Gruppe Nr. 0 Tübingen, den XXIX. Mai Anno Domini 00 Gero Schwenk, Forian Waker Biochemie-Praktikum: Programm E Versuch : Lactatkonzentration im Serum Enzyme Decies repetita pacebit. Aufgabensteung: Mit Hife der durch LDH enzymatisch kataysierten Reaktion von Lactat und NAD zu Pyruvat und NADH so die Lactatkonzentration im Butserum mittes photometrischer Extinktionsbestimmung der entstehenden NADH-Konzentration bestimmt werden, wobei das entstehende Pyruvat in einer zweiten Reaktion mit L- Gutamat, kataysiert durch Gutamat-Pyruvat-Transaminase, weiter umgesetzt und damit reativ voständig aus dem Geichgewicht der ersten Reaktion entzogen wird. Verwendete Methoden: Spektraphotometrie. Lambert-Beer sches Gesetz. Verdünnung. Wie immer. Versuchsauswertung: Die Anayseösung wurde angesetzt mit,5m Reaktionsgemisch, in dem L-Gutamat und NAD enthaten waren, und je 50µ Serum und Enzymösung mit Lactat-Dehydrogenase (LDH) und Gutamat-Pyruvat- Transaminase (GPT). As Bindprobe diente eine Lösung, in der der Enzymantei durch eine Ammoniumsufatösung ersetzt wurde. Dabei wurde die Extinktion der Anayse nach 0min zu 0,49 bestimmt. Aus dem Lambert-Beer schen Gesetz (E e c d) ergibt sich dadurch die Konzentration des entstandenen NADH in der Lösung wie fogt: E 0, 49 cm 5 c,4 0 ε d 6, 0³ cm Dies entspricht gemäß der Reaktionsgeichung der ursprüngich im Ansatz vorhandenen Lactatkonzentration (fas es voständig umgesetzt wurde). Auf die 50µ in der Anayse vorhandenes Serum bezogen ergibt sich hieraus die Lactatkonzentration zu: 5 600µ m c,95 0, 50µ g Die Massenkonzentration an Lactat kann nun durch sein Moekuargewicht von 90, bestimmt werden: m g mg mg,46 90,,, 00m Diese Konzentration iegt im physioogischen Bereich (-9mg Lactat pro 00m). Versuch : Enzymaktivität im Serum Aufgabensteung: Um die Aktivität der Gutamat-Oxaacetat-Transaminase (GOT) quantitativ nachzuweisen, wird das in der von ihr kataysierten Reaktion Aspartat + a-ketogutarat GOT, PALP Gutamat + Oxaacetat entstehende Oxaacetat in weiteren Reaktionen abgebaut, in denen jeweis NADH zu NAD oxidiert wird und somit eine photometrische Bestimmung der GOT-Aktivität ermögicht wird. Verwendete Methoden: Spektraphotometrie. Lambert-Beer sches Gesetz. Verdünnung. Wie immer. Versuchsauswertung: Das GOT-Serum wird zusammen mit einem Reaktionsgemisch, das sämtiche sonst benötigten Stoffe enthät, in eine Küvette pipettiert und die Extinktion bei 40nm nach einer, zwei, drei und vier Minuten ab Reaktionsbeginn gemessen.
min nach Start 4 E 40,0,980,95,885 E / min 0,04 0,045 0,050 Der Mittewert der Extinktionsdifferenz pro Minute beäuft sich auf 0,0457. Nach dem Lambert-Beer schen Gesetz: E e? c d d 0,0 m c ε d 0,0457 c pro Minute 7, 0 6, 0 min min cm Die Verdünnung beträgt 0,5m GOT auf,5m Reaktionsgemisch. Im Reaktionsgemisch aeine beträgt daher die Konzentrationsänderung an NADH, die der des Aspartats entspricht:,0m µ c 7, 0 44, 0,5m min µ Da U einem Mikro pro Minute entspricht, ist 44, 44, U pro Liter. Dieser Wert iegt deutich min über dem Normawert von U/ im Serum, was vieeicht auf einen Herzinfarkt oder eine Hepatitis schießen ässt. Versuch : LDH-Isoenzyme Aufgabensteung: Der Sinn und Zweck dieses Versuchs beschränkt sich auf die Messung der unterschiedichen kinetischen Parameter der LDH-Isoenzyme und deren Beeinfussung durch Inhibitoren. Aus den Messreihen werden ineare Lineweaver-Burk-Diagramme erstet, aus denen jeweis K M und v max des Isoenzyms, evt. mit Inhibitor, gewonnen werden. Aus diesen Werten wiederum assen sich Wechsezahen und die Inhibitorkonstante bestimmen. Jede Messreihe besteht aus mehreren Ansätzen, in denen jeweis unterschiediche Substratkonzentrationen vorhanden sind. Gruppe : LDH + Pyruvat as Substrat Gruppe : LDH + a-ketobutyrat as Substrat Gruppe : LDH + Pyruvat as Substrat + Oxaat as Inhibitor Gruppe 4: LDH5 + Pyruvat as Substrat Gruppe 5: LDH5 + a-ketobutyrat as Substrat Gruppe 6: LDH5 + Pyruvat as Substrat + Oxaat as Inhibitor Verwendete Methoden: Spektraphotometrie, Faserschreibermitschrift. Versuchsauswertung: Aus den vom Schreiber ersteten Extinktionsdiagrammen für jeweis acht oder zehn Ansätze pro Gruppe wurde für jeden Ansatz die Extinktionsdifferenz und die Zeit, in der die Reaktion stattfand, bestimmt, um daraus die Extinktionsänderung pro Minute zu berechnen. Dabei müssen stets die Werte aus dem steady state - Bereich zur Berechnung genommen werden. Im Lineweaver-Burk-Diagramm wird der Kehrwert davon as Ersatz für /v gegen die Y-Achse aufgetragen; die X-Werte (/S) steen die Kehrwerte der pro Ansatz dazugegebenen Substratmengen dar. /v für jeden Wert aus min/?e auszurechnen wäre unnötig, da sich dadurch nur eine Stauchung in Richtung der Y-Achse ergibt, die keinen Einfuss auf das Aussehen des Schaubides hätte. Aus den Lineweaver-Burk-Diagrammen jeder Gruppe so der jeweiige K M - und v max -Wert bestimmt werden. Der K M -Wert entspricht im Schaubid immer dem Kehrwert des negativen Abszissenabschnitts des Nupunkts; der v max -Wert offenbart sich uns im Kehrwert des Ordinatenabschnitts des Schnittpunkts mit der Y- Achse. v max berechnet sich daraus fogendermaßen:
E e c d c ε d c v t v t min und d 0,0 m Gruppe : Da LDH eine starke Substrathemmung hat, müssen die ersten vier Messwerte (mit den höchsten Substratkonzentrationen) bei der Konstruktion der Ausgeichsgerade ausgekammert werden. K m 0,05 0 0000 min min 0, v max 54 0 min 6, 0 cm cm Gruppe : K m,4 0 700 min,min v max 6, 0 0,8 cm cm 0 min Gruppe : K m 00 0,50 0 min,7min v max 6, 0 0,7 cm cm 59 0 min Gruppe 4: K m 080 0,9 0 min 0,5min v max 6, 0 cm cm 0 min
Gruppe 5: K m 0 0 00 4 min 0,min v max 6, 0 0 cm cm 608 0 min Gruppe 6: K m 4000 0,5 0 min,7min v max 6, 0 0,59 cm cm 95 0 min Es ässt sich sagen, dass v max mit Inhibitor (wie erwartet) etwas niedriger ist, während v max mit a- Ketobutyrat as Substrat vie höher as mit Pyruvat ausfät. Der Vergeich der K m -Werte ergibt, dass die Affinität der Isoenzyme LDH und LDH5 zu Pyruvat wesentich höher ist as zu a-ketobutyrat, während die Affinität von LDH zu Pyruvat bei geichzeitiger Anwesenheit von Oxaat as Inhibitor stark sinkt und die Affinität von LDH5 zu Pyruvat mit Inhibitorzugabe erhöht ist. Beim Vergeich von LDH und LDH5, bemerkt man, dass die Geschwindigkeit der Umsetzung bei LDH5 (Gruppen -6) agemein vie höher ist. Die Affinität (Der Kehrwert von K m ) scheint bei LDH ebenfas höher zu sein; die zweifach niedrigere Affinität von Gruppe zu Gruppe 6 könnte ein Messfeher sein. Berechnung der Inhibitorkonstanten für Oxaat: Durch die Zugabe des Inhibitors Oxaat in die durch LDH kataysierte Reaktion ergibt sich ein im Vergeich zur Messung ohne Inhibitor verändertes Lineweaver-Burk-Diagramm. Mit Hife der Inhibitorkonstanten K i und K ii ist es mögich, dieses aus einer Messreihe ohne Inhibitor zu berechnen nach fogender Forme: K m ϕ ' + ϕ v v v S max max I I Dabei entspricht ϕ ( + ) und ϕ ' ( + ). K i und K ii errechnen sich wie fogt: K i K ii 0,0005 K ii 0, 0059 54 0 min 59 0 min 0,0005 6, 0 0,50 0 0,0005 ( + ) 0,05 0 0,0059 K i
5 Gruppen und 6 4 0 min /?E 8 6 ( ) Gruppe 4 ( ) ( ) ( ) Gruppe 0-0000 -8000-6000 -4000-000 -0000-8000 -6000-4000 -000 0 000 4000 6000 / S Gruppen und 4 0 8 min /?E 6 Gruppe 4 Gruppe 4 0-5000 -4000-000 -000-000 0 000 000 000 4000 5000 6000 7000 / S
6 Gruppen 5 und 6 5,0 4,5 4,0,5,0 Gruppe 6 min /?E,5,0,5 Gruppe 5,0 0,5 0,0-5000 -4000-000 -000-000 0 000 000 000 4000 5000 6000 7000 / S
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