Quantikine IVD ELISA. Human Epo Immunoassay Kurzfassung der Arbeitsanleitung. Katalognummer DEP00

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1 Quantikine IVD ELISA Human Epo Immunoassay Kurzfassung der Arbeitsanleitung Katalognummer DEP00 Diese Kurzfassung der Arbeitsanleitung enthält das Assay-Protokoll und muß vor Gebrauch dieses Produktes vollständig gelesen werden. Die Leistungscharakteristika, eine Literaturliste sowie das Protokoll in Englisch finden Sie in der Hauptarbeitsanleitung. DE IVD ZUR IN-VITRO DIAGNOSTIK HERGESTELLT UND VERTRIEBEN VON: USA & Canada R&D Systems, Inc. 614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, USA TEL: (612) FAX: (612) EC REP VERTRIEBEN VON: UK & Europe R&D Systems Europe, Ltd. 19 Barton Lane, Abingdon Science Park, Abingdon OX14 3NB, UK TEL: +44 (0) FAX: +44 (0)

2 INHALTSVERZEICHNIS INHALT SEITE INHALT DES KITS...2 LAGERUNG...2 WARNUNGEN/VORSICHTSMAßNAHMEN...3 ANZEICHEN VON INSTABILITÄT ODER QUALITÄTSVERLUST...3 WEITERE BENÖTIGTE GERÄTE UND REAGENZIEN...4 MIKROTITERPLATTEN-READER...4 EINSCHRÄNKUNGEN...4 SAMMELN DER PROBEN UND LAGERUNG...5 REAGENZIENVORBEREITUNG...5 BESCHREIBUNG DER ARBEITSSCHRITTE...6 PLATTENLAYOUT...7 AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE...8 REPRÄSENTATIVE ERGEBNISSE FÜR DIE STANDARDKURVEN...8 VERDÜNNUNG VON PROBEN MIT HOHER EPO KONZENTRATION...9 QUALITÄTSKONTROLLE...9 PROBLEMLÖSUNGEN ZU ERWARTENDE ERGEBNISSE BESTIMMUNGSGEMÄßE ANWENDUNGEN Enzymgekoppelter Immunoassay (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA) für die quantitative Bestimmung von Erythropoietin (Epo) Konzentrationen in Humanserum und plasma zur Unterstützung in der Diagnose der Anämie und der Polyzythämie. ASSAY-PRINZIP Der Quantikine IVD Epo ELISA basiert auf der Doppel-Antikörper Sandwich Methode. Mikrotiterplatten- Vertiefungen, die mit Epo-spezifischem monoklonalem Antikörper aus der Maus vorbeschichtet wurden, werden mit Probenmaterial oder Standard inkubiert. Erythropoietin bindet an den immobilisierten Antikörper auf der Platte. Nach Entfernen von überschüssigem Probenmaterial oder Standard werden die Vertiefungen mit einem Epo-spezifischem polyklonalem Antikörper aus Kaninchen, der an Meerettichperoxidase gebunden ist, inkubiert. Während dieser zweiten Inkubationsphase bindet das Konjugat aus Antikörper und Enzym an das immobilisierte Epo. Überschüssiges Konjugat wird durch Waschen entfernt. Ein Chromogen wird in die Vertiefungen gegeben, und dort durch das Enzym unter Bildung eines blauen Farbkomplexes oxidiert. Diese Reaktion wird durch die Zugabe von Säure gestoppt, und bewirkt einen Farbumschlag von blau nach gelb. Die Intensität der Färbung ist direkt proportional zur Epo konzentration in der Probe oder Standard. Die Absorbenz dieses Komplexes wird gemessen, und eine Standardkurve wird erstellt indem man die Absorptionswerte der Standard konzentrationen gegen die Konzentration des Epostandards auftraegt. Die Epokonzentrationen der unbekannten Proben werden durch Vergleich ihrer optischen Dichte mit denen der Standardkurve bestimmt. Die im Assay verwendeten Standards sind rekombinantes humanes Epo und gegen die Second International Reference Preparation (67/343), eine aus Urin stammende Form des humanen Erythropoietins, kalibriert. 1

3 INHALT DES KITS SORB CONJ CAL 0 CAL 2.5 CAL 5 CAL 20 CAL 50 CAL 100 CAL 200 DIL AS DIL SPE BUF WASH 25X SUBS A SUBS B SOLN STOP LAGERUNG Erythropoietin Mikrotiterplatte (Part ) - Polystyrol Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (12 Streifen mit 8 Vertiefungen), beschichtet mit monoklonalem Maus- Antikörper spezifisch für humanes Erythropoietin Erythropoietin-Konjugat (Part ) - 21,5 ml polyklonaler Kaninchenantikörper spezifisch für humanes Erythropoietin, gebunden an Meerrettichperoxidase (enthält Konservierungsmittel. Erythropoietin 0.0 miu/ml Standard (Part ) - 2,1 ml eines auf Proteinen basierenden Puffers mit Konservierungsmittel. Erythropoietin 2.5 miu/ml Standard (Part ) - 2,1 ml von rekombinantem Epo in einem auf Proteinen basierenden Puffer mit Konservierungsmittel. Erythropoietin 5.0 miu/ml Standard (Part ) - 2,1 ml von rekombinantem Epo in einem auf Proteinen basierenden Puffer mit Konservierungsmittel. Erythropoietin 20.0 miu/ml Standard (Part ) - 2,1 ml von rekombinantem Epo in einem auf Proteinen basierenden Puffer mit Konservierungsmittel. Erythropoietin 50.0 miu/ml Standard (Part ) - 2,1 ml von rekombinantem Epo in einem auf Proteinen basierenden Puffer mit Konservierungsmittel. Erythropoietin miu/ml Standard (Part ) - 2,1 ml von rekombinantem Epo in einem auf Proteinen basierenden Puffer mit Konservierungsmittel. Erythropoietin miu/ml Standard (Part ) - 2,1 ml von rekombinantem Epo in einem auf Proteinen basierenden Puffer mit Konservierungsmittel. Erythropoietin Assay-Verdünnungspuffer (Part ) - 11 ml eines auf Proteinen basierenden Puffers mit Konservierungsmittel Natriumazid Proben-Verdünnungspuffer (Part ) - 26 ml eines proteinstabilisierten Puffers mit Konservierungsmittel. Erythropoietin Waschpufferkonzentrat (Part ) ml eines 25fachen Konzentrats mit Konservierungsmittel. Farbreagenz A (Part ) -12 ml Farbreagenz A (0,01 N gepuffertes Wasserstoffperoxid) Farbreagenz B (Part ) - 12 ml Farbreagenz B (0,35 g/l TMB) Stoplösung (Part ) - 11 ml 2 N Schwefelsäure. Achtung: ätzende Substanz; es wird empfohlen, Augen, Hände, Gesicht und Kleidung zu schützen Abdeckfolien - 4 selbstklebende Folienstreifen Ungeöffneter Kit Geöffnetes Kit/ Verdünnte Reagenzien Lagerung bei 2-8 C. Nicht nach Verfallsdatum gebrauchen. Verdünnter Waschpuffer Stoplösung Proben-Verdünnungspuffer Assay-Verdünnungspuffer Konjugat Ungemischtes Farbreagenz A Ungemischtes Farbreagenz B Standards (0,0-200 mlu/ml) Mikrotiterplatten-Vertiefungen Kann bei Raumtemperatur (20-25 C) bis zum Verfallsdatum gelagert werden. Können bei 2-8 C bis zum Verfallsdatum gelagert werden. Legen Sie die nicht gebrauchten Streifen zurück in den Trockenmittel enthaltenden Folienbeutel, und versiegeln Sie entlang des ganzen Klebesiegels. Kann bei 2-8 C bis zum Verfallsdatum gelagert werden. 2

4 WARNUNGEN/VORSICHTSMAßNAHMEN Zur in-vitro Diagnostik Benutzen Sie den Kit nicht mehr nach dem Verfallsdatum. Für optimale Resultate sollte jedes Labor seine spezifische Assay-Methode etablieren (Laborbankoder Schüttler-Protokoll) und jeden weiteren Assay nach dieser Methode durchführen. Um Variationen innerhalb des Assays zu minimieren wird empfohlen, den Assay innerhalb von 15 Minuten zu pipettieren. Ersetzen Sie in keinem Fall Reagenzien dieses Kits durch solche anderer Chargen oder fremder Kits. Setzen Sie die Reagenzien während der Lagerung und Inkubationen keinem starken Licht aus. Vermeiden Sie Kontakt zwischen Reagenzien und oxidierenden Stoffen sowie Metallen. Bei Kontakt mit Natriumazid verliert das Konjugat seine Aktivität. Nicht mit dem Mund pipettieren. Vermeiden Sie den Verzehr von Nahrungsmitteln und das Rauchen während der Handhabung mit Kitreagenzien und Probenmaterial. Vermeiden Sie den Kontakt von Haut und Schleimhäuten mit Kitreagenzien oder Probenmaterial. Bei Kontakt von Farbreagenzlösungen oder Stoplösung (2 N Schwefelsäure!!) mit Haut oder Augen muss unverzüglich mit reichlich Wasser gewaschen werden. Kontaktieren Sie anschließend einen Arzt. Behandeln Sie Serum und Materialien die mit dem Serum in Kontakt kommen, in Übereinstimmung mit den CLSI-Richtlinien zur Vermeidung der Übertragung von Krankheitserregern aus dem Blut während Laborarbeiten. Andere Inkubationszeiten und Temperaturen als die in dieser Anleitung angegeben, können zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Kontaminierung von Kitreagenzien kann zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Verwenden Sie, wenn möglich, Einwegpipetten, -spitzen und-behälter zur Vorbereitung und Lagerung der Reagenzien. Glasgeräte sollten gänzlich mit 1 N Schwefel-oder Salzsäure und anschließend mindestens dreimal mit destilliertem Wasser gespült werden. Weder Säure-noch Detergenzienreste sollten auf der Glasoberfläche verbleiben. Verwenden Sie Polypropylen-oder hochdichte Polyethylen (HDPE) Teströhrchen zur Probenverdünnung. Verwenden Sie keine Glasröhrchen. Einige Komponenten dieses Kits enthalten Natriumazid, das mit Blei oder Kupfer hochexplosive Metallazide bilden kann. Spülen Sie mit viel Wasser bei deren Beseitigung nach. ANZEICHEN VON INSTABILITÄT ODER QUALITÄTSVERLUST Die Substratlösungen sollten vor und nach der Vermischung farblos sein. Niederschläge in den Reagenzlösungen sind in der Regel Anzeichen für Instabilität oder Qualitätsverlust. Sollten irgendwelche Anzeichen für Instabilität oder Qualitätsverlust beobachtet werden, oder der Korrelationskoeffizient der Standardkurve kleiner als 0,95 sein, bewahren sie die fragwürdigen Reagenzien bei 2-8 C auf und kontaktieren Sie R&D Systems GmbH unter

5 WEITERE BENÖTIGTE GERÄTE UND REAGENZIEN Pipetten und Pipettenspitzen Horizontal umlaufender Rotationsmischer (Umlauf 0,3 cm), einstellbar auf 500 ± 50 U/min (erforderlich für das Schüttler-Protokoll) 4 Liter und 100 ml Messzylinder Mehrkanalpipette, Waschflasche, Mehrfachspender oder Mikrotiterplattenwaschautomat Papiertücher oder Ähnliches zum Ausklopfen der Vertiefungen Mikrotiterplatten-Reader, einstellbar auf eine Absorbanz von 450 nm und eine Korrekturwellenlänge von 600 nm Immunoassay-Reagenzienwanne Deionisiertes oder destilliertes Wasser Software für 4PL Kurven an passung Erythropoietin Serumkontrolle(n), z.b. Quantikine IVD Human Serum Control 1 und 2, sowie 3 (erhältlich bei R&D Systems, Kat.-Nr. CEP01 bzw. CEP03) oder gleichwertige Kontrollen MIKROTITERPLATTEN-READER Die Assay-Ergebnisse werden spektrometrisch bei 450 nm mit einem Mikrotiterplatten- Reader bestimmt. Für genauere Ergebnisse sollte eine Korrekturwellenlänge von 600 nm berücksichtigt werden, die optische Ungenauigkeiten in der Polystyrol-Mikrotiterplatte ausgleicht (540 nm, 570 nm und 650 nm sind ebenso möglich). Geräte ohne Korrekturfilter können mit der Einschränkung benutzt werden das die Assay-Genauigkeit leidet. Ein Mikrotiterplatten-Reader mit einem Bereich von 0 bis 3 O.D. und einer Genauigkeit von ± 0,005 O.D. ist erforderlich. Mikrotiterplatten-Reader mit einem Bereich von 0 bis 3 O.D. können verwendet werden, schränken aber den Messbereich des Assays ein. EINSCHRÄNKUNGEN Die Ergebnisse dieses Assays sollten in Verbindung mit Ergebnissen klinischer Beobachtungen und diagnostischer Anwendungen interpretiert werden. Es wurden keine Interferenztests mit Medikamenten vorgenommen. Sobald Probenkonzentrationen oberhalb des höchsten Standardwertes liegen, sollten sie mit Proben-Verdünnungspuffer verdünnt and anschließend noch einmal gemessen werden. Jede Veränderung, sei es beim durchführenden Laboranten, bei der Pipettiertechnik, Waschtechnik, Inkubationszeit oder Temperatur, sowie bei fortschreitendem Alter des Kits, hat Variationen im Bindungsverhalten zur Folge. 4

6 SAMMELN DER PROBEN UND LAGERUNG Serum - Verwenden Sie einen Serumseparator [serum separator] oder ein gerinnungsröhrchen [clot tube] und ermöglichen Sie der Probe bei Raumtemperatur (20-25 C) zu koagulieren. Zentrifugieren Sie bei 760 x g (1 x g = 1,118 x 10-5 (Radius[cm])(U/min) 2 ) und Raumtemperatur 15 Minuten innerhalb von 30 Minuten nach Probengewinnung, um eine Hämolyse zu vermeiden. Aliquotieren Sie bei Bedarf und lagern Sie die Proben in sterilen Teströhrchen bei 2-8 C bis zu 7 Tage oder bei weniger als -10 C unbegrenzt in einem nicht selbstenteisenden Gefrierschrank. Vermeiden Sie wiederholte Auftau-Einfrier-Zyklen. Plasma - Sammeln Sie Plasma unter Verwendung von EDTA als Antikoagulanz. Zentrifugieren Sie bei 760 x g und Raumtemperatur 15 Minuten lang innerhalb von 30 Minuten nac Probengewimn. Aliquotieren Sie bei Bedarf und lagern Sie die Proben in sterilen Teströhrchen bei 2-8 C bis zu 7 Tage oder bei weniger als -10 C unbegrenzt in einem nicht selbstenteisenden Gefrierschrank. Vermeiden Sie wiederholte Auftau-Einfrier-Zyklen. Es wird empfohlen, daß jedes Labor den Assay entweder mit Serum-oder EDTA Plasma-Proben standardisiert. Lipämische, hämolysierte oder kontaminierte Proben können ungenaue Ergebnisse ergeben und sollten nicht mit dieser Anleitung getestet werden. Weiterhin sind keine Medikamente bezüglich Interferenzen im Assay getestet worden. Siehe auch CLSI Guideline: Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens (CLSI Document H18; Aktuelle revision). REAGENZIENVORBEREITUNG Bringen Sie vor Gebrauch alle Reagenzien auf Raumtemperatur (20-25 C). Waschpuffer (1X) - Kristalle im Konzentrat können durch Erwärmung auf Raumtemperatur und vorsichtiges Schütteln wieder aufgelöst werden. Verdünnen Sie 100 ml Waschpufferkonzentrat mit 2400 ml deionisiertem oder destilliertem Wasser zur Herstellung von 2500 ml Waschpuffer (1X). Substratlösung - Die Farbreagenzien A und B werden zu gleichen Teilen zusammengegeben und müssen innerhalb von 15 Minuten verwendet werden. Pro Vertiefung werden 200 µl benötigt. Verwerfen Sie nichtgebrauchte fertige Substratlösung. Anzahl der benötigten Vertiefungen für den Assay HERSTELLUNG DER SUBSTRATLÖSUNG JE NACH ASSAYGRÖßE Volumen Farbreagenz A Volumen Farbreagenz B ml 11 ml 48 6 ml 6 ml 32 4 ml 4 ml 5

7 BESCHREIBUNG DER ARBEITSSCHRITTE Alle Reagenzien und Proben vor Gebrauch auf Raumtemperatur (20-25 C) erwärmen lassen. Es wird empfohlen, alle Proben und Standards als Doppelbestimmungen zu messen. Laborbank-und Schüttler-Protokolle werden mitgeliefert. Der vollständige Assay muss nach demselben Protokoll durchgeführt werden. 1. Alle Reagenzien wie beschrieben vorbereiten. 2. Nichtbenötigte Streifen der Mikrotiterplatte aus dem Plattenrahmen nehmen, und zusammen mit dem Kieselgel-Säckchen wieder im Folienbeutel verpacken und verschließen ml Epo Assay-Verdünnungspuffer in jede Vertiefung pipettieren. 4. Je 100 ml Standard, Kontrolle oder Probe in die jeweiligen Vertiefungen pipettieren. Vorsichtig für 1 Minute an den Plattenrahmen klopfen um sicherzustellen, dass der Inhalt der Vertiefungen durchmischt wurde. Platte mit der mitgelieferten selbstklebenden Folie verschliessen. Ein Platten-Layout mit einem Beispiel für Standards, Kontrollen und Proben ist auf Seite 20 beschrieben. Für Laborbank-Protokoll: 2 Stunden (± 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Für Schüttler-Protokoll: 1 Stunde (± 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einem horizontalen Rotationsmischer (Umlauf 0,3 cm) bei 500 ± 100 U/min inkubieren. 5. Den Inhalt der Vertiefungen gründlich absaugen bzw, die Platte umgekehrt auf einem Papiertuch kräftig ausklopfen. Nicht waschen. 6. In jede Vertiefung 200 ml Epo7-Konjugat pipettieren. Mit einer neuen selbsthaftenden Folie verschließen. Für Laborbank-Protokoll: 2 Stunden ± 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Für Schüttler-Protokoll: 1 Stunde ± 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einem horizontalen Rotationsmischer inkubieren. 7. Inhalt der Vertiefungen entleeren und waschen. Den Waschvorgang dreimal wiederholen, also insgesamt viermal waschen. Beim Waschen mit Spritzflasche, Mehrfachspender oder Plattenwaschautomat jede Vertiefung mit Waschpuffer auffüllen (400 ml). Um gute Ergebnisse zu erzielen, ist es sehr wichtig, die Flüssigkeit bei jedem Schritt vollständig zu entfernen. Um alle Reste von Waschpuffer zu entfernen, nach dem letzten Waschschritt den restlichen Waschpuffer absaugen oder die Platte umdrehen und auf einem Papiertuch Kröftig ausklopfen ml Substratlösung in jede Vertiefung pipettieren (Anmerkung: Substratlösung muss innerhalb von 15 Minuten nach dem Ansetzen verwendet werden) Minuten bei Raumtemperatur auf der Laborbank inkubieren ml Stoplösung in jede Vertiefung pipettieren, dabei in derselben Reihenfolge vorgehen wie bei der Substratzugabe. Ist der Farbumschlag nicht gleichmäßig, kann die Platte zum Mischen leicht gerüttelt werden. 10. Innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stoplösung die optische Dichte aller Vertiefungen mit einem Mikrotiterplatten-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmen. Wenn möglich, die Korrektur-Wellenlänge auf 600 nm einstellen. Ist das Gerät nicht mit einer Wellenlängen-Korrekturfunktion ausgestattet, müssen die Messwerte bei 600 nm von denen bei 450 nm abgezogen werden. Dies dient zum Ausgleich optischer Fehler der Mikrotitierplatte. Bestimmung der Absorption bei 450 nm ohne Korrektur führt zu höheren und weniger genauen Messwerten. 6

8 PLATTENLAYOUT Musterdiagramm für Standards, Kontrollen und Proben (S...) 7

9 AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Bestimmen Sie die Absorption jeder Vertiefung mit einem Mikrotiterplatten-Reader bei 450 nm als primäre Wellenlänge und bei 600 nm als Korrekturwellenlänge (540, 570 oder 650 nm sind ebenso möglich). Berechnen Sie den Absorptionsmittelwert der Doppelbestimmungen für jede Standardkonzentration, Kontrolle und Probe und subtrahieren Sie von diesen Mittelwerten den Absorptionsmittelwert des Leerwertes. Berechnen Sie eine Standardkurve durch Datenreduzierung mittels der 4 PL-Kurvenanpassung. Alternativ ist eine Auftragung der mittleren optischen Dichte jedes Standards auf der y-achse gegen die Konzentrationen auf der x-achse zur Ermittlung der Standardkurve und anschließender Anpassung möglich. Die Daten können ebenso durch doppelt-logarithmisches Auftragen linearisiert und die Standardkurve anschließend durch lineare Regression bestimmt werden. Diese Methode erzeugt akzeptable aber weniger präzise Ergebnisse als die vorher beschriebenen Methoden. Dokumentieren Sie die Werte für alle Proben, die innerhalb des Messbereichs von 2,5 bis 200 miu/ ml des Assays liegen. Für Proben, die oberhalb dieses Bereichs liegen, verfahren Sie wie im "Abschnitt Verdünnung von Proben mit hoher Epo Konzentration" beschrieben. Werte unterhalb dieses Bereichs sollten als nicht detektierbar oder < 2,5 miu/ml interpretiert werden. REPRÄSENTATIVE ERGEBNISSE FÜR DIE STANDARDKURVEN Diese Standardkurven werden zu Demonstrationszwecken zur Verfügung gestellt und sollten in keinem Fall als Ersatz für eigene Standardkurven verwendet werden. Eine entsprechende Standardkurve muß für jede Messung eines Probensatzes neu bestimmt werden. LABORBANK-PROTOKOLL LABORBANK-PROTOKOLL Optische Dichte Erythropoietin (miu/ml) (miu/ml) O.D. Mittelwert Korrigiert 0 0, ,074 0,073 2,5 0,106 2,5 0,108 0,107 0, , ,146 0,145 0, , ,353 0,348 0, , ,746 0,744 0, , ,340 1,319 1, , ,463 2,414 2,341 SCHÜTTLER-PROTOKOLL Optische Dichte Erythropoietin (miu/ml) SCHÜTTLER-PROTOKOLL (miu/ml) O.D. Mittelwert Korrigiert 0 0, ,047 0,046 2,5 0,070 2,5 0,076 0,073 0, , ,108 0,108 0, , ,263 0,263 0, , ,608 0,602 0, , ,098 1,090 1, , ,136 2,072 2,026 8

10 VERDÜNNUNG VON PROBEN MIT HOHER EPO KONZENTRATION Liegen Serum-oder Plasmaproben oberhalb einer Konzentration von 200 mlu/ml, verdünnen Sie mit Proben-Verdünnungspuffer. Zum Beispiel: Für Proben mit Epo-Konzentrationen zwischen 200 miu/ml und 2000 miu/ml ist eine 10fache Verdünnung notwendig. Verdünnen Sie dazu 25 ml der Probe mit 225 µl des Proben- Verdünnungspuffers. Für Proben mit Epo-Konzentrationen oberhalb 2000 miu/ml ist eine höhere Verdünnung notwendig, um die Epo-Konzentrationen in den Konzentrationsbereich der Standardkurve zu bringen (d.h. 20fache, 40fache und höhere Verdünnungen) Anmerkung: Verwenden Sie bitte Polypropylen-oder hochdichte Polyethylen (HDPE)- Teströhrchen für die Verdünnung der Proben. Verwenden Sie in keinem Fall Glasröhrchen. Der Gebrauch von Glasröhrchen verursacht fehlerhafte Ergebnisse, da Epo an Glas haftet! Zur Berechnung der Epo-Konzentration in verdűnnten Serum-oder Plasmaproben müßen die ermittelten Werte mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert werden. QUALITÄTSKONTROLLE Jedes Labor sollte ein eigenes Qualitätskontrollprogramm zur Handhabung des Quantikine IVD Epo Immunoassays entwickeln. Als Teil dieses Programmes sollten Kontrollen mit bekannten Epo-Konzentrationen (erhältlich bei R&D Systems) in jedem Assay mitgemessen werden. R&D Systems empfiehlt pro Assay mindestens zwei dieser Kontrollen, mit zulaufen verläßliche Durchführung des Assays zu gewährleisten. Um die von Tag zu Tag variierenden Assayergebnisse zu validieren ist es empfehlenswert, jeweils eine Kontrolle mit unteren bis mittleren Normalwerten einzuschliessen, sowie eine Kontrolle die im mittleren Konzentrationsbereich der Standardkurve liegt. Eine Kontrolle kann auch im unteren Bereich der Standardkurve mitgeführt werden, um auch in diesem Bereich eine verläßliche Assaydurchführung zu etablieren. Liegen die erhaltenen Werte nicht innerhalb des etablierten Bereichs, können die Assayergebnisse fehlerhaft sein. Die Ergebnisse eines einzelnen Assays sind verlässlich, wenn die Kontrollwerte innerhalb veröffentlichter Bereiche einer kommerziell erhältlichen Kontrolle oder des etablierten Bereichs einer hausinternen Kontrolle liegen. Der Korrelationskoeffizient der angepaßten Standardkurve sollte 0,95 sein. 9

11 PROBLEMLÖSUNGEN Im Allgemeinen sind Assayprobleme auf technische Anwendungsfehler, sowie auf Probleme mit den Reagenzien und Geräten zurueckzu führen. Sollte ein Assay misslingen, überprüfen Sie bitte die Verfallsdaten der einzelnen Reagenzien und versichern Sie sich, dass alle Reagenzien wie auf den Etiketten vorgeschrieben gelagert worden sind. Beachten Sie bitte auch den Abschnitt "Anzeichen von Instabilität oder Verschlechterung". Wenn die Assayqualität fragwürdig sein sollte oder Probleme während der Durchführung auftreten sollten, können Sie zur Eingrenzung des Problems folgende Tabelle zu Hilfe nehmen. PROBLEM MÖGLICHE URSACHE TEST ODER ABHILFE Hohe Standardabweichung (%) (große Variabilität der Doppelmessungen im Vergleich zu den laborindividuellen Anforderung an deren Präzision) Unvollständiges Waschen der Vertiefungen Nicht ausreichendes Entfernen der Waschlösung aus den Vertiefungen Unvollständiges Mischen der Farbreagenz A u. B Rotationsmischer spritzt Material aus den Vertiefungen auf die Plattenabdeckfolie Unterschiedliche Volumenzugaben in die Vertiefungen Checken sie das einwandfreie Arbeiten des wasch automaten Vertiefungen sollen nach Entfernen der Waschlösung "trocken" erscheinen Kalibrieren Sie den Schüttler auf 500 ± 50 U/m Stellen Sie Sicher das Pipetten kalibriert oind und einwandfrei arbeiten Kalibrieren Sie den Rotationsmischer auf 500 ± 50 U/m Reduziertes niedriges Delta (< 0,015 O.D.) oder starker Hintergrund Schlechte Korrelation der Standardkurve (r < 0,95) Nicht ausreichende Farbentwicklung Material spritzt aus den Vertiefungen auf die Plattenabdeckfolie Unvollständiges Waschen der Vertiefungen Nicht ausreichendes Entfernen der Waschlösung aus den Vertiefungen Unterschiedliche Volumenzugaben in die Vertiefungen Farbreagenzien A und B wurden zu früh gemischt Pipettierfehler Nicht ausreichendes Entfernen der Waschlösung aus den Vertiefungen Unterschiedliche Volumenzugaben in die Vertiefungen Inkorrekte Inkubationszeiten oder Temperaturen Fehlfunktion von Konjugat oder Substratlösung Rotationsmischer zu hock eingestellt Stellen Sie sicher, daß der Waschautomat ein wandfrei arbeitet Vertiefungen sollten nach Entfernen der Waschlösung "trocken" erscheinen Stellen Sie sicher, daß die Pipetten sauber und kalibriert sind Substratlösungen dürfen frühestens 15 min vor Gebrauch gemischt werden Berücksichtigen Sie nach individuellen Laborprozeduren erstellte Daten Vertiefungen sollten nach Entfernen der Waschlösung "trocken" erscheinen Stellen Sie sicher, dass die Pipetten sauber und kalibriert sind Halten Sie sich an vorgegebene Inkubationszeiten und Temperaturen Mischen Sie gleiche Volumina von Farbreagenz A, Farbreagenz B und Epo- Konjugat. Die Farbentwicklung sollte sofort eintreten Kalibrieren Sie den Rotationsmischer auf 500 ± 50 U/min 10

12 ZU ERWARTENDE ERGEBNISSE Normalbereich Die Normalbereiche für Serum und EDTA-Plasma wurden mit einem Quantikine IVD Epo ELISA bestimmt. Erythropoietin Konzentrationen wurden bei 123 gesunden Probanden aus dem Gebiet Minneapolis/St.Paul, Minnesota, USA bestimmt. Unter Anwendung der nichtparametrischen Methode zur Analyse von Referenzwerten, beschrieben in der NCCLS Veröffentlichung "How to define, determine, and utilize Reference Intervals in the Clinical Labaratory" (NCCLS Dokument C28-P; Vol. 12, No. 2), wurden die folgenden Referenzbereiche (2,5 bis 97,5 Perzentile) für Epo in Serum und Plasma bestimmt. Jedes Labor sollte jedoch seinen eigenen Normalbereich etablieren. 24 Verteilung der Normalwerte (n=123) 20 Serum Plasma Epo Normalbereiche Serum EDTA plasma 3,3-16,6 miu/ml 3,1-14,9 miu/ml Frequenz Erythropoietin Konzentration (miu/ml) Assoziierte Erkrankungen Patienten, die an Polycythaemia rubra vera leiden, können Epo Konzentrationen innerhalb des Normalbereiches aufweisen, während solche, die an sekundärer Polyzythämie leiden, erhöhte Werte an Serum Epo aufweisen. Polycythaemia rubra vera-patienten, die sich einer Phlebotomie unterzogen haben, weisen ebenso erhöhte Serum Epo Konzentrationen auf. Patienten, die an den häufigsten Anämieformen leiden, liegen mit höheren Werten außerhalb des Normalbereiches, wohingegen Patienten, die an Anämie in Verbindung mit chronischer Niereninsuffizienz leiden Werte aufzeigen, die im Normalbereich dieses Assays liegen. Anämische Patienten, die Bluttransfusionen erhalten, können niedrigere Werte als erwartet zeigen. Ungewöhnlich hohe Konzentrationen von Serum Epo können auch in diversen anderen pathologischen Zuständen beobachtet werden, eingeschlossen renale Neoplasmen, gutartige Tumore, polyzystische Nierenerkrankungen, Nierenzysten und Hydronephrosen. Die Ergebnisse dieses Assays sollten in Verbindung mit Informationen aus klinischen Daten und anderen diagnostischen Anwendungen betrachtet werden / R&D Systems, Inc.