Differentielle Expression von mirnas im peripheren Vollblut bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle

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1 Differentielle Expression von mirnas im peripheren Vollblut bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle aus der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgische Klinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. Dr. Dr. h. c. F. W. Neukam der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med. dent. vorgelegt von Rita Kintopp aus Erlangen

2 2 Als Dissertation genehmigt von der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 24. April 2014 Vorsitzender des Promotionsorgans: Gutachter/in: Prof. Dr. med. Dr. h. c. J. Schüttler Prof. Dr. med. Dr. med. dent. E. Nkenke PD. Dr. med. Dr. med. dent. F. Stelzle

3 3 Für meine Eltern, in Dankbarkeit und Liebe.

4 4 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Material und Methoden Ergebnisse Praktische Schlussfolgerung Abstract Background and Aims Materials and Methods Results Practical Conclusion Einleitung Das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle MicroRNA (mirna) Ziel der Arbeit Material und Methoden Patientenkollektiv Patientendaten Kontrollproben Blutprobengewinn RNA-Isolation und Qualitätskontrolle mirna Expressionsanalyse Reverse Transkription der mirna Quantitative Real-Time PCR (RT-qPCR) Statistische Auswertung Primer miscript PCR System Ergebnisse mirna Expression im Vollblut bei Patienten mit PECM Abhängigkeit der mirna Expression von klinischen Tumorparametern Tumorklassifizierung Graduierung Lymphknotenstatus Zusammenfassung Expressionsanalyse Diskussion... 45

5 5 8 Literaturverzeichnis Anhang Abkürzungsverzeichnis Herstellerverzeichnis Danksagung Lebenslauf... 63

6 6 1 Zusammenfassung 1.1 Hintergrund und Ziele MicroRNAs (mirnas) sind kleine, nicht-kodierende RNAs, die eine entscheidende Rolle in der posttranskriptionalen Genregulation spielen. Veränderungen in ihrer Expression sind an der Entstehung und der Progression vieler Tumorentitäten beteiligt. Deregulierte mirnas findet man in den Zellen verschiedener Malignome, wie zum Beispiel des Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle (PECM). Auf Grund ihrer hohen Stabilität können mirnas nicht nur im Gewebe, sondern auch im peripheren Blut nachgewiesen werden und bieten somit die Möglichkeit eines minimalinvasiven Verfahrens der Tumordiagnostik, basierend auf Vollblut. Ziel der Arbeit war es, die Bedeutung von im peripheren Vollblut zirkulierenden mirnas als diagnostische Biomarker für das Erkennen von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle zu prüfen, und somit ein minimalinvasives Verfahren zum Nachweis zu etablieren. 1.2 Material und Methoden Es wurden Proben peripheren Vollblutes von zwei Patientengruppen gewonnen. Gruppe 1 (Testgruppe) bestehend aus 44 Patienten mit einem histologisch gesicherten Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle und Gruppe 2 (Kontrollgruppe) bestehend aus 31 gesunden Freiwilligen. Beide Gruppen wurden hinsichtlich der Expression von mir-186, mir-494, mir-3162, mir und mir-let7d untersucht und anschließend die Expressionsraten verglichen. Zunächst wurde Gesamt-RNA einschließlich mirna aus den Vollblutproben isoliert und anschließend mittels reverser Transkription (RT) zu cdna umgeschrieben. Die mirna Expression wurde mittels der quantitativen Real-Time PCR (RT-qPCR) analysiert und anhand der CT Methode untersucht. Die gewonnenen Daten wurden statistisch ausgewertet. Die Grenze der statistischen Signifikanz liegt bei p<0,05.

7 7 1.3 Ergebnisse Die Testgruppe zeigt hinsichtlich der mirna Konzentrationen im Vollblut eine signifikant veränderte Expressionsrate der mirnas 186 (P=0,012), 494 (P=0,001) und 3651 (P=0,0001). MiR-186 zeigt bei Patienten mit Plattenepithelkazinom der Mundhöhle im Vergleich zur Kontrollgruppe eine erniedrigte Expressionsrate. MiR-494 und MiR-3651 zeigen bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle eine erhöhte Expressionsrate gegenüber der Kontrollgruppe. 1.4 Praktische Schlussfolgerung MiR-186, mir-494 und mir-3651 werden im Vollblut von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle im Vergleich zur Kontrollgruppe in signifikant unterschiedlichem Ausmaß exprimiert und eignen sich somit für den Nachweis dieser Erkrankung. Der wesentliche Vorteil dieser Methode im Vergleich zur Gewinnung einer Biopsie ist, dass die Blutentnahme eine geringere Invasivität aufweist. Dadurch ergibt sich auch ein zukünftiges Potential als minimal-invasive Screening-Methode für das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle

8 8 2 Abstract 2.1 Background and Aims MicroRNAs are small non-coding RNAs which play an important role in posttranscriptional gene regulation. Changes in their expression are often a reason for the development and progression of different malignancies. Deregulated mirnas are found in tissue of different malignant tumors such as oral squamous cell carcinoma (OSCC). Due to their high stability it is also possible to detect micrornas in whole blood. Therefore they might serve as promising minimally invasive biomarkers for the detection of oral squamous cell carcinoma. This study aimed at evaluating the significance of mirnas circulating in peripheral whole blood as diagnostic biomarkers in patients suffering from oral squamous cell carcinoma and consequently to establish a minimally invasive method for the diagnosis of OSSC. 2.2 Materials and Methods Blood samples from two patient groups were taken. Group 1 (test group) include 44 patients with histologically confirmed oral squamous cell carcinoma and Group 2 (control group) inclose 31 healthy study volunteers. Both groups were tested for expression levels of mirnas. Firstly whole RNA containing mirna was isolated from the blood samples. Subsequently mirna was translated into cdna by reverse transcription (RT). The mirna expression rate was analyzed on the basis of the semiquantitative Real-Time PCR (RTqPCR) and determined by CT method. Moreover the expression level of mir-186, mir-494, mir-3162, mir-3651 and mir-let7d was compared between both groups. The gained data were statistically evaluated by t-test using the significance level of p< Results With regard to the mirna expression the test group showed a significantly abberant expression rate of mir-186 (P=0.012), mir-494 (P=0.001) and mir-3651 (P=0.0001). The mirna expression could be ascertained to be downregulated for mir-186 and upregulated for mir-494 and mir-3651.

9 9 These mirnas are differentially regulated in whole blood samples from patients suffering from oral squamous cell carcinoma and are suitable as diagnostic biomarkers for a minimally invasive method to detect OSSC. 2.4 Practical Conclusion MiR-186, mir-494 and mir-3651 are differentially regulated in whole blood samples from patients suffering from oral squamous cell carcinoma in comparison with healthy volunteers. Therefore they are suitable for the detection of malignancy. The aberrant expression level of mir-186, mir-494 and mir in whole blood samples of oral squamous cell carcinoma patients could give a possibility to set up a minimally invasive screening method for OSSC.

10 10 3 Einleitung 3.1 Das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle Das Plattenepithelkarzinom ist das am häufigsten auftretende Malignom in der Mundhöhle. [11] Zusammen stehen das orale und pharyngeale Plattenepithelkarzinom im Kopf- und Halsbereich, an sechster Stelle der am häufigsten auftretenden malignen Neoplasien weltweit. [63] In Mitteleuropa haben Palttenepithelkarzinome einen Anteil von 3-5% an allen malignen Tumorentitäten. [25] Trotz der Anwendung multimodaler Therapiekonzepte und der stetigen Verbesserung in der Behandlung, beläuft sich die 5- Jahresüberlebensrate durchschnittlich auf ca. 50%. Somit hat das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle eine schlechte Prognose. [2, 34, 52] Die Ätiologie ist bis heute nicht vollständig geklärt. Zu den wesentlichen Faktoren, die eine Dysplasie des Plattenepithels begünstigen können, zählen Nikotin- und Alkoholabusus, chronisch mechanische Reize, mangelnde Mundhygiene, supprimierte Immunabwehr und HPV-Infektionen. [3, 5, 35, 56, 57] Der Behandlungserfolg ist erheblich vom Zeitpunkt der Erstdiagnose und dem damit verbundenen Therapiebeginn abhängig. Erfolgt eine Therapie in einem späteren Stadium, beträgt die mittlere 5- Jahresüberlebensrate ca. 30%. Wird das Plattenepithelkarzinom hingegen in einem frühen Stadium erkannt und die Therapie frühzeitig eingeleitet, steigt die 5- Jahresüberlebensrate auf einen Wert von 80%. Aus den genannten Daten wird ersichtlich, dass die Früherkennung von malignen Neoplasien der Mundschleimhaut eine entscheidende Rolle für die Heilungschancen und die Überlebensrate der Patienten spielt und von höchster klinischer Relevanz ist. [1, 2, 16, 19, 25, 27, 34, 38, 46] Ein weiterer Grund für die abnehmende Überlebensrate, neben einer späten Diagnosestellung, könnte eine inadäquate TNM-Klassifizierung sein. [24] Somit ist es schwierig ein adäquates Therapiekonzept individuell für den Patienten festzulegen, da wichtige prognostische Parameter fehlen. [24, 26] Des Weiteren gibt es eine hohe Inzidenz an lokalen Rezidiven, verursacht durch okkulte Tumorzellen im Randbereich von PECM. [2] Außerdem ist das orale Plattenepithelkarzinom für Feldkanzerisierung bekannt, was zum Auftreten

11 11 von lokalen Zweittumoren führen kann. [60] In all diesen Situationen könnte die durch Tumormarker bedingte Früherkennung und damit frühzeitige Therapie die Überlebensrate verbessern. Deshalb ist es notwendig neue Methoden, welche das maligne Potential von oralen Läsionen beurteilen und genauere Vorhersagen über deren Prognose ermöglichen, zu entwickeln. [1, 2, 16, 19, 25, 27, 34, 38, 46] Für diesen Zweck werden hoch sensitive und hoch spezifische Tumormarker benötigt, anhand derer effektive Diagnosetechniken etabliert werden könnten. [15, 54, 55, 62, 69, 73] Die differentielle Expression von Tumormarkern in malignen Zellen steht oftmals in Verbindung mit der Tumorgenese und dem klinischen Verlauf. [4, 17, 53, 64] Deshalb versucht man Gene zu identifizieren, welche als Biomarker für die Früherkennung von Malignomen genutzt werden können. [15, 55, 62, 69, 73] In dieser Studie sollte nicht nur geprüft werden, ob mirnas minimal-invasiv im peripheren Vollblut von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle nachgewiesen werden können und somit einen geeigneten diagnostischen Marker darstellen, sondern auch, ob diese bereits im Frühstadium der Erkrankung eine signifikant veränderte Expression im Blut aufweisen. Neben der histopathologischen Untersuchung, spielt die molekularbiologische Diagnostik eine wichtige Rolle. Durch den molekularbiologischen Nachweis von tumorspezifischen Markern, nicht nur im Gewebe, sondern ebenfalls im Blut wäre eine Objektivierung der Ergebnisse möglich. Die abweichende mirna Expression im Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle, im Vergleich zum gesunden Gewebe, wurde bereits nachgewiesen, diese veränderte Expression im Vergleich zur gesunden Mundschleimhaut könnte ein geeigneter Marker für die frühzeitige Diagnose sein. [17, 53] Es sollte geprüft werden, ob die in malignem Gewebe spezifischen Marker auch im peripheren Vollblut nachgewiesen werden können und somit die Diagnose eines PECM zulassen. Darauf basierend könnte ein minimal-invasives Verfahren zur Diagnostik des PECM etabliert werden.

12 MicroRNA (mirna) MicroRNAs sind eine Gruppe von kleinen, endogenen, nicht-codierenden, Nukleotide langen, einzelsträngigen RNAs. Sie regeln auf posttranskriptionaler Ebene die Genexpression und sind an der Regulation verschiedenster biologischer Zellprozesse, wie dem Zellzyklus, der Zelldifferenzierung und der Apoptose beteiligt. [64, 66] MiRNAs werden in verschiedensten Tumoren, einschließlich des Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle differentiell exprimiert. [7, 8, 18] Diese Abweichungen in der Expression, sind an der Entstehung und der Progression vieler Tumorentitäten beteiligt. [4, 64] Deregulierte mirnas nehmen Einfluss auf physiologische, biologische Zellabläufe und führen somit zur Transformation und Progression von malignen Veränderungen. [66] Es wurden bereits Unterschiede des mirna Expressionsprofils bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereichs im Vergleich zu Gesunden beschrieben. [8, 9, 17, 18, 33, 44, 58, 66, 65] Weiterhin wurde gezeigt, dass bei Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs ein Zusammenhang der mirna Expression mit klinischen Tumorparametern, dem Lymphknotenstatus und der Überlebensrate besteht. [29, 30] Leider stellen Kopf-Hals-Tumore eine sehr heterogene Gruppe dar, welche neben Tumoren der Mundhöhle auch Tumore der Nasenhöhle, des Pharynx und des Larynx beinhaltet. [9, 17, 33, 44] Die Tumorlokalisation hat jedoch einen großen Einfluss auf die Biologie des Plattenepithelkarzinoms und somit unterscheidet sich das orale Plattenepithelkarzinom signifikant von anderen. [33] Demzufolge unterscheidet sich die mirna Expression je nach Lokalisation des Tumors [33] Es gibt bis jetzt nur eine geringe Anzahl von Studien, die ausschließlich das mirna Expressionsprofil beim Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle untersuchen. Somit ist erst wenig darüber bekannt. Neueste Studien beschrieben bereits eine Änderung der mirna Expression in malignem Gewebe, wie des des Plattenepithelkarzinoms des Mundhöhle, im Vergleich zu gesundem Gewebe. [17, 66] Expressionsprofile mehrerer mirnas liegen bis jetzt nur im Gewebe vor. Es wurde bereits gezeigt, dass im Blut und im Gewebe unterschiedliche tumorassoziierte mirnas exprimiert werden. [30, 31, 40, 48]

13 13 Jedoch gibt es über Untersuchungen von peripherem Blut bei Patienten mit Malignom erst wenige Studien, und keine beschreibt ausschließlich die mirna Expression im Blut von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle. [40, 41, 42, 47, 65, 68] Es gibt bereits Berichte über einzelne, differentiell exprimierte mirnas im Plasma und Serum von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle. [30, 31, 40, 48] Der Nachweis der Veränderung der mirna Expression in malignen Zellen hat hohes Potenzial für neue Durchbrüche in Diagnostik, Prognostik und Therapie des PECM in naher Zukunft. [66] MicroRNAs könnten ein hilfreicher Marker für die frühzeitige Diagnose des Vorliegens eines oralen Plattenepithelkarzinoms sein. Mit ihrer Hilfe könnten prognostische Aussagen getroffen und neue Therapiemethoden etabliert werden. [17] In neuesten Studien zeigt sich bereits, dass das humane Serum eine wichtige Ressource für die Identifikation neuer Biomarker, wie mirnas, die für die klinische Diagnostik eine entscheidende Rolle spielen, darstellt. [64] Es sollte untersucht werden, ob der Nachweis einer veränderten Expressionsrate von mirnas nicht nur in malignem Gewebe, sondern auch im peripheren Blut von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle möglich ist. Somit könnte ein minimal-invasives Verfahren etabliert werden, welches für diagnostische und prognostische Anwendungen eingesetzt werden kann. Die Ergebnisse dieser Studie könnten neue, hoch potente Biomarker, welche im humanen Blut nachweisbar sind identifizieren. Es würden neue Durchbrüche in Diagnostik, Therapie, Prognostik und klinischem Monitoring des Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle mittels minimal-invasiver Methoden ermöglicht. [64]

14 14 4 Ziel der Arbeit Ziel der Studie ist es zu prüfen, ob durch Bestimmung und Vergleich der Expressionsmuster von mirnas im peripheren Vollblut von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle gegenüber gesunden Freiwilligen, bestimmte differenzielle Expressionsprofile zwischen den beiden Gruppen identifiziert werden können, welche den Nachweis des Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle zulassen. Es soll überprüft werden, ob die untersuchten mirnas im Vollblut von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle und gesunden Freiwilligen differentiell exprimiert werden, und somit eine Unterscheidung zwischen diesen beiden Gruppen möglich ist. Gleichzeitig soll geprüft werden, ob eine minimal-invasive Methode etabliert werden könnte, die auf der Identifizierung eines Expressionsmusters von mirnas im peripheren Vollblut basiert und eine zulässige Diagnostik für das Vorhandensein eines Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle erlaubt. Die Hypothesen des Projekts lauten wie folgt: Patienten, die an einem Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle leiden, zeigen im peripherem Blut ein spezifisches Muster differentiell exprimierter mirnas, über welche sie identifiziert werden können, Wenn differentiell exprimierte mirnas im Blut vorliegen, ist ein Plattenepithelkarzinom vorhanden. So soll ein minimal-invasives Verfahren, basierend auf peripherem Vollblut, zur Diagnostik und dem klinischen Monitoring von Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle entwickelt werden. Es ist anzunehmen, dass der Nachweis von differentiell regulierten mirna Expressionsmustern im Vollblut die Diagnostik, die Erstellung von Prognosen und die Therapie des Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle in Zukunft erleichtern wird.

15 15 5 Material und Methoden 5.1 Patientenkollektiv Für die mirna Expressionsanalyse im peripheren Venenblut gingen in die Studie Blutproben von 75 Personen ein. Die Proben wurden im Zeitraum zwischen 05/10 und 07/11 auf Station 1 und 2 der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgischen Klinik des Universitätsklinikums Erlangen-Nürnberg gesammelt. Das gesamte Patientenkollektiv lässt sich in zwei Gruppen unterteilen, welche in Tabelle 1 zusammengefasst sind. Gruppe Krankheitsbild Probenanzahl 1 Plattenepithelkarzinom 44 der Mundhöhle 2 gesund 31 Tabelle 1: Gruppen des Patientenkollektivs Gruppe 1 bestehend aus insgesamt 44 Patienten, bei denen in den Jahren 2010 und 2011 ein Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle diagnostiziert wurde. Gruppe 2 setzt sich aus 35 gesunden, freiwilligen Personen zusammen, welche in ihrer Krankengeschichte keinerlei pathologische Veränderungen der Mundschleimhaut aufwiesen. Diese Gruppe diente als Kontrollgruppe. Beide Gruppen wurden mittels der quantitativen Real-Time PCR anhand der CT-Methode hinsichtlich der mirna Expression untersucht. 5.2 Patientendaten Von allen Patienten wurden Informationen über Alter, Geschelcht und klinische Tumordaten gesammelt. Die Tumorklassifikation (TNM- Klassifikation), nach Tumorgröße, regionärem Lymphknotenstatus und Metastasierung erfolgte nach den Richtlinien der International Union against Cancer durch einen unabhängigen Pathologen. Der regionäre Lymphknotenstatus wurde in N0, kein Befall regionärer Lymphknoten, und N+, regionäre Lymphknotenmetastasen vorhanden, unterteilt. Des Weiteren

16 16 erfolgte eine Tumorgraduierung nach zunehmender Malignität (G1, G2, und G3) und die Einteilung in klinische Tumorstadien (l-lv) anhand der Tumorgröße, nach Vorgaben der WHO. Alle Tumoren der Stadien l-ll wurden als early und alle der Stadien lll-lv als late unterteilt. Alle Proben wurden durch den Pathologen klassifiziert. Bei allen Patienten aus Gruppe 1 erfolgten vor der Blutentnahme weder eine Radio-, noch eine Chemotherapie. Die Freiwilligen aus Gruppe 2 wurden von einem Mediziner zuvor als gesund klassifiziert. Bei der Auswahl der Proben wurde auf eine möglichst gleiche Verteilung der demographischen Patientendaten in beiden Gruppen geachtet. Tabelle 2 und 3 zeigen die relevanten demographischen Daten aller Probanden, die in die mirna Studien eingegangenen sind. Demographische Daten Durchschnittsalter (Jahre) 60,2±21,2 Altersspanne (Jahre) Geschlecht männlich (n) 21 (67, 7%) weibllich (n) 10 (32, 3%) Tabelle 2: Demographische Daten der gesunden Probanden (n=31)

17 17 Demographische Daten Durchschnittsalter (Jahre) 63,8±10,8 Altersspanne (Jahre) Geschlecht männlich (n) 30 (68, 2%) weiblich (n) 14 (31, 8%) Tumorgröße T1-2 (n) 24 (54, 5%) T3-4 (n) 20 (45, 5%) Lymphknotenstatus N0 (n) 28 (63,6%) N+ (n) 16 (36, 4%) Grading G1 (n) 7 (15, 9%) G2 (n) 27 (61, 4%) G3 (n) 10 (22, 7%) Staging Early (n) 24 (54, 5%) Late (n) 20 (45, 5%) Tabelle 3: Klinische und demographische Daten der Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle (n=44) 5.3 Kontrollproben Bei der relativen Quantifizierung der mirna wurden SNORD 44 und RNU6-2 als endogene Kontrollen für die Normalisierung der isolierten Proben eingesetzt. Dies diente der Überprüfung der Qualität des RNA-Template und zum Ausschluss von falsch-negativen Ergebnissen, die auf Grund der RNA- Integrität, RNA-Konzentration oder einer fehlenden Amplifikationsreaktion bei der PCR auftreten können.

18 18 Leerproben des Mastermix mit RNase freiem AD, an Stelle des RNA- Template dienten als Negativkontrolle. Zudem wurden die Proben der gesunden Freiwilligen aus Gruppe 2 als negative Kontrollgruppe verwendet. Die Kontrollproben wurden bei jeder Amplifikation mitgeführt. 5.4 Blutprobengewinn Von jedem Probanden wurde mit Hilfe des BD Vacutainer Safety-Lok TM Blood Collection Set je 2x2, 5 ml peripheres Venenblut aus der Ellenbeuge abgenommen und in je einer PAXgene TM Blood RNA Tube, nach Angaben des Herstellers, gesammelt. Das humane Vollblut wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend bis zur RNA-Isolation bei -80 Grad Celsius eingefroren. 5.5 RNA-Isolation und Qualitätskontrolle Zur molekularbiologischen Untersuchung wurde zuerst Gesamt-RNA aus dem humanen Vollblut isoliert. Die RNA-Isolation erfolgte mittels des PAXgene TM Blood mirna Kit, nach Angaben des Herstellers. Durch das speziell entwickelte Reinigungsverfahren ist es möglich die in der Gesamt- RNA enthaltene mirna mit zu isolieren. Die Qualität und Quantität der isolierten RNA jeder Probe wurde mittels des NanoDrop TM 3.3 ND-1000 Spektralphotometers und der dazugehörigen ND V3.7.1 Software, nach Angaben laut Hersteller überprüft. Die RNA- Konzentration wird in ng/µl angegeben. Für weitere Versuche muss die RNA Konzentration mindestens 50 ng/µl betragen. Anschließend wird die RNA bei -80 Grad Celsius eingefroren. 5.6 mirna Expressionsanalyse Für die Expressionsanalyse der mirnas im peripheren Vollblut bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle wurde zunächst von der Firma Febit Biomed (Heidelberg, Deutschland), mittels Mikroarrayanalyse der zuvor isolierten mirna ein mirna-profiling von je 20 Blutproben aus Gruppe 1 und 20 Blutproben aus Gruppe 2, zur Ermittlung deregulierter mirnas mit statistischer Relevanz, durchgeführt. Anhand der Mikroarrayanalyse wurde ein Expressionsprofil von 1205 humanen und 144 viralen mirnas im

19 19 peripheren Vollblut von 20 Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle und 20 gesunden Probanden erstellt und deren Abundanz in den zwei Gruppen verglichen. Die Mikroarrayanalyse ergab, dass bei Berücksichtigung der statistischen Signifikanzen und der absoluten Veränderungen der Expressionsraten insgesamt 21 mirnas in den zwei Gruppen differentiell reguliert sind. Von diesen mirnas treten 12 vermehrt und 9 vermindert im Blut von Patienten auf. An Hand eines Vulcano-Plots (logodd vs. log fold change) wurden die statistisch relevantesten mirnas nochmals verifiziert. Dabei waren im Vollblut bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle die mirnas 186, 494, 3162, 3651 und let7d am stärksten dereguliert und wiesen statistisch signifikante Expressionsunterschiede auf. Diese mirnas wurden in der folgenden Arbeit weiter untersucht. Die Validierung der im Mikroarray ermittelten Ergebnisse erfolgte mittels RTqPCR an einem gesamten Patientenkollektiv bestehend aus 75 Proben, unterteilt in Gruppe 1 (krank) und Gruppe 2 (gesund). Für den Nachweis von differentiell exprimierten mirnas wurde das mirna Script PCR System der Firma Qiagen nach den Angaben des Herstellers verwendet. Zunächst wurde die aus den Blutproben isolierte Gesamt-RNA mittels RT-PCR, durch das miscript ll RT Kit, zu cdna umgeschrieben. Diese diente als Template für die anschließende RT-qPCR, zum quantitativen und sensitiven Nachweis der Expression von mirna 186, 494, 3162, 3651, let7d und der endogenen Kontrollgene RNU6-2 und SNORD44. Die Real-Time PCR (RT-qPCR) wurde mittels des miscript Primer Assays und des miscript SYBR Green PCR Kit durchgeführt. Mit Hilfe der mirna-spezifischen Primer des miscript Primer Assays und der im miscript SYBR Green PCR Kit enthaltenen miscript Universal Primer der Firma Qiagen (Informationen siehe Abschnitt ) ist der hochsensitive und quantitative Nachweis von spezifischen mirnas mittels CT-Methode möglich. Im Anschluss an die Real-Time PCR wird das Dissoziationsanalyseprogramm gestartet, um spezifische von unspezifischen Produkten unterscheiden zu können und dadurch die Qualität der Ergebnisse zu validieren. Anschließend wurden die erhaltenen Messwerte normalisiert und statistisch ausgewertet.

20 Reverse Transkription der mirna Die reverse Transkription der zuvor aus den Blutproben isolierten Gesamt- RNA wurden mittels des miscript ll RT Kits, laut Angaben des Herstellers durchgeführt. Die dadurch generierte cdna diente als Template für den hoch spezifischen und hoch sensitiven mirna-nachweis durch anschließende Untersuchung in der quantitativen Real-Time PCR anhand der CT- Methode. Der miscript ll RT Kit enthält miscript Reverse Transcriptase Mix, 10x mi- Script Nucleics Mix, 5x miscript HiSpec Buffer, and 5x miscript HiFlex Buffer. Der miscript Nucleics Mix enthält alle für die Reaktion benötigten Komponenten und Primer, wie dntps, ratp, oligo-dt Primer, und eine interne, synthetische RNA Kontrolle, die mirna reverse Transkriptase Kontrolle, die die RT-PCR steuert. Die reverse Transkription mittels miscript HiSpec Puffer sichert das selektive Umschreiben von Ziel-miRNAs der miscript PCR Kontrolle in cdna. Die mirnas werden mittels der im HiFlex Puffer enthaltenen Poly(A)polymerase durch oligo-dt Primer polyadenyliert und durch reverse Transkription in cdna umgeschrieben. Dies geschieht parallel im selben Reaktionsgefäß. Die Verwendung des miscript Primer Assays in Kombination mit dem miscript SYBR Green PCR Kit, ermöglicht eine sensitive und spezifische quantitative mirna-analyse mittels RT-qPCR. Die Polyadenylierung sichert, dass keine genomische DNA erfasst wird. Zunächst werden alle benötigten RNA-Proben, die Kit-Komponenten und das RNase-freie Wasser auf Eis aufgetaut und anschließend der Mastermix aus den Komponenten des miscript ll RT Kit angesetzt und gut gemischt. Der Mastermix enthält alle für die RT-PCR benötigten Komponenten, außer dem RNA-Template, das untersucht werden soll. Bei jedem Versuch wurde RNAse-freies Aqua dest. als Negativkontrolle des MM mit angesetzt. Tabelle 4 zeigt die Verhältnisse der einzelnen Komponenten des Mastermix, der zu jedem RNA-Template hinzu pipettiert wurde. Die Volumina entsprechen den Angaben für ein Template und wurden mit der zu behandelnden Templatezahl multipliziert.

21 21 Komponenten Volumen (µl) pro Reaktion Mastermix 5x miscript HiSpec Buffer 4 10x miscript Nucleics Mix 2 miscript Reverse Transcriptase Mix 2 RNase-free-water Variable zum Ausgleich des Endvolumens RNA-Template RNA-Template Volumen variabel enthält 0,5 µg RNA pro Reaktion Gesamtvolumen 20 Tabelle 4: Mastermix miscript ll RT Kit für ein Template Der Mastermix wurde für die Anzahl der umzuschreibenden RNA-Proben angesetzt. In Eppendorfcups wurde zunächst das entsprechende Volumen an RNAse-freiem Wasser pipettiert. Hinzu kam danach der MM und zum Schluss die entsprechende Menge an RNA-Template, sodass in jedem Eppendorfcup die gleiche Menge von 0,5 µg RNA enthalten war. Jedes Eppendorfcup wurde 2 Sekunden auf dem Vortex gemischt und anschließend 10 sek bei rpm zentrifugiert. Anschließend kamen die Proben in den Thermocycler (Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler) um die Reaktion durchzuführen. Tabelle 5 zeigt die einzelnen Schritte und dazugehörigen Temperaturen des Programms des miscript ll RT Kit für die reverse Transkription. Schritt Zeit Temperatur Reverse Transkription 50 min 37 ºC Initial PCR Activation/Extension 5 min 95 ºC Hold for ever 4 ºC Tabelle 5: Programm des miscript ll RT Kit im Thermocycler

22 22 Die cdna-präamplifikate wurden bei -20 C eingefroren. Für die weitere Analyse der Proben mittels RT-qPCR wurden alle zuvor umgeschriebenen Templates mit RNAse-freiem AD verdünnt. Dazu wurden in jedes Eppendorfcup, welches bei einem Volumen von 20 µl eine Menge von 0,5µg RNA enthält, nach der RT-PCR, je 200µl RNAse-freies AD pipettiert. Dies entspricht einer RNA Konzentration von 2,27 ng/µl Quantitative Real-Time PCR (RT-qPCR) Zum quantitativen und sensitiven Nachweis der Expression der mirnas mir- 186, mir-494, mir-3162, mir-3651, mir-let7d und der endogenen Kontrollgene SNORD44 und RNU6-2 wird im Anschluss an die reverse Transkription eine quantitative Real-Time PCR durchgeführt. Diese wird mittels des mirna-spezifischen miscript Primer Assay und dem miscript SYBR Green PCR-Kit, welches die miscript Universal Primer (reverse primer) und den QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix enthält, durchgeführt. Das miscript PCR System ermöglicht eine höchst effiziente Amplifikation und somit eine präzise Expressionsanalyse von multiplen mirnas mittels der CT-Methode. Somit ist nach Angaben des Produktherstellers der hochsensitive, quantitative Nachweis von spezifischen mirnas möglich. Im Anschluss an die Real-Time PCR wird die Dissoziation gestartet, um die spezifische Amplifikation und dadurch die Qualität der Ergebnisse bestätigen zu können. Der Power SYBR Green PCR Master Mix als eine für SYBR Green Reagent Reaktionen optimierte Mischung enthält SYBR Green I Dye, AmpliTaq Gold DNAPolymerase LD, dntps, Passive Referense und eine optimierte Puffer-Komponente. Tabelle 6 zeigt die Zusammensetzung des Mastermix nach Anleitung des Herstellers. Alle DNA-Templates aus der RT-PCR werden kurz vor dem Versuch mit RNAse freiem Wasser auf eine Konzentration von 2,27 ng/µl verdünnt. Die Herstellung des Mastermix erfolgt nach Anleitung des Herstellers (Qiagen, Hilden). Die Primer, die bei der Real-Time PCR zum Einsatz

23 23 kommen sind bereits vor Beginn des Versuchs auf eine bestimmte Konzentration (0.6µM) vorverdünnt und aliquotiert bei -20 C aufbewahrt worden. (Informationen über einzelnen Primer siehe Abschnitt ) Alle Ansätze werden als Duplices angesetzt. Komponenten Volumen (µl) pro Reaktion Mastermix 2x QuantiTectMM SYBR Green 12,5 10x miscript Universal Primer 2,5 10x miscript Primer Assay 2,5 Rnase-free water 6,3 Gesamtvolumen MM 23,8 Template 1,2 (entspricht 2,7 ng pro Reaktion) Gesamtvolumen 25 Tabelle 6: Mastermix miscript SYBR Green PCR Kit für eine Reaktion Für die fünf mirnas und zwei endogenen Kontrollen wurden insgesamt sieben unterschiedliche Mastermixe, mit den entsprechenden genspezifischen miscript Primern angesetzt. Alle Kit-Komponenten und benötigten Primer werden auf Eis aufgetaut und daraus der Mastermix für jedes Gen angesetzt und gut vermischt. Die in Tabelle 6 aufgelisteten Volumina entsprechen den Angaben für ein Template und wurden mit der zu behandelnden Templatezahl multipliziert. Um das Ergebnis der Amplifikationen zu verifizieren, wurde von jedem DNA-Template eine Doppelprobe, unter gleichen Bedingungen, pipettiert.

24 24 Abbildung 1 zeigt exemplarisch das Pipettierschema für eine Platte. Abbildung 1: Pipettierschema RT-qPCR Zunächst wird in jedes Well 1,2 µl DNA-Template, entsprechend 2,7 ng DNA pro Well pipettiert. In einer Spalte befindet sich jeweils dieselbe Probe an cdna-template. Da jeweils Doppelproben pipettiert wurden, befinden sich in Spalte 1 und 2 identische Proben. Wobei C (Cancer) exemplarisch für einen beliebigen Patienten aus Gruppe 1 und G (gesund) für einen Probanden aus Gruppe 2 steht. Bei jedem Versuch wurde RNAse-freies AD (neg) und MM ohne Template als Negativkontrolle mitgeführt um eventuelle Kontaminationen auszuschließen. Nachdem in jedes Well die entsprechenden cdna- Templates pipettiert waren erfolgte anschließend die Zugabe von 23,8 µl MM pro Well. Dabei entspricht jede Zeile dem Mastermix mit den spezifischen Primern für ein bestimmtes Gen. RNU6-2 und SNORD44 dienten als endogene Kontrollen. Nach der Applikation des Reaktionsansatzes in die einzelnen Wells der Platte, wird diese mit einer Folie dicht abgedeckt. Bevor sie im Thermocycler platziert wird, wird sie in der Zentrifuge für 10 Minuten bei rpm zentrifugiert, um die durch das pipettieren eventuell entstandenen Luftblasen zu beseitigen und eine ebenmäßige Oberfläche des Reaktionsgemisches für die photometrische Messung in der RT-qPCR zu schaffen. Das

25 25 Verlaufsprotokoll für die Real-Time PCR entspricht den Angaben des Herstellers. Der Programmverlauf ist in der Tabelle 7 aufgezeigt. Schritt Zeit Temperatur/Zyklen Initial PCR Activation 15 min 95 ºC 3-Schritt-Cycling 40 Zyklen Denaturierung 15 sek 94 ºC Annealing 30 sek 55 ºC Extension 34 sek 70 ºC Tabelle 7: Programm miscript SYBR Green RT-qPCR Im Anschluss an die Amplifikation durch die Real-Time PCR erfolgt die Dissoziationsanalyse, bei der sich das spezifische Produkt vom unspezifischen Produkt unterscheiden lässt. Die Dissoziationstemperatur der mirnas liegt bei ca. 84 C. Auf dieser Weise wird die Richtigkeit des Amplifikationsproduktes überprüft Statistische Auswertung Die 7300 Real-Time PCR Software liefert zu jedem Template einen CT-Wert. Die erhaltenen CT-Werte wurden aus dem 7300 Real Time PCR System ausgeladen und in Microsoft Exel 2010 eingeladen. Mittels Microsoft Exel wurden die CT-Werte errechnet. Dazu wurden die CT-Werte der endogenen Kontrollen für jedes Gen auf einer Platte entsprechend gemittelt und damit der CT-Wert für jedes Template errechnet. Die erhaltenen Daten wurden nach Genen geordnet, in einer Exeltabelle aufgelistet und anschließend mittels des IBM SPSS Statistics 19 Programms ausgewertet. Die Auswertung auf statistische Signifikanz der mirna Expression erfolgte durch explorative Datenanalyse mittels Tests auf Normalverteilung, dem T- Test/Welch-Test, Mann-Whitney-Test und der Varianzanalyse mittels ANOVA.

26 Primer miscript PCR System Die quantitative Real-Time PCR wird mittels des mirna-spezifischen miscript Primer Assay (forward primer) und dem miscript SYBR Green PCR Kit, welches die miscript Universal Primer (reverse primer) und den QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix enthält, durchgeführt MiScript Primer Assays sind mirna-spezifische Primer, die für humane mirna Amplifikation einsetzbar sind. Die miscript Primer Assays gehört zum miscript PCR System zum quantitativen Nachweis von mirna. Die Primer stammen aus den miscript Primer Assays der Firma Qiagen. Sie wurden laut Angaben des Herstellers mit RNAse-freiem AD gelöst, auf eine Konzentration von 0.6µM eingestellt, aliquotiert und bei -20 C aufbewahrt. Tabelle 8 zeigt eine Übersicht der mittels des miscript Primer Assay und der miscript Universal Primer amplifizierten mirnas Sanger ID Sanger Accession Sequence reference number (qiagen) Hsa-Let- 7d*-5p MI AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU MS Hsa-miR p MIMAT CAAAGAAUUCUCCUUUUGGGCU MS Hsa-miR MIMAT CAUAGCCCGGUCGCUGGUACAU GA MS Hsa-miR p MIMAT UUAGGGAGUAGAAGGGUGGGGA G MS Hsa- mir494- MIMAT AGGUUGUCCGUGUUGUCUUCUC MSC p RNU6-2 NR_ MS SNORD44 NR_ MS Tabelle 8: Liste des miscriptprimerassay (Quiagen, Hilden)

27 27 6 Ergebnisse Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mittels des Statistikprogramms IBM SPSS Statistics Standard 19 der IBM Deutschland GmbH aus den zuvor ermittelten CT-Werten. Dabei wurde für die Ermittlung der Signifikanz einer differentiellen Expression der T-Test/Welch-Test verwendet. Das Signifikanzniveau liegt bei p<0, mirna Expression im Vollblut bei Patienten mit PECM Die mirna Expressionsanalyse wurde bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle im Vergleich zu gesunden Probanden durchgeführt. Die ermittelten Expressionsraten wurden zwischen den beiden Gruppen verglichen, um eine Aussage darüber zu treffen, ob bei Gruppe 1 (krank) eine signifikante Änderung der Expression bestimmter mirnas im Vergleich zu Gruppe 2 (gesund) vorliegt. Tabelle 9 zeigt eine Übersicht der Gruppen. Häufigkeit Prozent Gültige Prozente Kumulierte Prozente Gültig krank 44 58,7 58,7 58,7 gesund 31 41,3 41,3 100,0 Gesamt ,0 100,0 Tabelle 9: Gruppen der mirna-expressionsanalyse Es wurde untersucht, ob die mirnas 186, 494, let7d, 3162 und 3651 in Gruppe 1 (krank) im Vergleich zu Gruppe 2 (gesund) differentiell exprimiert werden. Gruppe 1 beinhaltet 44 Patienten und Gruppe 2 beeinhaltet 31 Gesunde. In Abbildung 2 sind die beiden Gruppen graphisch dargestellt.

28 28 Abbildung 2: Graphische Darstellung der Gruppen Um eine Aussage darüber zu treffen ob eine signifikante Änderung der mirna Expression bestimmter mirnas zwischen den beiden Gruppen besteht wurden die Ergebnisse statistisch ausgewertet. Das Signifikanzniveau beträgt p<0,05. Zunächst wurde für die vorliegenden Daten ein Test auf Normalverteilung mittels Quantiplot durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 und 11 zusammengefasst.

29 29 Fälle Gültig Fehlend Gesamt Gruppe N Prozent N Prozent N Prozent mi494 krank 40 90,9% 4 9,1% ,0% gesund 26 83,9% 5 16,1% ,0% mi3651 krank 40 90,9% 4 9,1% ,0% gesund 26 83,9% 5 16,1% ,0% milet7d krank 40 90,9% 4 9,1% ,0% gesund 26 83,9% 5 16,1% ,0% mi186 krank 40 90,9% 4 9,1% ,0% gesund 26 83,9% 5 16,1% ,0% mi3162 krank 40 90,9% 4 9,1% ,0% gesund 26 83,9% 5 16,1% ,0% Tabelle 10: Verarbeitete Fälle Normalverteilung Kolmogorov-Smirnov a Shapiro-Wilk Gruppe Statistik df Signifikan z Statistik df Signifikan z mi494 krank,073 40,200 *,955 40,114 gesund,134 26,200 *,922 26,051 mi3651 krank,070 40,200 *,986 40,881 gesund,106 26,200 *,975 26,745 milet7d krank,080 40,200 *,989 40,962 gesund,101 26,200 *,961 26,421 mi186 krank,081 40,200 *,959 40,158 gesund,141 26,194,939 26,129 mi3162 krank,093 40,200 *,980 40,680 gesund,122 26,200 *,966 26,525 a. Signifikanzkorrektur nach Lilliefors *. Dies ist eine untere Grenze der echten Signifikanz. Tabelle 11: Test auf Normalverteilung

30 30 Abbildung 3: Q-Q-Diagramm von mi3651 für Gruppe 1 Abbildung 4: Q-Q-Diagramm von mi3651 für Gruppe 2 Die Ergebnisse des Tests auf Normalverteilung sind in Abbildung 3 und Abbildung 4 graphisch als Quantiplots dargestellt. Die Q-Q-Diagramme zeigen, dass die einzelnen Gene innerhalb der Gruppe annähernd auf einer Geraden liegen. Einzelne abweichende Messwerte sind zu vernachlässigen.

31 31 Somit liegt Normalverteilung vor. Exemplarisch für alle mirnas ist die Normalverteilung von mir-3651 für Gruppe 1 und Gruppe 2 dargestellt. Für den Vergleich zweier unabhängiger Stichproben bei denen Normalverteilung vorliegt wird die statistische Auswertung mittels T- Test/Welch-Test vorgenommen. In der nachfolgenden Tabellen 12 sind die Ergebnisse der Gruppenstatistik der verarbeiteten Fälle dargestellt. Tabelle 13 zeigt die Ergebnisse der statistischen Auswertung. Gruppe N Mittelwert Standardabweichung Standardfehler des Mittelwertes mi186 krank 44 14,0799 1,55816,23490 gesund 31 13,2617 1,17485,21101 mi3162 krank 42 11,3077 2,08040,32101 gesund 29 11,3586 2,09353,38876 milet7d krank 42 2,1598 1,03236,15930 gesund 27 1,9895,84809,16322 mi3651 krank 44,5873,81546,12293 gesund 31 1,5392,59200,10633 mi494 krank 44 5,5550 1,26953,19139 gesund 31 6,5792 1,34558,24167 Tabelle 12: Gruppenstatistik

32 32 Tabelle 13: T-Test für statistische Signifikanzen der mirna Expression in Gruppe 1 und Gruppe 2 Der Levene Test auf Varianzengleichheit liefert bei einer Signifikanz von p<0,05 für mirna 186 und 3651 ungleiche Varianzen. Für mirna 494, 3261 und let7d sind die Varianzen bei einer Signifikanz von p>0,05 gleich. Bei der

33 33 statistischen Signifikanz der mirna Expression zwischen den Gruppen des T-Tests muss die entsprechende Zeile berücksichtigt werden. Es zeigte sich in der statistischen Analyse mittels T-Test, dass die mirnas 186 (P=0,012), 494 (P=0,001) und 3651 (P=0,0001) bei Betrachtung der p- Werte eine statistisch signifikante (p<0,05) Änderung der Expression im peripheren Vollblut bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle aufweisen. Dies bedeutet mirna 186, 494 und 3651 sind im Blut von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle im Vergleich zum Blut von Gesunden differentiell reguliert. Bei Betrachtung der Boxplots in Abbildung 5-9 zeigt sich graphisch, dass unter Berücksichtigung der Median-Werte und der CT-Methode die mirnas mir-186, mir-494 und mir-3651 bei Patienten mit PECM im Vergleich zu gesunden Freiwilligen differentiell reguliert sind. Bei mir-let7d (P=0,477) und mir-3162 (P=0,920) konnte kein statistisch signifikanter Unterschied in der mirna Expression zwischen Gruppe 1 und Gruppe 2 festgestellt werden. Abbildung 5: Boxplot der mi186 Expression in Gruppe 1 und 2

34 34 Abbildung 6: Boxplot der mi3162 Expression in Gruppe 1 und 2 Abbildung 7: Boxplot der milet7d Expression in Gruppe 1 und 2

35 35 Abbildung 8: Boxplot der mi3651 Expression in Gruppe 1 und 2 Abbildung 9: Boxplots der mi494 Expression in Gruppe 1 und 2

36 36 Abbildung zeigen die ROC-Kurven der differentiell exprimierten mirnas. Der positive Ist-Zustand ist gesund. Größere Werte der Variablen für das Testergebnis deuten stärker auf einen positiven Ist-Zustand hin. Aus den Abbildungen ist zu erkennen, dass mirna-186 im Vollblut von Patienten mit PECM im Vergleich zu Gesunden herunter reguliert ist. MiRNA-494 und mirna-3651 sind hoch reguliert. Abbildung 10: ROC-Kurve mir186 Abbildung 11: ROC-Kurve mi3651

37 37 Abbildung 12: ROC-Kurve mi Abhängigkeit der mirna Expression von klinischen Tumorparametern Neben der Expressionsanalyse bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle im Vergleich zu Gesunden, wurde des weiteren untersucht, ob ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Expression der regulierten mirnas 186, 494 und 3651 im peripheren Vollblut und den klinischen und histopathologischen Tumorparametern, wie Klassifizierung, Lymphknotenstatus, und Graduierung besteht Tumorklassifizierung Tabelle 14 zeigt die Verteilung der Tumorklassifizierung innerhalb der Gruppe 1. Early bezeichnet Patienten, die ein Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle der Klassifizuerung T1 oder T2 aufwiesen, late bezeichnet Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle der Klassifizierung T3 oder T4. Somit wurde zwischen einem frühen und einem späten Tumorstadium unterschieden, um zu Untersuchen ob eine differentielle Expression zwischen der Klassifizierung vorliegt.

38 38 Gültige Häufigkeit Prozent Prozente Kumulierte Prozente Gültig early 24 54,5 54,5 54,5 late 20 45,5 45,5 100,0 Gesamt ,0 100,0 Tab. 14: Einteilung Patienten nach Klassifizierung Abb. 13: Graphische Darstellung der Klassifizierung Abbildung 13 stellt die Unterteilung der Patienten nochmals graphisch dar. Von den 44 Patienten aus Gruppe 1, die an einem Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle erkrankt sind werden 24 als early und 20 als late klassifiziert. Die statistische Auswertung erfolgte mittels des Mann-Whitney-Tests bei einem Signifikanzniveau von p<0,05. Für diesen statistischen Test ist keine Prüfung der Werte innerhalb der Gruppen auf Normalverteilung nötig, da er auch gültig ist, wenn keine Normalverteilung vorliegt. Die Ergebnisse der Expressionsanalyse sind in Tabelle 15 und 16 dargestellt.

39 39 Tab. 15: Mann-Whitney-Test für Klassifizierung Tab. 16: Mann-Whitney-Test für Klassifizierung Für die mirnas 186, 3651 und 494 konnte keine statistisch signifikant veränderte Expressionsrate zwischen der Tumorklassifizierung early und late gezeigt werden.

40 Graduierung Weiterhin wurde untersucht ob mirna 186, 494 und 3651 zwischen den Gruppen G1, G2 und G3 der Tumorgraduierung differentiell exprimiert werden. Tabelle 17 zeigt, dass von den 44 Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle aus Gruppe 1, sieben Patienten als G1, 27 Patienten als G2 und zehn Patienten als G3 klassifiziert wurden. In Abbildung 14 ist diese Verteilung nochmals graphisch dargestellt. Die statistische Auswertung erfolgte mittels der Anova für unabhängige Stichproben. Zunächt wurde überprüft ob innerhalb der Gruppen Normalverteilung vorliegt, da Normalverteilung vorlag, erfolgte die Analyse mittels ANOVA. Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 und 19 dargestellt. Gültige Häufigkeit Prozent Prozente Kumulierte Prozente Gültig G1 7 15,9 15,9 15,9 G ,4 61,4 77,3 G ,7 22,7 100,0 Gesamt ,0 100,0 Tab. 17: Einteilung Patienten nach Tumorgraduierung Abb. 14: Graphische Darstellung der Graduierung

41 41 Tab. 18: ANOVA der mirna Expression der Graduierung Tab. 19: ANOVA der mirna Expression der Graduierung Es konnte insgesamt kein statistisch signifikanter Unterschied der mirna Expression der einzelnen mirnas 186, 494 und 3651 zwischen den Gruppen G1-3 nachgewiesen werden (Signifikanzniveau p<0,05). Daher wurde nicht weiter untersucht, wie sich die Expression zwischen den einzelnen Gruppen eines Genes verhält.

42 Lymphknotenstatus Von den 44 Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle wiesen 16 Personen eine histologisch gesicherte regionäre Lymphknotenmetastase auf. Bei 28 Patienten waren regionäre Lymphknoten ohne pathologischen Befund. Es wurde untersucht, ob zwischen den Proben mit Lymphknotenbefall und den von Metastasen freien Lymphknoten ein Unterschied der mirna Expression besteht. Hierfür wurden wieder die bereits in 6.1 identifizierten mirnas 186, 494 und 3651 untersucht. Tabelle 20 zeigt die Verteilung des Lymphknotenstatus innerhalb der Gruppe 1. In Abbildung 15 ist dies graphisch dargestellt. Häufigkeit Prozent Gültige Prozente Kumulierte Prozente Gültig Lymphknoten opb 28 63,6 63,6 63,6 Lymphknotenbefall 16 36,4 36,4 100,0 Gesamt ,0 100,0 Tab. 20: Einteilung Patienten nach Lymphknotenstatus Abb. 15: Graphische Darstellung des Lymphknotenstatus

43 43 Die statistische Auswertung erfolgte mittels des Mann-Whitney-Tests für zwei unabhängige Stichproben. Dieser Test ist unabhängig von der Normalverteilung, somit wurde hier kein Test auf Normalverteilung durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 und 22 dargestellt. Tab. 21: Mann-Whitney-Test für Lymphknotenstatus Tab. 22: Mann-Whitney-Test für Lymphknotenstatus Bei der Expressionsanalyse der mirnas 186, 494 und 3651 zwischen den beiden Gruppen des Lymphknotenstatus, Lymphknoten ohne pathologischen Befund und regionärer Lymphknotenbefall konnte keine signifikante Änderung der mirna Expression gezeigt werden. Als Signifikanzniveau wurde p<0,05 verwendet.

44 Zusammenfassung Expressionsanalyse Es konnte gezeigt werden, dass zwischen den Gruppen 1 (krank) und Gruppe 2 (gesund) eine signifikante Änderung der mirna Expression der mirnas 186, 494 und 3651 vorliegt. Bei den Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle werden die mirnas 186, 494 und 3651 im Vergleich zu gesunden Freiwilligen differentiell exprimiert. MiR-186 ist bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle im Vergleich zur Kontrollgruppe herunter reguliert. MiR-494 und mir-3651 sind bei Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle im Vergleich zur Kontrollgruppe hoch reguliert. Es konnte kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Tumorparametern und mirna Expression von mir-186, mir-494 und mir innerhalb der Gruppe 1, bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle, ermittelt werden. Tabelle 23 zeigt eine Übersicht der Signifikanzen der statistischen Tests. Als Signifikanzniveau für alle statistischen Tests wurde p<0,05 verwendet. p-value (Signifikanzniveau p<0,05) Let7 d Diagnose PECM 0,012 0,001 0,920 0,0001 0,477 Graduierung 0,473 0,786-0,655 - Lymphknotenstatus 0,903 0,855-0,788 - Clinical stage 0,604 0,850-0,850 - Tabelle 23: Übersicht p-werte

45 45 7 Diskussion Studien zur Expressionsanalyse von mirnas im Gewebe verschiedener Malignome haben gezeigt, dass mirnas eine wichtige regulatorische Rolle bei der Entstehung und Progression verschiedener Tumorentitäten spielen. [4, 64] Es wurde bereits gezeigt, dass mirnas in den Gewebeproben verschiedener Malignome, einschließlich des oralen Plattenepithelkarzinoms, differentiell reguliert werden. Diese veränderte Expression kann für die Diagnose, Klassifizierung und Prognose von Malignomen beim Menschen genutzt werden. [7, 18, 45] Seit der Entdeckung stabiler mirna im humanen Vollblut, Serum und Plasma und deren unterschiedlicher Expressionsmuster bei Gesunden und bei Patienten mit Malignom wurde gezeigt, dass im Blut zirkulierende mirnas als diagnostischer Marker für ein minimal-invasives Verfahren zur Tumordiagnostik, Überwachung und Prognose angewandt werden können. [10, 33, 43, 45, 48, 64] Ziel der vorliegenden Studie war es, die mirna Expressionsmuster im Vollblut von gesunden Probanden und Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle zu analysieren und hoch signifikante mirnas als potenzielle Biomarker für den Nachweis eines Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle mittels RT-qPCR zu identifizieren. Vorab wurden in einer Mikroarrayanalyse 21 mirnas identifiziert, welche bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikant veränderte differentielle Expression aufwiesen. (Febit biomed GmbH, Heidelberg) Dieses Ergebnis wurde für fünf der zuvor im MiKroarray identifizierten mirnas, mir-led7d, mir-186, mir- 494, mir-3162, mir-3651, in einem unabhängigen Cohort mittels RT-qPCR für Plattenepithelkarzinome der Mundhöhle validiert. In dieser Analyse zeigte sich, dass mir-186 im Blut von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant herunter reguliert ist. MiR-494 und mir-3651 sind bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle im Vergleich zur Kontrollgruppe hoch reguliert. MiRNAs beeinflussen eine Vielzahl von für die Entstehung und Progression von Malignomen, so auch von Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle, entscheidende biologische Stoffwechselvorgänge. [7, 18, 45] Der Einfluss von mir-186 auf Signalwege bei der Tumorentstehung und der