BioChip-Microarrays: Grundlagenforschung und Chancen für die Krankheitsdiagnostik Ruprecht Kuner Abteilung Molekulare Genomanalyse DKFZ Heidelberg
Vortragsübersicht Folie 1 1. Was ist ein Biochip? 2. Zielmoleküle in der Zelle 3. Wofür kann man den Biochip einsetzen? 4. Wie sieht ein Versuchsablauf aus? 5. Nutzen für den Patienten / klinische Anwendungen 6. Weiterentwicklungen in der Technologie
Sammelbegriff Biochip Folie 2 DNA (Genom) RNA (Genexpression) Protein gespottet cdna oder Oligo Matrix-CGH Proteinchip synthetisiert Genotypisierung Antikörperchip Methylierung
Sammelbegriff Biochip Folie 3 Definition: Miniaturisiertes Werkzeug mit dem simultan sehr viele biologische Moleküle untersucht werden können Ziel: Hochdurchsatz-Technologie bzw. Lab-on-the-chip
Quantitative und Qualitative Analysen in der Zelle Folie 4 DNA DNA-Analyse (Array-CGH, SNP) 3.2 Gb / 23.-29.000 Gene 15 Mio SNPs Transkriptom-Analyse (Oligo-, cdna Microarrays) 100.000 Transkripte / 400.000 Exons Protein-Analyse (Antikörper-Arrays, Protein-Arrays) 20.000 Proteine 60.000 Varianten 1 Mio Posttransl. Modifikationen
Krebsenstehung: Veränderungen in Signalwegen und der Genexpression Folie 5 Hanahan and Weinberg, Cell 100, 57-70 (2000)
Anwendungen von Microarrays in der Forschung und Medizin Folie 6 1. Untersuchung von menschlichen Zellen und Geweben 2. Suche nach Interaktionen und Funktionen von Genen und Proteinen 3. Erkennung von Erkrankungen (z.b. Tumoren) 4. Unterscheidung bzw. Vorhersage von klinisch wichtigen Faktoren wie Prognose und Therapieverläufen ( personalized medicine )
A B C D E F G H 0 dorit6 2000 4000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 6000-2 -4-6 Microarrays Startpunkt für Folgeexperimente Folie 7 Gen-Klonierung Microarrays Hamburg Proteinlokalisation BrdU 0 500 1000 1500 2000 2500 raw data Transfection Braunschweig Berlin Leipzig Düsseldorf Hilden Frankfurt Mannheim Heidelberg Freiburg München Funktionelle Assays A B C D E F G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12-4 -2-6 0 2 4 6 Immunhistochemie Protein-Protein Interactions Datenintegration Protein-Arrays
Versuchsablauf - Experimentplanung Folie 8 1. Fragestellung (z.b. Unterscheidung von Brusttumoren unterschiedlicher Prognose) 2. Auswahl der zu untersuchenden Proben (z.b. Patientenkollektiv mit unterschiedlichen Krankheitsverläufen 3. Probenentnahme, Aservierung und Versendung 4. Wahl der Technologie-Plattform (welcher Chip) 5. Experimentdurchführung (Laborausstattung) 6. Datenauswertung (Hilfe von Mathematikern und Statistikern) 7. Beantwortung der Fragestellung 8. Folgeexperimente (Validierung der Ergebnisse in unabhängigen Patientenkollektiven)
Focus: Tumorentstehung oder Progression Folie 9 Gesund Hyperplasie Dysplasie Tumor Invasion gesunde Zellen Erhohte Proliferationsrate Apoptose- Insensitivitat Unabhangigkeit von externen Signalen Substrat-unabhangiges Wachstum Angiogenese- Aktivierung Prävention / Frühe Detektion... Prognose der Tumorprogression und Metastasierung.weitaus weniger spektakulär als die Therapie könnten neue Entwicklungen bei der Pravention und frühen Diagnose der vielversprechenste Grund werden, die Zahl der Krebstote senken ( 2004 ) Vogelstein and Kinzler, Nature Medicine 10, 789-799
Klinische Faktoren beim Brustkrebs Folie 10 Subtypen invasiv ductal (70%) invasiv lobular (15%) medullär (5%) andere Epidemiologie 47,000 Neuerkrankungen/Jahr (D) 19,000 Todesfalle/Jahr Risikofaktoren (genetische Prädisposition; Hormonstatus) Genetische Marker Therapie chromosomale Veränderungen 11q13 (Cyclin D cluster) 17q21 (ERBB2 cluster) BRCA1, BRCA2 Operation, Chemotherapie Herceptin ( -ERBB2) Tamoxifen (Estrogen Rezeptor Inhibitor) weitere Ansätze in laufenden klinischen Studien
Übersicht: Microarray-Technologien zur Genexpression Folie 11 1. Gespottete Microarrays: Oligo-Arrays (50-70mers), cdna-arrays (500-1000bp) max. 50.000 Sequenzen 2. Oligo-Synthese direkt auf Microarray-Oberfläche maskengesteuerte Photolithographie (Affymetrix, Febit) bis zu 6.5 Mio Sequenzen 3. Weitere Produkte: BeadArray-Technologie (Illumina) Komplettsysteme (Oligo-Microarray, Real-Time PCR Validierung z.b. Applied Biosystem)
cdna- Microarrays: Production of PCR products Folie 12 TTTTTTTTTT AAAAAAAA mrna Reverse Transkription/ Klonierung PCR cdna Klone (Bibliotheken) cdna fragment (37.500 clones)
Kontrolle der PCR Produkte durch Gel-Elektrophorese Folie 13
Microarray-Produktion: Kontakt Spotting Folie 14
Microarray Produktion: Qualitätsanalyse Folie 15 Biorad Versarray: 48 Pins (Telecam) / 108 Slides (Quantifoil) Spotting Performance nach Spotting nach Behandlung vor Hybridisierung nach Hybridisierung Spot Morphologie Spot Alignment Spot Präsenz Spot Alignment Hintergrund Slide Artefakte DNA Präsenz Signal intensität Hintergrund
Weitere Microarray-Technologien Folie 16 Photolithographie (z.b. Affymetrix) Array-(Probe-) design Synthese von 10 15 25-mer Oligos in 100 Schritten
Präparation der biologische Probe (Biopsien, Zellen) Folie 17 Gewebe- oder Zellseparation kryo-konserviert, selektiert, klinische Informationen, Ethikvotum RNA Extraktion ( Qiagen Standardprotokolle (RNeasy RNA Quantifizierung und QC Agilent Bioanalyzer Chip Nanodrop Spectrophotometer RNA Amplifikation Menge: 0.5-2µg total RNA, (T7 RNA Polymerase) arna Quantifizierung und QC Agilent Bioanalyzer Chip Nanodrop Spectrophotometer RNA Labeling und Aufreinigung Superscript; Cy3 and Cy5 Nucleospin Extract Kit Hybridisierung, Waschen und Scannen Corning Chambers (37 C) GenePix 4000B
Dissektion von Tumorgewebe Folie 18 H & E IHC Tumor RNA Extraktion Microarray
Präparation der biologische Probe (Biopsien, Zellen) Folie 19 Gewebe- oder Zellseparation kryo-konserviert, selektiert, klinische Informationen, Ethikvotum RNA Extraktion ( Qiagen Standardprotokolle (RNeasy RNA Quantifizierung und QC Agilent Bioanalyzer Chip Nanodrop Spectrophotometer RNA Amplifikation Menge: 0.5-2µg total RNA, (T7 RNA Polymerase) arna Quantifizierung und QC Agilent Bioanalyzer Chip Nanodrop Spectrophotometer RNA Labeling und Aufreinigung Superscript; Cy3 and Cy5 Nucleospin Extract Kit Hybridisierung, Waschen und Scannen Corning Chambers (37 C) GenePix 4000B
Qualitätskontrolle der biologischen Probe Folie 20 Analyse der RNA mittels Biochip Dokumentation der Elektropherogramme Kriterien für RNA Qualität
Präparation der biologische Probe (Biopsien, Zellen) Folie 21 Gewebe- oder Zellseparation kryo-konserviert, selektiert, klinische Informationen, Ethikvotum RNA Extraktion ( Qiagen Standardprotokolle (RNeasy RNA Quantifizierung und QC Agilent Bioanalyzer Chip Nanodrop Spectrophotometer RNA Amplifikation Menge: 0.5-2µg total RNA, (T7 RNA Polymerase) arna Quantifizierung und QC Agilent Bioanalyzer Chip Nanodrop Spectrophotometer RNA Labeling und Aufreinigung Superscript; Cy3 and Cy5 Nucleospin Extract Kit Hybridisierung, Waschen und Scannen Corning Chambers (37 C) GenePix 4000B
Microarray-Experiment: wichtigste Schritte Folie 22
Datenanalyse und Quantifizierung Folie 23 76mm 25mm
Vorgehensweise bei der Datenanalyse und Statistik Folie 24 Rohdaten Visualisierung Qualitätsplots Expressionswerte; Statistische Tests Normalisierung von Andreas Buneß, modifiziert
Vorhersage der Hormonabhängigkeit beim Brustkrebs Folie 25 Alle Unterschiede Minimale Unterschiede 147 Gene 10 Gene Patienten ESR1 (+); 30 samples ESR1 (--); 26 samples high expression low expression Schneider et al., Int. J. Cancer 2006
Translationale Forschung: Aus der Forschung in die Klinik Folie 26 Kuner et al., DMW 2009
Translationale Forschung: Schwierigkeiten Folie 27!!...Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Labors und Technologien verbessert sich erheblich, wenn standardisierte Protokolle für die RNA Präparation, Microarray-Produktion, Hybridisierung und Datenauswertung angewendet werden...!!
Biochips in der klinischen Anwendung Folie 28 Brustkrebs: Mamaprint R Agendia (DNA-Microarray) zur Risikoabschätzung wiederkehrender Tumorerkrankungen und entsprechender Therapieoptionen Brustkrebs: Oncotype Dx R (qrt-pcr) gibt Aufschluss über die Wirksamkeit einer Kombinationstherapie (Tamoxifen+Chemotherapie) Weitere Systeme befinden sich in klinischen Studien Langfristig sollen gezielte, molekulare Screeningmethoden eine verbesserte individuelle Therapie und Nachsorge von Patienten ermöglichen
Technologieentwicklung Folie 29 1990-2000 2000-2010 > 2010? gespottete Oligo- oder cdna-microarrays Kommerzielle Systeme mit kürzeren, synthetisierten Oligosequenzen RNA Sequenzierung + Produktion, Flexibilität + Auflösung, Qualität, Datenintegration + Auflösung, Dynamischer Bereich, unbekannte Transkripte
Vielen Dank für das Interesse!! Folie 30