Aus der Klinik und Poliklinik für Urologie und Kinderurologie der Universität Würzburg Direktor: Universitäts-Professor Dr. med. H. Riedmiller MicroRNA-221 reguliert PMEPA1 und moduliert den TGFß-Signalweg im Prostatakarzinom Inaugural - Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Julius-Maximilians-Universität Würzburg vorgelegt von Philip Paul Herreiner aus Dietmannsried Würzburg, Mai 2015 http://d-nb.info/1080877169
1 EINLEITUNG 1 1.1 Inzidenz und Diagnostik des Prostatakarzinoms 1 1.2 MicroRNAs und ihre regulatorische Funktion 2 1.3 MicroRNA Expressionsprofile in Tumoren 3 1.4 MicroRNA Expressionsprofile im PCa 4 1.5 TGFß 5 1.5.1 Der tumorsuppressive TGFß/Smad-Signalweg 5 1.5.2 TGFß als Tumorpromotor 8 1.5.2.1 Die Konversion von TGFß vom Tumorsuppressor zum Tumorpromotor... 8 1.5.2.2 Die Bedeutung von TGFß für die epithelial-mesenchymale Transition 8 1.6 PMEPA1 9 1.6.1 PMEPA1 als T umorsuppressor 9 1.6.2 PMEPA 1 als onkogenes Regulatorprotein 10 2 FRAGESTELLUNG 13 3 MATERIAL UND METHODEN 14 3.1 Material 14 3.1.1 Zellkultur 14 3.1.1.1 Zelllinien 14 3.1.1.2 Zellkulturmedien 15 3.1.2 Chemikalien und Biochemikalien 15 3.1.2.1 Zellkulturreagenzien 15 3.1.2.2 Chemikalien für molekularbiologische Experimente 16 3.1.2.3 Primer für quantitative Real-Time PCR 18 1
3.1.2.4 Angesetzte Puffer und Lösungen 18 3.1.2.5 Antikörper 19 3.1.3 Geräte und Verbrauchsmaterialien 19 3.1.4 Software 21 3.2 Methoden 21 3.2.1 Sterilisation der verwendeten Materialien und Lösungen 21 3.2.2 Kultivierung der Tumorzelllinien 21 3.2.3 Transiente Transfektion 22 3.2.4 Vitalitätsassay 23 3.2.5 Zellemte 24 3.2.6 RNA-lsolierung und Bestimmung der RNA-K.onzentration 24 3.2.7 Bestimmung der mrna Expression mittels quantitativer Real-Time PCR 25 3.2.7.1 Reverse Transkription 25 3.2.7.2 qrt-pcr 26 3.2.8 Proteinisolierung und Bestimmung der Proteinkonzentration 28 3.2.9 Bestimmung der Proteinexpression 29 3.2.9.1 SDS-PAGE 29 3.2.9.2 Western Blot 30 3.2.10 Dual Reporter Luciferase Test 31 3.2.10.1 Allgemeines 31 3.2.10.2Klonierung und Plamsidisolation 32 3.2.10.3Transfektion 32 3.2.10.4Vermessung 33 3.2.11 Datenverarbeitung 34 3.2.11.1 Datenverarbeitung für Vitalitätsassay 34 3.2.11.2Datenverarbeitung für Western Blot 34 2
3.2.11.3Datenverarbeitung für qrt-pcr 34 3.2.11.4Datenverarbeitung für Dual Reporter Luciferase Test 35 3.2.12 Statistik 35 4 ERGEBNISSE 36 4.1 PMEPA1 als Zielgen der mir-221 36 4.1.1 Analyse der mir-221 kontrollierten PMEPA1 Expression auf mrna-ebene 36 4.1.1.1 Ermittlung der Transfektionseffizienz nachpre-mir-221 -Transfektion... 37 4.1.1.2 Analyse der PMEPA 1 Expression in pre-mir-22/-transfizierten Zellen... 38 4.1.1.3 Vergleich der mir-221- und PMEPA 1 Expression in PCa-Zelllinien 39 4.1.2 Analyse der mir-221-kontrollierten PMEPA1 Expression auf Proteinebene.. 41 4.1.3 Vorhersage potentieller mir-221 Zielgene in Internetdatenbanken 42 4.1.4 Analyse der Interaktion von mir-221 mit PMEPA 1 im Dual Reporter Luciferase Test 43 4.2 Einfluss von mir-221 Überexpression und exogener TGFß-Zufiihr auf das Proliferationsverhalten von PC3- und RWPE-l-Zellen 45 4.2.1 Analyse des Proliferationsverhaltens von RWPE-l-Zellen 45 4.2.2 Analyse des Proliferationsverhaltens von PC3-Zellen 47 4.3 Ex v/vo-analyse von mir-221 und PMEPA 1 im Primärtumorkollektiv 49 4.3.1 Beschreibung des Primärtumorkollektivs 49 4.3.2 Analyse der mir-221- und PMEPA 1 Expression im primären PCa und im assoziierten nicht-tumorösen Gewebe 51 4.3.3 Analyse der Assoziation und Korrelation von mir-221 - und PMEPA 1 Expression im Tumorkollektiv 53 5 DISKUSSION 56 5.1 PMEPA1 als Zielgen der tumorsuppressiven mir-221 im PCa 56 3
5.2 Die mir-221 vermittelte PMEPA1 Regulation und ihr Einfluss auf die Kontrolle des Zellwachstums in PCa-Zellen 58 5.3 MiR-221 verstärkt in PCa-Zelllinien den TGFß vermittelten Effekt auf das Proliferationsverhalten 60 5.4 Die PMEPA1 Expression ist im primären PCa erhöht und korreliert signifikant mit Herabregulation der mir-221 61 5.5 Mechanismus des mir-221 regulierten Einflusses von PMEPA1 auf die Tumorgenese und -progression 63 5.6 Der TGFß-Antagonismus als potentielle antikarzinogene Therapie 65 6 ZUSAMMENFASSUNG 67 7 LITERATURVERZEICHNIS 69 8 DANKSAGUNG 79 9 LEBENSLAUF 80 4