Vergleich der Reparaturfähigkeit von γh2ax zu immunologischen Eigenschaften bei Patienten mit Mamma- und Rektumkarzinom

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1 Aus der Strahlenklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau Vergleich der Reparaturfähigkeit von γh2ax zu immunologischen Eigenschaften bei Patienten mit Mamma- und Rektumkarzinom Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Maria Brunner aus Gundelsheim 1

2 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Referent: Korreferent: Prof. Dr. J. Schüttler PD Dr. L. Distel Prof. Dr. R. Fietkau Tag der mündlichen Prüfung:

3 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Methoden Ergebnisse und Beobachtungen Praktische Schlussfolgerungen Summary Background and aims Methods Results and observations Conclusion Einleitung Material und Methode Immunostaining Versuchsgrundlage Zellaufbereitung Röntgenbestrahlung Zentrifugation Fixierung und Permeabilisierung Fluoreszenzfärbung Auswertung Durchflusszytometrie T-regulatorische Zellen Zellisolierung Extrazelluläre Zellfärbung Intrazelluläre Zellfärbung Auswertung

4 4.2.2 Dendritische Zellen Zellaufbereitung Auswertung Ergebnisse Beziehung zwischen H2AX, ATM und PML Ergebnisse der H2AX-Färbung Ergebnisse der ATM/PML-Färbung Bedeutung von FoxP Ergebnisse zu den T-regulatorischen Zellen Bedeutung der dendritischen Zellen Ergebnisse zu den dendritischen Zellen Korrelationen Diskussion Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Anhang Danksagung Lebenslauf

5 1 Zusammenfassung 1.1 Hintergrund und Ziele Die Behandlung von Tumorpatienten wird in der Strahlentherapie mit ionisierenden Strahlen durchgeführt. Bei der Bestrahlung der Tumorzellen werden zwangsläufig auch Normalgewebszellen exponiert und es treten in ihnen Schäden auf. Dazu gehören auch die DNA- Doppelstrangbrüche. Diese können durch unterschiedliche Methoden sichtbar gemacht werden. Bei Patienten mit einer Tumorerkrankung können vermehrt weitere zelluläre Veränderungen im Sinne von erhöhten Strahlenempfindlichkeiten vorliegen. Ziel der Arbeit ist es, die Reparaturleistung der Zellen unter γh2ax, ATM und PML aufzuzeigen und die Akkumulation von DNA-Schäden im Laufe einer Behandlung darzustellen, um eine mögliche erhöhte Strahlensensibilität bei Patienten zu erkennen. 1.2 Methoden Tumorpatienten wurde vor und nach der ersten Therapiewoche Blut entnommen. Dieses wurde zur Durchführung verschiedener Versuche aufgeteilt. Zu Vergleichen waren die Lymphozyten vor einer Therapie, die entweder nicht oder mit 0,5Gy und 30min Reparaturzeit bzw. 2Gy und 24h Reparaturzeit bestrahlt wurden mit den Lymphozyten nach einer Woche Therapie und drei Tagen Reparaturzeit. Die Auswertung erfolgte mittels Immunostaining, eines Fluoreszenzmikroskops und eines Bildanalyseprogramms (Biomas). Zeitgleich wurde untersucht, wie viele T-regulatorische und dendritische Zellen im Blut vor und nach der Therapie vorhanden waren. Bei diesen Versuchen erfolgte die Auswertung an einem Durchflusszytometer (FACS). 5

6 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Bei den Immunostaining-Versuchen mit H2AX, ATM und PML wurden die Foci pro Zelle ausgewertet. Je mehr Zeit die Zellen zur Reparatur der Strahlenschäden bekamen, umso weniger Foci wurden mit H2AX erfasst. Die gleiche Beobachtung konnte für die Versuche mit ATM gemacht werden. Bei PML waren die Foci pro Zelle jedoch unabhängig von einer Bestrahlung in einem gleich bleibend hohen Zahlenbereich. Bei den T-regulatorischen Zellen wurde der Anteil an FoxP3+-Zellen ermittelt. Vor der Therapie wurden mehr FoxP3+-Zellen gemessen als nach der Therapie. Die Auswertung der dendritischen Zellen zeigte deutlich, dass gesunde Menschen einen höheren Anteil an dendritischen Zellen haben als Tumorpatienten. Innerhalb der Patientengruppe konnte beobachtet werden, dass der Anteil an dendritischen Zellen vor der Therapie höher ist als nach der Therapie. 1.4 Praktische Schlussfolgerungen In der Arbeit konnten Aussagen über die Reparaturfähigkeit von Zellen gemacht werden. DNA-Doppelstrangbrüche waren sowohl mit γh2ax, ATM und PML darstellbar. Es konnte unter Betrachtung der Ergebnisse zu γh2ax und ATM festgestellt werden, dass durch eine Bestrahlung die Anzahl der Foci pro Zelle zunehmen. Durch eine gewisse Reparaturzeit waren die Zellen jedoch auch in der Lage die DNA-Schäden zu beheben. Diese Methode soll als Ansatz dienen, um die Strahlenempfindlichkeit von Patienten festzustellen. Dazu sind noch die Langzeitergebnisse der Patienten nach der Therapie notwendig. Ebenso kommt es durch die Bestrahlung zu einer verminderten Anzahl an dendritischen Zellen und einem verstärkten Auftreten von T-regulatorischen Zellen. Durch den Vergleich von Patienten mit einer Kontrollgruppe konnte festgestellt werden, dass die Empfindlichkeit für Strahlen vom Gesundheitszustand der Probanden abhängt. 6

7 2 Summary 2.1 Background and aims In radiation oncology cancer patients are treated by ionising radiation. During the radiation of cancer cells it cannot be avoided to expose surrounding normal tissue cells resulting in DNA damage including DNAdouble strand breaks. DNA-double strand breaks can be visualised by the use of different methods. An increased radiosensitivity of patients with cancer disease may cause an increased number of cellular mutations. The aim of this work is to show the repair capability of cells under γh2ax, ATM and PML to further describe the accumulation of DNA damages during the time of treatment, to discover a possibly increased radiosensitivity of patients. 2.2 Methods Before and after the first week of cancer patients therapy, a blood sample was taken. They were splitted to conduct different tests. Lymphocytes before therapy were irradiated with either 0,5Gy and 30minutes repair time, 2Gy and 24hours repair time or not at all and compared with lymphocytes after one week of therapy and 3days repair time. The analysis was made using immunostaining, a fluorescence microscopy and a program for image analysis (Biomas). At the same time it was determined how many t-regulatory cells and dendritic cells existed in blood before and after therapy. These tests were done with a flow cytometry analysis (FACS). 7

8 2.3 Results and observations The immunostaining experiments with H2AX, ATM and PML were analyzed by counting the number of foci per cell. With increasing time the cells got to repair the radiation damages, fewer foci were recognized. The same observation could be made for the ATM foci formation. Independent of any irradiation the number of PML foci per cell remained at a constant range. The fraction of FoxP3+ cells was detected to identify t- regulatory cells. More FoxP3+ cells were found before than after therapy. The interpretation of the dendritic cells showed clearly that healthy individuals have a higher fraction of dendritic cells than cancer patients. In general it could be seen that patients had a higher percentage of dendritic cells before therapy, and a reduced number after therapy. 2.4 Conclusion In this work it was possible to make statements about the cells ability to repair its DNA-double strand breaks. DNA-double strand breaks could be visualised by using γh2ax, ATM and PML. Results with γh2ax and ATM made obvious that the number of foci per cell increased by ionizing radiation. If the cells got some time to repair it, they were able to eliminate DNA damages. This method may be seen as a starting point to determine the radiation sensitivity of patients. The long-term results of the patients side effects due to therapy are still lacking. The ionizing radiation also leads to a decreased number of dendritic cells and an increased appearance of t-regulatory cells. The comparison of patients with a control group showed that the sensitivity for radiation depends on the state of health of patients. 8

9 3 Einleitung Tumorerkrankungen stellen nach Herz-Kreislauferkrankungen die zweithäufigsten Todesursachen in Deutschland dar. Deutschlandweit gab es 2004 laut Schätzungen des Robert-Koch-Instituts Tumorneuerkrankungen bei Männern und bei Frauen (Batzler W. U. 2008). Bayernweit wurden Neuerkrankungen bei Männern und bei Frauen gemeldet (Meyer M. 2007). Während bei Männern das Prostatakarzinom mit 25,4% den größten Anteil an Neuerkrankungen ausmacht, gefolgt von Darmkarzinomen mit 16,2%, liegt bei Frauen der Tumor der Brustdrüse mit 27,8% an erster Stelle (Batzler W. U. 2008). Die seit 1980 beobachteten Inzidenzraten weisen für beide Geschlechter eine Zunahme auf (Batzler W. U. 2008). Dies ist aus den verstärkten Früherkennungsmaßnahmen und den Datenerhebungen des deutschen Krebsregisters zu erkennen. Die Krebsmortalität nimmt hingegen ab. Schätzungen zur Folge gibt es jährlich Frauen in Deutschland die neu an Brustkrebs erkranken. Das mittlere Erkrankungsalter beträgt 63 Jahre. Die Inzidenzrate für Deutschland liegt bei 135, für Bayern bei sind 17,9% der Mammakarzinompatientinnen in Deutschland an ihrer Erkrankung verstorben. Die 5- Jahres-Überlebensrate liegt bei 81%. Trotzdem ist Brustkrebs die häufigste Krebstodesursache bei Frauen. Die Risikofaktoren für ein Mammakarzinom sind eine frühe erste Regelblutung, Kinderlosigkeit oder ein höheres Alter bei der ersten Geburt, sowie der späte Eintritt in die Wechseljahre. Östrogen- und progesteronhaltige Ovulationshemmer können das Erkrankungsrisiko ebenfalls erhöhen (Key et al. 2003). Außerdem zählen Übergewicht, Bewegungsmangel, regelmäßiger Alkoholkonsum und Brustkrebserkrankungen der nahen Verwandtschaft zu den Risikofaktoren (Batzler W. U. 2008). Die zweithäufigsten Krebserkrankungen und zugleich Krebstodesursachen beider Geschlechter sind Dickdarm- und Rektumkarzinome. In 9

10 Deutschland erkranken jährlich Männer im durchschnittlichen Alter von 69 Jahren an Darmkrebs. Bei den Frauen gibt es ca Darmkrebsneuerkrankungen pro Jahr. Ihr Durchschnittsalter liegt bei 75 Jahren. Die Inzidenz bei Männern liegt in Deutschland bei 91,3 und in Bayern bei 85,8. Bei Frauen beträgt die Inzidenz in Deutschland 85,3 und in Bayern 68,9. Diese Inzidenzraten berufen sich auf Schätzungen. 12,4% der männlichen Patienten und 14,3% der weiblichen Patienten starben 2004 an Darmkrebs. Die relative 5-Jahres-Überlebensrate beträgt für Männer und Frauen 60% (Batzler W. U. 2008). Zu den Risikofaktoren von Darmkrebserkrankungen zählen vor allem regelmäßiger Alkoholkonsum, Übergewicht, Bewegungsmangel und eine Ernährung, die aus wenig Gemüsekonsum, ballaststoffarmen, fettreichen Produkten und viel rotem eisenhaltigen Fleisch besteht (Davis et al. 2009; Kim et al. 2009). Häufig sind auch Menschen, die im ersten Verwandtschaftsgrad mit einem Darmkrebspatienten stehen, einem hohen Erkrankungsrisiko ausgesetzt. Zur Prognoseverbesserung von Tumorpatienten wurden diagnostische Methoden zur Früherkennung eingerichtet. So gibt es für Frauen im Alter von 50 bis 69 Jahren ein Mammographie-Screening-Programm (Jotwani et al. 2009). Zur Darmkrebsvorsorge werden ab dem 50. Lebensjahr die Durchführung von Hämocculttests und Darmspiegelungen empfohlen. Für die Therapie der Patienten sind neben Operationsmöglichkeiten, Chemotherapie, Hormontherapie und anderen Verfahren auch die Strahlentherapie von großer Bedeutung (Batzler W. U. 2008). Bei der Strahlentherapie wie auch bei den anderen Therapieoptionen besteht jedoch auch ein Risiko für Therapienebenwirkungen. Eine möglichst frühzeitige Erkennung und Abschätzung einer erhöhten individuellen Strahlenempfindlichkeit bzw. einer relativen Strahlenresistenz bei Krebspatienten sind für die Strahlentherapie deshalb von essentieller Bedeutung. Für die Vorhersage der Strahlensensibilität gibt es inzwischen verschiedene Testverfahren wie den Koloniebildungstest, die Messungen der Chromosomenaberrationen (Keller et al. 2004), den Apoptose-Test, den Comet Assay 10

11 (Djuzenova et al. 2006) und die Bestimmung der Einzel- bzw. Doppelstrangbrüche (DSBs) der DNA. Ein weiteres Detektionsverfahren von DNA-DSBs zur Diagnostik der individuellen Strahlenempfindlichkeit eines Patienten, stellt der Nachweis des Histons γh2ax in Lymphozyten dar (Banath et al. 2004). Das reparaturassoziierte Histon γh2ax dient hierbei als Messparameter. H2AX ist normalerweise gleichmäßig im Zellkern verteilt, entsteht jedoch ein DNA-DSB kommt es zur Phosphorylierung von H2AX zu γh2ax am Ort der Läsion. Solche Ansammlungen von γh2ax können bereits wenige Minuten nach entstandenem DNA-Schaden nachgewiesen werden (Mahrhofer et al. 2006). In dieser Arbeit soll daher geklärt werden, ob und in wie weit sich Blutlymphozyten von vermindert und erhöht strahlensensiblen Tumorpatienten hinsichtlich ihrer Histon-H2AX-Phosphorylierung und Dephosphorylierung oder entsprechend der Induktion und Reparatur der DNA-DSBs, unterscheiden. Somit soll eine Anpassung der Therapieschemata durch die Vorhersage einer klinischen Strahlenüberempfindlichkeit für Patienten unter Strahlentherapie durch das Histon γh2ax ermöglicht werden, um so die Vermeidung oder Reduktion von therapiebedingten Strahlennebenwirkungen zu erreichen. 11

12 4 Material und Methode 4.1 Immunostaining Das Prinzip von Immunostaining ist das Sichtbarmachen von Proteinen einer Zelle anhand fluoreszenzmarkierter Antikörper. Die Proteine können homogen über die Zelle verteilt sein, in bestimmten Strukturen vorliegen oder sich in einzelnen Bereichen lokal stark anreichern. Die lokal angereicherten Proteine werden Foci genannt. Die Lokalisationen von verschiedenen Proteinen können durch die Immunostaining-Markierung miteinander verglichen werden. Bei der hier verwendeten indirekten Methode der Immunfluoreszenz wird ein Protein mit einem Primärantikörper markiert. Nun wird ein fluoreszierender Sekundärantikörper, der gegen den Primärantikörper gerichtet ist, zugegeben. Dieser bindet an den entsprechenden Primärantikörper. Somit wird das Protein sichtbar gemacht. Die Primär- und Sekundärantikörper werden aus verschiedenen Tierarten gewonnen Versuchsgrundlage An den Versuchen waren insgesamt 29 Mammakarzinompatientinnen, 24 Rektumkarzinompatienten und 14 Kontrollpersonen beteiligt. Den Tumorpatienten wurden vor der Therapie und eine Woche nach der ersten Bestrahlung je 2,5ml Vollblut entnommen. Den Kontrollpersonen wurde einmalig je 2,5ml Vollblut entnommen. Die Proben wurden in EDTA-Röhrchen aufbewahrt. Die Weiterverarbeitung des Blutes unterscheidet sich bei Patienten vor und nach der Therapie. Die Verarbeitung des Blutes der Kontrollpersonen entspricht den Patienten vor der Therapie. 12

13 4.1.2 Zellaufbereitung Bei Patientenblut vor der Therapie werden drei Versuchsbedingungen untersucht. Dementsprechend sind drei unterschiedliche Zentrifugenröhrchen nötig. Eines dient der Kontrolle. Ein Weiteres wird später mit 0,5Gy bestrahlt und erhält 30min Reparaturzeit für die durch die Strahlung induzierten Schäden. Das dritte Röhrchen wird mit 2Gy bestrahlt und erhält 24h Reparaturzeit. Bei Patientenblut nach einer Woche Therapie gibt es nur eine Versuchsbedingung. Die Zellen werden nicht in vitro bestrahlt. Es werden die in vivo durch eine Woche Strahlentherapie bei 5x1,8Gy und drei Tagen Reparaturzeit untersuchten Schäden gemessen. Der Versuch beginnt mit der Isolierung der Lymphozyten in der Dichtegradientenzentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland). Dafür werden auf dem Polymer Ficoll (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) die peripheren mononukleären Zellen (PBMC) von Lymphozyten, von Granulozyten, von Erythrozyten und von Thrombozyten getrennt. Bei Proben vor der Therapie werden im Zentrifugenröhrchen auf 7ml Ficoll 0,7ml Vollblut gegeben. Bei Patienten nach der Therapie wird auf 7ml Ficoll 1ml Vollblut gegeben. Die Proben werden für 15min bei 1200xg zentrifugiert und man lässt die Zentrifuge ohne zu Bremsen auslaufen (Bremse 0). Anschließend werden in Zellkulturröhrchen je 5ml 36 C warmes RPMI (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) gegeben. Der Lymphozytenring, der sich durch das Zentrifugieren entwickelt hat, wird in die 5ml RPMI pipettiert. Die Zellkulturröhrchen werden nun für 10min bei 300xg (Bremse 9) erneut zentrifugiert. Der entstandene Überstand wird abgekippt und das verbleibende Pellet wird gelöst. Nun fügt man dem Röhrchen erneut 5ml warmes RPMI zu. Anschließend erfolgt ein dritter Zentrifugengang für 10min bei 240xg. Der Überstand wird wieder abgekippt und das Pellet gelöst. Die Proben der Patienten vor der Therapie werden mit je 1ml RPMI/FKS (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) (siehe Anhang, Tabelle 1) aufgefüllt. 13

14 4.1.3 Röntgenbestrahlung Direkt nach der Lymphozytenisolierung wird das mit 2Gy 24h beschriftete Zellkulturröhrchen mit 2Gy bestrahlt. Die Bestrahlung erfolgt an einer General Electric (Ahrensburg, Deutschland) Isovolt-Titan 160 Röntgenröhre mit einem 2mm Aluminiumfilter. Das Röhrchen wird dann für 24h mit den anderen beiden Röhrchen in einen 37 C warmen Brutschrank (5% CO 2 ) gestellt. Die Zeit dient der Reparatur der DNA- Schäden. Eine halbe Stunde vor Ablauf dieser Reparaturzeit wird das mit 0,5Gy 30min beschriftete Röhrchen mit 0,5Gy bestrahlt und für eine halbe Stunde zur Reparatur im Brutschrank aufbewahrt. Die Lymphozyten von Patienten nach der Therapie werden ebenso, wie das mit Kontrolle beschriftete Röhrchen, nicht bestrahlt, sondern direkt weiterverarbeitet Zentrifugation Die für einen Tag im Brutschrank aufbewahrten Röhrchen werden zuerst für 8min bei 173xg zentrifugiert. Die weitere Vorgehensweise für Proben vor und nach der Therapie ist weitgehend identisch. Nach dem Zentrifugieren wird der entstandene Überstand abgekippt. Das Pellet wird gelöst. Entsprechend der zu Anfang applizierten Blutmenge werden die Zellen in 1xPBS (Gibco, Carlsbad, USA) (siehe Anhang, Tabelle 2) verdünnt (1ml Vollblut = 400µl PBS). Der Inhalt wird kräftig gemischt. Proben von Patienten vor der Therapie: Pro Objektträger gibt es in der Zytozentrifuge (Stat Spin Cytofuge, Westwood, USA) drei Felder in die Lösungen gegeben werden können. In einem Zentrifugengang werden pro Patient 3 Objektträger verwendet. Je Objektträger wird ein Feld mit Kontrolllösung, eines mit 0,5Gy bestrahlter Lösung und eines mit 2Gy bestrahlter Lösung versehen. Pro Feld werden 100µl eingefüllt. 14

15 Proben von Patienten nach der Therapie: Auch hier werden 3 Objektträger verwendet. Es liegt keine Unterscheidung der Felder vor. Pro Objektträger werden 2 Felder mit 130µl der vorbereiteten Lösung befüllt. Für 6min bei 1000xg erfolgt der jeweilige Zentrifugengang Fixierung und Permeabilisierung Nachdem die Zellen auf den Objektträger zentrifugiert sind werden sie zur Fixierung sofort für 20min in kaltes hundertprozentiges Methanol bei -20 C im Gefrierschrank aufbewahrt. Anschließend werden die Objektträger für 1min in eiskaltes hundertprozentiges Aceton gegeben. Dies dient der Permeabilisierung der Zellmembran, um die anschließende Färbung zu ermöglichen Fluoreszenzfärbung Die Objektträger werden 3x für 5min in PBS/FKS (siehe Anhang, Tabelle 3) gewaschen. Die Waschschritte erfolgen in einer Küvette auf einem Rüttler (Heidolph, Schwabach, Deutschland). Unter Vermeidung des Austrocknens der aufzentrifugierten Zellfelder wird nach den Waschschritten nur die Umgebung der Felder getrocknet. Das Austrocknen der Zellen würde zum Platzen der Lymphozytenkerne führen. Dann könnten die Kernproteine nicht mehr regulär angefärbt werden. Der Bereich der Zellfelder wird mit einem Fettstift bzw. Liquid Blocker (Science Services, München, Deutschland) markiert und die Primärantikörper werden aufgetragen. 15

16 Tabelle 1: Primärantikörper für Immunostaining Antikörper Hersteller Konzentration H2AX (mouse) Upstate, New York, USA 1:1500 ATM (mouse) Cell Signaling, Boston, USA 1:300 PML (rabbit) Santa Cruz, California, USA 1:50 Die Objektträger werden über Nacht, bei 4 C im Kühlschrank innerhalb einer Feuchtkammer aufbewahrt. Am darauf folgenden Tag erfolgt erneut ein zweimaliges 5minütiges Waschen mit PBS/FKS auf einem Rüttler in einer Küvette und ein einmaliger 5minütiger Waschschritt mit 1xPBS. Zur Konservierung der Zellen werden die Objektträger daraufhin für 20min in 2,5% Formaldehyd (siehe Anhang, Tabelle 6) gegeben. Anschließend erfolgen 3 Waschgänge mit PBS/FKS für je 5min. Die Sekundärantikörper werden aufgetragen, nachdem der äußere Bereich des markierten Areals getrocknet wurde. Tabelle 2: Sekundärantikörper für Immunostaining Antikörper Hersteller Konzentration G/M (mouse) Upstate, New York, USA 1:400 Ch/R (rabbit) Upstate, New York, USA 1:200 Die Inkubation erfolgt für eine Stunde bei Raumtemperatur in einer Feuchtkammer. Abschließend werden die Objektträger noch 3x für je 5min in 1xPBS gewaschen. Die Objektträger werden unter Lichtausschluss getrocknet. Nun erfolgt die Gegenfärbung mit Dapi (20µl), das Eindeckeln der Zellen in dem Antifade Reagenz Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, USA) (siehe Anhang, Tabelle 9) und das vorsichtige Auflegen eines 24x32mm großen Deckglases auf die Zellfelder. Nach einer Stunde Einwirkzeit bei Raumtemperatur können die Objektträger im Kühlschrank aufbewahrt oder direkt im Fluoreszenzmikroskop ausgewertet werden. 16

17 4.1.7 Auswertung Die Auswertung der Objektträger wird anhand eines Fluoreszenzmikroskops (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) und des Bildanalyseprogramms Biomas (Biomas-Software, Version 3.3, 10/2004, Distel, Erlangen, Deutschland, MSAB [Modulare Systeme in der angewandten Biologie]) durchgeführt. Die eingedeckten Objektträger werden ins Mikroskop eingespannt. Nun werden Bilder von den angefärbten Zellkernen mit einer CCD-Kamera (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) aufgenommen. Nach Färbung mit H2AX werden zwei Bilder aufgenommen. Eines in blauer Dapifärbung und eines von den mit dem Protein H2AX markierten Foci in rot. Bei der Färbung mit ATM/PML werden drei Bilder aufgenommen. Die Zellkerne wurden mit Dapi blau gefärbt, die Foci mit ATM grün und mit PML rot. Im Anschluss sortiert man die aufgenommenen Bilder in eine Matrix, so dass die Zellen dicht beieinander liegen und sich ein guter Überblick ergibt. Nicht aussagekräftige Bereiche werden vor der Auswertung gelöscht. Es folgt die Auswertung: Die zu einer Bedingung gehörenden Bilder werden übereinander gelagert und unter verschiedenen Aspekten verglichen. Ziel der Auswertung ist es, die Anzahl der Foci pro Zelle, Kolokalisationen von diesen in unterschiedlichen Färbungen, die durchschnittliche Helligkeit und die maximale Helligkeit der Foci, Helligkeit der Kerne und Helligkeit (in Graustufen) außerhalb der Kerne, Fläche der Foci (µm 2 ) und Fläche der Kerne (µm 2 ) zu ermitteln. Diese Angaben werden in eine Exceldatei übertragen. Mit den ermittelten Ergebnissen kann nun eine zielgerichtete Auswertung durchgeführt werden. 4.2 Durchflusszytometrie Mit einem Durchflusszytometer (FACS) ist es möglich, Zellen anhand ihrer Größe, Granularität und Fluoreszenzfärbung zu untersuchen und in Gruppen einzuteilen. Zellen werden an Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt. Das FACS-Gerät erfasst diese Zellen mit einem Laserstrahl, der 17

18 die gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffe anregt, die dann Licht bestimmter Wellenlänge emittieren. Für jeden Farbstoff gibt es ein spezifisches Signal. Dabei werden die Zellen in einem laminaren Einzelzellstrom am Laser vorbeigeleitet. Durch die Streuung der Lichtstrahlen wird die Zellgröße bestimmt. Das geschieht mit dem Vorwärtsstreulicht, Forwardscatter oder FSC. Die Zellgranularität wird durch das Seitwärtsstreulicht, Sidescatter oder SSC bestimmt. Dieses ist ein zweites Streulicht, das im 90 Winkel an Strukturen innerhalb der Zelle reflektiert wird. Für die Versuche und werden Tumorpatienten jeweils vor der Therapie und nach den ersten fünf Bestrahlungen und drei Tagen Pause 2ml Vollblut entnommen. Den Kontrollpersonen werden einmalig 2ml Vollblut entnommen. Als Auffangbehältnis dient ein Heparinröhrchen T-regulatorische Zellen T-regulatorische Zellen (Tregs) sind eine Untergruppe von T- Lymphozyten. Sie haben die Eigenschaft schädliche immunologische Reaktionen, ausgelöst durch eigene oder fremde Antigene, zu unterdrücken. Tregs müssen zur eindeutigen Identifikation CD4+, CD25+ und FoxP3+ sein. Die Grundlage des Versuchs ist ein Treg Detection Kit (human) PE der Firma Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Deutschland) Zellisolierung Für die Dichtezentrifugation der peripheren Blutlymphozyten (PBMC) werden in ein Zentrifugenröhrchen 7ml Ficoll gegeben. Darauf lässt man 1ml Vollblut fließen. Das Röhrchen kommt für 15min bei 1200xg (Bremse 0) in eine Zentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland). Es entsteht ein Lymphozytenring. Dieser wird abgesaugt und in ein Zellkulturröhrchen gegeben, welches bereits mit 5ml 36 C warmen RPMI 18

19 (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) gefüllt ist. Das Röhrchen wird nun für 10min bei 300xg zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand abgekippt. Das verbleibende Pellet wird gelöst und es werden weitere 5ml warme RPMI-Lösung zugefügt. Der Röhrcheninhalt wird gut gemischt. Nun werden 100µl der Lösung entnommen und in 10ml CasyTon- Lösung (Innovatis AG, Reutlingen, Deutschland) gegeben. Die Zellzahl wird gemessen. Sie beträgt im optimalen Fall 1x10 6. Es folgt ein weiterer Zentrifugengang der als Waschschritt dient für 10min bei 240xg. Der entstandene Überstand wird erneut abgekippt und das Pellet wird gelöst. Es folgt die Zugabe von 1ml RPMI/FKS (siehe Anhang, Tabelle 1). Die Substanzen werden gut gemischt. Ab diesem Schritt wird der Versuch in zwei Bedingungen aufgeteilt, den Versuch selber (A) und die Kontrolle (B) Extrazelluläre Zellfärbung Der Inhalt des Zellkulturröhrchens wird in zwei 2ml Eppendorfcups aufgeteilt. Bei 4 C werden die Cups für 10min und 300xg zentrifugiert (Sigma, Osterode, Deutschland). Der entstandene Überstand wird abgesaugt. Jedem Cup werden je 90µl des PBS+E-Puffers (siehe Anhang, Tabelle 10) zugegeben. Dem Cup A werden 10µl CD4-FITC (human) und 10µl CD25-APC (human) Antikörper zugegeben. Dem Cup B werden 10µl IgG1-FITC (human) und 10µl IgG2b-APC (mouse) an Antikörpern zugeführt. Alles wird gut gemischt und für 10min zur Inkubation im Kühlschrank aufbewahrt. Im Anschluss werden je Cup 1,5ml PBS+E zugegeben. Die Cups werden für 5min und bei 300xg zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt Intrazelluläre Zellfärbung 19

20 Für 30min wird nun je 1ml 4 C kalte Fix/Perm-Lösung (siehe Anhang, Tabelle 11) zugegeben. Die Inkubation erfolgt wieder im Kühlschrank. Anschließend fügt man den Mischungen je 1ml PBS+E hinzu. Es folgt ein Zentrifugenschritt für 5min bei 300xg und 4 C. Der entstandene Ü- berstand wird abgesaugt. Nun werden die Cups mit je 1,5ml einer 1xPerma-Lösung (siehe Anhang, Tabelle 12) aufgefüllt. Das Ganze wird zentrifugiert. Der Überstand wird erneut entfernt. Zur intrazellulären Färbung gibt man den Cups je 80µl 1xPerma-Lösung zu. Im Anschluss lässt man für 5min bei 4 C 5µl FcR Blocking Reagent (human) einwirken. FcR Blocking Reagent dient dem gezielten Aufsuchen von für die intrazelluläre Färbung geeigneten Zellen. In Cup A werden 10µl des Antikörpers Anti-FoxP3 (human) gegeben, in Cup B 10µl IgG1-PE (mouse). Die Lösungen gut mischen und für 30min im Kühlschrank einwirken lassen. Nun werden je Cup 1,5ml 1xPerma-Lösung zugegeben. Die Cups werden zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt. Der verbleibende Inhalt wird in einen 1xPBS-Puffer in 5ml FACS-Röhrchen umgefüllt Auswertung Die Messung erfolgt mit dem Durchflusszytometer (BD FACS Canto II, Heidelberg, Deutschland). Es soll überprüft werden, ob regulatorische T-Zellen auf die Färbung mit CD4 (FITC), CD25 (APC) und FoxP3 (PE) ansprechen. Der Kontrollversuch (Isotyp) dient der Festlegung der Gates. Zunächst werden Zellreste und tote Zellen aus der Messung ausgeschlossen, indem der Forwardscatter und der Sidescatter gegeneinander aufgetragen werden. In weiteren Dot plots werden die Antikörperfärbungen gegenübergestellt. Es zeigt sich in welcher Intensität die Färbung funktioniert hat. Die Werte werden logarithmisch aufgetragen. Die Auswertung erfolgt mit einer Software namens FlowJo (Tree Star, Ashland, USA). Beispiel für eine FACS-Auswertung von T-regulatorischen Zellen: 20

21 Abb.1: Darstellung des ersten Teils einer FACS-Messung, obere Reihe: Darstellung des Isotyps: linkes Diagramm: Darstellung aller im Isotyp gezählten Zellen (x-achse: FSC-A, y-achse: SSC-A), rechtes Diagramm: Eingrenzung der Lymphozyten (x-achse: Comp-FITC-A-CD4, y-achse: SSC-A); untere Reihe: Darstellung des Versuchs: linkes Diagramm: Darstellung aller im Versuch gezählten Zellen (x-achse: FSC-A, y-achse: SSC-A), rechtes Diagramm: Eingrenzen der Lymphozyten (x-achse: Comp-FITC-A-CD4, y-achse: SSC-A). 21

22 Abb.2: Darstellung des zweiten Teils einer FACS-Messung, obere Reihe: Darstellung des Isotyps: linkes Diagramm: Festlegung der Grenze für CD25+-Zellen für den Versuch (x-achse: Comp-FITC-A-CD4, y-achse: Comp- APC-A-Iso), rechtes Diagramm: Festlegung der Grenze für FoxP3+-Zellen für den Versuch (x-achse: Comp-FITC-A-CD4, y-achse: Comp-PE-A-Iso); untere Reihe: Darstellung des Versuchs: linkes Diagramm: Darstellung CD25+- Zellen (x-achse: Comp-FITC-A-CD4, y-achse: Comp-APC-A-CD25), rechtes Diagramm: Darstellung FoxP3+-Zellen (x-achse: Comp-FITC-A-CD4, y- Achse: Comp-PE-A-FoxP3). 22

23 4.2.2 Dendritische Zellen Der Versuch dient dazu dendritische Zellen zu erkennen und ihre Quantität festzustellen. Aufgrund der Heterogenität dieser aus plasmazytoid dendritischen Zellen (PDCs) und aus myeloid dendritischen Zellen (MDC1s und MDC2s) bestehenden Zellgruppe, wird in diesem Versuch ein Antikörpercocktail zur Identifikation der einzelnen Zellen verwendet. Grundlage zur Durchführung ist der Blood Dendritic Cell Enumeration Kit der Firma Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Deutschland) Zellaufbereitung Pro Patient gibt es zwei Versuchsbedingungen. Die Durchführung erfolgt direkt in zwei 5ml Polystyrene-Röhrchen. In dem Röhrchen A wird der Versuch selber durchgeführt. Röhrchen B dient der Versuchskontrolle. In beide Röhrchen werden je 300µl Vollblut gegeben. Zu Blut A werden 20µl eines Anti-BDCA-Cocktails beigemengt. Blut B werden 20µl eines Kontrollcocktails zugefügt. Tabelle 3: Komponenten des Anti-BDCA-Cocktails Antikörper Fluorochrom Spezifität CD303 (BDCA-2) FITC PDC CD1c (BDCA-1) PE MDC1 CD14 PE-Cy5 Monozyten CD19 PE-Cy5 B-Zellen CD141 (BDCA-3) APC MDC2 23

24 Tabelle 4: Komponenten des Kontroll-Cocktails Antikörper Fluorochrom Spezifität Mouse IgG1 FITC Isotyp-Kontrolle Mouse IgG2a PE Isotyp-Kontrolle CD14 PE-Cy5 Monozyten CD19 PE-Cy5 B-Zellen Mouse IgG1 APC Isotyp-Kontrolle Nun gibt man in beide Proben 10µl einer Dead Cell Discriminator Lösung. Der Röhrcheninhalt wird sanft gemischt und die Röhrchen werden für 10min unter eine 60Watt Glühbirne auf Eis gelegt. So kann der Dead Cell Discriminator tote Zellen, primär Erythrozyten, markieren. Dies wird durch Photoreaktion initiiert und der Farbstoff bindet irreversibel an die Nukleinsäure der betroffenen Zellen. Nach Ablauf der 10min werden beiden Röhrchen je 4ml einer 1xRed Blood Cell Lysis Lösung (siehe Anhang, Tabelle 13) zugegeben. Der Röhrcheninhalt sollte mehrmals gut gemischt werden, um möglichst viele zuvor markierte Erythrozyten lysieren zu können. Für weitere 10min lässt man die Lösung im Dunkeln und bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend werden die Röhrchen für 5min bei 300xg in eine Zentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) gegeben. Der Überstand wird großzügig abgesaugt. Das verbleibende Pellet sollte gut gelöst sein, bevor man je Probe genau 4ml des PBS+-Puffers (siehe Anhang, Tabelle 14) hinzugibt. Aus dem Röhrchen A werden 4µl Lösung entnommen und zur Bestimmung der Lymphozytenzahl 10ml einer CasyTon-Lösung (Innovatis AG, Reutlingen, Deutschland) zugefügt. Die Röhrchen selber werden erneut für 5min bei 300xg zentrifugiert. Die Überstände werden wieder großzügig entfernt. Den Proben werden nun je 300µl von PBS+, 150µl einer Fixierlösung und 5µl eines Discriminator Stop Reagens zugefügt. Zur Lagerung länger als 24h vor der Analyse kann noch eine separate Fixierlösung (siehe Anhang, Tabelle 15) zugegeben werden. 24

25 Auswertung Der Versuch wird mit dem Durchflusszytometer (BD FACS Canto II, Heidelberg, Deutschland) gemessen. Zur Auswertung dient die BD FACS Diva Software (BD, Heidelberg, Deutschland). Die Darstellungen sind logarithmisch. Verschiedene Dot plots sind nötig, um die dendritischen Zellen herauszufiltern. Im ersten Dot plot sind der Forwardscatter und der Sidescatter gegeneinander aufgetragen. Das Ziel ist Zellreste und tote Zellen auszusortieren. Im zweiten Dot plot wird der Sidescatter gegenüber CD14-CD19-PE-Cy-7-Antikörper aufgetragen. Dadurch sollen B-Zellen, Monozyten und Granulozyten aussortiert werden. Der dritte und vierte Dot plot zeigen nun an, wie viele dendritische Zellen der unterschiedlichen Sorten identifiziert werden konnten. Die Grenzen der Gates werden mit Hilfe des Kontrollversuchs (Isotyp) festgelegt. 25

26 Ein Beispiel für eine FACS-Messung von dendritischen Zellen: Abb.3: Darstellung des Isotyps, Dot Plot 1 (oben links): P1: alle aus Vollblut gewonnenen und gezählten Zellen (Granulozyten, Lymphozyten, Monozyten), Dot Plot 2 (oben rechts): Ausschluss von Granulozyten, B-Zellen, Monozyten, toten Zellen, P2: Lymphozyten ohne Monozyten und B-Zellen, P6: B-Zellen, Monozyten, tote Zellen, Dot Plot 3 (unten links): P3: Festlegung der Grenze für BDCA1+-Zellen für den Versuch, P4: Festlegung der Grenze für BDCA2+-Zellen für den Versuch, Dot Plot 4 (unten rechts): P5: Festlegung der Grenze für BDCA3+-Zellen für den Versuch. 26

27 Abb.4: Darstellung des Versuchs, Dot Plot 1 (oben links): P1: alle gezählten Zellen (Granulozyten, Lymphozyten, Monozyten), Dot Plot 2 (oben rechts): Ausschluss von Granulozyten, B-Zellen, Monozyten, toten Zellen, P2: Lymphozyten, P6: B-Zellen, Monozyten, tote Zellen, Dot Plot 3 (unten links): P3: BDCA1+-Zellen, P4: BDCA2+-Zellen, Dot Plot 4 (unten rechts): P5: BDCA3+-Zellen. 27

28 5 Ergebnisse 5.1 Beziehung zwischen H2AX, ATM und PML H2AX ist eine Modifikation des Histonproteins H2A. Das Protein H2AX besitzt an seinem Carboxylende ein Serin/Glutamin-Motiv (SQ). Dieses SQ-Motiv ist eine Erkennungsstelle für Phosphoinositol-3-Kinasen. Drei Proteinkinasen ATM, ATR und DNA-PKcs können H2AX phosphorylieren und somit in eine aktive Form überführen. ATM scheint durch ihre rasche H2AX-Phosphorylierung die am besten geeignete Kinase zu sein. Tritt ein DNA-DSB auf wird H2AX im S-139-Bereich phosphoryliert. Es entsteht γh2ax (Podhorecka 2009). Diese H2AX- Phosphorylierung nimmt einen umfassenden Bereich um die DSB- Stelle ein (Kinner et al. 2008). In Zellen, die einer ionisierenden Strahlung ausgesetzt werden, ist schon nach wenigen Minuten phosphoryliertes H2AX nachweisbar. Somit ist γh2ax ein früher und sehr sensitiver Marker für DSBs (Avondoglio et al. 2009; Clingen et al. 2008). ATM bedeutet Ataxia-teleangiectasia mutated protein. Dieses Protein gehört zur Familie der Phosphoinositol-3-Kinasen. Es ist das wichtigste Protein bei der Reparatur von durch Strahlung entstandenen DNA- DSBs (Adams et al. 2006). Liegt ein irreparabler Schaden vor, leitet ATM auch die Apoptose der Zelle mit ein. In inaktiver Form ist das Enzym ein Dimer. Entsteht ein DSB dissoziiert es in ein aktives Monomer. Die Aktivierung, die bereits bei geringen Strahlungsdosen stattfindet, erfolgt durch Autophosphorylierung am Serin Die entstehenden Monomere lagern sich der geschädigten DNA an. Schon wenige Minuten nach dem Einwirken ionisierender Strahlung sind erste phosphorylierte und damit aktivierte ATM-Foci nachweisbar. Um den DSB endgültig zu beheben, werden durch das ATM weitere Proteine phosphoryliert. Dazu gehört auch H2AX, das durch ATM zu γh2ax wird (Czornak et al. 2008; Zha et al. 2008). 28

29 PML ist die Abkürzung für promyelozytisches Leukämie Protein. PML wird über Zwischenschritte mittels ATM aktiviert. Die Phosphorylierung selber erfolgt durch das Enzym Chk2. PML sucht dann defekte Areale auf und macht sie sichtbar. Mit ATM verbindet es eine Kolokalisation der Foci, die in den Versuchsauswertungen auch zu sehen ist. Das PML-Protein stellt einen Teil des PML Nuclear Body (NB) dar. Diese NBs sind 0,2-1µm groß und liegen in einer Anzahl von 1-30 pro Zelle vor. Sie übernehmen Aufgaben in der DNA-Reparatur, im Zellzyklusablauf, bei der Regulation der Transkription, bei viralen Infekten und der Apoptose. Zum Erfüllen dieser Aufgaben enthalten sie bis zu 50 weitere Proteine (Reineke et al. 2009). Ein Mangel an PML NBs führt zu Chromosomeninstabilitäten und Anfälligkeiten für Tumoren. Bei der DNA- Reparatur durchlaufen viele Reparaturfaktoren die PML NBs und fügen diese Körper in den Reparaturvorgang mit ein (Dellaire et al. 2004). 5.2 Ergebnisse der H2AX-Färbung Verglichen werden in den unterschiedlichen Färbungen und den verschiedenen Personengruppen die Anzahl der Foci pro Zelle je Bedingung. Damit soll die Reparaturfähigkeit der Zellen bzw. der Probanden ermittelt werden. Durch die verschiedenen Versuchsbedingungen konnten unter zu Hilfenahme des Mikroskops unterschiedliche Beobachtungen gemacht werden: 29

30 Abb.5: Zellen, die zum Vergleich keinen Strahlendosen ausgesetzt wurden. Angefärbte Zellkerne mit Dapi (linkes Bild) und DNA-Doppelstrangbrüche mit γh2ax (rechtes Bild). Abb.6: Zellen, die mit einer Dosis von 0,5Gy ionisierender Strahlung behandelt wurden und eine anschließende Reparaturzeit von 30min bekamen. Angefärbte Zellkerne mit Dapi (linkes Bild) und DNA-Doppelstrangbrüche mit γh2ax (rechtes Bild). Abb.7: Zellen, die mit einer Dosis von 2Gy ionisierender Strahlung behandelt wurden und eine anschließende Reparaturzeit von 24h bekamen. Angefärbte Zellkerne mit Dapi (linkes Bild) und DNA-Doppelstrangbrüche mit γh2ax (rechtes Bild). 30

31 Abb.8: Lymphozyten nach 1 Woche Therapie, die mit 5x1,8Gy bestrahlt wurden und drei Tage in vivo Zeit zur Reparatur bekamen. Angefärbte Zellkerne mit Dapi (linkes Bild) und DNA-Doppelstrangbrüche mit γh2ax (rechtes Bild). Die Kontrollbedingung zeigt keine Foci auf (Abb.5). Der Patient und sein Blut sind noch nicht mit Strahlung in Kontakt gekommen. In einer weiteren Bedingung wurden die Lymphozyten mit 0,5Gy bestrahlt und erhielten 30min Zeit zur Reparatur. Eine relativ gleichmäßige Anzahl von DNA-DSBs ist anhand der zu sehenden Foci erkennbar (Abb.6). Wurden die Zellen mit 2Gy bestrahlt und erhielten eine Reparaturzeit von 24 Stunden sind DNA-DSBs vorhanden, jedoch deutlich weniger als bei der vorherigen Bedingung (Abb.7). Die Lymphozyten nach einer Woche Therapie zeigen vereinzelt Foci in den Zellen auf (Abb.8). Anhand der Auswertung der Mikroskopaufnahmen werden nun die ermittelten Werte in Diagrammen dargestellt. 31

32 3 Anzahl der Foci ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Gruppen Abb.9: Auswertung der Färbung mit H2AX, Versuchsbedingung: Kontrolle, Gruppe 1= Kontrollpersonen, 1,3= Mittelwert der Kontrollpersonen, Gruppe 2= Rektumkarzinompatienten, 2,3= Mittelwert der Rektumkarzinom- patienten, Gruppe 3= Mammakarzinompatientinnen, 3,3= Mittelwert der Mammakarzinompatientinnen. Bei nicht mit Strahlung behandelten Lymphozyten wurden mittels H2AX die Foci pro Zelle sichtbar gemacht. Die Kontrollpersonen weisen im Durchschnitt 0,31 Foci pro Zelle auf. Deutlich höher liegen die Zahlen bei den Tumorpatienten. Rektumkarzinompatienten wiesen im Vergleich zu der Kontrollgruppe 0,50 Foci pro Zelle (p=0,055) und Mammakarzinompatientinnen 0,71 Foci pro Zelle (p=0,042) auf. 32

33 8 7 6 Anzahl der Foci ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Gruppen Abb.10: Auswertung der Färbung mit H2AX, Versuchsbedingung: Bestrahlung mit 0,5Gy, Reparaturzeit 30min, Gruppe 1= Kontrollpersonen, 1,3= Mittelwert der Kontrollpersonen, Gruppe 2= Rektumkarzinompatienten, 2,3= Mittelwert der Rektumkarzinom- patienten, Gruppe 3= Mammakarzinompatientinnen, 3,3= Mittelwert der Mammakarzinompatientinnen. Eine weitere Probe der gleichen Personengruppen wurde mit 0,5Gy bestrahlt und bekam eine halbe Stunde Reparaturzeit. Auch hier liegt der gemittelte Wert der Kontrollpersonen mit 3,72 Foci pro Zelle wieder unter den Werten der Tumorpatienten. Rektumkarzinompatienten zeigen 4,59 (p=0,023) und Mammakarzinompatientinnen 4,69 Foci pro Zelle auf (p=0,012). Es ist ein Anstieg der Foci pro Zelle gegenüber den Kontrollen (Abb.9) festzustellen. (Mittelwert der Kontrollbedingung: 0,51 Foci pro Zelle; Mittelwert der Bedingung 0,5Gy 30min: 4,33 Foci pro Zelle). 33

34 6 5 Anzahl der Foci ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Gruppen Abb.11: Auswertung der Färbung mit H2AX, Versuchsbedingung: Bestrahlung mit 2Gy, Reparaturzeit 24h, Gruppe 1= Kontrollpersonen, 1,3= Mittelwert der Kontrollpersonen, Gruppe 2= Rektumkarzinompatienten, 2,3= Mittelwert der Rektumkarzinom- patienten, Gruppe 3= Mammakarzinompatientinnen, 3,3= Mittelwert der Mammakarzinompatientinnen. Bei einer weiteren Behandlung wurden die Lymphozyten einer 2Gy ionisierenden Strahlung ausgesetzt. Sie erhielten 24 Stunden Reparaturzeit. Für die Kontrollpersonen ist wieder ein geringerer Wert (2,23 Foci pro Zelle) ermittelt worden im Vergleich zu den Tumorpatienten (Rektumkarzinompatienten 2,57 Foci pro Zelle (p=0,316); Mammakarzinompatientinnen 3,28 Foci pro Zelle (p=0,015)). Im Vergleich zur vorherigen Versuchsbedingung (Abb. 10) ist die Anzahl der Foci pro Zelle gesunken (Mittelwert der Bedingung 0,5Gy 30min: 4,33 Foci pro Zelle; Mittelwert der Bedingung 2Gy 24h: 2,69 Foci pro Zelle) (p=0,041 im Vergleich Rektum- zu Mammakarzinompatientinnen). 34

35 2 Anzahl der Foci ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Gruppen Abb.12: Auswertung der Färbung mit H2AX, Versuchsbedingung: Patienten nach 1 Woche Therapie, Bestrahlung mit 5x1,8Gy, 3 Tage Reparaturzeit, Gruppe 2= Rektumkarzinompatienten, 2,3= Mittelwert der Rektumkarzinom- patienten, Gruppe 3= Mammakarzinompatientinnen, 3,3= Mittelwert der Mammakarzinompatientinnen. Die letzte Versuchsbedingung beschreibt die Anzahl der Foci bei Patienten nach einer Woche Bestrahlung. Die Lymphozyten bekamen keine weitere Fremdbehandlung. Eine Kontrollgruppe fehlt. Bei dieser Probandengruppe handelt es sich um nicht therapiebedürftige Personen. Die Anzahl der Foci pro Zelle bei Rektumkarzinompatienten beträgt im Mittel 0,77. Bei Mammakarzinompatientinnen liegt sie bei 0,63. Der Mittelwert beider Gruppen liegt mit 0,7 Foci pro Zelle höher als der Wert vor Therapie von allen nicht behandelten Lymphozyten (0,51 Foci pro Zelle), aber unterhalb der Werte, der in den Versuchen bestrahlten Zellen (Abb.10, Abb.11). Eine Reparaturleistung der Zellen scheint vorhanden zu sein (p=0,359). 35

36 2 Anzahl der Foci ,5 1 1,5 2 2,5 Gruppen Abb.13: Auswertung der Färbung mit H2AX, Versuchsbedingung: Rektumkarzinompatienten, Vergleich der Ergebnisse von vor Therapie (keine Bestrahlung) und nach 1 Woche Therapie (Bestrahlung mit 5x1,8Gy, 3 Tage Reparaturzeit), Gruppe 1= Rektumkarzinompatienten vor Therapie (Kontrollbedingung), 1,3= Mittelwert Rektumkarzinompatienten vor Therapie, Gruppe 2= Rektumkarzinompatienten nach 1 Woche Therapie, 2,3= Mittelwert Rektumkarzinompatienten nach 1 Woche Therapie. Einzeln betrachtet erhält man für die Rektumkarzinompatienten vor der Therapie einen Mittelwert von 0,5 Foci pro Zelle und nach der Therapie einen höheren Wert von 0,77 Foci pro Zelle. 36

37 3 Anzahl der Foci ,5 1 1,5 2 2,5 Gruppen Abb.14: Auswertung der Färbung mit H2AX, Versuchsbedingung: Mammakarzinompatientinnen, Vergleich der Ergebnisse von vor Therapie (keine Bestrahlung) und nach 1 Woche Therapie (Bestrahlung mit 5x1,8Gy, 3 Tage Reparaturzeit), Gruppe 1= Mammakarzinompatientinnen vor Therapie (Kontrollbedingung), 1,3= Mittelwert Mammakarzinompatientinnen vor Therapie, Gruppe 2= Mammakarzinompatientinnen nach 1 Woche Therapie, 2,3= Mittelwert Mammakarzinompatientinnen nach 1 Woche Therapie. Bei den Mammakarzinompatientinnen konnte vor der Therapie ein gemittelter Wert von 0,71 Foci pro Zelle und nach der Therapie ein geringerer Wert von 0,63 Foci pro Zelle ermittelt werden. 37

38 5.3 Ergebnisse der ATM/PML-Färbung Abb.15: Zellen, die zum Vergleich keinen Strahlendosen ausgesetzt wurden. Angefärbte Zellkerne mit Dapi (linkes Bild), DNA-Doppelstrangbrüche mit ATM (mittleres Bild) und PML (rechtes Bild). Abb.16: Zellen, die mit einer Dosis von 0,5Gy ionisierender Strahlung behandelt wurden und eine anschließende Reparaturzeit von 30min bekamen. Angefärbte Zellkerne mit Dapi (linkes Bild), DNA-Doppelstrangbrüche mit ATM (mittleres Bild) und PML (rechtes Bild). Abb.17: Zellen, die mit einer Dosis von 2Gy ionisierender Strahlung behandelt wurden und eine anschließende Reparaturzeit von 24h bekamen. Angefärbte Zellkerne mit Dapi (linkes Bild), DNA-Doppelstrangbrüche mit ATM (mittleres Bild) und PML (rechtes Bild). 38

39 Abb.18: Zellen nach 1 Woche Therapie mit 5x1,8Gy Bestrahlung und drei Tagen in vivo Reparatur. Angefärbte Zellkerne mit Dapi (linkes Bild), DNA- Doppelstrangbrüche mit ATM (mittleres Bild) und PML (rechtes Bild). Es wurde neben der Färbung mit H2AX eine Doppelfärbung mit ATM/PML durchgeführt. Die Versuchsbedingungen waren entsprechend denen mit H2AX (Abb.5-8). Unter der Kontrollbedingung können bei der Färbung mit PML mehr Foci pro Zelle beobachtet werden wie bei ATM (Abb.15). Bei der Färbung mit H2AX wurden keine Foci in den Zellen beobachtet (Abb.5). Die Lymphozyten wurden weiter mit 0,5Gy bestrahlt und erhielten eine Reparaturzeit von 30min. Focis sind in allen Färbungen vorhanden (Abb.16). Auch bei einer Bestrahlung mit 2Gy und einer Reparaturzeit von 24h sind Focis in der ATM- und PML- Färbung zu sehen (Abb.17). Außerdem wurden die Färbungen nach einer Woche Therapie betrachtet. Bei der Behandlung mit ATM sind vereinzelte Focis vorhanden. PML weist einen deutlich höheren Anteil an Focis auf (Abb.18). Die gesammelten Werte aus den Mikroskopaufnahmen werden im Folgenden mit Hilfe von Punktdiagrammen dargestellt. 39

40 4 3 Anzahl der Foci ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Gruppen Abb.19: Auswertung der Färbung mit ATM, Versuchsbedingung: Kontrolle, Gruppe 1= Kontrollpersonen, 1,3= Mittelwert der Kontrollpersonen, Gruppe 2= Rektumkarzinompatienten, 2,3= Mittelwert der Rektumkarzinom- patienten, Gruppe 3= Mammakarzinompatientinnen, 3,3= Mittelwert der Mammakarzinompatientinnen. Die Auswertung der ATM-Färbung zeigt, dass ebenso wie bei der H2AX-Färbung (Abb.9), die Anzahl der Foci pro Zelle bei den Kontrollpersonen (0,69 Foci pro Zelle) niedriger ist als bei den Tumorpatienten (Rektumkarzinompatienten 1,17 Foci pro Zelle, p=0,047; Mammakarzinompatientinnen 1,32 Foci pro Zelle, p=0,041). 40

41 5 4 Anzahl der Foci ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Gruppen Abb.20: Auswertung der Färbung mit PML, Versuchsbedingung: Kontrolle, Gruppe 1= Kontrollpersonen, 1,3= Mittelwert der Kontrollpersonen, Gruppe 2= Rektumkarzinompatienten, 2,3= Mittelwert der Rektumkarzinom- patienten, Gruppe 3= Mammakarzinompatientinnen, 3,3= Mittelwert der Mammakarzinompatientinnen. Im Vergleich dazu die Färbung mit PML. Die Anzahl der Foci pro Zelle liegt hier wesentlich höher. Die Kontrollpersonen weisen 2,74, die Rektumkarzinompatienten 2,69 und die Mammakarzinompatientinnen 2,91 Foci pro Zelle auf. Es ist kein wesentlicher Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der Tumorgruppe festzustellen (Mittelwert bei ATM 1,06 Foci pro Zelle; Mittelwert bei PML 2,78 Foci pro Zelle). 41

42 6 5 Anzahl der Foci ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Gruppen Abb.21: Auswertung der Färbung mit ATM, Versuchsbedingung: Bestrahlung mit 0,5Gy, 30min Reparaturzeit, Gruppe 1= Kontrollpersonen, 1,3= Mittelwert der Kontrollpersonen, Gruppe 2= Rektumkarzinompatienten, 2,3= Mittelwert der Rektumkarzinom- patienten, Gruppe 3= Mammakarzinompatientinnen, 3,3= Mittelwert der Mammakarzinompatientinnen. In der nächsten Bedingung wurden die Lymphozyten mit 0,5Gy bestrahlt und bekamen 30 Minuten Zeit zur Reparatur. Bei den Kontrollpersonen liegt der Wert der Foci pro Zelle mit 1,74 wieder unter den Werten von Rektumkarzinompatienten (2,64 Foci pro Zelle, p=0,025) und Mammakarzinompatientinnen (2,82 Foci pro Zelle, p=0,008). Ähnlich dem Verlauf bei H2AX (Abb.10) sind mehr Foci vorhanden wie unter der Kontrollbedingung in Abb.19 (Mittelwert der Kontrollbedingung ATM: 1,06 Foci pro Zelle; Mittelwert der Bedingung ATM 0,5Gy 30min: 2,4 Foci pro Zelle). 42

43 5 4 Anzahl der Foci ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Gruppen Abb.22: Auswertung der Färbung mit PML, Versuchsbedingung: Bestrahlung mit 0,5Gy, 30min Reparaturzeit, Gruppe 1= Kontrollpersonen, 1,3= Mittelwert der Kontrollpersonen, Gruppe 2= Rektumkarzinompatienten, 2,3= Mittelwert der Rektumkarzinom- patienten, Gruppe 3= Mammakarzinompatientinnen, 3,3= Mittelwert der Mammakarzinompatientinnen. Bei der Färbung der gleichen Zellen mit PML sind keine Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen festzustellen. Die Kontrollgruppe weist 2,62, die Rektumkarzinompatienten 2,85 und die Mammakarzinompatientinnen 2,82 Foci pro Zelle auf. Ein Anstieg der Foci pro Zelle im Vergleich zur Kontrollbedingung (Abb.20) innerhalb der PML- Färbung ist nicht vorhanden. 43

44 5 4 Anzahl der Foci ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Gruppen Abb.23: Auswertung der Färbung mit ATM, Versuchsbedingung: Bestrahlung mit 2Gy, Reparaturzeit 24h, Gruppe 1= Kontrollpersonen, 1,3= Mittelwert der Kontrollpersonen, Gruppe 2= Rektumkarzinompatienten, 2,3= Mittelwert der Rektumkarzinom- patienten, Gruppe 3= Mammakarzinompatientinnen, 3,3= Mittelwert der Mammakarzinompatientinnen. Unter der nächsten Bedingung wurden die Lymphozyten mit 2Gy bestrahlt und erhielten 24 Stunden Zeit zur Reparatur. Die Kontrollgruppe hat weniger Foci pro Zelle (2,01) wie die Gruppen der Rektumkarzinompatienten (2,67) und die der Mammakarzinom- patientinnen (2,59). Anders als bei der Auswertung der H2AX-Färbung (Abb.11) ist keine Abnahme der Foci pro Zelle gegenüber der Bedingung 0,5Gy 30min (Abb.21) festzustellen (Mittelwert der Bedingung ATM 0,5Gy 30min: 2,4 Foci pro Zelle; Mittelwert der Bedingung ATM 2Gy 24h: 2,42 Foci pro Zelle). 44