen und Aspergillus nidulans UV-hypersensitiven-Stämmen, Bayram et al., 2008). GFP-Fusionen mit crya lokalisieren konstitutiv im Zellkern. Dort wirkt crya UV-A/Blaulichtabhängig als Transkriptionsrepressor von Genen der sexuellen Entwicklung des Pilzes, wobei crya entweder direkt an die DNA bindet oder mit anderen Kernproteinen interagiert (Bayram et al., 2008). Die Photolyasen der Pilze haben eine N-terminale Extension, vergleichbar der von Arabidopsis thaliana cry-dash, die den Photolyasen und Cryptochromen anderer Organismen fehlt. Diese etwa AS lange Sequenz trägt ein putatives Mitochondrien- und Kernlokalisations-Signal (Berrocal-Tito et al., 2007). BLAST Untersuchungen dieser Sequenzen von einigen Vertretern der Photolyase-Familie der Pilze zeigte eine hohe Konservierung und Homologien mit Protein-Bindungsmotiven anderer Proteine. Außerdem konnten mögliche Phosphorylierungsstellen gefunden werden (Berrocal-Tito et al., 2007). Die lichtabhängige Interaktion von ursprünglichen Vertretern

27 EINLEITUNG 27 der Photolyase/Cryptochrom-Familie mit Regulatoren der Transkription könnte der Vorläufer vor der strikten Trennung von Cryptochromen und Photolyasen gewesen sein. CPD- Photolyasen DASH- Cryptochrome (6-4)- Photolyasen Cryptochrome Cryptochrome/(6-4)- Photolyasen Pilze Abb. 1.7: Stammbaum eines Teils der Cryptochrom/Photolyase-Familie. Mitglieder der Cryptochrome und (6-4)-Photolyase-Orthologen aus Pilzen sind rot, DASH-Cryptochrome in orange, Cryptochrome aus Pflanzen und Tieren in blau, (6-4)-Photolyasen in violett und CPD-Photolyasen in grün dargestellt (aus Bluhm und Dunkle, 2008).

28 EINLEITUNG Die cry-dash Familie Die ersten Vertreter der cry-dash Familie wurden 2003 in Synechocystis sp. und Arabidopsis thaliana entdeckt (Brudler et al., 2003; Kleine et al., 2003). Das Gen sll1629 aus Synechocystis sp. PCC6803 wurde bereits im Jahr 2000 von Hitomi et al. als Cryptochrom diskutiert und war damit das erste in Prokaryoten gefundene Cryptochrom. Ein homologes Gen aus Arabidopsis thaliana (At5g24850) wurde von Kleine et al. (2003) charakterisiert und analog zu den zwei bereits bekannten Cryptochromen aus Arabidopsis thaliana cry3 genannt. Phylogenetische Berechnungen ergaben eine nahe Verwandtschaft dieser Proteine mit den tierischen Cryptochromen, und um diese zu verdeutlichen, wurde der Name cry-dash (Drosophila, Arabidopsis, Synechocystis, Homo sapiens) von Brudler et al. (2003) eingeführt. Weitere Vertreter wurden durch Datenbank-Analysen auch in Vertebraten gefunden (Danio rerio, Xenopus laevis), sowie in zahlreichen Eubakterien, Archeen und Pilzen (Daiyasu et al., 2004). Die DASH-Cryptochrome zeichnen sich dadurch aus, dass ihnen der Cryptochrom-spezifische C-Terminus fehlt, hingegen tragen sie eine kurze N-terminale Extension, in der in Atcry3 ebenfalls eine DAS-Domäne lokalisiert ist und die ansonsten als typisch für Cryptochrome von Landpflanzen gilt (Abb. 1.6). Die Photolyase-ähnliche (PHR) Domäne ist in Atcry3 konserviert und trägt die Chromophore FAD und MTHF (Kleine et al., 2003; Song et al., 2006, Klar et al., 2007). Auch in Solanum lycopersicum und Oryza sativa wurden cry-dash Vertreter gefunden, die aber keine konservierten DAS-Motive zeigen (SWISSPROT CRYD_LYCES, CRYD_ORYSA). Die N-terminalen 40 Aminosäuren von Atcry3 dienen als duale Targeting-Sequenz, die das - im Zellkern kodierte - Protein an Chloroplasten und Mitochondrien adressiert (Kleine et al., 2003). Diese Targeting-Sequenz konnte auch in den Sequenzen der homologen Gene von Oryza sativa und Solanum lycopersicum gefunden werden, die subzelluläre Lokalisation wurde jedoch nicht überprüft. Facella et al. (2006) zeigen die Expression des CRY-DASH Gens aus Arabidopsis thaliana sowohl im Samen/Embryo als auch in adulten Pflanzenteilen, mit einem deutlichen Maximum in Wurzeln und Blättern. Außerdem ist die Expression photoperiodisch reguliert, sie erreicht in der Morgen- und Abenddämmerung ein Maximum und ist im cry1-knockout bzw. CRY2-Überexpressions Hintergrund verändert (Facella et al., 2006). Aufgrund dieses Expressionsmusters schlagen die Autoren eine Rolle von cry-dash in der Vermittlung des Lichteingangssignals an die innere Uhr vor. Bereits Hitomi et al. (2000) untersuchte das Synechocystis Protein sll1629 auf seine Photolyase-Aktivität und konnte keine Reparaturfunktion für (6-4)-Photoprodukte oder Cyclobutan-Pyrimidin-Dimeren in vitro nachweisen. Die Überexpression dieses Proteins in einem Photolyase-defizienten E.coli Stamm erhöhte jedoch die UV-Resistenz der Zellen,

29 EINLEITUNG 29 was auf eine Reparaturfunktion in vivo hindeutet. Den gleichen Effekt zeigte auch die Überexpression von Danio rerio und Xenopus laevis cry-dash (Daiyasu et al., 2004). In einem Photolyase-Assay wiesen diese beiden Cryptochrome eine schwache CPD- Reparaturaktivität auf. Die UV-Resistenz defizienter E.coli Zellen konnte durch die Überexpression von Atcry-DASH dagegen nicht gesteigert werden (Kleine et al., 2003). a b c Abb. 1.8: Arabidopsis thaliana cry3 Struktur: a DNA-Sequenz des CRY3-Gens mit Exon I-XII (oben) sowie das resultierende Protein (unten) mit seiner Domänenstruktur und den Cofaktoren. An Aminosäureposition 470 konnte WoLF PSORT eine putative NLS identifizieren. b Struktur des cry3-monomers: die N-terminale Chromophor-tragende Domäne ist in grün, der FAD-bindende Teil in grau dargestellt (aus Klar et al., 2007) c Struktur des DAS-Motivs (AS 2-40).

30 EINLEITUNG 30 Der Verlust des sll1629 Gens hatte auch keinen Einfluss auf die UV-Sensitivität von Synechocystis, was eine relevante Reparaturfunktion in situ ausschließt. Brudler et al. und Kleine et al. (2003) konnten nachweisen, dass cry-dash aus Synechocystis und Arabidopsis DNA Sequenz-unabhängig bindet. Für sll1629 wurde aufgrund von Microarray- Analysen eine Rolle als Transkriptionsrepressor postuliert. Vibrio cholerae cry1 (Vccry1) ist ebenfalls ein Mitglied der cry-dash Familie und trägt FAD und Methenyltetrahydrofoalt (MTHF) als chromophore Gruppen (Worthington et al., 2003). Vccry1 zeigt keine DNA-Reparaturfunktion und wurde mit einem assoziierten RNA- Fragment von Nukleotiden Länge co-aufgereinigt. Es handelte sich dabei um artifiziell überexprimiertes Protein. Für Vccry1 konnte in vivo die RNA-Bindung nicht nachgewiesen werden. Es ist das einzige Cryptochrom, bei dem die Bindung an eine Ribonukleinsäure gezeigt wurde (Worthington et al., 2003). Dass DASH-Cryptochrome einzelsträngige DNA binden, konnten auch Selby und Sancar (2006) zeigen. Wenn Cyclobutan-Thymin-Dimere in einzelsträngiger DNA vorlagen, wurden sie von Arabidopsis thaliana, Xenopus laevis und Vibrio cholerae cry-dash ebenso effizient lichtabhängig repariert wie von Vibrio cholerae Photolyase (Selby und Sancar, 2006). Im Photoreaktivierungs-Assay zeigten Vccry1 und Xlcry-DASH keine effektive Reparatur-funktion (Daiyasu et al., 2004; Selby und Sancar, 2006). Durch Vergleiche der Kristallstrukturen von Synechocystis und Arabidopsis thaliana cry- DASH (Brudler et al., 2003, Klar et al., 2007) mit den Kristallstrukturen einiger Photolyasen (E. coli: Park et al., 1995, Anacystis nidulans: Tamada et al., 1997; Mees et al., 2004; Thermus thermophiles: Komori et al., 2001; Klar et al., 2006) sowie mit Arabidopsis thaliana cry1 (Brautigam et al., 2004), lassen sich die strukturellen Gemeinsamkeiten bzw. Unterschiede der Proteine genauer analysieren (siehe auch Übersichtsartikel Müller und Carell, 2009). Die Proteinfaltung insgesamt gleicht sich aufgrund der in allen diesen Proteinen vorkommenden N-terminalen α/β-domäne sowie der C-terminalen α-domäne, die FAD in U-Konformation bindet. FAD ist der katalytische Cofaktor der Photolyasen und liegt im aktiven Zustand voll reduziert vor (FADH ). Es gibt ein Elektron an das DNA-Photoprodukt ab, nachdem es selbst angeregt wurde (Park et al., 1995). Der Redox-Zustand des FAD-Cofaktors in Atcry3 wird Blaulicht-abhängig verändert (Song et al., 2006): in Dunkelheit liegt ein Equilibrium von FAD ox (40 %), FADH o (5 %) und FADH (55 %) vor. Bei Belichtung wird FAD ox bzw. FADH 0 in FADH überführt, bei anhaltender Belichtung ist dieser Zustand nicht reversibel. Für das DASH-Protein aus Danio rerio (Drcry-DASH) wurde gezeigt, dass FAD in Dunkelheit voll oxidiert vorliegt und Blaulicht-abhängig zu FADH o reduziert wird und bei weiterer Belichtung zu vollständig

31 EINLEITUNG 31 reduziertem FADH 2 bzw. FADH (Zikihara et al., 2008). Jüngste Untersuchungen an mutiertem cry3 Protein ohne MTHF-Cofaktor konnten den FAD Photozyklus für cry3 aufklären (Zirak et al., 2009, siehe Abb. 1.9). Bei kontinuierlicher Belichtung wird FAD in Atcry3 vollständig zu FADH photoreduziert (Photozyklus II, Abb. 1.9), ein kurzer Lichtpuls bewirkt dagegen die Bildung von FAD, welches wieder zu FAD revertiert (Photozyklus I). Photozyklus II wird auch von Atcry1 und Drcry-DASH durchlaufen (Kottke et al., 2006; Bouly et al., 2007). Die Form, die das Belichtungssignal übermittelt, ist bei Atcry1 und Atcry2 FADH o. In Atcry3 dagegen bildet FADH die katalytisch aktive Form, ebenso wie in Photolyasen. Einen neuen Elektronentransportweg konnten Moldt et al., (2009) aufdecken, bei dem der zweite Cofaktor (MTHF) photoreduziert wird, vermutlich über den voll reduzierten katalytischen Cofaktor (FADH ). Hierbei entsteht Methylen- Tetrahydrofolat. Die Oberfläche rund um die FAD-Bindetasche zeigt bei cry-dash viele basische Aminosäurereste und ähnelt damit mehr den CPD-Photolyasen als den Cryptochromen. Diese basischen Aminosäuren sind in Photolyasen essentiell für die DNA-Bindung (Mees et al., 2004) und ihre Präsenz in cry-dash erklärt die DNA-Bindungseigenschaften des Proteins. Abb. 1.9: Vereinfachtes Schema des Photozyklus des FAD-Cofaktors in cry3: Photozyklus I gilt für dunkeladaptiertes Protein, mit zunehmender Belichtungszeit verändert sich der Zyklus zu Schema II, da das Protein eine lichtabhängige Konformationsänderung erfährt (aus Zirak et al., 2009).

32 EINLEITUNG 32 Durch die Co-Kristallisation von Atcry-DASH mit einem synthetischen einzelsträngigen CPD-Analogon (fünf Thymine mit CPD Läsion zwischen T2 und T3), sowie durch Bindungs- und Reparaturstudien, konnten die Photolyase-Eigenschaften von cry-dash detailliert untersucht werden (Pokorny et al., 2008). Die Bindung des T<>T Substrats durch Wassertstoffbrückenbindungen von Aminosäuren in der Flavin-Tasche ist in cry- DASH identisch zu der Bindung in konventionellen Klasse-I-Photolyasen. Allerdings ist die Flavin- und Substratbindetasche in cry-dash weniger hydrophob. Das Cyclobutan- Pyrimidin-Dimer wird auch in doppelsträngiger DNA repariert, wenn die Läsion von mindestens einer ungepaarten Base flankiert wird und die Thymine des CPDs keine Wasserstoffbrücken-Bindungen zum Komplementärstrang ausbilden können (Pokorny et al., 2008). Das bedeutet, dass die DASH-Cryptochrome ebenso wie die verwandten Photolyasen die Eigenschaft haben, CPD-Läsionen zu reparieren (und hierzu den gleichen Mechanismus verwenden), aber nicht dazu imstande sind, das CPD-Produkt aus dem DNA-Doppelstrang herauszuwinden. Der Grund dafür ist vermutlich die hydrophilere Oberfläche der FAD-Tasche (im Vergleich zu Photolyasen), die die Bindung des aus der DNA entwundenen Substrates destabilisiert. Die Reparaturfunktion von cry-dash unterstützt die Annahme, dass sich die Cryptochrome aus den Photolyasen entwickelt haben. Die lichtabhängige Interaktion von Mitgliedern der Cryptochrom/Photolyase-Familie mit Transkriptions-Regulatoren geht vermutlich der Aufspaltung der Cryptochrome und Photolyasen voraus (Berrocal-Tito et al., 2007). Unterstützt wird diese These von der in der Diatomee Phaeodactylum tricornutum vorkommenden Photolyase PtCPF1. Sie zeigt (6-4)-Photoreparatur sowie Aktivität als Transkriptions-Repressor in heterologer Expression in tierischen Zellen. Außerdem steuert sie die Blaulicht-abhängige Genexpression in Phaedactylum (Coesel et al., 2009). PtCPF1 wurde - wie Vccry1 - mit einem RNA-Fragment co-aufgereinigt und ist näher mit den (6-4)-Photolyasen/tierischen Cryptochromen verwandt als mit den CPD- Photolyasen. Die Alge besitzt sonst keine Cryptochrom-Gene und keine (6-4)-Photolyase, aber zwei Vertreter der DASH-Cryptochrome. Die Autoren diskutieren, dass CPF1 das Resultat unabhängiger Evolution und funktioneller Diversifikation in marinen Eukaryoten sein könnte. Es könnte die circardiane und diurnale Rhythmik mit dem Zell-Zyklus (Kontrollpunkte/ check points) in Verbindung bringen und damit ein Modell für die Erklärung des evolutionären Ursprungs der circadianen Uhr sein.

33 EINLEITUNG Zielsetzung Zu Beginn dieser Arbeit war die Familie der DASH-Cryptochrome und das zu dieser Gruppe gehörige Cryptochrom 3 aus Arabidopsis thaliana wenig erforscht; es lagen kaum Hinweise auf die Funktion dieses (putativen) Cryptochroms in vitro oder in vivo vor. Es war bekannt, dass cry3 in Arabidopsis in den Mitochondrien und Chloroplasten nach transienter Transfektion in Protoplasten lokalisiert ist (Kleine et al., 2003) und 2005 wurde die Kristallstruktur des Proteins aufgeklärt (Pokorny et al., 2005; Huang et al., 2006; Klar et al., 2007). Ziel dieser Arbeit war es, die Expression von cry3 in verschiedenen Organen bzw. Geweben von Arabidopsis thaliana auf RNA und Proteinebene zu untersuchen, um daraus Rückschlüsse auf die Funktion von cry3 ziehen zu können. Durch Generierung transgener Pflanzen, die cry3-gfp exprimieren, sollte die Organellen- Lokalisation des Proteins auch in intakten transgenen Linien nachgewiesen werden. Zur Untersuchung einer möglichen Organell-spezifischen Funktion von cry3 war es außerdem wünschenswert, Pflanzenlinien zu etablieren, in denen das Protein nur in Mitochondrienbzw. nur in Chloroplasten lokalisiert ist, um diese Linien dann phänotypisch mit dem Wildtyp vergleichen zu können. Ferner sollte anhand transienter Expression des cry3-gfp Fusionsproteins eine mögliche lichtabhängige Lokalisation in den Chloroplasten untersucht werden. Diese wäre denkbar, da für Cryptochrom 1 in Arabidopsis thaliana eine lichtregulierte Veränderung der Lokalisation gezeigt wurde (Yang et al., 2000). Durch die während dieser Arbeit erfolgte Aufklärung der Kristallstruktur des Proteins (Klar et al., 2007) und somit seiner Faltungsmotive erlangte die N-terminale α-helix von cry3 unser Interesse. Es wurde hierbei die Frage addressiert, ob diese für den Import in Chloroplasten eine Rolle spielt. Durch Expression entsprechender Deletionskonstrukte in Protoplasten sollte dies untersucht werden.

34 MATERIAL Material 2.1. Chemikalien Alle Chemikalien wurden, soweit nicht anders angegeben, von den Firmen ROTH und SIGMA bezogen. Die Verwendung und Lagerung erfolgte nach Herstellerangaben Puffer und Lösungen Die Zusammensetzung der verwendeten Puffer und Medien ist im jeweiligen Kapitel beschrieben. Alle Lösungen wurden vor Gebrauch autoklaviert oder sterilfiltriert. Die Bezeichnung H 2 O bezieht sich immer auf bidestilliertes Wasser Geräte Tabelle 1.1: In der vorliegenden Arbeit verwendete Geräte Gerät Bezeichnung Firma Digitalkamera Coolpix 5000 NIKON Fluoreszenzmikroskop Axiovert 200 M ZEISS Folienschweißgerät Vacupak KRUPS Heizblock Thermomixer comfort EPPENDORF Imagestation Gel Doc 1000 BIO-RAD Konfokales Laserscan- Mikroskop TCS SP2 Leica Magnetrührer RCT basic IKA Werke PCR-Cycler Mastercycler gradient Eppendorf ph-meter Photometer GeneAmp PCR System 9600 icycler (real-time Cycler) Microprozessor ph/ion Meter pmx 2000 UV-1202 UV-VIS Spectrophotometer k Perkin Elmer Biorad Wissenschaftlich Technische Werkstätten, Weilheim Shimadzu

35 MATERIAL 35 Photmeter Protein- Transferapparatur Schüttler UV-2401 PC UV-VIS Recording Spectrophotometer Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Innova 4230 Refrigerated Incubator Shaker G24 Environmental Incubator Shaker Multitron II Shimadzu Bio-Rad New Brunswick Scientific NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC INFORS AG Sterilbank Auro H 130 EHRET LABOR- UND PHARMATECHNIK Laminar flow cabinet Laflow FLOW LABORATORIES PRETTL Tischschüttler Typ 300 S GESELLSCHAFT FÜR LABORTECHNIK MBH Ultraschallgerät MSE (MEASURING & SCIENTIFIC EQUIPMENT) Wärmeschrank B 6060 HERAEUS INSTRUMENTS Wasserbad Typ 1003 GESELLSCHAFT FÜR LABORTECHNIK MBH Zellmühle MM 200 RETSCH, HAAN Zentrifugen Biofuge pico HERAEUS INSTRUMENTS Labofuge 400 R HERAEUS INSTRUMENTS J2-21 Centrifuge BECKMANN 2.4. Organismen Arabidopsis thaliana Es wurden Wildtyp-Stämme der Ökotypen Columbia (Col) und Landsberg erecta (Ler) verwendet, sowie die Phytochrom A knockout-mutante (phya) (Nagatani et al., 1993). Eine Linie, die cry3 im Ler Hintergrund unter Kontrolle des 35S-Promotors (aus Cauliflower Mosaic Virus) überexprimiert (= 35S:cry3), wurde von Stefan Reisbacher in unserem Labor hergestellt (Dissertation, 2009). Eine Transposon-Insertionslinie mit Insertionsstelle im CRY3-Gen des Nossen-Wildtyps (Nos) wurde vom RIKEN BIORESOURCE CENTER bezogen (pst 20171), diese Linie exprimiert kein cry3-protein(= cry3). Weitere transgene Pflanzen

36 MATERIAL 36 wurden in dieser Arbeit ebenfalls durch Agrobakterien vermittelte Transformation mittels Floral Dip erzeugt, ihre Herstellung ist in beschrieben. So entstanden die folgenden Linien: 35S:cry3-GFP: die Pflanze exprimiert ein Fusionsprotein aus cry3 (Volllänge) und GFP unter Kontrolle des 35S-Promotors im Ler Hintergrund. Eine weitere Linie exprimiert das GFP-Protein allein unter dem (hypothetischen) cry3-promotor (cry3:gfp) im Ler Wildtyp. Das Transitpeptid aus der Ferrodoxin-NADP + -Oxidoreduktase (AS 1-55) aus Spinacia oleracea fusioniert mit cry3 ohne N-terminale Zielsteuerungssequenz (AS ) wird in zwei Transposon-Linien als GFP-Fusion (p(fnr)cry3-gfp), bzw. ohne (p(fnr)- cry3), überexprimiert. Anstelle des FNR-Transitpeptids wird das Targeting-Peptid der Isovaleryl-CoA Dehydrogenase aus Arabidopsis (AS 1-48) in gleichen Fusionen exprimiert: Linie p(ivd)-cry3-gfp und p(ivd)-cry Escherichia coli Es wurde der E. coli-stamm XL1-Blue von STRATAGENE für Klonierungsarbeiten und DNA- Präparationen verwendet Agrobakterium tumefaciens Die stabile Transformation der Pflanzen wurde mit dem Agrobakterien-Stamm GV3101 (enthält das Helferplasmid pmp90) durchgeführt (Koncz und Schell, 1986). Der Stamm besitzt genomisch eine Rifampicillin-Resistenz und das Helferplasmid enthält das Gen für eine Gentamycin-Resistenz.

37 MATERIAL Antikörper Die beschriebenen Antikörper wurden in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration eingesetzt, andere Arbeitskonzentrationen siehe im Ergebnisteil. Die Langzeit-Lagerung erfolgte bei -80 C. Die sekundären Antikörper waren alle HRP-gekoppelt und wurden in der Konzentration 1: eingesetzt. Tabelle 1.2: Liste der verwendeten Antikörper Primäre Antikörper Arbeitskonz.: Wirt Hersteller (Katalog-Nr) Anti-cry3 (polyklonal) (1:1000) Kaninchen dieses Labor, EUROGENTEC Anti-GFP (polyklonal) (1:1000-1:30000) Ziege ROCKLAND ( ) Anti-DnaK (mitochondriales DnaK aus Lycopersicon spec., polyklonal) Anti-POM 34 (mitochondriales Porin aus Kartoffel) Anti-Histon H1-H4 (monoklonal) Anti-Histon H1 (monoklonal) (1:3000) Kaninchen L. NOVER, UNIVERSITÄT FRANKFURT (1:1000) Kaninchen H.-P. BRAUN, UNIVERSITÄT HANNOVER (1:2000) Maus CHEMICON (MAB052) (1:1000) Maus GENETEX (GFX72121) Sekundäre Antikörper (1: verdünnt) Anti-Kaninchen Ziege SIGMA (A6154) Anti-Maus Ziege SIGMA (A4416) Anti-Ziege Kaninchen SIGMA (A5420) 2.6. Plasmide Bei den in der Tabelle aufgeführten Plasmiden handelt es sich um die Ausgangsvektoren. Die daraus entwickelten Konstrukte sind im jeweiligen Ergebnisteil aufgeführt. Die

38 MATERIAL 38 Plasmide wurden in wässriger Lösung bei -20 C gelagert. Abbildungen der Plasmidkarten sind im Anhang aufgeführt (8.1). Tabelle 1.3: Liste der verwendeten Ausgangsplasmide Plasmid Verwendung Resistenz Hersteller pgem-t Analyse und Vermehrung von PCR-Produkten Ampicillin PROMEGA pava393 transient Expression in Pflanzenzellen Ampicillin ALBRECHT VON ARNIM, UNIVERSITÄT VON TENNESSEE pfgc5941 Binärer Vektor, zur stabilen Integration von DNA ins Pflanzengenom Kanamycin, BASTA ARABIDOPSIS BIOLOGICAL RESOURCE CENTER (ABRC) ppcv812 Binärer Vektor Ampicillin, Hygromycin CSABA KONCZ, MPI FÜR ZÜCHTUNGSFORSCHUNG KÖLN (KONCZ UND SCHELL, 1986) 2.7. Oligonukleotide Alle Oligonukleotide wurden von der Firma MWG BIOTECH synthetisiert und tragen das Datum des Auftragseingangs Primer für real-time PCR Primer zur Amplifikation der Basenpaare des CRY3 Gens: 5 Primer: #1 ( ): 5 ACCCCTTTCTTCCTCTTCTCTGTTCC 3 (Tm: 59,5 C) 3 Primer: #3 ( ): 5 CGTTACTCCTTTCCCCTTTCTCTTA 3 (Tm: 55,6 C) Primer zur Amplifikation der Basenpaare des Ubiquitin 10 Gens: 5 Primer: # 2 ( ): 5 CGG GAA AGA CGA TTA CTC TTG AGG 3 3 Primer: #1 ( ): 5 GCA AGA GTT CTG CCA TCC TCC Primer zur Amplifikation des CRY3-Promotors 5 Primer: #2 ( ) 5 ACAAACCCAAAATTCTGGAATCG 3 (Tm: 56 C) 3 Primer: #1 ( ) 5 AAT GGATCC CTTTTTGGTGTTTGTGTTTT 3 Der 5 Primer bindet 1500 bp, der 3 Primer 30 bp vor dem Startcodon des CRY3-Gens in der nicht-kodierenden Region von Chromosom 5, als Template diente genomische Gesamt-DNA aus Arabidopsis Wildtyp Ler.

39 MATERIAL Primer zur Amplifikation des CRY3-Gens Zur Amplifikation von CRY3 aus cdna des Wildtyps Ler oder Col wurden folgende Primer verwendet: 5 Primer: #1 ( ) 5 CCATGGCGGCTTCCTCTCTCTC3 3 Primer: #2 ( ) 5 CCATGGCAGGACCATTGTGTCTAGAAC 3 Das Translationsprodukt enthält das N-terminale, duale Targeting-Peptid und 5 wie 3 eine NcoI Schnittstelle (für Klonierungen in den Vektor pava393). Um cry3 ohne N-Terminus (ohne Zielsteuerungssequenz) zu amplifizieren, wurde ein weiterer Primer generiert, der 120 bp upstream des Startcodons im CRY3 Gen bindet. Der Primer generiert ebenfalls eine NcoI Schnittstelle. 5 Primer: #3 ( ) 5 CCATGGGATCCGCCGCAAAAATGAACGA 3 Zur Generierung von künstlichen Fusionsproteinen wurde ein 5 Primer entsprechend dem Obigen mit einer NheI statt einer NcoI Schnittstelle verwendet: 5 Primer: #1 ( ): 5 GCTAGCGTCCGCCGCAAAAATGAACGA Primer zur Amplifikation des Transitpeptids der Ferrodoxin-NADP + -Oxidoreduktase Die Gensequenz der FNR aus Spinacia oleracea (Acc.-Nr.: X07981) lag bereits in dem Vektor PBLUESCRIPT vor. Um die ersten 165 bp zu amplifizieren, die für das N-terminale Chloroplasten Targeting-Peptid kodieren, wurde ein 5 Primer mit NcoI Schnittstelle generiert sowie ein 3 Primer mit NheI Schnittstelle. 5 Primer: #4 ( ) 5 CCATGGCCACCACCGCTGTCACCGCC 3 3 Primer: #5 ( ) 5 GCTAGCCCGGCCCTGATGGGTCCCATTT Primer zur Amplifikation des Signalpeptids der Isovaleryl- CoA Dehydrogenase Um die ersten 145 bp der IVD (Acc.-Nr.: Y12695) aus cdna von Arabidopsis thaliana Wildtyp Ler zu amplifizieren, welche das Protein für den Import in Mitochondrien adressieren, wurden folgende Primer verwendet: 5 Primer: #2 ( ): 5 CCATGGTGCAGAGGTTTTTCTCCGCCA 3 3 Primer: #3 ( ): 5 GCTAGC GTATCTTGCGCAAACTTGGATAC 3 Der 5 Primer generiert eine NcoI, der 3 Primer eine NheI Schnittstelle zur Klonierung in den Vektor pava393.

40 MATERIAL Primer zur Amplifikation der NES aus RanBP1a Die Nucleus-Export-Sequenz aus dem Gen des Ran-Binding Protein 1a (Acc.-No.: CA ) aus Arabidopsis thaliana wurde mit den unten genannten Primern aus cdna des Wildtyps Ler amplifiziert. Das PCR Produkt entspricht den C-terminalen 216 bp des Gens und enthält 5 eine BglII und 3 eine BamHI Schnittstelle. 5 Primer: #1 ( ): 5 AGATCTAG 3 3 Primer: #2 ( ): 5 GGATCCTTATTGTTGAGGGACCACTTT Primer zur Deletion der α-helix aus CRY3 Um cry3 ohne N-terminale Helix zu exprimieren, wurde aus dem cry3-gen der Bereich der AS per gerichteter Mutagenese entfernt. Dazu wurde das QuickChange II Site- Directed Mutagenesis Kit der Firma STRATAGENE verwendet, als Template diente das Plasmid pava393-cry3-gfp. Die Primer wurden von der Herstellerfirma chromatographisch aufgereinigt (durch FPLC). Primer zur gerichteten Mutagenese an AS Position 12/13: 5 Primer: #1 ( ) 5 CCGTGTTCCGGCTCTCAGCGCTGAAGAGATTGACTCC 3 3 Primer: #2 ( ) 5 GGAGTCAATCTCTTCAGCGCTGAGAGCCGGAACACGG 3 Primer zur gerichteten Mutagenese an AS Position 27/28: 5 Primer:#3 ( ) 5 CCATAAAAACATTTGAGAGAAGCGCTTTACCTTCTTCTTCCTCCG 3 3 Primer:#4( ) 5 CGGAGGAAGAAGAAGGTGGGGCGCTTCTCTCAAATGTTTTTATGG3

41 METHODEN Methoden 3.1. Arbeiten mit Arabidopsis thaliana Pflanzen und Zellkulturen Pflanzenanzucht in Erde Ton- oder Plastiktöpfe mit dem Durchmesser 5-9 cm wurden mit einem zweimalig autoklavierten Erde/Vermiculite -Gemisch (2:1) gefüllt und gut gewässert. Zur Bekämpfung von Trauermückenlarven wurde zur Erde vor der Aussaat einmalig BAYER CombiGranulat -Lösung gegeben, im Falle eines späteren Befalls wurde diese Behandlung wiederholt. Zur Pflanzenanzucht wurden ~10-50 Samen ausgebracht und diese zwei Tage in Dunkelheit bei 4-8 C stratifiziert. Die weitere Kultur erfolgte in der Phytokammer (siehe unten), bzw. im Gewächshaus. Parameter Phytokammer: Langtag = 16 h Licht, 8 h Dunkel; Weißlicht: Photonenfluss 300 µmol/m 2 s; Lampen: Clean-ACE MT400 DL/BH und Multi-Hiace MF 400 LE/BUH der Firma EYE; Temperatur C, Luftfeuchte 60% Sterilanzucht auf Phytoagar Zur Sterilisation der Samen wurden diese in ein steriles 2 ml Reaktionsgefäß überführt und 2 min mit 70% EtOH inkubiert. Das Ethanol wurde abgeommen und die Samen weitere 15 min unter gelegentlichem Schütteln mit 5%iger (v/v) Natriumhypochlorid- Lösung mit 0,05% (v/v) Tween behandelt. Die Natriumhypochlorid-Lösung wurde entfernt und die Samen fünfmal mit sterilem H 2 O gewaschen. Die Samen wurden in 1 ml sterilem 0,15%igem (w/v) Phytoagar (DUCHEFA) aufgenommen und auf vorbereitete Petrischalen mit Phytoagar (siehe unten) getropft. Zur Herstellung steriler Phytoagar-Petrischalen wurde 1 L ½ MS-Medium (DUCHEFA) mit 0,5 g MES-Pufferan und 0,8% (w/v) Phytoagar auf ph 5,8 eingestellt und autoklaviert. Das abgekühlte Medium wurde in sterile Petrischalen (GREINER LABORTECHNIK) gegossen. Zur Herstellung von selektivem Medium wurde nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf etwa 50 C steriles BASTA (Endkonzentration 10 mg/l, AVENTIS) bzw. Hygromycin (Endkonzentration 15 mg/l) zugegeben. Je Petrischale wurden etwa 100 Samen ausgebracht und die Schalen mit Nesco -Film verschlossen. Die weitere Anzucht erfolgte wie in beschrieben.

42 METHODEN Flüssigkultur Um Wurzelmaterial für Proteinextrakte zu erhalten, wurden Arabidopsis Pflanzen in Gamborg B5 Flüssigmedium mit 1% Saccharose angezogen. Etwa Samen wurden sterilisiert (s. oben), in einen 250 ml Erlenmeyerkolben mit 50 ml Medium gegeben und im Langtag bei 250 rpm geschüttelt. Die nach 10 Tagen gebildete Wurzelmasse wurde von den grünen Pflanzenteilen abgetrennt und bis zur Weiterverarbeitung bei -70 C gelagert. Gamborg B5 Medium: Gamborg B5 3 g/l (DUCHEFA); 2,5 mm MES; ph 5,8 (KOH); 1% Saccharose Zellkultur In dieser Arbeit wurden eine weiße Arabidopsis-Wurzel und eine grüne Mesophyllzellkultur verwendet (Prof. Dr. C. KONCZ, MPI FÜR ZÜCHTUNGSFORSCHUNG KÖLN). Die Kulturen wurden bei 22 C bzw. 25 C und 100 rpm geschüttelt. Die grüne Zellkultur wurde im Langtag gehalten, die weiße in Dunkelheit. Alle 7 Tage wurden die Zellen unter sterilen Bedingungen überimpft: dazu wurden 10 ml 1 Woche alte Kultur zu 40 ml Zellkultur- Medium (siehe unten) in ein 250 ml Erlenmeyerkolben gegeben und weiter unter obigen Bedingungen geschüttelt. Zellkultur-Medium: 1x MS Vitamine (4.3 g/l DUCHEFA), 88 mm Saccharose, Gamborg B5 Vitamine (2,5 ml/l für grüne, 10 ml/l für weiße Zellkultur DUCHEFA), ph 5,7. Zusätzlich wurde für grüne Zellkultur zugegeben: Kinetin in einer Endkonzentration von 0,5 mg/l und NAA (α-naphthalenessigsäure) in einer Endkonzentration von 0,1 mg/l. Für weiße Zellkultur wurde das Hormon 2,4-D (2,4-Dichlorophenoessigsäure) in einer Endkonzentration von 1 mg/l hinzu gegeben Herstellung von Protoplasten aus Zellkultur Es wurde ein Kolben weiße oder grüne Zellkultur 3 Tage nach Überimpfung verwendet. 2 Kulturröhrchen (10 ml) wurden mit Zellsuspension befüllt und bei 400 x g 5 min zentrifugiert. Die Zellen wurden mit CaCl 2 -Puffer gewaschen und in jeweils 7 ml Enzymlösung aufgenommen. Die Ansätze wurden in einer sterilen Petrischale vereinigt und 6 h bei 25 C und 50 rpm geschüttelt. CaCl 2 -Lösung: 8 mm CaCl 2 ; 0.4 M Mannitol; ph 5.5 Enzymlösung: CaCl 2 -Lösung + 1% Cellulase; 0,25% Macerozym

43 METHODEN Herstellung von Protoplasten aus Blättern oder Wurzeln von Arabidopsis thaliana Es wurden nur Pflanzenteile aus steriler Anzucht (siehe 3.1.2) verwendet. Junge Blätter wurden unter sterilen Bedingungen in 2-4 mm 2 große Stücke zerteilt und entweder einzeln in Reaktionsgefäßen oder für präparative Zwecke in großer Anzahl in einer Petrischale mit Cellulase/Macerozym-Lösung über Nacht bei 25 C und 50 rpm geschüttelt. Cellulase/Macerozym-Lösung: Gamborg B5 3 g/l (DUCHEFA); 0,5 M Mannitol; 2.5 mm MES; ph 5.8 (KOH); 1,2% Cellulase; 0,8% Macerozym PEG vermittelte Transformation von Arabidopsis thaliana Protoplasten Protoplasten wurden wie in beschrieben hergestellt, die Zellen aus einem Ansatz auf zwei Kulturröhrchen aufgeteilt und bei 100 x g 5 min abzentrifugiert. Bei allen Pipettierschritten müssen für Protoplasten abgeschnittene Spitzen verwendet werden. Die Protoplasten wurden mit CaCl 2 -Lösung gewaschen, in wenig Restflüssigkeit resuspendiert und sehr langsam 10 ml W5-Lösung zugegeben (dafür werden etwa 20 min benötigt). Danach wurden die Zellen wieder abzentrifugiert und in 10 ml W5 Lösung aufgenommen. Ein Aliquot der Zellen wurde zum Bestimmen der Zelldichte entnommen, der Rest 20 min bei 4 C in Dunkelheit gelagert. Eine 1:100 Verdünnung der Protoplasten wurde in der Thoma-Zählkammer ausgezählt. Nach dem Abzentrifugieren wurden die Zellen in MMM- Medium aufgenommen und dabei auf eine Zelldichte von 2 x 10 7 Protoplasten/mL eingestellt. Je Ansatz wurden 250 µl Zellen in ein Zellkulturröhrchen gefüllt und 20 µg Plasmid-DNA (20 µl der Konzentration 1 µg/µl) zugegeben sowie anschließend sehr langsam 250 µl 40%iges (w/v) PEG. Der Ansatz wurde vorsichtig gemischt und 20 min inkubiert. Dann wurden sehr lagsam 10 ml W5 zugegeben (dauert etwa 30 min). Nach dem Abzentrifugieren bei 100 x g 5 min wurde das Pellet in 2 ml K3 aufgenommen und die Zellen in Dunkelheit bei 25 C über Nacht (ca. 20 h) gelagert. W5-Lösung: 154 mm NaCl; 125 mm CaCl 2 ; 5 mm KCl; 5 mm Glucose; ph MMM-Medium: 15 mm MgCl 2 ; 0,1% MES; 0,5 M Mannitol; ph 5.8 PEG: 40% (w/v) PEG; 0,4 M Mannitol; 0,1 M Ca(NO 3 ) 2, K3-Medium: 400 mm Sucrose, 4.3 g Gibco MS Medium (DUCHEFA), 100 mg Myo-Inositol, 250 mg Xylose, 460 mg CaCl 2, 10 mg Thiamin, 1 mg Pyridoxin, 1 mg Nicotinsäure/1 L, ph 5.8

44 METHODEN Agrobakterien-vermittelte Transformation von Arabidopsis Pflanzen durch Floral Dip Pflanzenvorbereitung: Samen der zu transformierenden Ökotypen wurden in Tontöpfen ausgesät, die bis direkt unter den Rand mit Erde gefüllt und mit einem Nylonnetz zugebunden waren. Nach der Keimung (die Pflanzen wachsen durch das Netz hindurch) wurden die Keimlinge auf 3 pro Topf vereinzelt und im Langtag weiter kultiviert. Nach ca. 4 Wochen wurden die ersten Knospen entfernt, um eine vermehrte sekundäre Blütenbildung zu erzielen. Nach weiteren 4-8 Tagen waren die Pflanzen transformationsfähig (Infloreszenzen 2-10 cm lang, Blütenknospen noch geschlossen). Vor dem Dippen wurden alle geöffneten Blüten entfernt. Anzucht Agrobakterien: Eine Einzelkolonie des entsprechenden Agrobakterien-Stammes wurde in 5 ml Kulturmedium inkl. Antibiotika h bei 250 rpm und 28 C geschüttelt und mit dieser Vorkultur 500 ml Medium angeimpft. Nach Erreichen einer OD 600 = 2 (nach 1-2 Tagen) wurden die Zellen abzentrifugiert (5.500 x g, 20 min, RT) und in 500 ml Infiltrationsmedium resuspendiert mit einer resultierenden OD 600 = 0,8. Kulturmedium für Agrobakterien: 10 g Trypton, 5 g Hefe-Extrakt, 5 g NaCl/L, entsprechend wurden Antibiotika zugegeben mit einer Endkonzentration von: Kanamycin 50 mg/ml, Gentamycin 10 mg/ml, Rifampicin 25 mg/ml Infiltrationsmedium: 5% (w/v) Sucorse; 0,05% (v/v) Silwet L-77 (LEHLE SEEDS, Vac-instuff) Selektionsplatten: auf BASTA -Resistenz: 5-10 mg/l Glufosinat-Ammonium; auf Hygromycin-Resistenz: mg/l Hygromycin, jeweils in Phytoagar ohne Saccharose Floral dip (Infiltration): Ein großes Becherglas wurde bis zum Rand mit Zellsuspension gefüllt, die Pflanzen kopfüber in die Suspension gehalten für ca. 5 s unter leichtem Schütteln. Nach der Transformation wurden die Pflanzen einen Tag lang in einer großen Plastikwanne mit Haushaltsfolie abgedeckt bei geringer Lichtintensität gehalten. Danach wurden sie weiter bis zur Samenernte im Langtag kultiviert. Selektion transgener Pflanzen: Die geernteten Samen wurden oberflächensterilisiert (siehe 3.1.2) und auf Selektions- Platten ausgebracht. Selektiert wurde auf die jeweilige Antibiotika- bzw. Herbizid-

45 METHODEN 45 Resistenz, die auf der T-DNA, die von der Pflanze aufgenommen wurde, kodiert war. Im Falle des ppcv812 Vektors handelte es sich um eine Resistenz gegen Hygromycin (Expression einer Hygromycin B-Kinase, welche das Antibiotikum durch Phosphorylierung inaktiviert), bei pfgc5491 um die Resistenz gegen BASTA (Expression der Glufosinat-N- Acetyl-Transferase, welche das im BASTA enthaltene Glufosinat in eine biologisch unwirksame Form umwandelt). Nach Stratifikation wurden die Platten in die Phytokammer überführt, nach der Keimung entwickelten sich nur die resistenten Pflanzen weiter. Nach 1-2 Wochen wurden diese auf Erde umgesetzt und zur Selbstung und späteren Samenernte in Aracons (LEHLE SEEDS) verpackt Proteinbiochemische Methoden Herstellung von Protein-Gesamtextrakt aus Arabidopsis thaliana Es wurden Pflanzenteile aus Anzucht auf Erde oder Phytoagar verwendet. Die Pflanzenteile wurden geerntet, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verarbeitung bei -70 C gelagert. Zum Zellaufschluss wurde das Material in einen Mörser, oder bei kleinen Mengen in 2 ml Eppendorfgefäßen, mit 50% (v/w) Extraktionspuffer in flüssigem N 2 eingefroren. Für die Extraktion in 2 ml Gefäßen wurden 2 Stahlkugeln (Ø 5 mm) zugegeben. Von Hand wurde ca. 5 min gemörsert unter wiederholter Zugabe von N 2, die Reaktionsgefäße wurden in Adaptoren in die Zellmühle (MM200, RETSCH) eingespannt und das Material 2 x 30 s bei 30 Hz aufgebrochen. Das gefrorene Material wurde in frische Gefäße überführt und 20% (v/v) SDS-Probenpuffer zugegeben. Die Proben wurden bei 95 C 5 min erhitzt und bei x g 10 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und bei -20 C gelagert. Extraktionspuffer: 125 mm Tris/HCl ph 8,0; 3% SDS; 2% Triton X xSDS-Probenpuffer: 225 mm Tris/HCl ph 6,8; 50% Glycerin; 5% SDS; 0,05% Bromphenolblau; 250 mm DTT Kernproteinisolation aus Arabidopsis Zellkultur Als Ausgangsmaterial wurden transformierte oder untransformierte Protoplasten aus weißer oder grüner Zellkultur verwendet (siehe und ). Für die Kernisolation aus transformierten Protoplasten wurden 8 x 10 7 Zellen benötigt. Die am Vortag transformierten und in K3 inkubierten Protoplasten wurden zusammengeführt und nach Zugabe von ca. 5 x Volumen W5 5 min bei 100 x g abzentrifugiert. Der Überstand wurde

46 METHODEN 46 verworfen und die Zellen in wenig Restvolumen resuspendiert. Alle folgenden Arbeiten wurden auf Eis durchgeführt. Das 2-fache Volumen Honda Puffer mit 0,5% Triton (Weigel und Glazebrook, 2001) wurde zugegeben und der Ansatz ca. 15 min auf Eis inkubiert. Lichtmikroskopisch wurde anschließend kontrolliert, ob die Kerne bereits frei lagen, andernfalls wurden die Zellen durch eine Kanüle (Ø 0,6 mm) gesaugt und somit die Zellmembranen aufgebrochen. Die Suspension wurde durch eine Nylonmembran Ø 20 µm (MILIPORE) gefiltert und die Kerne bei 1500 x g und 4 C 5 min abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit Honda Puffer (0.1% (v/v) Triton X100) gewaschen und anschließend in 1 ml Honda Puffer aufgenommen. Bei 100 x g wurden Stärke und restlicher Debris pelletiert, der Überstand erneut bei 1800 x g zentrifugiert. Die so gewonnenen Kerne wurden in 200 µl 5 x SDS-Probenpuffer (3.2.1.) aufgenommen und 5 min auf 95 C erhitzt. Honda-Puffer: 2.5% Ficoll PM 400, 5% Dextran T 40, 0.4 M Sucrose, 25 mm Tris/HCl ph 7,4; 10 mm MgCl 2 ; 10 mm ß-Mercaptoethanol; 10 µl/ml Protease Inhibitor Cocktail for plant cell und tissue extracts (SIGMA) Konzentrationsbestimmung von Proteinen mit Amidoschwarz Zur Bestimmung des Proteingehaltes denaturierter Proben wurde die Amidoschwarz- Methode (Chapdelaine et al., 2001) verwendet. Dazu wurden 5 µl der Proteinlösung mit H 2 O auf 200 μl aufgefüllt und mit 800 μl Amidoschwarzlösung versetzt. Mit einer 12 minütigen Zentrifugation bei x g (RT) wurde das präzipitierte Protein pelletiert. Anschließend wurde die überschüssige Färbelösung durch Waschen mit 1 ml Waschlösung entfernt und erneut 12 min zentrifugiert. Das getrocknete Pellet wurde in 1 ml 0,2 M NaOH resuspendiert. Die Messung erfolgte photometrisch bei 615 nm gegen eine ebenso behandelte, proteinfreie Referenz. Der Proteingehalt wurde anhand einer BSA-Eichkurve berechnet. Färbelösung: 90% (v/v) Methanol; 10% (v/v) Essigsäure; 1 Spatelspitze Amidoschwarz 10B (etwa auf eine OD 615 = 10) Waschlösung: 90% (v/v) Methanol; 10% (v/v) Essigsäure SDS-Page nach Lämmli Für die anschließende Immunodetektion von Proteinen wurden die Proben zunächst auf einem 10%igen (w/v) Polyacrylamid-Gel nach Lämmli aufgetrennt. Es wurde eine Mischung von Acrylamid/Bisacrylamid von 37,5:1 verwendet.

47 METHODEN 47 Trenngel: 10% Acrylamid; 0,37 M Tris/HCl ph 8,8; 0,1% SDS, 0,4% Ammoniumpersulfat; 0,06% Temed Sammelgel: 3,5% Acrylamid; 0,125 M Tris/HCl ph 6,8; 0,2% SDS; 0,7% Ammoniumpersulfat; 0,05% Temed Die Proben wurden vor dem Auftragen 5 min auf 60 C erhitzt, die Auftrennung erfolgte bei 45 V und max. 300 ma. Als Größenstandard wurde der Marker SDS 7B der Firma Sigma bzw. der PageRuler Pestained Protein Ladder von MBI FERMENTAS verwendet Coomassie-Färbung von Polyacrylamid-Gelen Zur Anfärbung von Proteinen in SDS- PAGE Gelen wurden die Gele 1 h in Färbelösung geschwenkt. Färbelösung: 25% (v/v) Isopropanol, 10% (v/v) Essigsäure, 0,05% Coomassie-R250 Anschließend wurde mit 10% Essigsäure solange gewaschen, bis der Gelhintergrund vollständig entfärbt war. Zum Trockenen wurden die Gele anschließend in H 2 O gewaschen, zwischen zwei Lagen Zellglas in einen Rahmen eingespannt und über Nacht getrocknet. Alternativ wurden die Gele in Klarsichtbeuteln eingeschweißt Immobilisierung von Proteinen auf Nitrocellulose-oder PVDF-Membran Zum Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose- oder PVDF-Membran wurden die Proteingele sowie die Membran zunächst ½ h in Transferpuffer äquilibriert. PVDF- Membranen wurden durch kurzes Eintauchen in Methanol aktiviert. Anschließend wurde ein Stapel aus 6 Lagen blotting- Papier (MN 218 B MACHEREY & NAGEL) oder zwei Lagen Extra Thick Blot Paper (BIORAD) in Transferpuffer getränkt und Luftblasen entfernt. Darauf wurden die Membran und das Gel gelegt und diese wieder mit 6 Lagen getränktem Papier abgedeckt. Dieser Stapel wurde zwischen die Elektroden einer Semi-Dry Blotting Apparatur (BIORAD) eingespannt und die Proteine für h bei konstant 21 V auf die Membran übertragen. Transferpuffer: 48 mm Tris/HCl; 39 mm Glycin; 0,0375% SDS; 20% (v/v) Methanol Immunodetektion von Proteinen Nach dem Transfer wurde die Membran für 1 h in Blockingpuffer geschwenkt. Alternativ wurde diese Inkubation über Nacht bei 4 C durchgeführt. Überschüssiges Milchpulver wurde kurz mit TBS-T abgespült, bevor die Membran 1 h mit primärem Antikörper (Konz. siehe Materialteil) unter leichtem Schwenken inkubiert wurde. Unspezifisch gebundener

48 METHODEN 48 Antikörper wurde durch dreimaliges Waschen mit TBS-T für jeweils 10 min entfernt. Es folgte eine weitere einstündige Inkubation mit sekundärem Antikörper (1: in TBS- T), der an Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelt war. Vor der Detektion wurde erneut 3x 10 min mit TBS-T gewaschen. TBS-T: 150 mm NaCl; 20 mm Tris/HCl ph 7,5; 0,1% Tween 20 Blockpuffer: 7% (w/v) Milchpulver in TBS-T Bevor das Substrat der HRP (H 2 O 2 ) zugegeben wurde, wurde die Membran kurz in 0,5 M Tris/HCl ph 7,5 gewaschen. 14 ml Detektionslösung wurde durch einen Sterilfilter (Ø 45 µm) auf die Membran getropft und die Membran damit 1 min inkubiert. Nach Abschütten der Lösung wurde die Membran in Folie eingeschweißt. In einer Entwicklungskammer wurde ein Röntgenfilm auf die Membran gelegt und die Expositionszeit der Signalstärke angepasst; sie betrug zwischen 2 und 15 min. Der Röntgenfilm wurde entwickelt und anschließend getrocknet. Detektionslösung: 12,5 mm Luminol; 0,8 mm p-cumarsäure (beides in DMSO gelöst); 0,2 M Tris/HCl ph 8,5; 0,018% H 2 O 2 GMX-Entwickler und -Fixierer wurden bei der Firma KODAK gekauft und nach Herstellerangaben verdünnt Rehybridisierung einer Membran Bereits immobilisierte Antikörper wurden von einer Membran entfernt indem diese mit stripping solution bedeckt und 30 min bei 55 C darin geschwenkt wurde. Anschließend wurde die Membran mindestens dreimal mit TBS-T gewaschen und erneut geblockt (siehe oben). stripping solution: 62,5 mm Tris/HCl ph 7,5; 100 mm ß-Mercaptoethanol; 2% (w/v) SDS 3.3. Molekularbiologische Methoden Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli Plasmid-DNA aus Escherichia coli wurde nach der Methode der alkalischen Lyse von (Birnboim und Doly, 1979) isoliert. Um Plasmid-DNA im präparativen Maßstab zu erhalten, wurde das Plasmid Maxi Kit (Ausbeute high copy Plasmide ca. 500 µg - 1 mg) von QIAGEN oder das NucleoBond Xtra Maxi Kit von MACHEREY-NAGEL (Ausbeute etwa 1,5 mg) nach Herstellerangaben verwendet. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte photometrisch durch Absorptionsmessung bei 260 nm.

49 METHODEN Isolation genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana Genomische DNA aus frischem Material von Arabidopsis wurde nach einem Protokoll von (Rogers und Bendich, 1985) isoliert. Das Gewebe wurde gewogen und in flüssigem N 2 zu feinem Pulver zermörsert bzw. mit der Zellmühle (siehe ) aufgeschlossen. Nach der Extraktion wurden Konzentration und Reinheit photometrisch durch Absorptionsmessung bei 260 und 280 nm bestimmt Isolation von mrna aus Arabidopsis thaliana Zur Extraktion von RNA aus frischem Gewebe von Arabidopsis thaliana wurde das RNeasy Plant Mini Kit von QIAGEN nach Herstellerangaben verwendet. Die RNA wurde in 60 µl RNA-freiem H 2 O eluiert. Die Konzentration der RNA wurde photometrisch abgeschätzt und 1 µg RNA zur DNAse-Behandlung eingesetzt. Es wurde die Deoxyribonuklease I Amp Grade (INVITROGEN) verwendet und nach Herstellerangaben eingesetzt. Der DNA Abbau erfolgte bei 22 C im PCR-Cycler und wurde durch Zugabe von EDTA (2,5 mm) und Hitzeinaktivierung der DNAse für 10 min bei 65 C gestoppt. Die DNAfreie RNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei -70 C gelagert cdna Herstellung aus Arabidopsis RNA Es wurde 1 µg RNA (siehe ) mit 0,5 µg Oligo(dT) 18 (INVITROGEN) bei 70 C inkubiert (Denaturierung von Sekundärstrukturen) und auf Eis 5 min abgekühlt. Dann wurden 0,5 mm dntps, 5 units RNAse Inhibitor (beides FERMENTAS) sowie 50 units BioScript RNase HLow (BIOLINE) zugegeben (Endvolumen 20 µl). Die reverse Transkription erfolgte bei 37 C 1 h im PCR-Cycler und wurde 10 min bei 70 C gestoppt. Die cdna wurde bei -20 C gelagert Amplifikation von DNA durch PCR Standard-PCR Reaktionen, die u.a. zur Kontrolle dienten, wurden mit der Taq-DNA Polymerase von FERMENTAS durchgeführt nach Standard-Protokollen (siehe Herstellerangaben bzw. Saiki et al., 1985; Mullis, 1990). Für Klonierungszwecke wurde die Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase F-530L von FINNZYMES verwendet. PCR-Puffer und Mg 2+ -Lösungen wurden vom Hersteller mitgeliefert, 10 mm dntp-mix wurde durch Verdünnung der 100 mm dntp-stammlösungen von FERMENTAs selbst hergestellt. Plasmid-DNA wurden etwa ng eingesetzt, von genomischer DNA mindestens 100 ng. Annealing-Temperatur, Elongationszeit, Mg 2+ -Konzentration und Zyklenzahl

50 METHODEN 50 wurde entsprechend dem Template, den Primern (siehe 1.7) und der Größe des Amplifikats gewählt. Die gerichtete Mutagenese durch spezifischen Basenaustausch wurde mit dem QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE) nach Herstellerangaben durchgeführt. In dem Kit enthalten ist die PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase, die Primer wurden nach den in der Anleitung angegebenen Richtlinien ausgewählt (siehe ). Für Real-time PCR-Reaktionen wurde der iq Supermix von BIORAD verwendet. Pro 25 µl Ansatz wurden je 0,4 µm Primer sowie 0,1 µg cdna zugegeben. Der Fluoreszenzfarbstoff SYBR green sowie dntps und die itaq hot-start DNA Polymerase sind im 2-fach Puffer enthalten. Alle Ansätze wurden als MasterMix ohne Template bzw. Primer vorbereitet und dann aufgeteilt, um die Abweichung der Ergebnisse durch Pipettier-Ungenauigkeit zu minimieren. PCR Platten und Siegelfolie wurden von der Firma PEQLAB bezogen (96 Well PCR Plate und QPCR Film) Aufarbeitung der real-time PCR Rohdaten Die vom BIORAD icycler ausgegebenen Daten wurden in MICROSOFT Office Excel exportiert und mit dem Programm LinRegPCR Version 7.0 (Universität Amsterdam, Ramakers et al., 2003) weiter verarbeitet. Aus den Steigungen der exponentiellen Phase der PCR-Kurven (Fluoreszenz/Zyklenzahl) ermittelt das Programm die jeweils Amplifikatspezifische PCR-Effizienz anstatt prinzipiell von einer Effizienz=2 (Produktverdopplung pro Zyklus) auszugehen. (siehe unter Estimation via increase in "absolute fluorescence" method 4 (window-of-linearity) ). Pro Amplikon (i.d.r. CRY3 und Ubiquitin) wurde der Mittelwert der PCR-Effizienz errechnet und für jede Probe der Wert der Potenz PCR-Effizienz CT (CT = threshold cycle) bestimmt (siehe Pfaffl, 2001). Aus den Werten jedes Proben-Triplikats wurde ebenfalls der Mittelwert berechnet sowie die Standardabweichung nach ( x x) 2. Gl. 3.1 n Agarosegelelektrophorese Zur Analyse und Größentrennung von DNA-Fragmenten wurden 1-2%ige Agarosegele in TBE-Puffer (nach Sambrook et al., 1989) verwendet. Der Gelmatrix (QA-Agarose TM von QBIOGENE) wurden 0,1 µg/ml Ethidiumbromid zugesetzt. Als Längenstandard wurde

51 METHODEN 51 Lambda DNA/Eco91 Marker von FERMENTAS verwendet. Vor dem Auftragen wurde den Proben 5x Probenpuffer zugesetzt. TBE-Puffer: 89 mm Tris/HCl ph 8,3; 89 mm Borsäure; 2,5 mm EDTA 5x Probenpuffer: 50% Glycerin; 50% 10x-TBE; 0,2 mg/ml Bromphenolblau Die Rückgewinnung von DNA aus dem Gel erfolgte mit dem Qiaex II Gel Extraktion Kit der Firma QIAGEN nach Herstellerangaben Restriktion und Ligation von DNA-Fragmenten Für Restriktionen von DNA-Fragmenten und Vektoren wurden Restriktionsendonukleasen der Firma FERMENTAS verwendet. Es wurde 1 u Enzym pro 1 µg zu schneidender DNA eingesetzt, der Ansatz wurde i.d.r. 1 h bei 37 C inkubiert, bzw. entsprechend den abweichenden Angaben des Herstellers. Die Ligation von PCR-Produkten bzw. zuvor restringierten DNA-Fragmenten in geeignete Klonierungs- bzw. Expressionsvektoren entsprechend ihrem A/T-Überhang bzw. ihren zueinander komplementären Schnittstellen erfolgte mit der T4-DNA-Ligase von FERMENTAS. Es wurden 5 u pro Ansatz verwendet, Vektor und Insert wurden im Verhältnis 1:5 eingesetzt und 1 h bei RT inkubiert Sequenzierung Zur Kontrolle von PCR-Produkten auf ihre Fehlerfreiheit wurden die Amplifikate nach ihrem Klonieren in Zwischen- bzw. Endvektoren von der Firma GATC sequenziert (Aufbereitung der Proben nach GATC-Angaben). Es wurden die vorhandenen Standard- (M13)-Primer verwendet, bzw. passende Sequenzierungsprimer von GATC synthetisiert. Die erhaltenen Chromatogrammdaten wurden mit dem Programm Vektor NTI bzw. Conting Express von INVITROGEN ausgewertet Datenbankanalysen Um die Aminosäuresequenz von cry3 auf eine mögliche NLS hin zu untersuchen, wurde das Programm WoLF PSORT ( verwendet (Horton et al., 2006; Horton et al., 2007). Es sagt die subzelluläre Lokalisation von Proteinen anhand ihrer Aminosäuresequenz voraus und unterscheidet dabei Pflanzen, Tiere und Pilze. Es handelt sich um eine Weiterentwicklung des PSORTII Programms und hat nach eigenen Aussagen eine Vorraussage-Genauigkeit von über 80%. Auf bereits vorhandene Microarraydaten von Arabidopsis thaliana wurde über das Programm Genevestigator der ETH Zürich zugegriffen (Zimmermann et al., 2005).

52 METHODEN Fluoreszenzmikroskopie Konfokale Laserscanning-Mikroskopie Fluoreszenz-Aufnahmen wurden mit dem TCS SP2 Mikroskop der Firma LEICA unter Verwendung des HCX PL APO 40x/ Öl CS Objektives angefertigt. Für Voreinstellungen wurde die Epifluoreszenz mit einer HBO 50W Lampe angeregt und mit einem Blaufilter (BP , LP 515) detektiert. GFP- und Plastiden-Autofluoreszenz wurde mit einem Argonlaser bei 488 nm angeregt und mit Hilfe des Teilerspiegels TD 488/543/633 und zweier Photomultiplier getrennt voneinander detektiert (bei bzw nm). Diese Einstellungen wurden auch für die Anregung und Detektion des DNA-Farbstoffs Vybrant DyeCycle Orange (Invitrogen) verwendet, wobei das Signal bei nm detektiert wurde. Die Nachbearbeitung der aufgenommenen Bilder erfolgte mit dem LC Lite Programm (LEICA) Epifluoreszenz-Mikroskopie Um Aufnahmen von mit Hoechst (33342 Invitrogen) gefärbten Zellkernen anzufertigen, wurde das Epifluoreszenz-Mikropskop Axiovert 200 M der Firma ZEISS mit der HAMAMATSU Kamera C verwendet. Das Mikroskop wurde über die Software Velocity 4.0 angesteuert. Hoechst wurde mit 365 nm angeregt und bei 410 nm detektiert. Der Filtersatz für egfp hat ein Anregungsmaximum bei 475 nm und maximale Emission bei 525 nm.

53 ERGEBNISSE Ergebnisse 4.1. Cryptochrom 3 Expression in Organen von Arabidopsis thaliana Zur Analyse der CRY3 Expression wurde aus verschiedenen Organen von Arabidopsis thaliana mrna isoliert und diese in cdna umgeschrieben. Die cdna wurde für quantitative real time PCR verwendet. Keimlinge des Ler Wildtyps wurden auf ½ MS Phytoagar Platten unter Langtagbedingungen angezogen. Nach 8 Tagen wurden die Keimlinge geerntet, die Wurzeln abgetrennt, und die Gewebeproben einzeln weiterverarbeitet oder bei -70 C gelagert. Alle anderen oberirdischen Pflanzenteile wurden von Ler Pflanzen aus Langtag Anzucht auf Erde gewonnen. Rosettenblätter wurden 30 Tage nach Aussaat geerntet, Spross, Blüten, Schoten nach 36 Tagen. Die Ernte erfolgte immer vormittags nach 5 h Belichtung. Von der gewonnen cdna wurden 0.1 µg pro real-time PCR-Ansatz verwendet. Es wurden die CRY3-Werte immer mit Ubiquitin als house-keeping Protein normiert. Von dem CRY3 Gen wurde ein 170 bp Produkt, von Ubiquitin10 ein 145 bp Produkt amplifiziert (siehe ). Von jedem Ansatz wurden Duplikate bzw. Triplikate eingesetzt und die PCR mindestens zwei Mal wiederholt. Aus den Ergebnissen wurde, nach Aufarbeitung mit dem LinRegPCR Programm, der Mittelwert sowie die Standardabweichung nach Gleichung 4.1 berechnet: Gl. 4.1 Die relative CRY3-Expressionsrate errechnet sich mit Gl. 4.2: cry 3 Effizienz X = ubi Effizienz CTcry 3 CTubi Gl. 4.2 (mit X= CRY3-Expressionsrate; CT=threshold cycle) Der Wert für die CRY3-Expression in Keimlingen wurde als 1 gesetzt, indem die Werte X eines Datensatzes durch den Wert X Keimlinge geteilt wurden. Somit stellt sich die CRY3- Expression in den verschiedenen Geweben als ein Vielfaches des Gehaltes an cry3 mrna in Keimlingen dar. In den Wurzeln und in den Blüten ist die Expression etwa dreifach so stark, in Schoten nur etwa doppelt so hoch. In Blättern und Stängeln liegt nur etwa halb so viel cry3 mrna vor wie in Keimlingen. Das Ergebnis aus acht Datensätzen (=8 PCR Läufe) ist in Abb. 4.1 dargestellt.

54 ERGEBNISSE 54 Relativer cry3 mrna Gehalt t ,7 2,9 1,8 1,0 0,6 0,4 Keimling Wurzel Blätter Stängel Spross Blüten Schoten Abb. 4.1: CRY3 Expression in Geweben von Arabidopsis thaliana. Real-time PCR Ergebnis: die Stärke des cry3 Signals ist relativ zur Expression in Keimlingen dargestellt. Um die CRY3 Expressionraten nicht nur miteinander sondern auch absolut vergleichen zu können, wurden 25 fg eines CRY3-Standards parallel zur Pflanzen-cDNA eingesetzt und die Ergebnisse anhand der Gleichung 4.3 normiert: X = cry 3 Effizienz ubi Effizienz Std Effizienz CTcry 3 CTubi CTStd Gl. 4.3 Als Standard diente das Plasmid pgem-t mit dem CRY3-Gen als Insert. Abbildung 4.2 zeigt die Ergebnisse von zwei real-time PCR Reaktionen, in denen jeweils Proben-Triplikate eingesetzt wurden. Relativer cry3 mrna Gehalt t ,6 11,7 1,6 1,7 Keimling Wurzel Blätter Spross Stengel Blüte Schote 25 fg cry3 Abb. 4.2: CRY3-Expresssion in Geweben von Arabidopsis thaliana. Die Menge an cry3 mrna ist als Vielfaches von 25 fg des cry3 Standards dargestellt und wurde durch realtime PCR bestimmt. 7,7 5,2 1,0

55 ERGEBNISSE 55 Im Unterschied zu den Ergebnissen der real-time PCR ohne Verwendung des Standards zeigt das Ergebnis unter Verwendung von 25 fg cry3 DNA eine stärkere Expression in Wurzeln als in Blüten. Der cry3-cdna Gehalt beträgt in Wurzeln etwa das 12-fache, in Blüten etwa das Achtfache. Im Vergleich zum Keimling liegt die Expression in Blüten viel niedriger (etwa nur doppelt so hoch) als in den PCR Reaktionen ohne cry3 Standard (3,5- fach so hoch). Die Standardabweichung ist jedoch geringer, wenn die Ergebnisse auf 25 fg cry3 DNA bezogen wurden Cryptochrom 3 Proteingehalt in Organen von Arabidopsis thaliana Proteingesamtextrakt aus verschiedenen Geweben von A. thaliana Ler Wildtyp wurden für Western blot Analysen eingesetzt, um die Organe, in denen cry3 am stärksten exprimiert wird, zu bestimmen. Keimlinge wurden zwei Wochen auf Phytoagar Platten, Pflanzen für die Wurzelernte 10 Tage in Flüssigkultur angezogen (siehe ). Blätter wurden ebenfalls von Phytoagar Platten geerntet und zwar 21 Tage nach Aussaat. Pflanzen zur Ernte von Blüten, Schoten und Sprossgewebe wurden auf Erde für 36 Tage angezogen. Alle Keimlinge und Pflanzen wurden unter Langtagbedingungen gehalten und vormittags nach 5 h Belichtung geerntet. Die Gewebe wurden sofort zu Proteinextrakten weiterverarbeitet oder bei -70 C eingefroren. Von den SDS-Proben wurde die Gesamtproteinkonzentration mit Amidoschwarz bestimmt. Je 100 µg Protein pro Ansatz wurden auf ein großes 10%iges SDS-Lämmli-Gel aufgetragen und bei 45 ma (max. 300 mv) aufgetrennt. Nach dem blotten auf eine Nitrocellulase-Membran wurde das cry3 Protein (~ 60,4 kda) mittels cry3-antikörper immunodetektiert. Die Ergebnisse von vier Western blots sind in Abbildung 4.3 dargestellt. Es wurden je Gewebe Proteinextrakte von zwei unabhängigen Präparationen aufgetragen.

56 ERGEBNISSE 56 Keimlinge Blätter Spross Blüten Schoten Wurzeln Abb. 4.3: cry3 Vorkommen in verschiedenen Geweben von A. thaliana. ECL-Immunodetektion des cry3 Proteins isoliert aus Arabidopsis Geweben, Proteinauftrag je Spur 100 µg. Die Intensität des cry3 Signals wurde mit dem Programm IMAGEJ quantifiziert sowie die Mittelwerte und die Standardabweichungen berechnet. Das Ergebnis ist in Abbildung 4.4 graphisch dargestellt. Relative Signalstärke ,2 11,9 12,9 7,8 6,8 2,5 Keimlinge Blätter Stengel Spross Blüten Schoten Wurzeln Abb. 4.4: Quantifizierung der cry3-signalstärken. Mit dem Programm ImageJ wurde die Intensität der Banden des in Abb. 4.3 gezeigten Western Blots ausgewertet. Der cry3 Proteingehalt ist in den untersuchten Proben der Wurzeln am größten. Das entspricht dem Ergebnis der real-time PCR Analysen, welches zeigt, dass in Wurzeln die

57 ERGEBNISSE 57 cry3 Expression am höchsten ist. Etwa ¼ weniger Protein findet sich in Keimlingen und Blüten und halb so viel in Blättern und Schoten. Die Expression des cry3 Gens ist ebenfalls in Blüten hoch, etwas niedriger ist sie in Keimlingen. Deutlich vermindert ist die Expression in Blättern, am schwächsten im Spross Chloroplasten-Import des cry3 Proteins Die Lokalisation des cry3 Proteins in Chloroplasten von Arabidopsis thaliana wurde von Kleine et al. (2003) mit GFP-fusioniertem cry3 sowie durch in vitro Importstudien nachgewiesen. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zeigen eine Überlagerung des GFP- Signals mit der Autofluoreszenz des Chlorophylls bzw. der Chloroplasten in transient exprimierenden Protoplasten. Im Rahmen dieser Arbeit sollten drei weitere Fragestellungen geklärt werden: i) Ist der Import von cry3 in Chloroplasten lichtabhängig reguliert? ii) Spielt die N-terminale α-helix eine Rolle für den Chloroplasten-Import? iii) Kann die transient nachgewiesene Lokalisation von cry3-gfp in den Chloroplasten auch in transgenen Pflanzen gezeigt werden, die cry3-gfp konstitutiv exprimieren? Möglicher Einfluss von Licht auf den Import von cry3 in Chloroplasten Um einen möglichen Licht-gesteuerten Import des cry3 Proteins in Chloroplasten nachzuweisen, wurden cry3-gfp exprimierende Zellen fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Für die transiente Expression wurde das Plasmid pava393 (siehe 2.6.) verwendet, das bereits das GFP-Gen unter Kontrolle des 35S-Promotors trägt. 100 ng cdna (siehe und ) aus Arabidopsis thaliana Wildtyp Columbia wurden als Template in einer Standard-PCR mit den Primern #1 und #2 ( ) eingesetzt (siehe , ). Das so erhaltene PCR-Produkt umfasst die gesamte kodierende Region von CRY3. Nach Kontrolle dieses PCR-Produkts wurde das fehlerfreie CRY3-Insert in pava393 kloniert. Das resultierende Plasmid wurde in E. coli amplifiziert, aufgereinigt und für transiente Expression in Protoplasten von Arabidopsis thaliana Mesophyllzellkultur eingesetzt. Die transformierten Protoplasten wurden über Nacht im Dunkeln inkubiert und am nächsten Tag entsprechend den Angaben in Abbildung 4.5 und 4.6 bestrahlt. Bei einem ersten Versuch wurden die Zellen aus Dunkelheit auf einen Objektträger überführt und unter dem Mikroskop betrachtet. Es wurde sofort ein Bild einer cry3-gfp exprimierenden

58 ERGEBNISSE 58 Zelle angefertigt und anschließend unter dem Mikroskop 30 min Weißlicht eingestrahlt. Nach der Bestrahlung wurde von der Zelle ein weiteres Bild aufgenommen. Die Aufnahmen einer Zelle sind in Abbildung 4.5 dargestellt. Das zytosolische GFP-Signal nahm nach der Bestrahlung nicht ab bzw. das Signal wurde in den Chloroplasten nicht stärker. In Abbildung 4.5 ist beispielhaft nur eine Zelle gezeigt, weitere untersuchte Zellen zeigten ebenfalls keinen Hinweis auf eine Verstärkung des cry-gfp Signals im Chloroplasten nach Bestrahlung mit Weißlicht. Da sich die Zellen während der Belichtung etwas bewegten, war die Interpretation der Bilder erschwert. Es wurden verschiedene Versuche unternommen, durch Einbettung der Zellen in Alginat oder Anheftung an beschichtete Objektträger/Deckgläser die Protoplasten in ihrer Position zu fixieren. Das Hauptproblem hierbei war die starke Hitzeentwicklung unter dem Mikroskop, die das Alginat verflüssigte bzw. die Empfindlichkeit der Protoplasten-Membran, die einer Anheftung an säuregereinigte Deckgläser nicht standhielt. Daher lieferten diese Versuche kein besseres Ergebnis. Die scheinbare leichte Zunahme der Fluoreszenz im Cytosol nach der Belichtung ist - da die Zellen ihre Lage leicht verändert haben - nicht eindeutig. GFP + Chlorophyll DIC t 0 t 1 =30 min Abb. 4.5: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von cry3-gfp exprimierenden Protoplasten aus grüner Zellkultur. Die Zellen wurden nach der Transformation im Dunkel gehalten (oben t 0 ) und anschließend unter dem Mikroskop 30 min mit Weißlicht bestrahlt (unten t 1 ). Gezeigt sind die überlagerten Bilder aus dem GFP- bzw. Chlorophyllkanal (Balken = 10 µm).

59 ERGEBNISSE 59 Aufgrund der erwähnten Schwierigkeiten bei der Positionierung der Zellen wurden in einem zweiten Versuch die Zellen nach der Transformation in zwei Aliquots aufgeteilt und eines im Dunkeln gehalten, während das andere belichtet wurde. Die belichteten Zellen wurden nach 11 h Dunkelheit 5 h mit Weißlicht (300 µe/m 2 s) bestrahlt (Abb. 4.6b) oder 16 h im Blaulichtfeld (21 μmol/m 2 s) inkubiert (Abb. 4.6c). Um eine verminderte Expression durch Licht- und Hitzestress zu vermeiden, wurden die Protoplasten nur 5 h dem Weißlicht ausgesetzt. Die Dunkelkontrolle wurde 16 h in Dunkelheit gehalten (Abb. 4.6a). Eine Abnahme der cytosolischen Fluoreszenz bzw. eine Zunahme der Fluoreszenz innerhalb der Chloroplasten in den belichteten Zellen - im Vergleich zu den Protoplasten aus Dunkelheit - ist auf den Bildern nicht erkennbar. Auch die Expressionsstärke von cry3-gfp insgesamt unterscheidet sich nicht signifikant in den gezeigten Zellen. Das Blaulicht zeigt im Vergleich zum Weißlicht keine höhere Wirksamkeit für den Import. Somit kann aufgrund dieser Daten nicht ausgeschlossen werden, dass der Import von cry3 in die Chloroplasten durch Licht beeinflusst wird. a GFP Chlorophyll DIC Overlay b c Abb. 4.6: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von cry3-gfp exprimierenden Protoplasten aus grüner Zellkultur. a Dunkelkontrolle: Die Zellen wurden nach der Transfektion 16 h im Dunkeln gehalten. b Zelle nach 5 h Weißlichtbestrahlung; die vorherige Inkubation über Nacht erfolgte in Dunkelheit. c Zellen nach 16 h Blaulichtbestrahlung.

60 ERGEBNISSE Die Rolle der N-terminalen α-helix für den Plastidenimport Der cry3 N-Terminus trägt drei kurze Sequenzmotive, die auch auf dem C-Terminus von Atcry1 und Atcry2 vorhanden und in allen Cryptochromen von Landpflanzen konserviert sind. Diese werden als DAS-Motiv zusammengefasst (siehe Einleitung und Abb. 4.7a) und spielen eine Rolle für die Weiterleitung von Lichtsignalen in Atcry1 und Atcry2 (Lin und Shalitin, 2003). Welche Funktion das DAS-Motiv in cry3 übernimmt, ist bisher ungeklärt. Die cry-dash Proteine aus Oryza sativa und Solanum lycopersicum zeigen keine Konservierung dieser Domäne. Die strukturelle Nähe zum Targeting-Peptid, das den Import in Chloroplasten und Mitochondrien vermittelt, führte zu der Überlegung, dass zwischen diesen Domänen eine Interaktion stattfinden könnte, die den Organellen- Import beeinflussen könnte. Zwischen dem D-Motiv (DHIHVP) und der Serin-reichen Region liegt eine α-helix, die N-terminal einige saure Aminosäuren trägt (A-Motiv, siehe Abb. 4.7a). Eine Konformationsänderung im Bereich dieser Helix könnte somit den Import in die Organellen beeinflussen. Diese Möglichkeit sollte durch transiente Expression des α- Deletionsproteins fusioniert mit GFP untersucht werden. Für diesen Versuch wurde aus dem oben verwendeten Plasmid pava393-cry3-gfp die N- terminale α-helix entfernt. Die α-helix umfasst die AS 12-28; N- und C-terminal davon wurden mittels gerichteter Mutagenese (QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit, STRATAGENE) in zwei Schritten Eco47III Schnittstellen eingebracht (Primer siehe , PCR ). Der für die α-helix kodierende Bereich wurde herausgeschnitten und der Vektor religiert (siehe Abb. 4.7b, resultierendes Konstrukt = δαcry3-gfp). Die Fehlerfreiheit des cry3 und GFP-Gens wurde durch Sequenzierung des Plasmides überprüft. Protoplasten aus Arabidopsis thaliana Mesophyll-Zellkultur wurden mit dem Plasmid pavaδαcry3-gfp PEG-vermittelt transformiert (3.1.7.) und über Nacht in Dunkelheit inkubiert. Am nächsten Tag wurden mit dem konfokalen Mikroskop Aufnahmen von den Zellen angefertigt. Wie in Abbildung 4.7c zu sehen ist, zeigt die detektierte GFP-Fluoreszenz keinen Unterschied zu den Zellen, die mit cry3-gfp transformiert wurden (Abb. 4.7d). Es liegt sowohl eine Co-Lokalisation von GFP und Chlorophyll vor, was bedeutet, dass das Protein in die Organellen transportiert wird, als auch ein leichter cytosolischer Hintergrund, der vermutlich von der Expressionsstärke des Proteins abhängig ist. Eine Aussage über den Import in Mitochondrien kann anhand dieser Bilder nicht gemacht

61 ERGEBNISSE 61 werden. Die N-terminale α-helix beeinflusst den Chloroplastenimport des cry3-proteins unter den untersuchten Bedingungen somit nicht erkennbar. a b AS Position cry3 Sequenz... TGAACGACCA TATCCACCGT GTTCCGGCTC TCAgCGctGA AGAGATTGAC TCCGTCGCCA...N...D...H...I...H...R...V...P...A...L...T...E...E...E...I...D...S...V...A TAAAAACATT TGAGAGAagC GCtTTACCTT CTTCTTCCTC CGTTAAGAGA AAGGGGAAAG I...K...T...F...E...R...Y...A...L...P...S...S...S...S...V...K...R...K...G...K c GFP Chlorophyll DIC Overlay d Abb. 4.7: N-terminale α-helix und Lokalisation des cry3 Proteins ohne α-helix a Struktur des N-terminalen DAS-Motives. b Eingebrachte Mutationen zur Deletion der α- Helix: kleingeschriebene Basen sind durch gerichtete Mutagenese verändert, fett gedruckte Basen = Eco47III Schnittstellen, rote Aminosäuren wurden deletiert. c cry3-gfp ohne α- Helix und d Wildtyp cry3-gfp transient exprimiert in Protoplasten aus grüner Zellkultur von Arabidopsis thaliana (Balken = 10 µm).

62 ERGEBNISSE cry3-gfp wird in transgenen Pflanzen in Chloroplasten importiert Der Import des cry3-proteins konnte anhand der Fusion mit GFP in transienten Assays nachgewiesen werden (Kleine et al., 2003). Transient wird das eingebrachte Gen unter Kontrolle des 35S-Promotors stark überexprimiert und unterliegt nicht den Regulationsmechanismen einer intakten Pflanze. Um die zuvor gezeigten Ergebnisse auch in Pflanzen verifizieren zu können, wurden das Fusionsgen cry3-gfp stabil in das Pflanzengenom von Arabidopsis thaliana (Wildtyp Landsberg erecta) integriert. Dieses Konstrukt wurde zunächst unter Kontrolle des eigenen Promotors in den binären Vektor pfgc5941 eingebracht und in das Pflanzengenom integriert. Aus den nachfolgend isolierten BASTA -resistenten Pflanzen konnte jedoch keine Linie gewonnen werden, die eine detektierbare GFP-Fluoreszenz zeigte. Daher wurde ebenfalls der 35S-Promotor zur Transkriptionskontrolle des Fusionsgens verwendet, um Pflanzen mit detektierbarer Expressionsstärke zu erhalten. Aus den BASTA -resistenten Pflanzen wurden zunächst Proteinextrakte aus Blättern hergestellt und 100 µg davon auf einem 10%igen SDS-Gel aufgetrennt. Durch Immunodetektion wurde mit dem GFP- bzw. cry3-antikörper die Expression des cry3-gfp Fusionsproteins in den einzelnen Pflanzen-Linien überprüft (Abb. 4.8). Die Größe des Volllängen cry3-proteins fusioniert mit GFP beträgt ~ 100 kda # Pflanze 100 kda Abb. 4.8: cry3 Expressions-Analyse transgener Pflanzen. Es wurden für den Western Blot 100 µg Protein/Spur aufgetragen und eine 1:1000 Verdünnung des GFP Antikörpers (Ziege) eingesetzt. Die berechnete molekulare Masse des Fusionsproteins beträgt 98 kda. Samen der Pflanzen, die deutliche Expression zeigten, wurden nach ihrer Selbstung geerntet und erneut auf BASTA -Selektionsplatten ausgebracht. Etwa 10 Tage nach Keimung (und sichtbarem Absterben der Keimlinge ohne Transgen) wurden die Kotyledonen der BASTA -resistenten Keimlinge im Epifluoreszenzmikroskop (3.4.2) betrachtet und mit Wildtyp-Keimlingen verglichen. In Abbildung 4.9 ist eine Aufnahme des Blattrandes eines Keimlings von Linie #2.7 gezeigt (a) sowie Wildtyp Gewebe (b) zum

63 ERGEBNISSE 63 Vergleich. Die cry3-gfp Pflanze (Abb. 4.9a) zeigt eine deutliche Fluoreszenz im GFP Kanal im Bereich der Chloroplasten. Die Überlagerung der Chlorophyll- und GFP-Signale führt zu einer orange-gelb dargestellten Co-Lokalisation. Der Wildtyp zeigt dagegen nur ein geringes Hintergrundsignal im Bereich von nm. a GFP Chlorophyll Overlay DIC b c d Abb. 4.9: cry3 lokalisiert in Chloroplasten in transgenen Pflanzen. a Ausschnitt aus dem Blatt eines Keimlings der 35S:cry3-GFP exprimierenden Linie (#2.7) - betrachtet unter dem Fluoreszenzmikroskop. b Fluoreszenz eines Wildtyp-Blattes. c Protoplasten aus Kotyledonen von 10 Tage altem Keimling der in a gezeigten Pflanze. d Protoplasten aus Kotyledonen von 10 Tage altem Keimling des Wildtyps Ler (Balken = 10 µm). Um das Signal aus Chloroplasten noch deutlicher darstellen zu können, wurden aus Keimlingen dieser transgenen Pflanzen Protoplasten isoliert. Konfokale Aufnahmen dieser Zellen sowie Wildtyp Mesophyll-Protoplasten sind in Abbildung 4.9c und 4.9d gezeigt.

64 a ERGEBNISSE 64 Ebenso wie in dem intakten Keimlingsgewebe zeigen die Protoplasten eine starke GFP- Fluoreszenz in den Chloroplasten. Die Wildtyp-Kontrolle zeigt hingegen keine GFP- Fluoreszenz Künstlicher Organellen-Import von cry3 Wie bereits von Kleine et al. (2003) gezeigt, adressiert das topogene Signal des N- Terminus von cry3 das Protein an Chloroplasten und Mitochondrien. Um die Funktion von cry3 in späteren Analysen weiter zu untersuchen, ist es wünschenswert, das Protein nur in einer dieser Organellen in der Pflanze vorliegen zu haben. Phänotypische Veränderungen dieser Pflanzen im Vergleich zum Wildtyp bzw. zur kompletten cry3- Knockout Pflanze würden einen Hinweis auf die Organellen-spezifische Funktion des Proteins geben. Um solche Pflanzen zu generieren, wurden cry3-knockout Pflanzen mit dem CRY3-Gen stabil transformiert, welches statt des originalen, 40 AS langen Targeting- Peptids das Transitpeptid der Ferrodoxin-NADP-Oxidoreduktase p(fnr) bzw. das mitochondrielle Targeting-Peptid der Isovaleryl-CoA-Dehydrogenase p(ivd) N-terminal trägt. cry3(1-569)-gfp NcoI NheI p(fnr)-cry3(40-569)- P(FNR) GFP p(fnr)-cry3(40-569) P(FNR) 55 AS NcoI NheI p(ivd)-cry3(40-569)- P(IVD) GFP p(ivd)-cry3(40-569) P(IVD) 48 AS NcoI cry3 (1-569) XbaI NcoI XbaI GFP 40 AS cry3 (40-569) XbaI NcoI XbaI GFP XbaI cry3 (40-569) XbaI NcoI XbaI GFP XbaI Abb. 4.10: Schematische Darstellung der Konstrukte zum artifiziellen targeting von cry3. FNR Precursor adressiert cry3 an Chloroplasten, die IVD-Zielsteuerungssequenz an Mitochondrien. Die ursprüngliche cry3-gfp Fusion ist oben gezeigt.

65 ERGEBNISSE Das FNR-Transitpeptid adressiert cry3 an die Chloroplasten Das Transitpeptid der Ferrodoxin-NADP-Oxidoreduktase aus Spinacia oleracea (Clausmeyer et al., 1993; Acc.-Nr.: X07981) lag bereits in dem Vektor pbluescript vor. Das plastidäre Signalpeptid befindet sich N-terminal am Vorläufer-Protein und besitzt keine sauren Aminosäure-Reste. Außerdem bildet der N-Terminus keine Sekundärstruktur. Dem Import über TOC und TIC (Translocase of the outer/inner chloroplast membrane) geht die Phosphorylierung der Signalsequenz voraus sowie die Interaktion mit Hsp70 (Becker et al., 2005). Es wurden die für p(fnr) kodierenden 165 bp amplifiziert und mit cry3 ohne N-Terminus fusioniert. In dem Vektor pava393 befand sich dann p(fnr)-cry3-gfp in einem durchgängigen Leseraster unter der Kontrolle des 35S-Promotors (Abb. 4.10). Dieses Konstrukt wurde transient in Arabidopsis thaliana Protoplasten getestet (siehe Abb. 4.11). GFP Chlorophyll Overlay DIC Abb. 4.11: Konfokale Aufnahmen von Protoplasten transformiert mit p(fnr)-cry3-gfp Größenmaßstab = 10 µm Abbildung 4.11 zeigt ein starkes Signal im GFP-Kanal, das mit der Chlorophyll- Autofluoreszenz co-lokalisiert. Das Fusionsprotein wird somit in die Chloroplasten importiert. Zugleich zeigt die Zelle wenig Hintergrundfluoreszenz, was darauf hinweist, dass kein GFP-gekoppeltes cry3 in Mitochondrien transportiert wird. Für die stabile Transformation von Arabidopsis cry3-knockout-pflanzen wurde die Fusion p(fnr)-cry3 bzw. p(fnr)-cry3-gfp in den binären Vektor pfgc5941-gfp eingebracht (siehe ). Diese Konstrukte wurden durch transiente Expression in Protoplasten überprüft und anschließend in Agrobakterium tumefaciens transformiert. Durch Floral Dip wurden diese in cry3-knockout Pflanzen eingebracht. Die Selektion transgener Pflanzen erfolgte durch das auf der T-DNA lokalisierte BASTA -Resistenzgen. Die nach BASTA - Selektion überlebenden Keimlinge wurden auf Erde überführt und dort bis zur Samenreife weiterkultiviert (Phytokammer, Langtag). Die Samen (F 1 ) jeder Pflanze wurden separat

66 ERGEBNISSE 66 geerntet und einige wiederum einer BASTA -Selektion unterzogen. Das Aufspaltungsverhältnis der BASTA -resistenten zu den nicht resistenten Pflanzen liegt im Idealfall bei 3:1, wenn nur eine Insertion der T-DNA im Pflanzengenom vorliegt (homozygote Exprimierer : Heterozygote : homozygot Wildtyp = 1 : 2 : 1). Von den überlebenden Keimlingen wurden etwa 10 bis zur Samenreife weiterkultiviert und die Nachkommen dieser Pflanzen (F 2 ) erneut selektiert. Waren die getesteten Samen einer Pflanze alle resistent, die zuvor in der F 1 Generation eine reguläre Aufspaltung zeigte, so ist anzunehmen, dass diese F 2 Pflanze homozygot das eingebrachte Gen enthält. #7 #6 #5 #4 #3 Marker (kda) Abb. 4.12: cry3 Expressions- Analyse der p(fnr)-cry3-gfp- Pflanzen. Die Detektion des ~96 kda großen Proteins erfolgte mittels GFP-Antikörper. Um nachzuweisen, dass die so isolierten Pflanzen p(fnr)-cry3 bzw. p(fnr)-cry3-gfp exprimieren, wurden aus dem Pflanzenmaterial Proteinextrakte hergestellt und auf einem 10%-igen SDS-Gel aufgetrennt. Die Immunodetektion des p(fnr)- cry3-gfp Proteins mit cry3- bzw. GFP-Antikörper (siehe 2.5 bzw / 3.2.7). ist in Abbildung 4.12 gezeigt. Nur zwei der analysierten Linien zeigen tatsächlich die Expression des gewünschten Proteins. Pflanze Nr. 3 spaltet in der Segregationsanalyse in dem erwarteten Verhältnis auf, im Gegensatz zu Linie 7. Für weitere Arbeiten wurden daher homozygote F 2 -Pflanzen der Linie Nr. 3 verwendet. Für Expressions-Screens der FNR-cry3(40-569)-Linien wurde der cry3 Antikörper verwendet (siehe 2.5). Der Western Blot (Abb. 4.13) zeigt, dass die Linien Nr. 4, 7 und 10 das Fusionsprotein tatsächlich exprimieren, wobei Linie Nr. 4 die stärkste Expression zeigt. Da das Konstrukt in die cry3-knockout Linien eingebracht wurde, konnte kein endogenes cry3-signal (60,4 kda) detektiert werden. FNR-cry3 #2 FNR-cry3 #4 FNR-cry3 #6 FNR-cry3 #7 FNR-cry3 #8 FNR-cry3 #10 Neg Kontrolle Marker (kda) Abb. 4.13: Expressions-Analyse der FNR-cry3 Pflanzen. Zur Immunodetektion mittels cry3 Antikörper wurden 100 µg Protein/Spur aufgetragen, die des FNR-cry3 Proteins beträgt ~67 kda.

67 ERGEBNISSE Das Targeting-Signal der IVD dirigiert cry3 in Mitochondrien Das Targeting-Peptid der Isovaleryl-CoA-Dehydrogenase aus Arabidopsis thaliana (Acc.- Nr.: Y12695), welches das Protein für den Import in Mitochondrien adressiert, ist auf den N-terminalen 25 AS des Proteins lokalisiert (Daschner et al., 2001). Der Mitochon-drien- Import erfolgt mit Hilfe von Chaperonen über den TOM-Komplex (translocase of the outer membrane), welcher die N-terminale Signalsequenz erkennt. Diese besteht aus positiv geladenen Aminosäuren, die eine amphiphile α-helix bilden. Aus dem Innermembranraum wird das Protein weiter über den TIM-Komplex (translocase of the inner membrane) transportiert. Peptidasen entfernen nach dem Import die Präsequenz (Wiedemann et al., 2004). Aus dem Vektor puc-ivd-smgf4 (Daschner et al., 2001) wurden die ersten 145 bp des IVD-Gens mit entsprechenden Primern (siehe ) amplifiziert. Es wurde hierbei die gleiche Klonierungsstrategie verfolgt wie für das FNR Transitpeptid (siehe Abb. 4.10). Wie in beschrieben, erfolgte die Klonierung des Fusionsproteins p(ivd)-cry3(40-569)(- GFP) zuerst im Vektor pava393 für transiente Expression und nach erfolgreichem Test die Umklonierung in den binären Vektor pfgc5941. Konfokale Bilder von Protoplasten, die p(ivd)-cry3-gfp exprimieren, sind in Abb gezeigt. Die Expression in Zellen aus grüner Arabidopsis Mesophyll-Zellkultur zeigt keine Co-Lokalisation des GFP Signals mit der Chlorophyll-Autofluoreszenz (Abb. 4.14a). Wurzelzell-Protoplasten, die das gleiche Konstrukt exprimierten, wurden mit Mitotracker Orange gefärbt, um die Mitochondrien im konfokalen Mikroskop sichtbar zu machen (Abb.4.14b). In p(ivd)-cry3-gfp exprimierenden Zellen zeigte sich eine Co-Lokalisation der Fluoreszenzen von GFP und Mitotracker (Abb. 4.14b untere Zellen). Zur Kontrolle ist auch eine Mitotracker -gefärbte, nicht exprimierende Zelle gezeigt, die kein Hintergrundsignal im GFP-Kanal aufweist (Abb. 4.14b oben). Für die stabile Transformation von Arabidopsis cry3-knockout-pflanzen wurde das Fusionsprotein p(ivd)-cry3 in den binären Vektor pfgc5941 eingebracht. Die Klonierung erfolgte wie in für FNR-cry3 beschrieben, das GFP stammte hierbei aus dem Vektor pfgc5941. Mittels der Floral Dip-Methode wurde pfgc5941-p(ivd)-cry3(-gfp) Agrobakterium tumefaciens-vermittelt in cry3-knockout-pflanzen eingebracht. Die Selektion transgener Pflanzen erfolgte ebenso wie die der p(fnr)-cry3(-gfp) Keimlinge über die BASTA -Resistenz, die auf der T-DNA des Vektors lokalisiert ist.

68 ERGEBNISSE 68 Auch von den so gewonnenen p(ivd)-cry3(-gfp) Pflanzen wurden Proteingesamtextrakte hergestellt, um die Expression des Fusionsproteins im Western Blot nachzuweisen. Abbildung 4.15 a zeigt einen Western Bot mit Gesamtprotein verschiedener p(ivd)-cry3- GFP Linien (F 1 Generation), detektiert mit dem cry3 Antikörper. a GFP Chlorophyll Overlay DIC GFP Mitotracker Overlay DIC b Abb. 4.14: Konfokale Aufnahmen von Protoplasten aus Mesophyll- bzw. Wurzel-Zellkultur transformiert mit IVD-cry3-GFP. Das GFP-Signal co-lokalisiert nicht mit den Chloroplasten (a) der Mesophyllzellen. Eine Überlagerung des GFP-Signals mit der Mitotracker -Fluoreszenz ist in b gezeigt. Größenstandard = 10 µm Die berechnete molare Masse des Fusionsproteins beträgt ~94 kda. Linie Nr. 1 zeigt eine starke Überexpression des Proteins (Abb a), auch in Linie Nr. 3 ist es nachweisbar, nicht hingegen in Linie Nr. 2. Das Aufspaltungsverhältnis der Nachkommen von Linie #3 in Bezug auf die BASTA -resistenz zeigt, dass diese Pflanze heterozygot mit nur einer T- DNA Insertion ist. Linie #1 zeigte dagegen keine konsistente Aufspaltung in der Folgegeneration. Daher wurden für nachfolgende Arbeiten homozygote Nachkommen der Linie #3 weiter kultiviert.

69 ERGEBNISSE 69 a p(ivd)-cry3-gfp #1 p(ivd)-cry3-gfp #2 p(ivd)-cry3-gfp #3 Marker (kda) b p(ivd)-cry3 #5 p(ivd)-cry3 #9 p(ivd)-cry3 #11 p(ivd)-cry3 #12 p(ivd)-cry3 #17 p(ivd)-cry3 #19 p(ivd)-cry3 #21 Marker (kda) Abb. 4.15: Expressions-Screening des p(ivd)-cry3(-gfp) Proteins in transgenen Pflanzen. ECL-Western blot mit Proteinextrakten der p(ivd)-cry3-gfp (a) und der p(ivd)-cry3 (b) Pflanzen. Es wurden je 100 µg Proteingesamtextrakt mit einer 1:1000 Verdünnung des cry3- Antikörpers detektiert. Die berechnete molare Masse der Fusionsproteine beträgt ~94 mit bzw. ~68 kda ohne GFP. Die Gesamtextrakte der p(ivd)-cry3 Linien wurden ebenfalls mittels Immunodetektion getestet. Ein western blot dieser Linien ist in Abb b gezeigt. Alle Pflanzen bis auf #12 und #21 weisen ein Signal entsprechend der erwarteten Proteingröße von 68 kda (siehe Positivkontrolle) auf. Die Segregationsanalyse der Linie #5 zeigt, dass 25% der Nachkommen nicht BASTA -resistent sind. Daraus kann man schlussfolgern, dass diese Linie heterozygot mit nur einer T-DNA Insertion ist. Für weitere Arbeiten mit diesen beiden transgenen Linien müssen aus der nächsten Generation der Linien #3 (p(ivd)- cry3-gfp) bzw. #5 (p(ivd)-cry3) homozygote Nachkommen isoliert und weiter vermehrt werden. Wie in Abb unten deutlich zu erkennen ist, geht von dem Nucleolus ein starkes GFP- Signal aus, das auch zuvor bereits in cry3-gfp und p(fnr)-cry3-gfp exprimierenden Protoplasten beobachtet wurde. Eine Zusammenstellung von Abbildungen aller Konstrukte, die ein GFP-Signal im Kern bzw. Nucleolus lieferten, ist in Abb gezeigt. Das p(ivd)-cry3-gfp Konstrukt zeigte eine besonders deutliche Lokalisation im Nucleolus, eine Vergrößerung des Kernbereichs eines transformierten Protoplasten ist in Abb gezeigt. Hier sind die verschiedenen Bereiche des Nucleolus erkennbar und eine stärkere Verteilung des GFP-Signals in den granulären Zentren (Abb. 4.16, rechts) ist gut zu beobachten. Eine schwache Fluoreszenz ist auch im Kernplasma zu sehen (Abb. 4.16, links).

70 ERGEBNISSE 70 GFP DIC GFP DIC Abb. 4.16: Vergrößerter Kern mit Kernkörperchen zweier Protoplasten, die IVDcry3(40-569)-GFP exprimieren. Das GFP Signal ist bei diesen konfokalen Aufnahmen nicht in grün, sondern in glow-over-and-under dargestellt, wobei das stärkste Signal in Weiß abgebildet wird. Auf dem rechten Bild sind granuläre und fibrilläre Zentren des Nucleolus zu erkennen. Das Signal loklaisiert stärker in den granulären Strukturen (Größenmaßstab = 10 µm). Um die beobachtete Lokalisation von cry3 im Kern bzw. Nucleolus weiter zu verifizieren, wurde eine weitere Datenbankanalyse mit einem Vorhersageprogramm (WoLF PSORT) für die subzelluläre Lokalisation von cry3 durchgeführt.

71 ERGEBNISSE 71 GFP DIC Wurzelzellen Protoplast transformiert mit: pava393-cry3(1-569)-gfp pava393- p(fnr)-cry3(40-569)- GFP pava393- p(ivd)-cry3(40-569)- GFP pava393- cry3(40-569)-gfp-nes pava393-gfp Abb. 4.17: Vergleich der Lokalisation des GFP Signals der verschiedenen transient exprimierten Proteine. Arabidopsis thaliana Protoplasten einer Wurzelzellkultur wurden transformiert mit dem Vektor pava393, der jeweils das nebenstehende Insert unter 35S-Kontrolle enthielt. Sowohl originäres cry3(-gfp) als auch die künstlichen targeting-fusionen zeigen eine Lokalisation im Kern, speziell im Nucleolus. Dort findet sich dagegen nicht das cry3-gfp-nes Fusionsportein, wie es bei einer Kernexportsequenz zu erwarten ist. Auch GFP allein lokalisiert nicht im Kern (Größenstandard = 10 µm).

72 ERGEBNISSE Das cry3-protein lokalisiert im Nucleolus Mit dem Programm WoLF PSORT ( Horton et al., 2007) wurde eine Vorhersage für die Lokalisation von cry3 in der Pflanzenzelle durchgeführt. Dazu ermittelt das Programm die 14 nearest neighbours (Proteine mit ähnlicher Aminosäuresequenz wie cry3), deren Lokalisation bereits bekannt ist und vergleicht die Sequenzen mit cry3 (mit und ohne N-Terminus). Daraus ergibt sich eine Lokalisations-Wahrscheinlichkeit. Die Vorhersage sah wie folgt aus: Tabelle 4.1: Vorhersage der Lokalisation von cry3 des subzellulären Vorhersageprogramms WOLFPSORT. Die 14 nearest neighours sind in den folgenden Kompartimenten lokalisiert: Cry3 Kern Chloroplast Mitochondrien andere mit N-Term 5 5 2,5 1,5 ohne N-Term Die Programme PSORT (Nakai und Kanehisa, 1992) und PSORTII, auf denen WoLF PSORT basiert, finden eine pat7 NLS ab AS Position 470 mit dem Motiv PKEKRHW, siehe Abb (Ausführliches Ergebnis im Anhang). a cry3 MTHF FAD DAS PHL- domain MAASSLSLSS PLSNPLRRFT LHHLHLSKKP NLS (pat7): PKEKRHW b cry3-gfp DAS CRY3 GFP Abb. 4.18: Lokalisation der pat7 NLS im cry3 Protein. Schematische Darstellung des cry3-gfp (unten) und das ursprüngliche cry3 Protein mit seiner Domänen-Struktur und den Cofaktoren (oben) sowie der vorhergesagten pat7 NLS. Ein pat7 Motiv ist die typische NLS des SV40 T-Antigens. Das Motiv beginnt mit einem Prolin und es folgen von 6 Aminosäureresten, wobei drei der letzten vier basische Aminosäuren sein müssen (Hiscox, 2007). Lösliche Transportproteine wie Importinα, Importinβ und Ran binden an die NLS dieser Proteine und ermöglichen unter GTP- Verbrauch den aktiven Transport durch die Kernporen (Macara, 2001).

73 ERGEBNISSE 73 Lokalisationsanalysen der cry3-gfp Fusionen deuten auch auf eine nukleäre Lokalistaion von cry3 hin. In vitro wurde dieses Ergebnis bereits bestätigt (siehe Abb und 4. 17). Um die durch cry3-gfp markierte Struktur eindeutig als Kern nachzuweisen, wurden transformierte Protoplasten mit dem DNA Farbstoff Hoechst gefärbt und die Zellen mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop betrachtet. Fluoreszenzbilder dieser Protoplasten sind in Abbildung 4.19 gezeigt. Die Lokalisation des GFP-Signals in dem durch Hoechst als Kern markierten Kompartiment ist klar erkennbar. cry3-gfp GFP Hoechst DIC Die Nucleus-Export-Sequenz (NES) aus dem Ran-Binding Protein 1a (Haasen et al., 1999/ Acc. No.: CA ) aus Arabidopsis thaliana wurde mit cry3-gfp fusioniert, um zu überprüfen, ob das Fusionsprotein aus dem Kern ausgeschlossen und so die Kernlokalisation des Ursprungsproteins bestätigt wird. Eine NES ist ein Leucin-reiches Signal und besteht in AtRanBp1a aus den Aminosäuren Leucin in Position 176 und 179 und Valin in Position 181 der Aminosäuresequenz. Diese NES wird von dem Exportin1- Homolog aus Arabidopsis thaliana, XPO1, erkannt und zusammen mit RanGTP gebunden. Dieser Triple-Komplex wird dann aus dem Kern exportiert (Haasen et al., 1999). Die C- terminalen 216 bp des AtRanBP1 Gens wurden aus cdna des Ökotyps Landsberg erecta cry3- GFP-NES Abb. 4.19: Lokalisation von cry3-gfp-nes im Vergleich zu cry3-gfp Arabidopsis thaliana Wurzel Protoplasten transformiert mit cry3-gfp und cry3-gfp-nes, gefärbt mit dem DNA Farbstoff Hoechst Epifluoreszenz Bilder wurden im GFP- (525 nm) und Hoechst -Kanal (410 nm) aufgenommen. Die Hoechst Fluoreszenz ist bei Bindung des Farbstoffs an RNA geringer als bei Bindung an DNA. Entsprechend ist der Nucleolus weniger stark gefärbt als das Kernplasma (Größenmaßstab = 10 µm) cry3-gfp-nes lokalisiert nicht im Nucleolus

74 ERGEBNISSE 74 amplifiziert und in das Plasmid pava393-cry3-gfp 3 von dem GFP-Gen eingebracht (Schema siehe Abb. 4.20). Im Gegensatz zu cry3-gfp zeigt die Fusion mit der Nucleus- Export Sequenz kein GFP-Signal im Kern bei transienter Expression in Wurzelprotoplasten. Konfokale Aufnahmen dieser Zellen sind in Abbildung 4.17 gezeigt, sowie Epifluoreszenzbilder mit Hoechst-Färbung in Abbildung cry3-gfp-nes DAS CRY3 GFP NES Abb. 4.20: Schema des cry3-gfp Fusionsproteins mit C-terminaler NES. Die NES stammt aus dem Protein RanBP1a von Arabidopsis thaliana. Um cry3 auch direkt und nicht nur über die GFP-Fluoreszenz im Zellkern nachzuweisen, wurden die Kerne aus Wurzelzellkultur-Protoplasten, die mit den cry3-gfp Konstrukten transformiert wurden, isoliert (nach Weigel und Glazebrook, 2002, siehe ). Das lichtmikroskopische Bild einer Verdünnung der angereicherten Kernfraktionen ist in Abbildung 4.21 a gezeigt. Die Isolation der Kerne wurde unter dem Lichtmikroskop verfolgt. Ein Aliquot wurde mit DAPI gefärbt und im Fluoreszenzmikroskop betrachtet, um sicherzustellen, dass es sich bei den aufgereinigten Strukturen tatsächlich um Kerne handelt (nicht gezeigt). Aus den Kernen wurden durch Aufnahme in Probenpuffer Proteinextrakte hergestellt und diese im präparativen SDS-Gel aufgetrennt (3.2.4). Anschließend wurden die Proteine auf eine Nitrocellulose Membran transferiert und dort immunochemisch detektiert (3.2.6./3.2.7.). Das cry3-gfp(-nes) Protein wurde sowohl mit dem cry3 als auch mit dem GFP Antikörper detektiert. Außerdem wurde mit dem Histon H1 Antikörper die Anreicherung von Kernproteinen überprüft (Abb c). Insgesamt liefert der GFP-Antikörper ein stärkeres Signal als der cry3-antikörper. Beide detektieren aber das gleiche Protein. Es ist zu erkennen, dass im Kernproteinextrakt kaum cry3-gfp-nes Protein vorliegt, cry3-gfp liefert dagegen ein deutliches Signal im Kernextrakt. Als Kontrolle, dass cry3-gfp-nes und cry3-gfp gleich stark exprimiert wurden, dient das Signal im Gesamtextrakt (Abb c).

75 ERGEBNISSE 75 a b c Kerne Gesamtextrakt cry3-nes cry3 cry3-nes cry3 kda Antikörper α.cry3 α.gfp goat 25 α Histon H1 mouse Abb. 4.21: Präparation von Kernproteinextrakten aus Protoplasten a Verdünnung der isolierten Kerne, etwa 500-fach vergrößert. b Coomassie-gefärbtes Gel mit dem gleichen Proteinauftrag wie in c. c ECL-Westernblot mit Kernproteinen von cry3-gfp (88.kDa) bzw. cry3- GFP-NES (96 kda) exprimierenden Protoplasten einer Wurzelzellkultur, die transient transformiert wurde. Proteinauftrag jeweils 100.µg. Von dem Gel wurden Duplikate angefertigt und eine Membran gestripped und rehybridisiert mit Histon H1 Antikörper (27 kda) cry3-gfp lokalisiert im Zellkern in transgenen 35S:cry3- GFP Pflanzen Die bereits in gezeigten transgenen Arabidopsis thaliana Ler Pflanzen, die cry3-gfp unter Kontrolle des 35S-Promotors exprimieren, wurden auch genutzt, um die Kernlokalisation von cry3-gfp zu verifizieren. Die Wurzel von BASTA -selektierten 7 Tage alten Keimlingen der 35S:cry3-GFP Linie (#1.3, Abb. 4.8) wurden mit Vybrant DyeCycle Orange gefärbt (1 h Inkubation in 1:1000 Verdünnung) und konfokale Fluoreszenzaufnahmen der Wurzelhaare angefertigt. Der Farbstoff bindet spezifisch an doppelsträngige DNA und emittiert (angeregt mit 488 nm) Licht im Wellenlängenbereich von nm (Maximum). Das Ergebnis für die cry3-gfp Linie sowie für den Wildtyp nach gleicher Behandlung sind in Abb gezeigt.

76 ERGEBNISSE 76 a GFP Vybrant Overlay DIC DyeCycle Orange b Abb 4.22: Detailaufnahmen der Zellkerne in Wurzelhaaren von 7 Tage alten Keimlingen. a Wurzelhaarzelle der 35:cry3-GFP Pflanze #1.3. Die Kerne sind mit Vybrant DyeCycle Orange gefärbt. Eine Co-Lokalisation mit dem GFP-Signal ist in gelb dargestellt. b Wurzelhaare von 7 Tage alten Wildtyp-Keimlingen. Die Färbung mit Vybrant DyeCycle führt zu einem schwachen Hintergrundsignal im GFP-Kanal (Größenmaßstab = 10 µm). Um die subzellulären Strukturen noch besser auflösen zu können, wurden aus Kotyledonen der transgenen 35S:cry3-GFP Pflanze #2.7 Protoplasten isoliert (3.1.6.). Diese Zellen wurden ebenfalls mit Vybrant Dyecycle Orange behandelt, um den Kern anzufärben. Das Ergebnis ist in Abb gezeigt. Die Protoplasten zeigten ein GFP Signal im Kern, das mit dem Vybrant Signal überlagert, nicht jedoch mit dem Chlorophyll colokalisiert. Man erkennt, dass der durch Vybrant gefärbte Teil größer ist (gesamter Kern) als die Struktur der GFP Lokalisation (zwei Nucleoli). Daraus lässt sich schließen, dass es sich um im Kern bzw. Nucleolus lokalisiertes cry3-gfp Protein handelt. Da cry3 auch in den Chloroplasten lokalisiert und diese auch DNA enthalten (Plastom), zeigten erwartungsgemäß die Chloroplasten ebenfalls beide Signale. Der Wildtyp zeigt eine starke

77 ERGEBNISSE 77 Autofluoreszenz des Chlorophylls im GFP Kanal, der durch Vybrant markierte Kern zeigt aber kein GFP Signal. a cry3-gfp Wildtyp Chlorophyll Vybrant ( nm) b Chlorophyll Vybrant GFP Overlay Vybrant + GFP (weiß) GFP Overlay Vybrant + GFP Abb. 4.23: Co-Lokalisation von cry3-gfp und dem Kernfarbstoff Vybrant Dyecycle in Protoplasten a Konfokale Aufnahmen eines Mesophyllzellen-Protoplasten, der aus Keimlingen der cry3-gfp exprimierenden Linie #2.7 gewonnen wurde. Die doppelsträngige DNA wurde mit Vybrant Dyecycle Orange gefärbt. Die überlagerten Signale sind in Weiß dargestellt, der Kern durch einen Pfeil gekennzeichnet. Man sieht eine starke Überlagerung der Signale im Zellkern (GFP: zwei Nucleoli, Vybrant: gesamter Kern). b Aufnahme einer Wildtyp-Mesophyllzelle. Das Chlorophyll zeigt ein Hintergrundsignal im GFP Kanal und ein leichtes Vybrant-Signal. Der Kern ist durch Vybrant markiert, er zeigt kein Signal im GFP Kanal (Maßstab = 10 µm). Aus Keimlingen der 35S:cry3 Linie (Reisbacher, Dissertation 2009) wurde Blattmaterial fixiert und daraus Ultradünnschnitte angefertigt (alle Arbeiten AG Prof. Dr. U.G. Maier/M. Johannsen). Die Schnitte wurden mit aufgereinigtem cry3-antikörper inkubiert und mit goldgekoppeltem Zweitantikörper ( der Goldpartikel 30 nm) detektiert. Transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Aufnahmen zeigten das cry3-protein durch die höhere Elektronendichte des Goldes als schwarze Spots an. Eine Aufnahme ist in Abb gezeigt. In der Vergrößerung des Kerns sind zwei Spots zu erkennen, wodurch cry3 im Kern angezeigt wird. Da in dieser Aufnahme die Feinstruktur des Kerns nicht erkennbar ist, kann nicht unterschieden werden, ob das Protein im Nucleolus oder im Kernplasma vorliegt.

78 ERGEBNISSE 78 Abb.4.24: TEM Aufnahme eines Schnittes durch einen Keimling der cry3- Überexpremierer Linie. Links ist die ganze Mesophyllzelle zu sehen, rechts der vergrößerte Kern. Hier sind zwei Bindungsstellen des goldgekoppelten Zweitantikörpers erkennbar (Pfeile), die den cry3-antikörper im Kern anzeigen, sowie ein an die Kernmembran angelagertes Signal. Pflanzenmaterial und Bilder von Stefan Reisbacher (2009).

79 DISKUSSION Diskussion 5.1. Das cry3-protein liegt vermehrt in Wurzeln und Blüten vor Das organspezifische Vorkommen und die entwicklungsabhängige Expression von cry3 könnten Hinweise auf die Funktion des Proteins liefern. Die real-time PCR Daten zeigten die stärkste Expression des CRY3-Gens in isolierten Geweben von Wurzeln und Blüten (Abb. 4.1 und 4.2). Die Analysen der Western blots mit Proteinextrakten gleicher Gewebe bestätigen einen hohen cry3-proteingehalt in Wurzeln und Blüten (Abb. 4.3 und 4.4). Im Gegensatz zu der geringen Expression des CRY3-Gens in Keimlingen ist der cry3 Proteingehalt in Keimlingen hoch. Die Standardabweichungen der Meßwerte für Keimlinge und Blätter sind größer als die der anderen Proben, was vermuten lässt, dass die cry3 Mengen in den verwendeten Proteinpräparationen schwankten. Der Keimling ist mitotisch sehr aktiv und hat eine gesteigerte Proteinsynthese-Rate im Vergleich zu den anderen Geweben. Daher kann trotz relativ geringer CRY3-Genexpression der cry3 Proteingehalt hier höher sein als in den anderen Proben. Die Analyse von bereits veröffentlichten Microarray-Daten durch das Programm GENE- relative Expression # Arrays Gekeimter Samen Keimling Junge Rosette Knospe Junge Blüte Entwickelte Blüte Blüten und Schoten Reife Samenschoten # Arrays Abb. 5.1: Microarraydaten der CRY3 Expression zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten von Arabidopsis thaliana (aus GENEVESTIGATOR).

80 DISKUSSION 80 VESTIGATOR (Hruz et al., 2008) bestätigt die in dieser Arbeit ermittelten relativen Werte und gibt auch Aufschluss über die entwicklungs-abhängige Expression von cry3 (Abb. 4.1 und 4.2): von der sehr Stoffwechsel-aktiven keimenden Pflanze bis zum ruhenden Samen nimmt die Expression von CRY3 in der gesamten Pflanze ab, mit einem leichten Anstieg in den sich entwickelnden Samenschoten (Abb. 5.1). Facella et al., (2006) haben die Expression des homologen Gens in Tomate untersucht und gesteigerte Transkriptmengen in Wurzeln und Blättern gefunden (Blüten wurden hier nicht untersucht). Es ist auch denkbar, dass cry3 in speziellen Geweben des Blattes oder der Wurzel vermehrt vorkommt, was bei der Untersuchung des gesamten Organs mittels real time PCR oder Western Blot niveliert wird. Um dieses näher zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit Konstrukte mit cry3::gfp und cry3::gus als Reportergen-Fusionen unter Kontrolle des zufällig definierten CRY3-Promotors kloniert und mittels floral dip in Arabidopsis thaliana eingebracht. Die Expression dieser Konstrukte war jedoch anhand der Reportergene nicht nachweisbar. Es ist somit möglich, dass der CRY3-Promotor nur schwach aktiv ist und nicht genug detektierbares Reporterprotein exprimiert wurde. Eine schwache GFP-Fluoreszenz ist durch die starke Autofluoreszenz des Chlorophylls und einiger sekundärer Pflanzenstoffe fluoreszenmikroskopisch evtl. nicht detektierbar, wenn die Lichtemission dieser Inhaltstoffe zu groß ist im Verhältnis zum GFP-Signal. Auch die GUS-Färbung ist problematisch, da bei einer zu niedrigen Konzentration der ß- Glucuronidase zu wenig Substrat (X-Gluc: 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Glucuronsäure) umgesetzt wird, so dass die durch Oxidation entstandene Blaufärbung des Produktes (5,5'-Dibrom-4,4'-Dichlor-Indigo) nicht zu erkennen ist (Jefferson et al., 1987). Es ist also ebenso denkbar, dass der CRY3-Promotor für die genutzten Reportersysteme zu schwach ist. Das cry3-protein in Gewebeschnitten von Solanum lycopersicum wurde anhand von Digoxigenin-markierten Sonden nachgewiesen (Facella et al., 2006). Es wurde entlang der ganzen Blattfläche im Palisaden- und Schwammparenchym lokalisiert, außerdem in der photosynthetisch aktiven Rindenschicht des Stängels als auch in der Wurzelspitze. Blütengewebe wurde hier nicht analysiert. Der hohe Gehalt an cry3-protein in Wurzeln könnte auf eine Photorezeptor-Funktion von cry3 in diesem Gewebe während der Samenkeimung hinweisen. Zu diesem frühen Zeitpunkt könnten die Lichtsignale sowohl der Photomorphogenese des Keimlings als auch der Wahrnehmung schädlicher Strahlung dienen, um Schutzmechanismen zu aktivieren. Die Wurzel der entwickelten Pflanze könnte durch Bodenerosion oder Fraßfeinde wieder dem Licht exponiert werden. In der Erde wäre die Perzeption von Schwachlicht durch cry3

81 DISKUSSION 81 denkbar. Arabidopsis thaliana cry1 und cry2 werden in allen Pflanzenorganen lichtunabhängig exprimiert (Lin und Shalitin, 2003). Microarray-Analysen durch GENEVESTIGATOR zeigen, dass die mrna beider Cryptochrome in Wurzeln vergleichsweise niedrig vorliegt, der Gehalt ist maximal im Keimling und den Rosettenblättern (Hruz et al., 2008). Da beide Gene insgesamt stärker exprimiert werden als cry3 (cry2 etwa um das 10-fache), ist die Menge an cry2-rna in Wurzeln tatsächlich höher als die der cry3-rna. Vergleichbare Daten für die Proteingehalte liegen nicht vor. Die Reparatur von CPD-Schäden durch cry3 in entwundener oder einzelsträngiger DNA (Pokorny et al., 2008) könnte in Wurzeln eine Rolle spielen, wenn diese kurzfrisitg dem Licht ausgesetzt sind (siehe oben). Das Protein der Arabidopsis thaliana CPD-Photolyase konnte in Wurzeln kaum nachgewiesen werden, ebenso das der (6-4)-Photolyase (Waterworth et al., 2002). Cry3 könnte somit diese Funktion in den Wurzeln für einzelsträngige DNA übernehmen. Arabidopsis thaliana weist den höchsten Gehalt der CPD-Photolyase in Blüten bzw. Schoten auf, vermutlich um die Entstehung von Schäden in der DNA der Blütenmeristemzellen zu minimieren. Blüten einschließlich der dort befindlichen Meristeme sind hohem UV-Stress ausgesetzt. In diesem Zusammenhang sind die starke Expression und der Gehalt an cry3 in den Blüten erklärbar, sofern cry3 dort auch eine Photolyase-Funktion erfüllt. Im Zusammenhang mit der UV-B Perzeption wurde eine Mutante isoliert, bei der die Wurzeln nach Ausfall des RUS1-Gens hypersensitiv auf UV-B Licht reagieren, was nur bei Anzucht auf Agar, aber nicht in Erde zum Tragen kommt (Tong et al., 2008). Dieses Protein wird in den Wurzeln exprimiert und ist vermutlich Teil der Antwortreaktion auf UV- B Strahlung. Cry3 ist eines von etwa 100 Genen, deren Expression durch UV-B-Strahlung von geringer Dosis induziert wird (Ulm et al., 2004). Eine mögliche Funktion von cry3 in der Signalkette der UV-B-vermittelten Repression von Plastidengenen wurde von Stefan Reisbacher (Dissertation 2009) untersucht und kann aufgrund der dort beschriebenen Befunde ausgeschlossen werden. Vor Kurzem wurde von unserer Arbeitsgruppe gezeigt, dass cry3 bei UV-A-Bestrahlung 5,10-Methenyl-THF zu 5,10-Methylen-THF photoreduziert (Moldt et al, 2009). Wird cry3 zusammen mit der Methylen-THF Dehydrogenase inkubiert, katalysiert die Dehydrogenase die Bildung von Methenyl-THF und NADPH (Abb. 1.9, siehe Einleitung 1.6.4). Isoenzyme der MTHF-Dehydrogenase finden sich im Cytosol, den Chloroplasten und auch in Mitochondrien, also den Organellen, in denen cry3 lokalisiert (Hanson et al., 2000). Möglicherweise spielt cry3 hier für den Folat-Metabolismus eine Rolle, da diese Reaktion zwar lichtabhängig ist, aber unabhängig von der Photosynthese. Da Folate vermehrt in

82 DISKUSSION 82 meristematischem Gewebe gebildet und gebraucht werden (Jabrin et al., 2003), könnte cry3 Photosynthese-unabhängig Methylen-THF bereitstellen. Tatsächlich haben Facella et al. (2006) gesteigerte Mengen des cry-dash Proteins aus Solanum lycopersicum im Embryo in den meristematischen Geweben nachgewiesen. Die Quanten-Ausbeute der Photoreduktion von Methenyl-THF durch cry3 ist jedoch sehr niedrig, weshalb diese Funktion von cry3 in vivo vermutlich nur unter Starklichtbedingungen eine Rolle spielt (Moldt et al., 2009). Im Wurzelmeristem wird cry3 wahrscheinlich kaum zum Folat-Pool dieser Zellen beitragen, in Blüten käme eine Funktion von cry3 im Folatstoffwechsel dagegen in Betracht Die Chloroplasten-Lokalisation von cry3 ist lichtunabhängig Das cry3-protein wurde als GFP-Fusion im Chloroplasten nachgewiesen (Kleine et al., 2003) und auch im Western Blot mit Protein aus isolierten Chloroplasten durch cry3- Antikörper immunodetektiert (Reisbacher, Dissertation 2009). Eine duale Zielsteuerungssequenz wurde auf den N-terminalen 40 AS u.a. von TargetP (einem öffentlichen Bioinformatik Programm, das Vorhersagen zur Lokalisation des Proteins macht) gefunden. Außerdem wurden in vitro Importstudien mit Erbsen-Chloroplasten durchgeführt, die den Import von cry3 in Chloroplasten bestätigen (Kleine et al., 2003). Von cry1 aus Arabidopsis thaliana ist eine Lichtabhängigkeit hinsichtlich seiner Lokalisation beschrieben (Yang et al., 2000): In Dunkelheit gezogene 5 Tage alte transgene Keimlinge, die GUS-CCT1 (Cryptochrom 1 C-Terminus) exprimierten, wiesen das GUS-Signal fast ausschließlich im Kern auf, wohingegen das Signal bei Anzucht im Licht im Cytosol lokalisiert war. Eine ähnliche Lichtregulation für die Lokalisation von cry3 entweder in Chloroplasten oder im Cytosol wäre denkbar und wurde mittels GFPfusioniertem cry3 in transienter Expression in Protoplasten untersucht (siehe 4.3.1). Die Bilder zeigten eine geringfügige Zunahme des cytosolischen GFP-Signals nach 30 min Belichtung (Abb. 4.5), jedoch keine Veränderung des plastidären GFP-Signals. In einem zweiten Versuch wurden die transfizierten Protoplasten in drei Aliquots geteilt. Die Zellen, die mit Blaulicht bestrahlt wurden, zeigten insgesamt ein etwas stärkeres GFP Signal im Cytosol, die Lokalisation in den Chloroplasten ist jedoch nicht verändert im Vergleich zur Dunkelkontrolle oder der Weißlichtprobe (Abb. 4.6). Es scheint somit keine lichtabhängige Chloroplasten-Lokalisation des cry3 Proteins vorzuliegen, die sich in dem untersuchten kurzen (30 min) oder langen (über Nacht)

83 DISKUSSION 83 Zeitraum abspielt. Auch Blaulicht zeigt keinen Einfluss auf die Lokalisation. Da cry3 hier unter dem 35S Promotor exprimiert wurde, liegt sehr viel mehr cry3 Protein in den Zellen vor als unter natürlichen Bedingungen. Die Importmaschinerie könnte in den transgenen Linien daher überlastet sein und auf ein Signal zur Steigerung des cry3 Imports als Reaktion auf Weiß- oder Blaulicht nicht reagieren. Um die Lokalisation von cry3 auch ohne Überexpression in der Zelle untersuchen zu können, wurde cry3-gfp unter Kontrolle des CRY3-Promotors kloniert. Die resultierende Proteinmenge war jedoch entweder unterhalb der Detektionsgrenze oder die verwendete Promotorregion nicht funktional, da kein GFP- Signal detektiert werden konnte. Einfluss der N-terminalen α-helix auf den Import Cry3 trägt am N-terminalen Ende ein konserviertes Motiv, das sich auch in Atcry1 und cry2 findet, hier jedoch in der C-terminalen Extension (s. Abb. 4.7a). Diese sogenannte DAS-Domäne setzt sich zusammen aus den Aminosäuren DQXVP (D), einer Region mit sauren Aminosäuren (D, E, acidic) und einem weiteren Motiv, STAES gefolgt von GGXVP. Dieses Motiv ist konserviert in pflanzlichen Cryptochromen von Moosen bis zu den Blütenpflanzen (Lin, 2002). Photolyasen weisen keine DAS-Domänen auf. Die DAS Domäne hat in cry1 und cry2 physiologische Relevanz: die lichtabhängige Kernlokalisation von cry1 sowie die konstitutive von cry2 wird ebenso wie die Interaktion mit COP1 durch den C-Terminus gewährleistet (Wang et al., 2001; Kleiner et al., 1999). Eine Mutation im Bereich des DQXVP Motivs führt zum Verlust der Inhibition des Hypokotylwachstums (Ahmad et al., 1995). In cry3 ist durch die unmittelbare Nähe der DAS-Domäne zum Targeting-Peptid eine intramolekulare Interaktion denkbar, die z.b. die Faltungseigenschaften der Zielsteuerungssequenz beeinflusst. Das Chloroplasten-Importpeptid nimmt an der Oberfläche des TOC Komplexes (Transporter of the outer chloroplast membrane) eine helikale Struktur an (liegt i.d.r. zuvor unstrukturiert vor, Bruce, 2001). Eine Bindung der DAS-Domäne an andere Faktoren könnte die Proteinfaltung verändern und damit den Import beeinflussen. Chloroplasten-Zielsteuerungssequenzen werden häufig phosphoryliert, das konnte für die Signalpeptide von Mitochondrien bisher nicht gezeigt werden (Becker et al., 2005). Es ist nicht bekannt, ob Proteine mit einem dual-targeting durch Phosphorylierung ihre Lokalisation verändern und welche Faktoren hierbei eine Rolle spielen. Es ist also auch eine Veränderung des Phosphorylierungsstatus von cry3 denkbar, an dem andere Proteine beteiligt sind, die mit der DAS-Domäne interagieren.

84 DISKUSSION 84 Hierdurch könnte sich die Faltung des Proteins verändern und das Targeting-Peptid in eine Position gebracht werden, die einen Import erschwert. Insbesondere wäre hier natürlich eine lichtabhängige Kontrolle anzunehmen, die aber in dieser Arbeit (4.3.1.) nicht gezeigt werden konnte. Die konfokalen Aufnahmen einer Zellen, die cry3-gfp ohne α-helix unter 35S-Kontrolle exprimiert, ist in Abb. 4.7 gezeigt. Die hier erkennbare Lokalisation des GFP-Signals unterscheidet sich nicht von der gezeigten Lokalisation des Wildtyp-GFP-Fusionsproteins. Die N-terminale α-helix der DAS-Domäne ist also für den Import des Proteins in Chloroplasten nicht notwendig und scheint für diesen auch keine regulatorische Funktion zu haben. Cry3-GFP wird in transgenen Pflanzen in Chloroplasten importiert Die Lokalisation von cry3 in Chloroplasten wurde bislang in vivo dadurch gezeigt, dass mit GFP-fusioniertes cry3 in Protoplasten einer Zellkultur exprimiert wurde. Ferner bestätigen in vitro Importstudien mit 35 S-Met markiertem cry3 den Import von cry3 in Chloroplasten (Kleine et al., 2003). Außerdem konnte das Protein wie bereits erwähnt mittels Immunodetektion im Western Blot in der Proteinfraktion aus aufgereinigten Chloroplasten nachgewiesen werden (Reisbacher, Dissertation 2009). Um diese Lokalisation auch in planta zu zeigen, wurde cry3-gfp stabil in das Pflanzengenom von Wildtyp Arabidopsis Pflanzen eingebracht (2.1.8). Die Kontrolle der Expression durch die eigene Promotorregion war auch hier nicht funktional, so dass nur Pflanzen mit Überexpression unter 35S-Kontrolle vorliegen (Abb. 4.9). Es war in diesen Linien deutlich ein starkes GFP- Signal in den Chloroplasten erkennbar, das die Lokalisation von cry3 im Chloroplasten auch in intakten Pflanzen bestätigt. Eine artifizielle Lokalisation von cry3 aufgrund der Fusion mit GFP ist nicht zu erwarten; Peeters und Small (2001) konnten keine falsche Adressierung von GFP-fusionierten plastidären Proteinen nachweisen, selbst nicht bei starker Überexpression. Die Funktion von cry3 in Chloroplasten (wie auch in Mitochondrien) bleibt spekulativ. Für cry3 wurde eine sequenzunspezifische Bindung an doppel- und einzelsträngige DNA nachgewiesen (Kleine et al., 2003), weshalb eine Rolle von cry3 bei der direkten Regulation der Transkription denkbar ist. Auch in Synechocystis konnte durch den Vergleich der Expressionsstärken des psba1 Proteins (kodiert für das D1 Protein des Photosyntheseapparates) im Wildtyp Stamm und im cry-dash Deletions-Stamm gezeigt werden, dass cry-dash an der lichtabhängigen Induktion der psba1 Expression beteiligt

85 DISKUSSION 85 ist (Kleine, Dissertation 2003). Die Expression von zumindest einem Sigma-Faktor, AtSIG5 wird Blaulicht-abhängig von Atcry1 und Atcry2 induziert. AtSIG5 bildet eine kernkodierte Untereinheit der plastidenkodierten RNA-Polymerase (PEP), die u.a. die Expression der psbd und psba Gene steuert (Mochizuki et al., 2004). Die UV-A abhängige Induktion des Plastidengens rbcl wird nicht durch die Photorezeptoren phya, phyb und cry1 reguliert und war daher ein putativer Kandidat der möglichen Genregulation durch cry3. Eine Beteiligung von cry3 an dieser UV-Induktion konnte jedoch ausgeschlossen und auch für das plastidäre psaa-gen nicht gezeigt werden (Reisbacher, Dissertation 2009). DASH-Cryptochrome haben die Fähigkeit, Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere zu erkennen und lichtabhängig zu reparieren, sofern die Wasserstoffbrückenbindung der Läsion und der unmittelbar benachbarten Nukleotide zum Komplementärstrang aufgehoben wird (siehe Einleitung ). Solche kurzen Entwindungen der DNA Doppelhelix treten z.b. bei der DNA Replikation und Transkription auf und dies sowohl im Zellkern als auch in den Organellen, die ihr eigenes Genom (Chondrom bzw. Plastom) besitzen. Dass cry3 an diesen Prozessen im Rahmen einer Reparaturfunktion beteiligt ist, wäre denkbar und würde auch eine weitere Funktion z.b. bei der Genregulation nicht ausschließen, da diese unterschiedlichen Eigenschaften auch bei anderen Vertretern der Photolyase/ Cryptochrom-Familie in Pilzen vereint sind (Bayram et al., 2008, siehe Einleitung 1.6.3). Wie bereits oben erwähnt wurde von Moldt et al., (2009) kürzlich nachgewiesen, dass cry3 (und andere Photolyasen) Methenyl-THF zu Methylen-THF reduzieren können, welches für die Pflanze von Bedeutung ist. Es wird regulär bereigestellt durch den C1- Stoffwechselweg, durch die Glycin-Decarboxylase, und durch die Serin-Hydroxymethyltransferase (Rebeille et al., 2006). Von der C1-THF Synthase und der Serin- Hydroxymethyltransferase existieren Isoformen in Mitochondrien, Chloroplasten und dem Cytosol (Rebeille et al., 2006) und cry3 könnte einen alternativen Stoffwechselweg zur Synthese von Methylen-THF in diesen Kompartimenten ermöglichen. Der katalytische Schritt, der zuvor auch als Photobleaching bezeichnet wurde, braucht jedoch sehr viel Lichtenergie, sodass die Bereitstellung von MTHF nur unter Starklichtbedingungen stattfinden könnte. Viele der bisher gefundenen Proteine in Arabidopsis, die in Chloroplasten und Mitochondrien importiert werden, sind in die Genexpression involviert (Peeters und Small, 2001), wie z.b. Aminoacyl-tRNA Synthetasen und RNA Polymerasen. Ferner sind es RNA bindende Proteine, Proteine die dem Schutz vor oxidativem Stress dienen und solche, die an der Purin-Synthese beteiligt sind. Durch die Bereitstellung von Methylen-THF würde sich cry3 in diese Gruppen einordnen lassen, indem es die Bildung von Formylmethionyl-

86 DISKUSSION 86 trna sowie die Synthese von Purinen unterstützt. Das homologe Protein aus dem Bakterium Vibrio cholerae (Vccry1) wurde mit einer Nukleotiden langen RNA coaufgereinigt (Worthington et al., 2003). Funktion und Herkunft dieses RNA-Fragments bleiben unklar, ebenso wie die Frage, ob die RNA ein Substrat von Vccry1 darstellt. Es ist möglich, dass cry3 in Plastiden und Mitochondrien ebenfalls RNA bindet. Bislang wurde es jedoch nicht aus den Organellen isoliert und daraufhin untersucht. Da die Funktion von cry3 in den Organellen noch völlig ungeklärt ist, ist es nötig, Pflanzen zur Verfügung zu haben, die cry3 artifiziell in nur eines der beiden Organellen transportieren. Grundlage hierfür ist eine cry3-knockout Linie, die in unserem Labor etabliert wurde. Cry3 ohne eigene N-terminale Präsequenz fusioniert mit den künstlichen Zielsteuerungs-Sequenzen der Ferrodoxin-NADP-Oxidoreduktase aus Spinacia oleracea (an Chloroplasten) bzw. der Isovaleryl-CoA-Dehydrogenase (an Mitochondrien) konnte stabil in diese Knockout-Linie eingebracht werden (siehe Ergebnisse 4.4). Da diese Gene mit und ohne GFP-Fusion in das Pflanzengenom integriert wurden, konnte das korrekte Targeting auch mikroskopisch an Gesamtpflanzen bestätigt werden. Gegenstand dieser Arbeit war die Generierung dieser transgenen Pflanzen und die Isolation von homozygoten Linien mit nur einer T-DNA-Insertion. In zukünftigen Arbeiten werden die Nachkommen dieser Pflanzen z.b. auf ihre Entwicklung unter bestimmten Lichtbedingungen, ihren Blühzeitpunkt, ihre Reaktion auf (Licht-)Stress etc. untersucht und mit dem Wildtyp bzw. der Knockout-Linie verglichen. Chloroplasten- bzw. Mitochondrien-spezifische Reaktionen und Signalwege können so identifiziert werden und zur Aufklärung der Funktion von cry3 in definierten Kompartimenten beitragen Cry3 ist auch im Nucleolus lokalisiert Der Nucleolus ist ein gut erkennbares und deutlich differenziertes Subkompartiment des Zellkerns. Er ist gut erforscht und galt lange einzig als Ort der Ribosomen-Biogenese (Übersichtsartikel Raska et al., 2006). Neuere Forschungsergebnisse zeigen, dass dieses Kompartiment weit mehr Funktionen hat, die eng mit dem Zellzyklus verknüpft sind ( nicht-ribosomale nucleoläre Funktionen ). Auch ist der Nucleolus keine starre Einheit sondern eine sehr dynamische Struktur mit einem hohen Transportaufkommen an Proteinen, die bisher nicht im Nucleolus vermutet wurden. Eine mögliche pat7 Kernsteuerungssequenz hat das Vorhersageprogramm WOLFPSORT im Bereich der Aminosäureposition 470 vorhergesagt. Das Programm ordnet cry3 dem Zellkern zu, ebenso dem Chloroplasten und Mitochondrium. Ein pat7-motiv beginnt mit

87 DISKUSSION 87 einem Prolin gefolgt von 6 Aminosäuren, wovon drei der letzten vier Aminosäuren basisch sind. Es handelt sich dabei um eine klassische NLS (Nucleus Localization Signal). Die Motive, die ein Protein an den Nucleolus adressieren, sind weit weniger konserviert (sog. NoLS). Es steht noch kein Bioinformatik-Programm zur Verfügung, dass eine Vorhersage für eine NoLS ermöglicht. In einigen Proteinfamilien konnten konservierte Motive aus basischen Aminosäuren mit vielen Lysin- und Arginin-Resten identifiziert werden, die sich häufig mit denen einer NLS überschneiden (Übersicht über einige identifizierte NoLS in Emmott und Hiscox, 2009). Es ist daher nicht möglich, vorherzusagen, ob cry3 eine NoLS trägt oder nicht. Im Nucleolus wurden sehr viele Proteine ohne NoLS oder klassische NLS nachgewiesen, sodass weitere Formen des Transports, z.b. über Interaktion mit anderen Proteinen oder Bindung an Nukleinsäuren in Frage kommen (Emmott und Hiscox, 2009). Die Hauptkomponenten des Nucleolus, Nucleostemin und Nucleophosmin, interagieren mit zahlreichen Proteinen und Nucleinsäuren und gelten als Hub-Proteine. Für Nucleostemin wurde ein sehr schneller Transport zwischen Cytoplasma und Nucleolus gezeigt (Tsai und McKay, 2005). Die Bindung an GTP reguliert die Lokalisation des Proteins im Nucleolus, wobei die GTP-gebundene Form die Bindung an nucleoläre Proteine ermöglicht und Nucleostemin so im Nucleolus hält. Ohne GTP wird es zurück in das Cytoplasma transportiert (Misteli, 2005). Die Bindung an GTP ist eine mögliche Regulation des Proteinaustauschs zwischen Nucleolus und Cytoplasma, wobei eine GTP-Bindetasche jedoch nur für etwa 3% der Nucleolus-lokalisierten Proteine vorhergesagt wurde (Misteli, 2005). Für das Nucleokapsid-Protein des PRRS-Virus (ein Schweinevirus) wurde gezeigt, dass ein pat7-motiv das Protein an den Nucleus und Nucleolus adressiert, es aber auch über eine Nucleus-Export-Sequenz (NES) verfügt. Diese ist vermutlich für den Rücktransport des Proteins in das Cytosol notwendig. Die Fusion von cry3 mit einer artifiziellen NES führt zum Ausschluss des größten Anteils von cry3 aus dem Zellkern (siehe Abb. 4.22), ein schwaches Signal ist jedoch auch in der Kernfraktion von cry3-nes noch erkennbar. Ob diese auf cytosolische Kontamination zurückgeht oder cry3-nes im Vergleich zum Wildytp cry3 nur schneller aus dem Kern ins Cytosol transportiert wird, kann man anhand dieses Ergebnisses nicht schließen. Die Frage nach der Funktion von cry3 im Zellkern/Nucleolus bleibt bislang unbeantwortet. Die von Worthington et al. (2003) gezeigte Bindung von cry-dash an ein etwa Basen langes RNA-Fragement in dem Bakterium Vibrio cholerae (Vccry1) konnte für isoliertes cry-dash Protein aus anderen Organismen nicht gezeigt werden. Im Zellkern/Nucleolus wäre eine Vielzahl von RNAs unterschiedlicher Größe vorhanden

88 DISKUSSION 88 (snrnas, snornas), die Funktion einer Bindung dieser RNAs durch cry3 bleibt jedoch fraglich. Eine schwache Reparaturfunktion von CPD-Schäden in RNA durch Vccry1 konnte gezeigt werden (Selby und Sancar, 2006), sie ist jedoch nicht so effizient wie die Reparatur von CPD-Läsionen in einzelsträngiger DNA durch Vccry1. Pokorny et al. (2008) konnten zeigen, dass die Bindung des CPD-Schadens in DASH- Cryptochrom gleich erfolgt wie bei CPD-Photolyasen, aber die Fähigkeit des Herauswindens des Photoproduktes aus der DNA-Doppelhelix verloren gegangen ist. Auch für ein Cryptochrom aus Rhodobacter sphaeroides (cryb), welches nicht zur Familie der DASH-Cryptochrome gehört, wurde kürzlich die unspezifische Bindung an einzelsträngige DNA sowie doppelsträngige DNA und einzelsträngige RNA gezeigt, die beiden letzteren allerdings nur mit schwacher Affinität. Doppelsträngige RNA wurde von cryb nicht gebunden (Hendrischk et al., 2009). In jüngster Vergangenheit sind viele Hinweise auf nucleoläre Funktionen publiziert worden, die weit über die der Ribosomen-Biosynthese hinaus gehen und bei denen cry3 ebenfalls eine Reparaturfunktion erfüllen könnte. Die Aufklärung des Nucleolus-Proteoms von Arabidopsis thaliana (Pendle et al., 2005) hat gezeigt, dass nur etwa ein Viertel der gefundenen Proteine funktional an der Ribosomen-Biogenese beteiligt sind (siehe Abb. 5.2). Cry3 wurde in dieser Arbeit nicht identifiziert; da es sich bei cry3 um ein nur schwach exprimiertes Protein handelt, ist dies aber nicht verwunderlich. Die 217 identifizierten Proteine können auch insofern nur ein kleiner Ausschnitt der tatsächlich sich dort befindenen Proteine sein, da etwa nur Dreiviertel der bekannten ribosomalen Proteine gefunden wurden. Durch den Einsatz effizienter Methoden (Multiple Massenspektrometrie) wird die Anzahl der gefundenen Proteine stark ansteigen, wie es auch bei dem humanen nucleolären Proteom der Fall war: von den heute bekannten über 4500 nucleolären Proteinen (geschätzte Abdeckung 80%, Ahmad et al., 2009), kannte man 2003 erst etwa 700 Proteine (Leung und Lamond, 2003). So wurden z.b. die Assemblierung von Signalerkennungs-Partikeln (SRP, Ribonucleoprotein-Komplex, beteiligt am Transport von Proteinen in das ER), die Modifizierung kleiner RNAs und das RNA- Editing, die Telomerase-Reifung, die Zellzyklus-Kontrolle und die Stress-Wahrnehmung als nucleoläre Funktionen postuliert (Übersichtsartikel Lo et al., 2006). In Arabidopsis thaliana wurden die Proteine UPF2 und UPF3 im Nucleolus nachgewiesen, die am Nonsense mediated mrna Decay (NMD) beteiligt sind (Kim et al., 2009), sowie eine Anreicherung von anormalen mrnas im Nucleolus. Pflanzen-Viren nutzen den Nucleolus und die verwandten Cajal-Bodies zur systemischen Infektion (Hiscox, 2007; Kim et al., 2007a). Die genauen Mechanismen der Infektion sind noch nicht aufgeklärt, aber die Virus-

89 DISKUSSION 89 Proteine nutzen den Protein-Austausch zwischen Cajal-Bodies, Nucleolus und dem Cytosol. Bei all diesen Funktionen spielen kurze RNA-Fragmente eine Rolle (snrnas, snornas), die möglicherweise ebenso ein Substrat für cry3 darstellen wie einzelsträngige DNA (Selby und Sancar, 2006). Vermutlich assoziiert cry3 auch in den Chloroplasten und Mitochondrien mit der dortigen Organellen-DNA (Plastom/Chondrom), dies konnte durch bildgebende Verfahren bislang jedoch nicht ausreichend belegt werden. Viele kernkodierte RNA-bindende Proteine, vor allem Vertreter der großen Familie der PPR-(pentatricopeptide repeat)-proteine, ebenso wie RRM-Proteine (RNA Recognition Motiv) werden in Chloroplasten transportiert (Nickelsen, 2003) und spielen dort eine Rolle bei der Reifung plastidärer Transkripte, dem Spleißen und dem RNA-Editing. Außerdem wird durch sie die RNA-Stabilität und die Translations-Initiation reguliert (Nickelsen, 2003). Interessanterweise gehöre viele der im Nucleolus Proteom verzeichneten Proteine zu dieser Gruppe (Pendle et al., 2005). Ob im Rahmen dieser Genregulations-Aktivität auch eine Speicherung von cry3 im Nucleolus eine Rolle spielt, um das Protein (kurzfristig) aus dem Kern auszuschließen, muss noch geklärt werden. Der Nachweis von cry3 im Kern liefert den Hinweis darauf, dass cry3 (ebenso wie cry1 und cry2) an der Regulation der Genexpression direkt oder indirekt, durch Interaktion mit anderen Proteinen, beteiligt sein könnte. Darauf deuten auch die Micorarray-Analysen der Synechocystis cry-dash Mutante hin, die in ihrem Genexpressionsmuster verändert ist (Brudler et al., 2003). Auch eine Rolle in der lichtabhängigen Genregulation ist denkbar und wurde für Synechocystis cry-dash gezeigt (Brudler et al., 2003; Kleine, Dissertation 2009). Für den Transkriptionsfaktor APL (altered phloem development) wurde die duale Lokalisation in Mitochondrien und dem Kern nachgewiesen (Carrie et al., 2009) und für viele weitere Proteine postuliert (Schwacke et al., 2007). Cry3 könnte entsprechend ein trial lokalisiertes Protein (möglicherweise mit Funktion als Regulator von Genexpression) darstellen. Da auch die RNA-Bindung von cry3 möglich ist, könnte cry3 auch auf Translationsebene die plastidären Gene regulieren. Weiterführende Microarrays der Arabidopsis cry3-knockout oder Überexpressions-Linien sind erforderlich, um solche Veränderungen im Genexpressionsmuster im Vergleich zum Wildtyp aufzudecken. Mit dieser Arbeit konnten einige wichtige Befunde hinsichtlich Expression und Lokalisation von cry3 erzielt werden, die für weitere funktionelle Analysen bedeutsam sind. Die vermehrte Lokalisation in den zellteilungsaktiven Organen (Wurzeln, junger Keimling) unterstützt die Hypothese, dass cry3 im Folatstoffwechsel eine Rolle spielen könnte (Moldt

90 DISKUSSION 90 Nucleolar/snoRNP Ribosomal Unbekannt in At and Hs Splicing/snRNP Putative Kontaminantionen Chaperone Transkription Unbekannt Pflanzen-spezifisch DEAD/H-Box Transport/ Exon-Junction- Complex DNA-Interaktion Andere UNbekannt- Andere Translation RNA/Nukleotid-Bindung Abb. 5.2: Verteilung der nucleolären Proteine nach Proteinklassen vom Scottish Crop Research Institute - Computational Biology (AtNoPDB) (Brown et al., 2005b). et al., 2009). Darüberhinaus sind Folate auch für die Synthese von Ethylen notwendig, wodurch das erhöhte Vorkommen von cry3 in den Blüten und reifenden Samenschoten erklärbar wäre. Die subzelluläre Lokalisation in den Mitochondrien und Chloroplasten wäre ebenfalls mit einer Funktion von cry3 im Folatstoffwechsel konform, die neu entdeckte Lokalisation im Kern und speziell im Nucleolus weist aber auf eine darüber hinausreichende Funktion hin. Die zahlreichen Funktionen des Nucleolus, die mit einer Vielzahl von einzel- und doppelsträngiger DNA- und RNA-Spezies einhergehen (siehe Abb. 5.2), macht eine Beteiligung von cry3 auf den verschiedensten Ebenen denkbar. Die Reparatur kurzzeitig entwundener und einzelsträngig vorliegender DNA Abschnitte (im Bereich der rdna bzw. NORs) wäre eine Möglichkeit und eine Funktion, die cry3 ebenfalls in Mitochondrien und Chloroplasten erfüllen könnte. Mit geringerer Effizienz könnte auch die Bindung an RNA und deren Reparatur durch cry3 eine Rolle spielen (Worthington et al., 2003, Selby & Sancar 2006).