Biochemie/ Mikrobiologie

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1 Biochemie/ Mikrobiologie Ort: Praktikumsraum der Biochemie MA Nord Ebene 0, Raum 428 Zeitplan: gemäß Gruppenverteilungsplan Leitung: Prof. Dr. R. Erdmann Der Teil Biochemie/Mikrobiologie des Biologiepraktikums findet an zwei aufeinanderfolgenden Nachmittagen statt. Am ersten Praktikumstag werden die Versuche 1 bis 5 durchgeführt, die am zweiten Praktikumstag beendet und ausgewertet werden. Daneben werden am zweiten Tag auch die Versuche 6 und 7 durchgeführt. Die Ergebnisse der Versuche werden auf den dafür vorgesehenen Seiten der Praktikumsanleitung protokolliert und anschließend dem Kursbetreuer vorgelegt. Auflage

2 VORBEMERKUNGEN ZUR SICHERHEIT IM LABORATORIUM Im Praktikum gilt absolutes Rauchverbot. Es ist ebenfalls verboten, im Labor zu essen und zu trinken. Außerdem ist zum Schutz der eigenen Kleidung ein Kittel (geschlossen!) zu tragen. Alle Lösungen, die in den Versuchen eingesetzt werden, müssen mit mechanischen Pipettierhilfen (Eppendorf, Finnpipette) dosiert werden. Im Labor vorhandene automatische Pipetten sind Präzisionsinstrumente und müssen mit großer Sorgfalt behandelt werden. Die Handhabung dieser Pipetten ist ausführlich im nächsten Kapitel dargestellt. HANDHABUNG DER AUTOMATISCHEN PIPETTEN Eine wichtige Voraussetzung für gutes Gelingen aller Versuche ist das richtige Pipettieren. Die Dosierung von Flüssigkeiten im Mikroliter-Bereich wird mit mechanischen Pipettierhilfen (Eppendorf-, und/oder Finn-Pipetten) durchgeführt. Beachten Sie die folgenden Regeln und üben Sie den Umgang mit den Pipettierhilfen vor dem Versuch mit destilliertem Wasser. FINN-PIPETTEN Die Finn-Pipette ist ein volumetrisches Gerät zur genauen und sicheren Messung und Aufgabe von Flüssigkeiten. Je nach Modell können Volumina von 0,1 µl bis 5000 µl gemessen und dosiert werden. Die Finn-Pipette hat ein digitales Mikrometer, das das Volumen angibt. Das Volumen wird durch Drehen der farblich geriffelten Einstellschraube eingestellt und ist innerhalb des Einstellbereiches der Pipette kontinuierlich einstellbar. Das höchste Volumen steht auf der Seite der Abwurfvorrichtung und entspricht der Nummer des Pipettenmodells. Im Praktikum wird folgendes Pipettenmodelle verwendet: Die Finn-Pipette wird mit Einwegpipettenspitzen aus Polypropylen benutzt. Wichtig: Pipetten mit gefüllter Spitze niemals hinlegen! 2

3 Im Praktikum wird folgendes Pipettenmodelle verwendet: Modell Einstellbereich (µl) Rändelschraube gelb Rändelschraube blau Die Finn-Pipette wird mit Einwegpipettenspitzen aus Polypropylen benutzt. Die Einwegspritzen stellen die höchste Sicherheit für den Anwender dar und verhindern die Kontamination zwischen den Proben. Um den Anwender vor einer Kontamination durch die Spitzen zu schützen, verfügt die Finn-Pipette über einen eingebauten Spitzenabwerfer. Einstellen des Volumens Die Digitalanzeige besteht aus drei Ziffern und wird von oben nach unten abgelesen. Die drei Ziffern geben das gewählte Volumen an. Bei den blauen Pipetten bedeuten Ziffern Mikroliter Das Volumen der Pipette wird durch Drehen der schwarzen, geriffelten Einstellschraube eingestellt. Diese Pipette wird auf 1,0 ml oder 1000 µl eingestellt. Pipettierung Die blaue Spitze auf den Schaft der Pipette aufstecken. Die Spitze dabei mit leichtem Drehen fest andrücken, um absolute Dichtheit zu gewährleisten. Anmerkung: Niemals Flüssigkeiten mit einer Finn-Pipette ohne Spitze aufnehmen! 3

4 Füllen Den Druckknopf bis zum ersten Druckpunkt eindrücken (Abb. 2A). Die Pipette senkrecht halten, und die Spitze in die Probenflüssigkeit ca. 1cm eintauchen. Den Druckknopf langsam loslassen, um die Probe aufzusaugen (Abb. 2B). Eine Sekunde warten, und dann die Spitze aus der Flüssigkeit herausnehmen. Achtung: die Öffnung der Spitze nicht berühren! Entleeren Das Ende der Spitze in einem Winkel von 10 bis 40 Grad gegen die Innenwand des Gefäßes halten. Den Druckknopf langsam bis zum ersten Druckpunkt herunterdrücken (Abb.2C). Eine Sekunde warten. Den Druckknopf bis zum zweiten Druckpunkt herunterdrücken, um restliche Flüssigkeit auszustoßen (Abb. 2D). Die Spitze durch Drücken des Spitzenabwerfers abwerfen. Die Spitze muss nur gewechselt werden, wenn eine andere Flüssigkeit aufgegeben oder die Volumeneinstellung geändert wird. Pipettenspitzen Pipettenspitzen werden aus hochwertigem Polypropylen hergestellt. Die Spitzen sind farbig und entsprechen der Farbe auf dem Druckknopf.Blaue oder gelbe Spitzen 4

5 Organisatorische Hinweise Die Zuteilung der Arbeitsplätze an die Studenten geschieht anhand der auf den Praktikumskarten eingetragenen Nummern; jeder Student muss daher seine Nummer kennen. An jedem Arbeitsplatz sind die für die Versuche benötigten Materialien und Geräte aufgestellt. Jeder Student sollte einen wasserfesten Filzschreiber, ein Lineal und einen Arbeitskittel mitbringen. Bei Bedarf, aber immer vor Verlassen des Praktikumsraums, sind die Hände zu Waschen und zu Desinfizieren. Mäntel etc. können in den vor dem Kurssaal aufgestellten Spinden oder auf der Fensterbank im Kurssaal abgelegt werden. Für die Spinde empfiehlt es sich ein Vorhängeschloss mitzubringen. Für abhanden gekommene Gegenstände wird keine Haftung übernommen. Gebrauchte Geräte (Pipettenspitzen, Kulturröhrchen) werden in den auf den Arbeitstischen aufgestellten Abfallbehältern entsorgt. Objektträger und sonstige Glasabfälle werden in das gekennzeichnete Becherglas gegeben. Die Ölimmersions-Objektive der Mikroskope sind nach der Benutzung mit einem mit Alkohol benetzten Tuch vorsichtig zu reinigen. Vorsicht!! Bunsenbrenner!! (Haare, Kittel, Hände, Kittel, Steckdosen, Kabel) Bei Unklarheiten bitte rechtzeitig die Kursbetreuer um Rat fragen. Beimpfte Agarplatten nicht offen stehen lassen. Die am 1. Kurstag beimpften Agarplatten werden verschlossen und auf der Unterseite mit GruppenNr. (A1, A2, D2), Name und Versuchstag beschriftet. Der Kursassistent legt die Aparplatten im Anschluss an alle Versuche in die entsprechenden Brutschränke. Am 2. Kurstag liegen dann die Platten entsprechend der Gruppennummern wieder aus. 5

6 Desinfektion und Sterilisation Desinfektion: Ziel ist das Abtöten pathogener Mikroorganismen Sterilisation: Ziel ist das Abtöten aller Bakterien (inkl. Sporen), Pilze und Protozoen, sowie die Inaktivierung von Viren in einem Material. Hygienische und chirurgische Händedesinfektion Bei der ortständigen Besiedelung mit Bakterien handelt es sich um die residente grampositive Flora, die bis in die Tiefen der Spaltlinien und entlang den Hautanhangsgebilden sitzt. Oberflächliche und immer wieder wechselnde Bakterien stellen die transiente Flora dar, die häufig auch gramnegativ sein kann. Zur korrekten Desinfektion dürfen nur nach VAH-Liste (Verbund für angewandte Hygiene) bzw. Standardzulassung gemäß Arzneimittelgesetz 36 zugelassene, alkoholische Hautdesinfektionsmittel verwendet werden. Der Vorgang der hygienischen Händedesinfektion hat zum Ziel, die Übertragung von Krankheitserregern zu verhindern. Dies soll durch die Abtötung der transienten Flora erreicht werden. Durch die hygienische Händedesinfektion kann eine Keimübertragung von Mensch zu Mensch oder auch Arzt bzw. von Pflegepersonal auf den Patienten weitgehend vermieden werden. Sie ist ein wesentlicher Bestandteil der Prophylaxe von Hospitalinfektionen. Die hygienische Händedesinfektion muss jedes Mal vor dem Verlassen des Praktikumsraumes durchgeführt werden!!! Die chirurgische Händedesinfektion hat zum Ziel, neben der transienten auch möglichst die gesamte residente Flora zu beseitigen. Sie wird vor operativen Eingriffen durchgeführt. Durchführung der hygienischen Händedesinfektion: ausreichende Menge (mind. 3 ml) des Desinfektionsmittels mittels Ellenbogentechnik aus Desinfektionsmittelspender entnehmen Desinfektionsmittel über sämtliche Bereiche der trockenen Hände unter besonderer Berücksichtigung der Innen- und Außenflächen einschließlich Handgelenken, Flächen zwischen den Fingern, Fingerspitzen, Nagelfalze und Daumen einreiben für die Dauer der Einwirkzeit von 30 Sekunden feucht halten Durchführung der chirurgischen Händedesinfektion: vor der chirurgischen Händedesinfektion werden Hände und Unterarme mit nach oben gerichteten Fingerspitzen und tieferliegenden Ellenbogen gewaschen (1 Min.) ausschließlich Nägel und Nagelfalzen sollen bei Bedarf mit weicher, desinfizierter Kunststoffbürste und hygienischen Handwaschpräparaten gereinigt werden trocknen der Hände mit einem keimarmen Einmal-Handtuch einreiben der Hände und Unterarme nach Drei-Drittel-Regel mit einem Hautdesinfektionsmittel (5 Min.), wobei die gesamte Hautoberfläche bis zum Ellenbogen 3 Minuten benetzt sein muss 6

7 1. Praktikumstag 1. Mikroorganismen in der Mund- und Rachenflora Theoretischer Hintergrund und medizinische Relevanz: Mundhöhle und Rachen sind von zahlreichen apathogenen Mikroorganismen besiedelt. Strikt anaerobe Keime (Bakterien, die bei Zutritt von Sauerstoff in Oberflächenkulturen nicht wachsen können) überwiegen mindestens um den Faktor 30 über aerobe Keime; daneben können Pilze und Protozoen in geringer Menge vorkommen. Unter den aeroben Keimen überwiegen vergrünende Streptokokken, apathogene Neisserien (gramnegative Kokken) und apathogene Corynebakterien (grampositive Stäbchen). Der Rachenflora kommt eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Zahnkaries zu, da es auf Zahnbelägen aus nicht verdauten Kohlenhydraten zur Vermehrung von säureproduzierenden Streptokokken kommt. Diese Keime sind in der Lage, hochmolekulare Kohlenhydrate zu produzieren, die sie vor einer Zerstörung durch das bakterizide Speichelenzym Lysozym schützen. Unter dieser Schicht wird der Zahnschmelz demineralisiert. Daneben kommen in geringer Anzahl häufig auch Keime vor, die bei massenhaftem Auftreten oder eindeutiger klinischer Symptomatik als Krankheitserreger gelten müssen (z.b. ß- hämolysierende Streptokokken, Haemophilus influenzae). Es zeigt sich hier das Problem einer quantitativen Beurteilung der Flora in physiologischer Weise mit Mikroorganismen besiedelten Körperregionen. Material: Blutagarplatte für jeden Teilnehmer eine Agarplatte steriler Abstrichtupfer Filzschreiber (Edding) Bunsenbrenner Impföse Ausführung: Eine Blutagarplatte wird auf der Rückseite mit den Initialen des Studenten und der Gruppennummer als auch der Versuchsnummer beschriftet. - Entnahme des Tonsillenabstrichs (Tupfer vorsichtig an die Tonsillen heranbringen und unter drehenden Bewegungen abstreichen. Wichtig: Berührung mit sonstigen Regionen der Mundhöhle vermeiden! - mit Tupfer eine Hälfte der Blutagarplatte beimpfen. - fraktioniertes Ausstreichen auf der Agarplatte siehe Abbildung Seite 9 - Die Platten werden verschlossen und ins Regal mit dem Deckel nach unten gelegt. Der Betreuer legt die Platten anschließend für 2 Tage in den 37 C Brutschrank. Am 2. Kurstag werden die Ergebnisse ausgewertet (Seite 27). 7

8 2. Differentialausstrich Theoretischer Hintergrund: Einzellige Mikroorganismen (Bakterien und Hefen) vermehren sich auf geeigneten Nährmedien meist sehr rasch (Generationszeiten: wenige Minuten bis Stunden) durch vegetative Teilung. Auf festen Nährböden (Agarplatten) kann eine einzelne Zelle in wenigen Tagen zu einer Einzelkolonie mit ca Zellen und mehreren mm Durchmesser heranwachsen, die einen Klon identischer Zellen darstellt. Einzelkolonien verschiedener Mikroorganismen unterscheiden sich häufig durch ihre Größe, Form und Farbe, so dass eine Identifizierung möglich ist. Durch einen Verdünnungsausstrich auf einer geeigneten Agarplatte ist es oft möglich, aus einem Gemisch verschiedener Mikroorganismen einzelne, charakteristische Einzelkolonien zu gewinnen, mit deren Hilfe der Mikroorganismus weiter charakterisiert und durch weitere Untersuchungen (z.b. der Stoffwechselleistungen) genau identifiziert werden kann. Im folgenden Versuch sollen mehrere verschiedene Arten von Mikroorganismen getrennt und ihr relativer Anteil in einer Mischkultur bestimmt werden. Die auf dem Nährmedium gewachsenen Organismen werden am zweiten Praktikumstag makroskopisch und mikroskopisch charakterisiert. Medizinische Relevanz: Die Gewinnung von Reinkulturen eines Erregers ist eine unabdingbare Voraussetzung für die exakte Diagnostik von Infektionskrankheiten. In der Regel werden aus dem Untersuchungsmaterial (Blut, Abstriche, Körperflüssigkeiten, Stuhlproben) zunächst Anreicherungskulturen angelegt, aus denen sich durch einen Differentialausstrich auf einem geeigneten Agar-Nährboden Einzelkolonien gewinnen lassen. Diese können als kleine Reinkulturen für die weitere mikroskopische, biochemische und immunologische Charakterisierung des Mikroorganismus verwendet werden. Material: YPD-Agarplatte für jeden Teilnehmer eine Agarplatte Reaktionsgefäß (Eppi) mit einer Mischkultur M Impföse Bunsenbrenner Filsschreiber (Edding) Vortex Ausführung: Die Mischkultur auf dem Vortex (Wirlmix) mischen. Von der Mischkultur wird eine kleine Menge mit der sterilen Impfösen wie im folgenden Schema beschrieben, (3-Ösen-Ausstrich nachfolgende Seite) gezeigt ausgestrichen. Das fraktionierte Ausstreichen wird vom Kursbetreuer gezeigt. Die Platte wird verschlossen und auf der Rückseite mit Gruppennummer, Name und Versuchsnummer beschriftet und mit dem Deckel nach unten ins Regal gelegt. Der Betreuer legt die Platten anschließend für 2 Tage in den 30 C Brutschrank. Am 2. Kurstag werden die Ergebnisse ausgewertet (Seite 27). Dabei soll die relative Zahl der verschiedenen Mikroorganismen bestimmt und von je einer repräsentativen Einzelkultur ein mit Methylenblaufärbung gefärbtes Präparat mikroskopisch untersucht werden.. 8

9 3-Ösen-Ausstrich Um Bakterien zu isolieren werden diese auf YPD- Agar mit dem 3-Ösenausstrich vereinzelt und das Wachstum der colony forming units (CFU) abgewartet. Mit der ausgeglühten und abgekühlten Öse wird einmalig in das mit Keimen (M) beschriftete Eppendorfgefäß Probe entnommen und im Zick-Zack vom Rand zur Mitte auf einem Drittel der Agar-Oberfläche verteilt. Die Öse wird wieder ausgeglüht und nach Abkühlen zieht man sie einmal durch das bereits beimpfte Feld und dann im Zick-Zack über das zweite Drittel des Nährbodens. Nach Ausglühen wird in analoger Weise das letzte Drittel beimpft, nachdem man die Impföse einmal durch das zweite Drittel gezogen hat Mit einer ausgeglühten und wieder erkalteten Impföse etwas Material entnehmen. Die Hälfte der Platte mit einer engen Zickzacklinie beimpfen. Öse ausglühen und erkalten lassen. Kein neues Material entnehmen! Impföse einmal durch den bereits beimpften Bereich führen und ohne abzusetzen das nächste Viertel in einer engen Zickzacklinie beimpfen. Öse ausglühen und erkalten lassen. Kein neues Material entnehmen! Impföse einmal durch den zuletzt beimpften Bereich führen und ohne abzusetzen das letzte Viertel in einer engen Zickzacklinie beimpfen. 9

10 Temperaturzonen bei einer Flamme am Beispiel einer Kerze 10

11 3. Gärversuch Theoretischer Hintergrund: Heterotrophe Mikroorganismen sind meist in der Lage, ihren gesamten Nährstoffbedarf aus einfachen organischen Verbindungen zu bestreiten. Aus diesen können nicht nur die komplexen Zellstrukturen aufgebaut sondern auch die für Wachstum und Vermehrung benötigten Energien gewonnen werden. Besonders günstige C-Quellen sind verschiedene Zucker. Zucker sind eine Untergruppe der Kohlenhydrate, sie enthalten Kohlenstoff (C) und die Elemente des Wassers (H 2 O) im Verhältnis C 6 (H 2 O) 6. Zucker sind entweder Polyhydroxyaldehyde (Aldosen) oder Polyhydroxyketone (Ketosen). Für Mikroorganismen sind die meisten Zucker hervorragende Kohlenstoff- und Energiequellen. Minimale Strukturunterschiede können jedoch tiefgreifende Auswirkungen auf die biologische Verwertbarkeit spezifischer Zucker haben. In den Mikrobenzellen können die Zucker unter Gewinnung von ATP abgebaut werden (Gärung), dabei entstehen Gas (CO 2 ) und verschiedene organische Säuren (z.b. Milchsäure oder Essigsäure).Verschiedene Mikroorganismen unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit bestimmte Zucker zu vergären, so dass diese Eigenschaft zur Charakterisierung eines unbekannten Organismus verwendet werden kann. Im folgenden Versuch werden die beiden epimeren Einfachzucker (Monosaccharide) Glucose und Galactose verwendet, die sich lediglich durch die räumliche Anordnung (Konfiguration) der alkoholischen Hydroxylgruppe C-Atom 4 (Abb. 4) unterscheiden. Daneben werden auch die aus zwei Glucoseeinheiten zusammengesetzten Doppelzucker (Disaccharide) Maltose und Cellobiose eingesetzt, die sich nur durch die räumliche Anordnung der Bindung zwischen den beiden Glucoseeinheiten (α glycosidisch bzw. ß glycosidisch) unterscheiden, sonst jedoch völlig identisch sind (Abb.5). Diese scheinbar geringfügigen Strukturunterschiede haben einen tiefgreifenden Einfluss auf die biologische Wertigkeit dieser Zucker. Glucose (Traubenzucker) ist für fast alle Mikroorganismen eine hervorragende C-Quelle. Galactose (ein Bestandteil des Milchzuckers) kann dagegen nicht von allen Mikroorganismen verwertet werden. Ähnliches gilt für Maltose und Cellobiose. Während viele Organismen aus Maltose (dem Grundbaustein der pflanzlichen und tierischen Stärke) Glucose freisetzen können, vermögen nur einige wenige spezialisierte Pilze und Protozoen Cellobiose (Grundbaustein der Cellulose) in die beiden Glucosemoleküle aufzuspalten. 11

12 In der Regel werden Einfachzucker wie Glucose und sein Epimer Galaktose gut verwertet. Die aus zwei Zuckereinheiten zusammengesetzten Disaccharide Maltose (α Glucosyl-(1-4)-Glucosid) und Cellobiose (ß-Glucosyl-(1-4) -Glucosid) (vgl. Abb. 5) können dagegen nicht von allen Mikroorganismen in die beiden Zuckereinheiten gespalten und verwertet werden. Die Verwertung bestimmter C-Quellen lässt sich in einem einfachen Kulturversuch überprüfen. Dabei wird in einem Kulturröhrchen ein nährstofffreies Basismedium(dieses enthält einen Säureindikator) gegeben, mit der zu untersuchenden C-Quelle versetzt und einer Kultur des Mikroorganismus beimpft. Zusätzlich enthält das Kulturmedium eine Gasfalle (sog. Durham-Röhrchen), in der sich gebildetes CO2 fängt. Kann die zugesetzte C- Quelle vergoren werden, führt die Säurebildung zum Farbumschlag des Indikators und in der Falle fängt sich eine Gasblase. Medizinische Relevanz: Auch in der menschlichen Ernährung spielen Kohlenhydrate, besonders Polymere der Glucose wie Stärke und Glykogen, sowie Galaktose als Bestandteil des Milchzuckers Lactose (ß-Galaktosyl-1 4 Glucosid) eine wichtige Rolle. Von Gesunden wird die aus Lactose durch das Verdauungsenzym Lactase freigesetzte Galaktose im Stoffwechsel zu Glucose epimerisiert. Seltene angeborene Enzymdefekte in diesem Stoffwechselweg können jedoch die Verwertung von Galaktose unmöglich machen und zum Krankheitsbild der Galaktosämie führen. Dabei staut sich die unverwertete Galaktose im Blut an und führt zu einer schweren, unbehandelt tödlichen, Vergiftung des Gehirns. Bei einer rechtzeitigen Diagnose kann jedoch durch eine frühzeitige Behandlung eine Schädigung der Kinder vollständig verhindert werden. 12

13 Material: 8 Kulturröhrchen (mit Durham-Röhrchen) mit je 5 ml Minimalmedium + Bromthymolblau als Säureindikator (Umschlagpunkt ph 4,5). je 1 Plastikreagenzglas mit 3 ml 20 %ige Glucose-, Maltose-, Galaktose-, u. Cellobiose-Lösung. 2 Kulturröhrchen mit je 5 ml 0,5%ige Suspension eines Wildstammes und eines Laborstammes der Bäckerhefe Reagenzglasständer, 1 ml-pipette, Pipettenspitzen (blau), Filzschreiber Vortex Ausführung: -Beiden Kulturröhrchen mit den verschiedenen Hefestämmen auf dem Vortex mischen -8 Kulturröhrchen auf dem Glas, nicht auf dem Deckel, nummerieren -nach Angaben des Pipettierplans mit den entsprechenden Hefestämmen und Zuckerlösungen versetzt. Die Ansätze danach vorsichtig mischen (keinen Vortex nehmen, da keine Luftblasen in die Gasfallen gelangen dürfen) -An die vorgesehenen Gruppennummerplätze für den 2. Kurstag ins Regal gestellt. Die Versuchsergebnisse zur Gas- und Säurebildung (+/-) werden am 2. Kurstag in der Tabelle protokolliert. Pipettierplan: Kulturröhrchen -Nr. Hefe stamm Zucker Wildstamm (WS) 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml Laborstamm (LS) 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml Glucose 1,0 ml 1,0 ml Galaktose 1,0 ml 1,0 ml Maltose 1,0 ml 1,0 ml Cellobiose 1,0 ml 1,0 ml 13

14 Auswertung Die Verwertung der verschiedenen Zucker [Gas- und Säurebildung (+/-)] wird in der folgenden Tabelle protokolliert. Glucose Galactose Maltose Cellobiose Gas Säure Gas Säure Gas Säure Gas Säure Wildstamm Laborstamm In ähnlicher Weise werden in der klinischen Diagnostik Tests zur Bestimmung bestimmter Keime (API 20 für Enterobacterien oder API Candida für Hefen) in sogenannten bunten Reihen durchgeführt. Im Anhang Keimidentifikation bunte Reihe 14

15 4. Antibiotika/ Resistenzbestimmung Theoretischer Hintergrund und medizinische Relevanz: Antibiotika sind sehr komplexe organische Verbindungen, die von einigen Mikroorgansimen (Bes. Streptomyceten und Pilzen) in die Umgebung ausgeschieden werden und die in anderen Mikroorganismen grundlegende Lebensprozesse (z.b. Replikation, Genexpression oder die Zellwandbiosynthese) blockieren. Etwaige Nahrungskonkurrenten werden dadurch abgetötet zumindest in ihrem Wachstum gehemmt. Penicillin (Abb.6), das von einigen filamentösen Pilzen der Gattung Penicillium sezerniert wird, hemmt spezifisch eine essentielle Reaktion in der Biosynthese des Mureins der Zellwand. Das Außenskelett wachsender Bakterien verliert dadurch an Festigkeit und die Bakterienzellen werden durch osmotische Lyse zerstört. Da Murein ausschließlich in den Zellwänden von Prokaryonten vorkommt, ist dieses Antibiotikum spezifisch nur gegen Bakterien wirksam und kann zur Therapie bei bakteriellen Infektionen eingesetzt werden. Der wichtigste Strukturbestandteil des Penicillins ist der sog.ß-lactamring (vgl. Abb. 6)der für die Wirkung auf die Mureinsynthese verantwortlich ist. Viele an sich penicillinempfindliche Bakterien können durch Bildung des Enzymes ß-Lactamase (=Penicillinase), das den ß- Lactamring hydrolytisch spaltet, gegenüber dem Antibiotikum resistent werden, jedoch kann das native Penicillinmolekül durch chemische Strukturveränderungen gegenüber ß- Lactamase resistent gemacht werden. Die pharmazeutische Industrie bietet eine Reihe von substituierten Penicillinen (darunter auch Oxacillin) an, die durch Lactamase nicht mehr gespalten werden können und deshalb erfolgreich gegen Penicillin-resistente Bakterien eingesetzt werden. Eine antibiotische Therapie verspricht aber nur Erfolg, wenn das Antibiotikum gegen den Krankheitserreger wirksam ist, bzw. keine Resistenz vorliegt. Die Wirksamkeit von Antibiotika kann mit verschiedenen Methoden überprüft werden. Die am häufigsten verbreitete Methode ist der Agardiffusionstest 15

16 Abb.7. Bei dem ein mit dem zu testenden Antibiotikum getränkter Filterpapierstreifen auf eine mit dem Keim beimpfte Agarplatte gelegt wird. Aus der Größe der Hemmhöfe lassen sich Rückschlüsse auf die Empfindlichkeit des Bakteriums ziehen. Die theoretischen Grundlagen dieses Verfahrens sowie weitere Methoden der Resistenzbestimmung werden im Kursus der Medizinischen Mikrobiologie (5. Semester) behandelt. Staphylococcus epidermidis ist ein Bestandteil der normalen Hautflora, der aber bei bestimmen Patienten auch Infektionen hervorrufen kann. Dies ist auf seine Fähigkeit an Polymeren zu binden zurückzuführen Im Krankenhaus aber kann er bei abwehrgeschwächten Menschen bei Unsauberkeit eine Ursache für schwere Erkrankungen (sog. nonosomiale Infektion) sein. Im folgenden Versuch sollen zwei S.epidermis-Isolate (genetisch minimal veränderte Stämme) auf Ihre Empfindlichkeit gegen Penicillin G und Oxacillin (einem Penicillinase-festen Penicillinderivat) hin untersucht werden. 16

17 Material: Flüssigkultur von 2 Staphylococcus epidermidis-stämmen (Staph 1 und 2) 2 Reagenzgläser mit 2 ml physiolog. NaCl (steril) Wattetupfer 2 Müller-Hinton-Agarplatten Penicillin (P)- und Oxacillin (Ox)-Testblättchen Pinzette Ausführung von beiden Bakterienkulturen werden Verdünnungen hergestellt, indem man 100µl der zuvor gevortexten Kultur in ein Röhrchen mit 2 ml physiolog. NaCl pipettiert aus jeder Verdünnung wird mit einem Wattetupfer eine Müller-Hinton-Agarplatte gleichmässig mit Bakterien beimpft mit einer Pinzette wird je ein Penicillin (P)- und Oxacillin (Ox)-Testblättchen mit der Pinzette aufgelegt und leicht angedrückt Platten mit dem Deckel nach oben ins Regal legen die Müller-Hinton-Agarplatten werden bei 37 C über Nacht bebrütet Auswertung: Die Hemmhofdurchmesser werden ausgemessen und anhand folgender Tabelle interpretiert: empfindlich (E) resistent (R) Penicillin 10 U 29 mm 28 mm Oxacillin 1 µg 18 mm 17 mm Staph-1 Staph-2 Penicillin 10 U Oxacillin 1 µg 17

18 5. Wachstum und Nachweis von Bakteriophagen (Bakterienviren) Theoretischer Hintergrund: Viren sind sehr kleine (> 100nm) Partikel, die an der Grenze zwischen unbelebten Makromolekülkomplexen und sehr einfachen lebenden Organismen stehen. Sie bestehen praktisch nur aus einem Innenkörper, einem DNA-oder RNA-Molekül, das ihre gesamte genetische Information enthält, und einer Schutzhülle aus Proteinen (Kapsid). Viren haben keinen eigenen Stoffwechsel und können daher Nährstoffe weder aufnehmen noch verwerten. Auf der anderen Seite besitzt jedes Viruspartikel (Virion) die vollständige genetische Information für seine Vermehrung. Eine Fortpflanzung findet jedoch nur statt, wenn das Virus in eine geeignete Wirtszelle eindringen und ihren Stoffwechsel auf die Produktion von Viruspartikeln umprogrammieren kann. Die infizierte Wirtszelle produziert bis zu mehreren hundert neue Viruspartikel und geht in der Regel selbst dabei zugrunde. Viren sind auf bestimmte Wirtszellen spezialisiert. So vermehren sich z. B. bakterielle Viren, die als Bakteriophagen oder Phagen bezeichnet werden, nur in geeigneten Bakterienzellen, wobei meistens nur eine oder wenige verwandte Bakterienarten von einem bestimmten Phagen infiziert werden können. So infiziert z.b. der hier verwendete Bakteriophage T4 spezifisch bestimmte Stämme des Enterobakteriums Escherichia coli. Der Nachweis von Bakteriophagen lässt sich am einfachsten aufgrund ihrer Infektiosität für das Wirtsbakterium führen. Dazu wird ein kleines Volumen einer Phagensuspension mit einer großen Zahl von Wirtsbakterien gemischt. Die Mischung wird gleichmäßig auf einem Nähragar verteilt, so dass die Bakterien zu einer homogenen Zellschicht ( Zellrasen ) auswachsen. In diesem Rasen bilden diejenigen Bakterien, die mit einem Phagen infiziert wurden, ein infektiöses Zentrum, von dem aus benachbarte Zellen ebenfalls infiziert und zerstört werden. Da Bakteriophagen sich nur in wachsenden Zellen vermehren können, wiederholt sich der Infektionsprozess nur solange, bis die Wirtszellen das Wachstum aus Nährstoffmangel einstellen. Zu diesem Zeitpunkt ist im Bereich des infektiösen Zentrums der Bakterienrasen zerstört. Es hat sich ein mehrere mm großes kreisrundes Loch ( Plaque ) gebildet. Bei geeigneter Verdünnung der Phagensuspension ist jeder Plaque von einem einzelnen Viruspartikel verursacht, so dass sich aus der Zahl der Plaques die Anzahl der infektiösen Partikel in der Suspension (= Virustiter ) errechnen lässt. Medizinische Relevanz: In der Medizin haben Bakteriophagen nur eine untergeordnete Bedeutung. Versuche, bakteriell bedingte Infektionskrankheiten durch spezifische gegen Erreger gerichtete Phagen zu bekämpfen, erwiesen sich als erfolglos. Dagegen spielen Infektionen durch animalische Viren (z.b. Grippe, Hepatitis, Pocken, Masern, Röteln, Windpocken, sowie AIDS) in der medizinischen Praxis eine ungeheure Rolle. Auch bei diesen Viruskrankheiten führt die Infektion zu einer lytischen Zerstörung der Wirtszelle, die je nachdem betroffenen Organe zu den charakteristischen Krankheitssymtomen führen. Da es sich bei Viren um intracelluläre Parasiten handelt, die den Stoffwechsel der Wirtszelle nutzen, ist eine Behandlung mit Antibiotika zwecklos und gefährlich. Problem der Entwicklung antiviraler Medikamente Da Viren beziehungsweise Virionen im Gegensatz zu Bakterien keine Zellen sind, können sie auch nicht wie solche abgetötet werden. Es ist lediglich möglich, eine virale Infektion und die 18

19 Virusvermehrung durch Virostatika zu be- oder zu verhindern. Besonders die biochemischen Vermehrungsabläufe können von Virusart zu Virusart sehr unterschiedlich sein, was die Findung eines hemmenden oder unterbindenden Wirkstoffes erschwert. Da die Vermehrung der Viren im Inneren von normalen Zellen stattfindet und sich dort sehr eng an die zentralen biochemischen Zellmechanismen ankoppelt, müssen die in Frage kommenden antiviralen Wirkstoffe entweder das Eindringen der Virionen in die Wirtszellen verhindern, in den Zellstoffwechsel zum Nachteil der Virusvermehrung eingreifen, oder nach einer möglichen Virusvermehrung in den Zellen das Austreten der neuen Viren aus den Zellen unterbinden. Andererseits müssen diese gesuchten Wirkstoffe jedoch auch für den Körperstoffwechsel, den Zellverband und/oder den internen Zellstoffwechsel insgesamt verträglich sein, da sonst nicht nur beispielsweise die Virusvermehrung in den Zellen zum Erliegen kommt, sondern schlimmstenfalls auch das (Zell-)Leben des gesamten behandelten Organismus. Weil diese Bedingungen sehr schwer zu vereinbaren sind, sind die bisher entwickelten antiviralen Medikamente auch oft mit schweren Nebenwirkungsrisiken verbunden. Es handelt sich um eine Gratwanderung, welche die Medizin bislang meist vor eine unlösbare Aufgabe stellt. Verschärft wird die Entwicklung von effektiven antiviralen Medikamenten außerdem durch die Resistenzentwicklung von Seiten der zu bekämpfenden Viren gegenüber einem einmal gefundenen, brauchbaren Wirkstoff, zu der sie auf Grund ihres extrem schnell ablaufenden Vermehrungszyklus und der biochemischen Eigenart dieser Replikation gut in der Lage sind. Der Virentiter Der Titer ist in der Biologie und Medizin ein Maß für eine Konzentration, z. B. eines Antikörpers, Antigens oder eines Virus. Er wird dadurch bestimmt, dass die Probe fortlaufend verdünnt wird und mit den Verdünnungen ein bestimmter Test auf den zu bestimmenden Stoff (z. B. Elisa/ Immunoassay) durchgeführt wird. Die weitestgehende Verdünnung, bei der noch eine Reaktion nachweisbar ist, wird als Titer angegeben. Die Ermittlung des Titers war früher eine übliche Methode, um eine Immunität nach einer Impfung oder den Anstieg der Konzentration von Antikörpern während einer akuten Infektionskrankheit zu beurteilen. In der Regel wird zum Beispiel ein Blutserum in Zweierstufen verdünnt, d. h. Verdünnungen von 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 usw. hergestellt. Die Verdünnungen gibt man dann z. B. auf Zellkulturen, die dann mit einem Virus infiziert werden. Die höchste Verdünnungsstufe, bei der noch eine Infektion der Zellen vollständig verhindert wird (also noch ausreichend Antikörper vorhanden sind), wird als Titer angegeben. Ein Titer von 1:1024 gibt also eine höhere Konzentration an als 1:128, da trotz höherer Verdünnung noch eine positive Reaktion des Tests festzustellen war. Die Angabe des Titers ist heute aufgrund moderner und einfacherer Verfahren zur Antikörper- oder Antigenbestimmung ungebräuchlich geworden. Nur bei wenigen Krankheitserregern ist eine Verdünnungsreihe noch notwendig, wenn ein Neutralisationstest oder eine Komplementbindungsreaktion durchgeführt werden muss. Auch bei der manchmal noch gebräuchlichen Bestimmung des Rötelntiters haben doch andere Verfahren zur Feststellung einer Immunität den Titer weitgehend verdrängt. Aber selbst wenn heute in der Serologie Antikörperkonzentrationen in ng/ml oder IE/ml angegeben werden, wird der Begriff Titer für diese Angaben fälschlicherweise verwendet. 19

20 Material: Ausführung: 2 Petrischalen mit LB-Agar 2 Plastikreagenzgläser mit Weichagar im 50 C Wasserbad Reaktionsgefäß (Eppi) mit Phagensuspension P Reaktionsgefäß (Eppi) mit 0,9ml Natriumchloridlösung NaCl Reaktionsgefäß (Eppi) mit E.coli Kultur E 0,1 ml bzw. 100 µl Pipette gelbe Pipettenspitzen Filzschreiber (Edding) Beide LB-Platten mit dem Edding am Rand beschriften, (GruppenNr., verdünnt oder unverdünnt) Phagen und E.coli Lösungen vortexen 100 µl der gemischten Phagenlösung in das Eppi mit den 0,9ml Natriumchloridlösung geben (entstandene Verdünnung 1:10 der Ursprungsphagenlösung Zügiges Arbeiten ist nun wichtig, da der Weichagar schnell erkaltet und sich ansonsten ungleichmäßig verfestigt 100 µl der unverdünnten Phagenlösung und 100 µl E.coli-Kultur in den Weichagar (am Wasserbad) pipettieren 3x schwenken und den mit Phagen und E.coli versetzten Weichagar auf die entsprechende LB-Platte gießen und gleichmäßig verteilen 100 µl der verdünnten Phagenlösung und 100 µl E.colil-Kultur in den Weichagar (am Wasserbad) pipettieren 3x schwenken und den mit Phagen und E.coli versetzten Weichagar auf die entsprechende LB-Platte gießen und gleichmäßig verteilen Beide Platten mit dem Deckel nach oben am Arbeitsplatz stehen lassen. Auswertung: Am 2. Kurstag werden die entstandenen Plaques ausgezählt (Phagenanzahl/ml) und derdurchschnittswert aller Arbeitsgruppen der unverdünnten Phagensuspension bestimmt. Anhand der auf beiden Platten ausgezählten Plaques wird die Anzahl der in der Suspension enthaltenen Phagen errechnet. (Verdünnungsfaktor beachten!) Ergebnis: Die Anzahl der Phagen in eine ml Suspension ist: Phagenpartikel/ml 20

21 2. Praktikumstag Laufzettel: 1.Wachstumskurve von E.coli - alle 30 min Trübung im Photometer messen -Werte im Graphen eintragen - nach 90 min. anhand es Graphen kontrollieren, ob die Verdopplungsrate bestimmt werden kann (Berechnung oder im Graphen ablesen 2. Objektträger von den verschiedenen Keimen (direkt nach der Wachstumskurve anfertigen) - Zwei Klone vom Rachenabstrich (Versuch 1) und 3 bis 4 der verschiedenen im Differentialausstrich (Versuch 2) gefundenen Kolonien auf je einen Objektträger geben, Anmerkung: Objektträger braucht zum Trocknen Zeit. -eigene Objekte mikroskopieren und es in den entsprechenden Tabellen protokollieren. -als Vergleich die bereitliegenden Objekte anschauen. 3. Gärversuch auswerten -Farbveränderung und Gasbildung protokollieren und evtl. quantifizieren. 4. Antibiotika-Versuch -Hemmhöfe ausmessen (Angabe im Skript in Millimetern) 5. Bakteriophagen-Versuch -Plaques (Löcher) zählen -Phagentiter/ml berechnen (Achtung Verdünnung beachten) -Werte an die Tafel schreiben 21

22 6. Wachstumskurve von E.coli Theoretischer Hintergrund: Das Wachstum von Mikroorganismen kann entweder als Zunahme der Zellmasse oder als Zunahme der Zellzahl gemessen werden. Am einfachsten lässt sich die Zunahme der Zellzahl durch eine Trübungsmessung verfolgen. Licht, das durch eine Suspension von einzelligen Mikroorganismen fällt, wird an den Zellen gestreut; die Suspension sieht daher trüber aus. Der Grad der Trübung (Tr) ist der Dichte der Suspension über einen weiten Bereich direkt proportional (Tr=kN), so dass eine einfache Trübungsmessung Aufschluß über die Zellzahl (N) geben kann. In einem geeigneten flüssigen Nährmedium leben Mikroorganismen in der Anfangsphase in der kein Wachstum stattfindet (lag-phase) (A), mit einer konstanten Generationszeit. Das bedeutet, dass sich die Zellzahl in der Kultur nach jeweils einer Generationszeit verdoppelt. Die Zunahme der Zellzahl mit der Zeit folgt also einer Exponentialfunktion N t = N 0 x2 g wobei N t und N 0 die Zellzahlen zu den Zeiten t bzw. 0 (Beginn des Exponentialwachstums) und g die Anzahl der Zellteilungen zwischen den Zeitpunkten 0 und t bedeuten. Man spricht deshalb von einem exponentiellen Wachstum der Kultur (exponentielle oder log-phase). (B) Exponentielles Wachstum kann nur solange anhalten wie Nährstoffe im Kulturmedium zur Verfügung stehen. Sind die Nahrungs- und Energiequellen verbraucht, so hört das Wachstum auf und die Kultur geht zunächst in die stationäre Phase (C) über, in der die Zellzahl sich nicht mehr verändert. Nach längerer Zeit kommt es dann schließlich zur Absterbephase (D), in der die Zellzahl langsam absinkt. 22

23 Material: Suspension von E.coli Erlenmeyerkolben mit 10 ml sterilem LB-Medium 1 ml Pipette mit blauen Pipettenspitzen 1ml Küvetten (Halbmikroküvetten) 37 C Wasserbad Photometer Ausführung: 1ml Nährmedium aus dem Kolben entnehmen und in eine Küvette pipettieren (dient als Vergleichslösung für die Messung, man bezeichnet diese Probe als Leerwertprobe) Zu dem mit Nährmedium gefüllten Erlenmeyerkolben wird nun 1ml E.coli Suspension hinzupipettiert Kolben schwenken, damit eine gleichmäßige Suspension entsteht Aus dem Kolben 1ml entnehmen und in eine weitere Küvette füllen. Beide Proben - Leerwert und die frisch mit E.coli beimpfte Probe (to min) - werden nun am Photometer bei 600nm vermessen. Zuerst wird der Leerwert in das Photometer gestellt, dann wird ein Nullabgleich (Zero) durchgeführt und die beimpfte Probe vermessen und der abgelesene Wert in der angeführten Tabelle notiert. Der Kolben wird nun in das 37 C Wasserbad gestellt und geschüttelt. Da es sich hierbei um eine Zeitkurve handelt, wird in Abständen von je 30 min weitere 1ml Proben aus dem Kolben genommen und gegen den Leerwert vermessen. Nicht vergessen den Kolben wieder in das Wasserbad zurückzustellen Zeit (min) Trübung (o.d600nm) Zeit (min) Trübung (o.d600nm) In den Pausen zwischen den Probenentnahmen und Messungen werden die Ergebnisse der Versuche des ersten Versuchstages ausgewertet und protokolliert. 23

24 Auswertung Die gemessenen Trübungswerte werden in das vorgegebene halblogarithmische Koordinatensystem eingezeichnet und die Punkte durch eine Kurve verbunden. Aus dem linearen Abschnitt der Wachstumskurve kann die Verdopplungszeit (td), die benötigt wird um die Zellzahl in der Kultur zu verdoppeln und die der Generationszeit entspricht, direkt abgelesen oder nach der Formel td = 2 ( 2 1) log 2 1 berechnet, wobei t 1 ; t 2 und N 1 ; N 2 die Zeiten bzw. Zellzahlen zu Beginn und Ende des exponentiellen Wachstums bedeuten: Ergebnis: Unter den verwendeten Versuchsbedingungen beträgt die Generationszeit der Bakterien min. 24

25 Wachstumskurve von E.coli Trübung (od600nm) Zeit (min) 0 min 25

26 7. Mikroskopischer Nachweis von Bakterien (Methylenblau-Färbung) Mithilfe dieser Färbemethoden werden 2 bis 3 unterschiedliche Kolonien von Hautkeimen (Versuch 1) und 3 bis 4 der verschiedenen im Differentialausstrich (Versuch 2) gefundenen Kolonien untersucht. Die Ergebnisse der Färbung werden wie in der nachfolgenden Tabelle bei der Auswertung nach morphologischen und mikroskopischen Kriterien von Versuch 1 und Versuch 2 protokolliert. Material: Ausführung: Objektträger, schwarze Kachel Glasschreiber zur Nummerierung der Objektträger phys. NaCl in Tropfflaschen Methylenblaulösung Filterblock Herstellung eines fixierten Präparates mit Kolonien einer Agarplatte: Objektträger auf die schwarze Kachel legen und mit dem Glasschreiber die Nummer des Präparates auf den Objektträger kratzen einen kleinen Tropfen NaCl in die Mitte des Objektträger geben Impföse ausglühen und auskühlen lassen mit der erkalteten Impföse eine Kolonie auf der Agarplatte leicht antippen Material im NaCl großflächig verteilen und komplett lufttrocknen lassen, bis kein Flüssigkeitsfilm auf dem Objektträger mehr sichtbar ist (damit mit dem nächsten Schritt die Bakterien nicht gekocht werden!!) Hitzefixierung: Objektträger mit der Bakterienseite nach oben (Pinzette, Schutzbrille) gleichmäßig der Länge nach durch die Flamme ziehen, diesesn Vorgang 3mal wiederholen Hitzefixierte Präparate auf die Färbebank am Waschbecken legen. Methylenblaulösung auf das Präparat für 1 min tropfen und nach 1 min unter fließendem Wasser Die überschüssige Farblösung unter fließendem Wasser abspülen Präparat in den Filterblock legen und abtrocknen. Mikroskopische Untersuchung der Präparate Auf das gefärbte Präparat einen Tropfen Immersionsöl geben und mit dem Ölimmersionsobjektiv (100fache Vergrößerung) bei offener Blende und hochgestelltem Kondensor mikroskopieren. Beurteilung der Bakterienform (Kokken, Stäbchen, Größe) und ihrer Lagerung (Ketten, Haufen). Nach dem Mikroskopieren wird das Objektiv mit 70%igem Alkohol gereinigt. Die selbst angefertigten Präparate werden in dem an den Waschbecken stehenden Plastikbechergläsern entsorgt und die Beispielpräparate zurück in den Objektträgerhalter gelegt. 26

27 Auswertung der Versuche Zu Versuch 1 (Rachenflora) Bestimmen Sie die Anzahl der Kolonien. Protokollieren Sie die Morphologie der Kolonien (Größe, Form, Farbe) und führen Sie mit den Mikroorganismen aus charakteristischen Kolonien eine Methylenblaufärbung durch. Protokollieren Sie die Morphologie der gefunden Mikroorganismen und versuchen Sie, sie aufgrund ihrer Form (Stäbchen, Kokken) und Lagebeziehung (Haufen, Ketten) zu charakterisieren. Charakterisieren Sie maximal drei Keime nach makroskopischen und mikroskopischen Kriterien. Hautkeim 1 Hautkeim 2 Hautkeim 3 Koloniemorphologie (Durchmesser, Farbe, Oberfläche glänzend oder matt, Geruch etc. Mikroskopie Vorbereitung der Proben siehe Aufgabenteil 7 Methylenblaufärbung Zu Versuch 2 (Differentialausstrich) Bestimmen Sie die Morphologie der gefundenen Keime nach Größe, Form und Farbe. Führen Sie mit den Mikroorganismen aus charakteristischen Kolonien eine Methylenblaufärbung durch. Protokollieren Sie die Morphologie der gefunden Mikroorganismen und versuchen Sie, sie aufgrund ihrer Form (Stäbchen, Kokken) und Lagebeziehung (Haufen, Ketten) und Größe zu charakterisieren. Charakterisieren Sie 3 Keime nach makroskopischen und mikroskopischen Kriterien und nehmen Sie noch 2 Keime von unterschiedlicher Größe auf einen Objektträger und mikroskopieren Sie diese. Keim 1 Keim 2 Keim3 Koloniemorphologie (Durchmesser, Farbe, Oberfläche glänzend oder matt, Geruch etc. Mikroskopie Vorbereitung der Proben siehe Aufgabenteil 7 27

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29 Glossar Absterbephase Aldose Agar Antibiotika apathogen Bakteriophagen bakterizid Blutagar denaturieren Desinfektion Disaccharid Einzelkolonie Enterobakterien Enzym epimere Zucker Endphase des Wachstums von Mikroorgansimen in der der Zelltod gegenüber der Zellteilung überwiegt Einfachzucker mit einer Aldehydgruppe (-CH=O) als wichtigste funktionelle Gruppe Aus einer Alge gewonnenes Polysaccharid, das bei hoher Temperatur flüssig ist und beim Abkühlen geliert. Das Gel kann durch Einschluss der unterschiedlichen Nährlösungen feste Nährböden für Mikroorganismen bilden. Von Mikroorganismen gebildete und ausgeschiedene hochkomplexe organische Verbindungen, die durch eine spezifische Hemmung zentraler Lebensprozesse andere Mikroorganismen abtöten oder im Wachstum hemmen kann, ncht krankheitserregend für Bakterien spezifische Viren abtötende Wirkung von Desinfektionsmitteln auf Bakterien Agarnährboden mit eingeschlossenen roten Blutkörperchen Zerstörung der nativen Raumstruktur (besonders von Proteinen) Abtötung aller Erreger übertragbarer Infektionskrankheiten Aus zwei über eine glykosidische Bindung verknüpfte Einfachzucker zusammengesetzt zu einem Doppelzucker Auf einem festen Nährboden (Agarplatte) durch vegetative Vermehrung aus einer einzelnen Zelle gewachsener Klon identischer Mikroorganismen. Eine Einzelkolonie stellt eine Reinkultur dar. In der Darmflora vorkommende, meist apathogene Bakterien, vorwiegend gramnegative Stäbchen. Zu ihnen gehören allerdings auch verschiedene Krankheitserreger. Katalytisch wirksames Protein, das spezifische biochemische Reaktionen zu beschleunigen vermag. Zucker, deren Konfiguration nur in einem einzigen asymmetrischen Zentrum unterschiedlich ist, wie z.b. Glucose und Galaktose 29

30 Galaktosämie Galaktose Generationszeit Genexpression Glucose Heterotroph(er) Stoffwechsel angeborene Stoffwechselkrankheit, bei der Galaktose nicht abgebaut werden kann. Hexose, Bestandteil des Milchzuckers Laktose Die Zeit, in der sich die Mikroorganismen verdoppeln Umsetzung der im Genom gespeicherten genetischen Information in spezifische funktionelle Genprodukte: Proteine (durch Transkription und Translation) oder rrna bzw. trna (nur Transkription) = Traubenzucker, wichtigstes Kohlenhydrat im Stoffwechsel Baustoffwechsel, der vorgefundene organische Moleküle als Kohlenstoffquelle verwendet. Einfachzucker mit einer Ketogruppe Ketose ß-Lactamring LB-Medium log-phase/ exponentielle Phase Membran, biologisch Minimalmedium Monosaccharide Müller-Hinton Agar Murein als wichtigste funktionelle Gruppe Lactame sind intramolekulare Säureamide. Der viergliedrige ß-Lactamring ist wesentlich für den antibiotischen Wirkungsmechanismus der sog. ß- Lactamantibiotika (Penicillin und Cephalosporin) Von den Biologen Luria und Burrows entwickeltes optimales Nährmedium für E.coli Phase der Wachastumskurve, in der sich die Zellen mit konstanter Generationszeit exponentiell teilen Biologische Membranen bestehen aus durch eingelagerte Proteine stabilisierte Lipiddoppelschichten Nährmedium, das lediglich die einfachsten für das Wachstum von Mikroorganismen unentbehrliche Nährstoffe enthält Einfachzucker Von Müller und Hinton entwickeltes Optimalmedium für den Antibiotika- Diffusionstest Charakteristisches netzartiges Bauelement der Bakterienzellwand aus langen Kohlenhydratketten, die durch kurze Peptideketten quervernetzt sind. Bei der Mureinsynthese wird die Ausbildung der Peptidvernetzung durch Penicillin spezifisch blockiert. 30

31 parasitisch, parasitierend pathogen Penicillin Polymer Proteine Replikation Resistenz saprophytisch stationäre Phase Sterilisation Titer Viren virulent Virion/ Viruspartikel Wachstum von Mikroorganismen Wachstumskurve YPD-Agar von (oft auch) anderen Organismen lebend krankheitsauslösend Von Schimmelpilzen der Gattung Penicillium gebildetes Antibiotikum, das spezifisch die Biosynthese von Murein in der Bakterienzellwand hemmt. Durch Aneinanderreihung von ähnlichen Grundbausteinen (Monomeren) aufgebautes Makromolekül wichtigste Klasse von biologischen Polymeren; aus Aminosäuren aufgebaut DNA-Synthese Unempfindlichkeit gegenüber äußeren Einflüssen z.b. Antibiotika oder anderen Medikamenten von abgestorbenem Zellmaterial lebend Dritte Phase der Wachstumskurve, in der die Zellzahl konstant bleibt, weil sich Zellvermehrung und Zelltod die Waage halten. Abtötung aller vermehrungsfähigen Mikroorganismen Durch eine Verdünnungsreihe bestimmte Konzentration Subzelluläre, sehr kleine (<0.3 m) Lebensformen an der Grenze zwischen unbelebten Makromolekülkomplexen und sehr primitiven Mikroorgansimen, die aus einer Nukleinsäure (DNAoder RNA) und einigen Proteinen bestehen. hochgradig pathogen Infektiöse Viruseinheit. Aufgebaut aus einem Innenkörper aus DNAoder RNA und dem aus Kapsomerenproteinen zusammengesetztes Kapsid Da sich Mikrooganismen bei Verdoppelung ihrer Zellmasse in zwei Tochterzellen teilen, ist für sie Wachstum gleichbedeutend mit Zellvermehrung von Mikroorganismen Auftragung der Anzahl von Mikroorganismen gegen die Zeit. Eine Wachstumskurve umfasst vier Phasen: 1.lag-Phase, 2.exponentielle Phase, 3.stationäre Phase und die Absterbephase Optimalmedium für das Wachstum von Mikroorganismen auf der Basis von Yeast (=Hefe), Pepton und Dextrose 31

32 Keimidentifikation Die Diagnostik mikrobieller Kontaminanten kann je nach Aufgabenstellung auf unterschiedlichem Niveau ausgeführt werden. Zur primären Charakterisierung dienen neben einer Beurteilung des makroskopisch erkennbaren Wachstumsverhaltens einfache Reaktionen, wie Gram-Färbung, Oxidase-Test, sowie mikroskopische Methoden. Hierzu steht ein leistungsfähiges Mikroskop zur Verfügung, welches auch fluoreszenzanalytische Messungen erlaubt. Präzisionsbestimmungen bakterieller Keime werden über das API- System durchgeführt, das auf der Basis zahlreicher, spezifischer Stoffwechselvorgänge arbeitet ( bunte Reihe ) und rechnergestützt einen großen Vergleichsdatenbestand zur exakten Diagnose heranzieht. 32