2. Tertiärstruktur. Lernziele: 1) Verstehen wie Röntgenstrukturanalyse und NMR Spektroskopie gebraucht werden um Proteinstrukturen zu bestimmen.

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1 2. Tertiärstruktur Lernziele: 1) Verstehen wie Röntgenstrukturanalyse und NMR Spektroskopie gebraucht werden um Proteinstrukturen zu bestimmen. 2) Verstehen warum nicht polare Reste im inneren eines Proteins vorkommen und polare Reste an der Oberfläche. 3) Verstehen dass die Tertiärstruktur eines Proteins aus der Kombination von Sekundärstrukturelementen welche Motive und Domänen bilden, hervorgeht. 4) Verstehen dass über die Zeit die Sruktur eines Proteins höher konserviert ist als seine Sequenz. 5) Familiarisieren mit der Information die durch Bioinformatik und Datenbasen zu finden ist. A. Bestimmung der Proteinstruktur 1

2 U.Albrecht BC1 Röntgenstrukturanalyse eine Methode zur Charakterisierung von Proteinstrukturen Interpretation von Röntgenstrukturen - direkte Abbildung von Molekülen - Sichtbarkeit eines Moleküls abhängig von Wellenlänge der Strahlung. z.b. Licht = 400nm alles < 400 nm wird in Lichtmik. nicht gesehen. Röntgenstrahlen ca nm ähnlich wie kovalente Bindungsabstände sichtbar Aber keine Linsen für Röntgenstrahlen Beugungsmuster Schwärtzung auf Film mathematische Rekonstruktion der Struktur - Röntgenstr. wechselwirken mit Elektronen, nicht Kernen Bild von Elektronendicheverteilung Röntgenbeugungsaufnahme eines Einkristalls von Pottwal-Myoglobin. Diffraktionsmuster ist eine Funktion der Elektronendichte des Kristalls U.Albrecht BC1 Elektronendichteverteilung des Häms bei 0.2 nm Auflösung. Ähnlichkeit mit Topographischen Höhenkurven. Je dichter desto mehr Elektronen Eisen hohe Elektronendichte Überlagerung von Ebenen verschiedener Elektronendichte ergibt eine dreidimansionale Elektronendichteverteilung. Auflösung 0.14 nm Myoglobin Dreidimansionale Computerdarstellung der Elektronendichteverteilung des menschlichen Rhinoviruses bei 0.3 nm Auflösung 2

3 Proteinkristallstrukturen erreichen keine atomare Auflösung U.Albrecht BC1 - Proteinkristalle dreidimensionale Gitter mit hohem Wassergehalt - wässrige Lösungsmittel nötig für strukturelle Integrität des Proteinkristalls - Proteinkristall hat gelatinöse Konsistenz, nicht starr, deshalb Position ein bisschen beweglich was zu geringerer Auflösung führt. - Auflösung genug um Polypeptidgerüst auszumachen, ähnliche AS wie Leu, Ile, Thr und Val können schlecht voneinander unterschieden werden. - Primärstruktur des Proteins muss bekannt sein, um Aminosäuren und Elektronendichte- verteilung in Deckung zu bringen. Elektronendichteverteilung von Diketopiperazin bei angegebener Auflösung 3

4 Proteinstrukturbestimmung mit NMR Entwickelt durch K. Wüthrich Interproton Abstände werden gemessen entweder über den nukleären Oberhauser Effekt (NOESY) oder über Bindungen mit korrelativer Spektorskopie (COSY) signale auf der Diagonalen zeigen Interaktionen zwischen Protonen die weniger als 5 Angsröm auseinander sind. Alle interaktionen zusammen ergeben eine Interpretation der Proteinfaltung. Proteine sind nicht starre Gebilde, sondern beweglich, deshalb können verschiedene ähnliche Strukturen erhalten werden. 4

5 B. Seitenketten Lokalisation und Polarität Die Aminosäurenseitenketten in globulären Proteinen sind räumlich gemäss ihren Polaritäten angeordnet. 1. unpolare Reste sind meist im inneren des Proteins Die hydrophoben Effekte die diese Verteilung steuern sind verantwortlich für die dreidimensionale Struktur des nativen Proteins. 2. geladene AS sind meist an der Oberfläche und in Kontakt mit Wasser. 3. ungeladene polare AS sind normalerweise an der Oberfläche des Proteins aber können auch im Inneren auftreten. Wenn im inneren, sind sie fast immer über H-Brücken mit anderen AS verbunden was ihre polarität neutralisiert. Seitenkettenlokalisierung in α-helix und β-faltblatt α-helix aussen β-faltblatt weiss = Peptidbindgunskette innen gelb, rot = unpolare Seitenketten violett = polare Seitenketten unpolare Seitenketten sind in beiden Strukturen vorwiegend auf einer Seite angeordnet. 5

6 Anodnungen der Seitenketten in einem ganzen Protein hydrophile Seitenketten in grün hydrophobe Seitenketten in orange Pferdeherz Cytochrom c C. Supersekundärstrukturen und Domänen Hauptsekundärstrukturen sind Helices und Faltblätter. In globulären Proteinen kommen sie kombiniert in verschiedenen Verhältnissen und Kombinationen vor. z.b. Cyt b562 nur a-helices Immunglobulin Fold nur b-faltblätter Die meisten Proteine haben beides wie z.b. LDH und Carboxypeptidase A 6

7 Gruppierungen solcher Sekundärstrukturen kommen auch als Supersekundärstrukturen vor und bilden sogenannte Motife. 1. Am häufigsten βαβ Motif (a) 2. β Hairpin (b) 3. αα Motif (c) 4. Griechisches Motif (d) das häufigste Motif in Proteinen bekannter Struktur. 5. β- Faltblätter rollen sich zu β Fässchen auf. Unten sind 3 verschiedene Typen aufgezeichnet. retinol bindeprotein asparagine amidase F Triosephosphat isomerase 7

8 Motife können funnktionelle als auch strukturelle Bedeutung haben. z.b. βαβαβ Einheiten sind oft Nukleotid Bindungsstellen. In den meisten Nukleotiden welche Dinukleotide binden (z.b. NAD+) zwei solcher βαβαβ Einheiten kombinieren zu einem Motif das als Dinukleotid-Bindungsstelle bezeichnet wird. LDH ist ein Beispiel eines solchen Proteins. Grosse Polypeptide bilden Domänen Polypeptide mit mehr als 200 AS falten normalerweise in zwie oder mehr globuläre Cluster welche als Domänen bezeichnet werden. z.b. hat glycerinaldehyd-3-phosphate dehydrogenase zwei Domänen Bindet GA-3-P Viele Domänen sind strukturell unabhängige Einheiten welche die eigenschaften von kleinen globulären Proteinen haben. 8

9 D. Proteinfamilien Proteine mit verschiedener Sequenz können ähnliche dreidimansionale Strukturen annehmen wie z.b im Cyt c verschiedener Spezies. (konvergente Evolution). Das heisst, dass in der Evolution essentielle strukturelle und funktionelle Elemente von Proteinen und nicht primär die Sequenz konserviert werden. Dreidimensionale Struktur von c-typ Cytochromen 9