Versuch 5: ELISA (Serumtitration) Lernziele: 1) Definition der Begriffe Antigen, Antikörper, Epitop, Paratop, Affinität, Avidität 2) Monoklonale und polyklonale Antikörper 3) Praktische Durchführung einer Serumtitration mittels colorimetrischem ELISA 4) Bestimmung des Endpunktiters Hintergrund: Die ELISA-Technik ist eine einfache, vielseitig anwendbare und hochsensitive Methode zum Nachweis von Antigenen und Antikörpern. Welche der 3 Hauptvarianten (antibody-capture ELISA, sandwich-elisa, competitive-elisa) angewandt wird, hängt von der Fragestellung und von den Ausgangsmaterialien ab. Bei allen Varianten wird ein biologischer Stoff an eine Matrix gebunden. Dabei kommen eigens für diese Technik entwickelte 96-Well Mikrotiterplatten zum Einsatz. Der antibody capture assay wird hauptsächlich zur Untersuchung des Immunstatus eines Menschen oder eines Versuchstieres verwendet. Verabreicht man einem Versuchstier ein Antigen oder erkrankt ein Mensch, werden als Reaktion ganz spezifische Antikörper gebildet. Diese können im antibody capture assay nachgewiesen werden. Nachdem das Antigen 12-24h an die Mikrotiterplatte gebunden hat (üblicherweise über Nacht bei 4 C) müssen noch vorhandene freie Bindungsstellen abgesättigt werden, um eine unspezifische Bindung des Antikörpers an die Platte zu verhindern. Dazu benötigt man ein Protein, mit dem der Antikörper nicht kreuzreagieren kann, wie beispielsweise BSA (bovines Serumalbumin) oder fettarmes Milchpulver. Nach dem Absättigen wird die Probe aufgetragen und darin enthaltene Antikörper, die ein passendes Paratop für das Antigen besitzen, können daran binden. Die restlichen Proteine werden ausgewaschen. Ob zur Untersuchung humaner Seren in medizinischen Labors oder von Seren aus Versuchstieren in der Forschung in allen Seren lassen sich die Antikörper der betreffenden Spezies durch ihre charakteristische Fc-Region nachweisen. Antikörper, die gegen diese Fc-Regionen gerichtet und mit einem Enzym wie horseradish-peroxidase (HRP) oder alkaline Phosphatase gekoppelt sind, kann man käuflich erwerben. Ein Beispiel für einen gängigen Nachweisantikörper ist etwa HRP-goat-anti-mouse IgG1. Dafür wurde eine Ziege mit Maus-Antikörpern der Subklasse IgG1 immunisiert, die daraufhin gebildeten polyklonalen Ziegenantikörper gereinigt und kovalent mit HRP gekoppelt. Dieser 2. Antikörper wird aufgetragen und bindet an die Fc-Regionen des bereits
gebundenen 1. Antikörpers. Nach Inkubation wird wiederum das überschüssige Protein ausgewaschen und ein farbloses Färbereagenz zugegeben. Das darin enthaltene H 2 O 2 ermöglicht die Spaltung des Farbstoffes ABTS durch das kovalent an den Nachweisantikörper gebundene Enzym. Dadurch bildet sich eine lösliche Farbwolke. Sind gute Kontraste sichtbar, wird die Reaktion durch Zugabe einer 2%-igen Oxalsäurelösung abgebrochen, die die HRP zerstört. Anschließend misst man die optische Dichte bei 405nm im Plattenphotometer. Der Sandwich-ELISA wird verwendet, um aus einem komplexen Proteingemisch ein ganz bestimmtes Protein zu detektieren, wie z. B. ein bestimmtes Zytokin als diagnostischen Marker in Patientenserum. Da diese Substanzen nur im Promillebereich im Serum vorkommen, macht es keinen Sinn, das Serum auf eine Mikrotiterplatte aufzutragen und mittels spezifischem markierten Antikörper das gesuchte Zytokin nachzuweisen. Über 99,99% der Platte wären mit anderen Proteinen als dem gesuchten besetzt. Hier kommt daher der sandwich-elisa zum Einsatz, wofür man 2 verschiedene Antikörper benötigt, die dasselbe Antigen, aber nicht dasselbe Epitop erkennen. Die beiden Antikörper müssen also verschiedene Paratope enthalten und nur einer der beiden ist enzymmarkiert. Der nicht markierte Antikörper wird an die Mikrotiterplatte gebunden und die Probe zugegeben. Alle Proteine mit dem passenden Epitop binden, die anderen werden ausgewaschen. Der zweite markierte Antikörper bindet an ein anderes Epitop des an den ersten Antikörper gebundenen Proteins. Mittels Enzymreaktion kann nun das Zielprotein nachgewiesen werden. Zur Quantifizierung mittels ELISA gibt es prinzipiell 3 Möglichkeiten: Steht eine Reinstprobe (Standard) mit genauer Konzentrationsangabe zur Verfügung, kann man daraus eine Verdünnungsreihe erstellen, die OD-Werte gegen die Verdünnung auftragen und anhand dieser Eichgeraden die Konzentration unbekannter Proben ablesen. Ist kein Standard vorhanden, kann mittels kompetitivem ELISA quantifiziert werden. Dafür erfolgt zunächst eine Vor-Inkubation von unmarkiertem Antikörper mit der Probe, die das Antigen enthält. Dann wird diese Mischung auf Wells, die mit Antigen gecoatet wurden, aufgetragen. Je mehr Antigen in der Probe vorhanden ist, desto weniger freier Antikörper ist nun verfügbar zur Bindung an das Antigen im Well. Um die Menge an primärem Antikörper, der gebunden hat, festzustellen, kommt ein enzymgekoppelter sekundärer Antikörper spezifisch für den Isotyp des primären Antikörpers zum Einsatz. Je höher die Konzentration des Antigens in der ursprünglichen Probe, desto niedriger die Absorption. Zuletzt bleibt noch die Methode der Titerbestimmung: Der Titer einer Probe ist ein fiktiver Wert, der keine absolute Aussage über die Konzentration oder die Menge der darin enthaltenen Moleküle zulässt und lediglich eine Verdünnung angibt, bei der die Probe noch
nachgewiesen werden kann. Dazu benötigt man eine Verdünnungsreihe einer Standardprobe und einige Wells, die nur 2. Antikörper erhalten, um die OD Werte des Backgrounds messen zu können. Trägt man die OD-Werte in einem Diagramm gegen die Verdünnungen auf, erhält man eine sigmoide Kurve, die im OD Background endet. Nun berechnet man die Standardabweichung der Background-Wells. Aus der Rechnung: OD Background + 2*STABW ergibt sich ein Wert, der etwas über der Backgroundgeraden die Verdünnungskurve der Standardprobe schneidet. Die Verdünnung, die diesem Schnittpunkt entspricht, wird als Endpunkttiter bezeichnet. Durchführung: 1. Coaten mit Antigen (Phl p 5) über Nacht bei 4 C: 50µL/well einer 1µg/mL in Phosphatpuffer (PBS) Sie erhalten eine vorbereitete Mikrotiter-Platte, deren obere Hälfte (48 Wells) bereits gecoatet wurde. 2. Ausklopfen der Platte: Sie kippen die Platte über dem Waschbecken aus und leeren die Wells mit viel Schwung. Anschließend wird der Rest an Flüssigkeit auf einem Stück Küchenpapier kräftig ausgeklopft. 3. Blocken: Sie pipettieren in jedes der 48 Wells 200 µl Block-Buffer (PBS-0.1% Tween-20, 0.5% BSA) und lassen die Platte bei Raumtemperatur für 30 min stehen.
4. Verdünnungsreihe: Während der Inkubation mit Block-Puffer stellen Sie sich eine Verdünnungsreihe des Immunserums (1. Antikörper) in Block-Buffer her. Die erste Verdünnung für die Verdünnungsreihe ist 1:100, dann wird in 1:3-er Schritten weiterverdünnt (insgesamt 12 Verdünnungen). Alle Verdünnungen sollen doppelt aufgetragen werden (50 µl/well), d.h. von jeder Verdünnung werden mindestens 100 µl, besser etwas mehr hergestellt. Vergessen Sie nicht jeweils vor dem Weiterführen in die nächste Verdünnung gründlich zu vortexen! 5. Waschen: Nach dem Ausklopfen (siehe Punkt 2) pipettieren sie pro Well 300 µl Waschpuffer (PBS/0,1% Tween-20). Dieser Schritt wird 3mal wiederholt! 6. Auftragen des 1. Antikörpers: Von den unter Punkt 4 hergestellten Verdünnungen pipettieren Sie je 50µl/Well. Jede Verdünnung wird doppelt aufgetragen. Die übrigen zwei ganzen Reihen (24 Wells) bekommen statt einer Serumverdünnung nur 50 µl Block-Buffer und dienen zur Bestimmung des Backgrounds. Anschließend wird der ELISA inkubiert wie unter Punkt 3. Während der Inkubationszeit bereiten Sie eine Verdünnung von 1:2500 des 2. Antikörpers (HRP-goat-anti-mouse IgG) in Block- Buffer vor. Sie benötigen diese Lösung für 48 Wells á 50 µl. 7. Sie waschen erneut 4x mit PBS/0,1% Tween wie unter Punkt 5 beschrieben. 8. Auftragen des 2.Antikörpers: Sie pipettieren 50µL/Well in sämtliche 48 Wells. 9. Erneut erfolgt nun für 30 min ein Inkubationsschritt bei Raumtemperatur. Inzwischen bereiten Sie die Substratlösung vor. Dafür kommen auf 22 mg ABTS (hell-türkises Pulver) 10 ml Citratpuffer (ph 4,0) und 10 µl einer 30%-igen H 2 O 2 Lösung. 10. 4x waschen der Platte mit PBS/0,1% Tween (siehe Punkt 5). 11. Nun wird pro Well 50 µl Substrat aufgetragen. Achtung! Mit dem Auftragen des Substrats warten, bis das Photometer frei ist! Beginnen Sie das Auftragen bei den Background-Wells und arbeiten Sie sich von der niedrigsten Serumkonzentration zur höchsten vor! Während der Farbentwicklung müssen Sie die Platte schütteln und genau beobachten! Sobald deutliche Farbkontraste zu sehen sind, messen Sie im Photometer die OD bei Absorption 405nm. 12. Zur Auswertung tragen Sie zunächst in einem Graphen die Verdünnungen gegen die OD-Werte (jeweils den Mittelwert der beiden Doppelwerte) auf. Dann berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der 24 Background-Wells. Daraus ergibt sich der OD-Wert am Endpunkt. Nun können Sie feststellen, zwischen welchen 2 Verdünnungen der Endpunkttiter des Serums liegt. Um diesen genau zu berechnen, tragen Sie in einem zusätzlichen Graphen diese beiden Verdünnungen gegen die
zugehörigen OD-Werte auf und legen durch die beiden Punkte eine Gerade. In die zugehörige Geradengleichung setzen Sie den OD-Wert am Endpunkt ein und können so den Endpunkttiter berechnen. Material: Geräte: Kolbenhub-Pipetten, einstellbar für Maximal-Volumina von 1000, 200, und 20µL 1,5mL Eppendorf Reaktionsgefäße Platten-Photometer (405nm) 96-well NUNC Maxisorp Flachbodenplatten mit hoher Bindungskapazität Reagenzien/Lösungen PBS: 1.5mM KH 2 PO 4, 8.1mM Na 2 HPO 4, 140mM NaCl, 2,7mM KCl, ph7.5 Antigen = Phlp 5 (Gräserpollenallergen) Blockpuffer (PBS, 0.1% Tween-20, 0.5% BSA) Waschpuffer (PBS, 0.1% Tween-20) Citratpuffer (0,1M Na-Citrat, ph 4.0) Immunserum (von mit Phl p5 immunisierten Mäusen) Sekundärer Antikörper: HRP-goat-anti-mouse IgG ABTS (2,2 -Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) H 2 O 2 (30%) Oxalsäure