1. Wissenschaftliche Bedeutung 2. Einführung Proteinstruktur 3. Bestimmung Sekundärstruktur 4. Bestimmung Tertiärstruktur 5.
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- Ingelore Goldschmidt
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1 Michael Hofstetter
2 1. Wissenschaftliche Bedeutung 2. Einführung Proteinstruktur 3. Bestimmung Sekundärstruktur 4. Bestimmung Tertiärstruktur 5. Vorhersage Sekundärstruktur 6. Vorhersage Tertiärstruktur 7. CASP 8. Anwendungen 9. Diskussion
3 Struktur bestimmt Funktion Ca. 300 Krankheiten wegen Proteinschäden oder fehlerhafter Faltung Alzheimer Creutzfeld-Jakob Scrapie Erkennen von Inhibitoren (Medikamente) Protein Design
4 1 Primärstruktur 2 Tertärstruktur mit Sekundärstruktur (blau: α-helizes; rot: β-faltblätter) 1 ²
5 1 2 Quartärstruktur, links als Backbone-Darstellung, rechts Oberflächendarstellung
6 Primäre Struktur gibt tertiäre Struktur vor Thermodynamische Hypothese Minimale Energie => stabil Beobachtung: Denaturierte Proteine nehmen in Lösung die gleiche Struktur ein Struktur gibt Funktion vor
7 Bindungstyp Kovalent Wasserstoffbrücken Wirkungsbereich 0,1 0,15nm ~1/r² Ion-Ion 1/r Ion-ruhender Dipol 1/r² Ion-rotierender Dipol 1/r 4 Ruhender Dipol-Dipol 1/r 3 Rotierender Dipol-Dipol 1/r 6 Ion-unpolar 1/r 4 Dipol-unpolar 1/r 6 Unpolar-unpolar 1/r 6 Wirkungsbereich der einzelnen Bindungen. r = Abstand zwischen den Atomen. Quelle: Gibas C, Iambeck P. Einführung in die praktische Bioinformatik. O'Reilly ISBN:
8 Sekundärstruktur FTIR Tertiärstruktur Röntgenstrukturanalyse Kernspinresonanzspektroskopie Zirkulardichroismus
9 Sekundärstruktur Chou-Fasman Methode Garnier-Osguthorpe-Robson Methode (GOR) Profile Network Prediction Heidelberg (PHD) Tertiärstruktur Homologiesuche Threading De novo/ab initio Strukturvorhersage
10 Warum nicht alle Proteinstrukturen bestimmen? Aufwand bis zu 1Jahr (je Protein) Teuer Sehr viele bekannte Sequenzen Wenig bekannte Strukturen
11 Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR)
12 Fourier Transform Infrared Spectroscopy Prinzip: Absorption von IR Strahlung Änderung Schwingungsverhalten IR-Signale Symmetrische Streckschwingung, Asymmetrische Streckschwingung, Biegeschwingung (von links nach rechts) Quelle:
13 Strahlungsquelle Zirkoniumoxid Keramikstrahler IR-Laser Probe Versuchsprobe Referenzprobe Lösungsmittel Tetrachlormethan Chloroform Versuchsaufbau stationärer Spiegel beweglicher Spiegel Lichtquelle Strahlungsteiler Probe Detektor Michelson-Interferometer, gezeichnet nach: Richter G. Praktische Biochemie. Thieme ISBN: Quelle:
14 Röntgenkristallographie Kernspinresonanzspektroskopie Zirkulardichroismus
15 Wichtigstes Verfahren 88,6% der PDB Einträge Prinzip: Proteinkristall wird bestrahlt Extrem kurzwellige Röntgenstrahlen Bestimmung der Anordnung über Beugungsmuster Beugungsmuster Quelle:
16 Problem: Protein muss als Einkristall vorliegen Prinzip der Erzeugung : Gesättigte Lösung wird zur Übersättigung gebracht Kristallisationskeime werden gebildet Proteinmoleküle lagern an Großer Kristall entsteht (0,1-0,5mm) Achtung! Kristallisation kann (kleine)änderungen in der Struktur bewirken Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines Kristalls. Quelle (Abbildung): Löffler G, Petrides P. Biochemie und Pathochemie. Springer Verlag ISBN:
17 Problem: Im Normalfall fällt das Protein aus Lösung: Variation der Lösungsbedingungen Lösungsbedingungen u.a.: Zeitablauf Zugesetzte Salze Puffersubstanzen PH-Wert Temperatur Kristallisationsroboter probieren viele (vorgegebene) Variationen aus es wird eine große Menge des Proteins gebraucht
18 λ = 0,03-0,5 nm Kristall schockgefroren (-174 C) Kristall wird gedreht (0,02-0,1 /min) Aufnahme 1-2 Generator Blende Kristall Interaktion mit Elektronen Beugung und Streuung Interferenzen Röntgenstrahl Röntgenstrukturanalyse, gezeichnet nach Richter G. Praktische Biochemie. Thieme ISBN: Detektor
19 Phasenproblem Kristall in Lösung inkubieren Wieder bestrahlen Ableitung der Elektronendichteverteilung SIR Elektronendichte MIR Elektronendichte Beugungsmuster [1] Elektronendichteverteilung [2] [1] [2] Kendrew et al. Structure of Myoglobin A Three Dimensional Fourier Synthesis. Nature 1960; 185(4711);pp
20 Auflösung abhängig von Zahl der Beugungsintensitäten in Fourier- Synthese Auflösungen 0,5nm 0,2nm Atomare Auflösung 0,1nm Softwaregestützte kristallographische Verfeinerung Tertiärstruktur von Myoglobin [1] [1] Kendrew et al. Structure of Myoglobin A Three Dimensional Fourier Synthesis. Nature 1960; 185(4711);pp
21 Röntgenkristallographie Kernspinresonanzspektroskopie Zirkulardichroismus
22 Meisten Atome besitzen Kernspin Ausrichtung im Magnetfeld: parallel antiparallel 2D-Verfahren für Proteine COSY (Correlated Spectroscopy) NOESY (Nuclear Overhauser and Exchange Spectroscopy)
23 Max. ca. 30kDa Löslich Stabil bei Raumtemperatur Mittelung aus mehreren Modellen Qualitative Überprüfung notwendig
24 Correlated Spectroscopy 2 Anregungsimpulse Korrelationen in Mischzeit Fouriertransformation -> 1D Spektrum Verschiedene Δt Max. 10kDa
25 Nuclear Overhauser and Exchange Spectroscopy Kern-Overhauser-Effekt Resonanzfrequenzen bei Übertragung der Magnetisierung Max. 10kDa
26 Röntgenkristallographie Kernspinresonanzspektroskopie Zirkulardichroismus
27 Circulardichroismus (CD) Spektroskopie mit polarisiertem Licht Interaktion von L-/R-polarisiertem Licht mit chiralen Zentren -> Elliptisch polarisiertes Licht Geringe Messwerte -> empfindliche Messgeräte
28 Monochromator Polarisator Elektrooptischer Lichtquelle Modulator Detektor a b c d Probe Zirkulardichroismus schematisch, gezeichnet nach Richter G. Praktische Biochemie. Thieme ISBN: a) Monochromatisches Licht b) Linear polarisiertes Licht c) Alternierend rechts und links polarisiertes Licht d) Elliptisch Polarisiertes Licht
29 Chou-Fasman Methode Garnier-Osguthorpe-Robson Methode (GOR) Profile Network Prediction Heidelberg (PHD)
30 Publiziert 1950 von Peter Chou und Gerald Fasman Basiert auf Analyse von 15 Proteinen Bestimmung der Konformationsparameter Entwicklung Regelsatz (1974) Erweiterung der Basis auf 28 Proteine (1978)
31 Suche einen Cluster von 4 Aminosäuren aus H α oder h α unter jeweils 6 aufeinanderfolgenden Residuen und erweitere diese nach beiden Seiten hin, bis der mittlere Score <P> für ein Tetrapeptid unter den Wert 1.03 fällt Vorhersagewahrscheinlichkeit: 55-60% Zuordnung der einzelnen Aminosäuren, Chou and Fasman 1974
32 Chou-Fasman Methode Garnier-Osguthorpe-Robson Methode (GOR) Profile Network Prediction Heidelberg (PHD)
33 Garnier-Osguthorpe-Robson Methode (1978) 17 AS Fenster Einschränkungen: α-helizes min. Länge = 4 AS β-faltblätter min. Länge 2 AS
34 GOR I : 26 Proteine, 4500 Residuen GOR II: 75 Proteine, Residuen GOR III: inkl. Paare GOR IV: 267 Proteine, Residuen GOR V: inkl. evolutionäre Informationen Vorhersagegenauigkeit: 73,5% (GOR V)
35 Chou-Fasman Methode Garnier-Osguthorpe-Robson Methode (GOR) Profile Network Prediction Heidelberg (PHD)
36 Profile Network Prediction Heidelberg Neuronales Netz (NN) 2x hintereinander NN Jeweils ein Hidden Layer Vorgeschaltet: multiple Alignment Nachgeschaltet: Mittelwertbildner
37 PSI-Blast Suche Sequenzalignment mit MAXHOM Ermittlung signifikanter Treffer Extraktion lokaler und globaler Parameter
38 Vorkommen der 20 Aminosäuren Anzahl Deletions (Nd) Anzahl Insertions (Ni) Konserviertheit (Cw) Übergabe erfolgt residuenweise Blöcke von 13 Residuen Mittleres wird ausgewertet
39 Quelle: Merkal R, Waak S. Bioinformatik Interaktiv. Wiley-VCH Verlag ISBN
40 Homologiesuche Threading De novo/ab initio Strukturvorhersage
41 Synonym: comparative modeling Struktur von ~65000 Proteinen bestimmt(pdb) Voraussetzung: ähnliche Sequenz (>30%) Ähnliches Protein als Vorlage Genauigkeit abhängig von Übereinstimmung Vergleich Modprob > 2,9Mio Proteinstruktur Abhängigkeit der Sequenzübereinstimmung und Strukturgenauigkeit Quelle: Bujnicki J. Practical Bioinformatics. Springer ISBN:
42 1. Nehme Sequenz, suche bekannte Proteine 2. Finde beste Sequenz 3. Nehme dessen Peptidrückgrat als Basis 4. Fülle Lücken 5. Ergänze Seitenketten 6. Optimiere Anordnung der Seitenketten 7. Energie- oder wissensbasierte Optimierung
43 Workflow von Mod-Pipe Quelle: Bujnicki J. Practical Bioinformatics. Springer ISBN:
44 Homologiesuche Threading De novo/ab initio Strukturvorhersage
45 Grundidee kleine Zahl an natürlich vorkommenden Proteinstrukturen Es gibt ein Mittel über eine Sequenz, welches Auskunft über die Faltung gibt Kein ausgefeiltes Atommodell Vorhersage Faltungsstruktur Entfernte Homologien bestimmbar
46 kleine Zahl an natürlich vorkommenden Proteinstrukturen Begrenzte Anzahl an Möglichkeiten wenn nur 2 unterschiedliche Grundtypen 6 mögliche Faltungsblöcke Hydrophobe Helix / Faltblatt Hydrophile Helix / Faltblatt Amphipathische Helix /Faltblatt
47 Es gibt ein Mittel über eine Sequenz, welches Auskunft über die Faltung gibt Aminosäuren neigen zu bestimmten Strukturen Proteine unempfindliche auf Ersetzung einzelner Aminosäuren Verschiedene Aminosäurenpaare können ähnliche Interaktionen, Kontaktenergie und Packdichte haben Mittel über paarweisen Kontakt beeinflusst Positionierung
48 (1) Bekannte Strukturen liefern Schablone (2) Threading (einfädeln) der Sequenz (3) Finden der verschiedenen Möglichkeiten (4) Bewertungsfunktion
49 Homologiesuche Threading De novo/ab initio Strukturvorhersage
50 Ab initio = von Anfang an De Novo = von Neuem Idee: Primärstruktur bestimmt Tertiärstruktur Wissensbasiert oder nicht wissensbasiert Nicht wissensbasiert Berechnung Atomkräfte Finden der min. Energie
51 Berechnung der freien Energie Atomkräfte (Fokus): Van der Waalskräfte Wasserstoffbindung Elektrostatische Kräfte mit hoher Wirkungsweite Bewertung - Unterscheidung Rosetta all-atom refinement
52 Verschiedene Vorgehensweisen Hohe Ähnlichkeit zu bekannten Templates Mittlere Ähnlichkeit zu bekannten Templates Niedrige Ähnlichkeit zu bekannten Templates Keine Ähnlichkeit zu bekannten Templates
53 Proteinvorhersage Wettbewerb Nicht veröffentlichte Proteine Vorhersage Strukturbestimmung Vergleich Berechnung/Bestimmung
54 Rosetta u.a.: Anthrax Alzheimer Malaria Prostatakrebs Berechnet Mutationen ein
55 Verfahren zur Bestimmung teuer und langwierig Homologiesuche erfolgsversprechender je mehr Proteine bestimmt wurden Ab intio/de Novo vielversprechende Ansätze Entwicklung der De Novo/ab initio Vorhersage noch am Beginn
56 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
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