3.14. Mikroskop (Durchführung für den Studiengang Biological Sciences)

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1 3.14 Mikroskop (Durchführung für den Studiengang Biological Sciences) Mikroskop (Durchführung für den Studiengang Biological Sciences) Ziel Das Experiment soll Verständnis vermitteln für den Zusammenhang zwischen Beugungsvorgängen und dem Auflösungsvermögen eines Mikroskops. Außerdem wird die Funktionsweise des insbesondere in der Biologie sehr wichtigen Phasenkontrastverfahrens untersucht. Hinweise zur Vorbereitung Die Antworten auf diese Fragen sollten Sie vor der Versuchdurchführung wissen. Sie sind die Grundlage für das Gespräch mit Ihrer Tutorin/Ihrem Tutor vor dem Versuch. Informationen zu diesen Themen erhalten Sie in der unten angegebenen Literatur. Machen Sie sich vor dem Versuch mit der Beugung am Gitter vetraut. Wie ist ein Mikroskop aufgebaut? Was ist das köhlersches Beleuchtungsprinzip? WasbestimmtdieVergrößerung des Mikroskops? Was ist eine numerische Apertur? WasbestimmtdasAuflösungsvermögen? Was bewirkt ein Immersionsobjektiv? Was ist das Phasenkontrastverfahren? Zubehör Stereo-Mikroskop-Korpus mit Durchlicht-Beleuchtungseinheit Phasenkontrastobjektive 10 und 40 mit eingebautem ringförmigem λ/4-plättchen ( Phasenplättchen ) Okular 10 Fernrohr für den Okulartubus zur Beobachtung des Beugungsbildes Lochblende und Streuscheibe zum Auflegen auf die Lichtquelle Blenden zum Einschieben in den Strahlengang zwischen Objektiv und Okular/Fernrohr

2 Versuche zur Optik Digitalkamera Nikon Coolpix 990 bzw. 995 mit Adapter für Fototubus zur Dokumentation der Ergebnisse Farbfilter (Grün- bzw. Rotfilter) Objektträger mit verschiedenen Amplituden- und Phasenobjekten. Diese Objekte wurden durch Elektronenbestrahlung eines PMMA-Films im Rasterelektronenmikroskop hergestellt (Elektronenstrahllithographie). Wasserbecken und Diffraktionsfolie (Prägegitter mit Gitterkonstante g =1μm aus Kunststofffolie) als Modell für ein Immersionsobjektiv Laserdiode (λ = 650 nm, Laserklasse 2, Ausgangsleistung P Diode < 1 mw) zur Beleuchtung des Modells Grundlagen Das Mikroskop Ein Mikroskop ist im wörtlichen Sinne ein Gerät zum Sehen kleiner Gegenstände. Zu diesem Zweck muss es den Sehwinkel vergrößern, den diese Gegenstände auf der Netzhaut überdecken. Es gibt dafür prinzipiell verschiedene Möglichkeiten. Die einfachste davon kommt ganz ohne Apparate aus und besteht darin, näher an den Gegenstand heranzugehen. Dieser Vorgehensweise ist durch die begrenzte Brechkraft des Auges eine natürliche Grenze gesetzt, die typischerweise bei 25 cm liegt. 1 Die nächste Möglichkeit besteht in der Verwendung einer Lupe, also einer Konvexlinse (Sammellinse), die die Augenlinse unterstützt. Möchte man noch höhere Vergrößerungen erzielen, so setzt man zwei Vergrößerungsstufen hintereinander. Seit Anfang des 17. Jahrhunderts und auch noch in den heute üblichen Mikroskopen wird dazu zunächst mit Hilfe einer kurzbrennweitigen Konvexlinse oder -linsenkombination (Objektiv) ein stark vergrößertes reelles Bild des Gegenstandes erzeugt und dieses dann durch eine weitere Konvexlinse oder -linsenkombination (Okular) betrachtet, die als Lupe wirkt. Das prinzipielle Problem Beim Blick durch ein Mikroskop gehen wir normalerweise davon aus, dass das was wir sehen auch die Wirklichkeit zeigt, also den Gegenstand selbst so wie er ist. Überlegt man etwas genauer, so stellt man allerdings schnell fest, dass das zur Beobachtung eingesetzte Mikroskop einen erheblichen Einfluss auf das sichtbare Bild hat. 1 Eine interessante Möglichkeit, diese Grenze zu umgehen, besteht darin, eine sehr kleine Lochblende direkt vor das Auge zu halten. Man kann sich eine solche Lochblende selbst herstellen, indem man mit einer Nadel ein kleines Loch in eine Aluminiumfolie sticht. Am besten legt man die Folie dazu auf eine harte Unterlage, damit nur die Nadelspitze das Loch macht. Man kann dann wesentlich näher an einen Gegenstand herangehen, ohne dass er unscharf erscheint. Allerdings wird das Bild sehr lichtschwach.

3 3.14 Mikroskop (Durchführung für den Studiengang Biological Sciences) 403 Man unterscheidet im Mikroskop zwischen dem primären Bild, das im Inneren des Mikroskops vom Objektiv erzeugt wird und dem sekundären Bild, das vom Okular wiederum aus dem primären Bild erzeugt wird und das wir betrachten. Beim primären Bild handelt es sich um ein Beugungsbild. Verschiedene Objekte können dasselbe sekundäre Bild liefern, wenn die Verschiedenheit des von ihnen erzeugten primären Bildes im Mikroskop künstlich beseitigt wird. Umgekehrt können gleiche Objekte verschiedene sekundäre Bilder liefern, wenn ihr primäres Bild im Mikroskop auf irgendeine Weise ungleich gemacht wird. Wir sehen sozusagen nur das, was das Mikroskop aus dem Objekt macht! Wenn man ein Mikroskop benutzt, sollte man sich dieser Tatsache stets bewusst sein. Das Auflösungsvermögen U eines Mikroskops ist definiert als Kehrwert U = 1/s des geringsten auflösbaren Abstandes s zweier Punkte. 2 Dieses Auflösungsvermögen hat mit der Vergrößerung des Mikroskops nicht direkt etwas zu tun. Man kann relativ einfach ein Mikroskop mit einer sehr hohen Vergrößerung bauen. Die Vergrößerung gibt nur an, um welchen Faktor der Sehwinkel eines Objektes auf der Nezhaut vergrößert wird, wenn man ihn nicht ohne optische Hilfsmittel im Normsehabstand 25 cm, sondern durch das Mikroskop berachtet. Dabei zeigt das Bild aber trotzdem nicht unbedingt viele Details, sofern man nicht auch das Auflösungsvermögen verbessert. Man spricht von einer sog. leeren Vergrößerung. 3 Theoretisches Auflösungsvermögen Überlegungen zum Auflösungsvermögen eines Mikroskops wurden sowohl durch von Helmholtz (selbst leuchtendes Objekt, [GGG78] S. 368), als auch durch Abbe 4 (nicht selbst leuchtendes Objekt, [GGG78] S. 403) angestellt. Als geringsten gerade noch auflösbaren Abstand zweier Punkte erhielten diese s Helmholtz = 1.22 k s Abbe = λ A λ A bzw. (3.14.1) (3.14.2) 2 Der kleinste auflösbare Abstand s wird oft auch als Auflösungsgrenze bezeichnet. 3 Das Phänomen ist ähnlich, als würde man mit einem normalen Fotoapparat ein Luftbild von einem Fußballstadion machen und sich dann das Negativ als überdimensionales Poster abziehen, um die Grashalme auf dem Rasen zu zählen. Bei diesem Beispiel hat man gleich den Eindruck, dass das wohl nicht gehen kann. Man wird eine im Wesentlichen homogene grüne Fläche erhalten, die keine Anhaltspunkte über feinere Strukturen des Rasens enthält. In gleicher Weise wird ein schlechtes Mikroskop nur eine homogene Fläche mit einem mittleren Farbwert zeigen, wo ein besseres Mikroskop durchaus noch feinere Strukturen erkennen lässt. 4 Ernst Karl Abbe ["abe] (vgl. auch Anhang K.1 auf Seite 789). Hinweis: Abbe war Deutscher, die Schreibweise ist daher nicht Abbé, das wäre nämlich der französische Titel der Weltgeistlichen (die Aussprache dieses Titels ist [ab"e], er entspricht dem deutschen Titel Abt ). Es gibt allerdings auch einen deutschen Fußballspieler namens Ernst Abbé.

4 Versuche zur Optik mit λ = Wellenlänge im Vakuum, A = numerische Apertur 5 = n sin α, n = Brechungsindex des Mediums zwischen Objekt und Objektiv, α =halberöffnungswinkel des Objektivs, d. h. halber Winkel, unter dem das Objektiv vom Objekt aus erscheint, k = empirischer physiologischer Faktor 1. Die Ergebnisse nach Abbe und von Helmholtz unterscheiden sich lediglich um einen konstanten Faktor der Größenordnung eins. Sie lassen sich jeweils auch auf den Fall inkohärent bzw. kohärent leuchtender Objekte verallgemeinern, so dass vom Standpunkt der modernen Optik kein prinzipieller Unterschied zwischen ihnen besteht. Immersionsobjektive Ein sog. Immersionsobjektiv ( lat. immergere = eintauchen) nutzt die Verringerung der Wellenlänge in einem Medium mit verringerter Lichtgeschwindigkeit, also mit einem Brechungsindex n>1. Zu diesem Zweck wird der Zwischenraum zwischen Objekt und Objektiv mit einer sog. Immersionsflüssigkeit gefüllt. Die Immersionsflüssigkeit darf natürlich weder das Objekt noch das Objektiv beschädigen und muss außerdem möglichst transparent sein. Häufig wird Zedernöl verwendet. Das Licht hat darin eine kleinere Wellenlänge und alle Beugungswinkel bei der Beugung an den Strukturen eines Objektes werden daher auch kleiner. Dies führt dazu, dass auch noch Beugungsordnungen von kleineren Strukturen ins Objektiv gelangen und zur Bildentstehung beitragen können. Ein weiterer positiver Effekt ist, dass weniger Licht durch Reflexion an den Oberflächen verloren geht, da die Brechungszahlunterschiede geringer sind. Phasenkontrastverfahren Das Phasenkontrastverfahren wurde im Jahre 1932 von F. Zernike erfunden. Es bietet insbesondere im Bereich der Biologie einen enormen Vorteil gegenüber der bis dahin ausschließlich üblichen Methode des Anfärbens der Präparate, denn es greift nicht in die Chemie des untersuchten Objektes ein. Eine sehr ausführliche Beschreibung der Funkionsweise des Verfahrens findet sich in [GGG78]. Versuchsdurchführung 1. Formatieren Sie unbedingt die Speicherkarte der Digitalkamera in der Kamera. 6 5 lat. apertus =geöffnet, offen, lat. aperire = öffnen 6 So stellen Sie sicher, dass die Karte keine alten Bilder enthält,

5 3.14 Mikroskop (Durchführung für den Studiengang Biological Sciences) Machen Sie sich zunächst mit der Bedienung des Mikroskops, den beiden in den Tubus einschiebbaren Linsensystemen (Okular und Fernrohr) sowie der Digitalkamera vertraut. Sie dürfen dabei frei experimentieren, die folgende Liste soll nur als Vorschlag und Hilfestellung dienen: Verwenden Sie als zu beobachtendes Objekt das Punktgitter. Beobachten Sie durch das Okular (im rechten Okulartubus), wählen Sie eine angenehme Beleuchtungsstärke und stellen Sie das Objekt scharf, indem Sie den Objekttisch nach oben und unten verschieben. Beobachten Sie nun durch das Fernrohr (im linken Okulartubus). Verändern Sie die Position des Objekttisches nicht, sondern stellen Sie scharf, indem Sie die Verstellmöglichkeiten am Fernrohr (obere Linse) ausnutzen. Sie sehen dann die verschiedenen durch Beugung am Objekt erzeugten Bilder der Lichtquelle (also der Spalt- oder Lochblende über der Lampe). Fotografieren Sie mit Hilfe der Digitalkamera Bild und Beugungsbild des des 90 -Punktgitters. 3. Untersuchen Sie den Zusammenhang zwischen Beugungsordnungen und Bildqualität: a) Blenden Sie die höheren Beugungsordungen aus dem primären Bild aus, indem Sie i. eine Spaltblende ii. eine Lochblende unmittelbar oberhalb des Objektivs in den Strahlengang einschieben. b) Beobachten Sie zunächst durch das Fernrohr, welche Beugungsordnungen dadurch wegfallen und c) betrachten Sie dann durch das Okular die Veränderung im sekundären Bild. d) Führen Sie Ihrer Betreuerin/Ihrem Betreuer die Ergebnisse vor und dokumentieren Sie das Gesehene mit Hilfe der Digitalkamera. 4. Abbildung eines Phasenobjektes: Hinweise: Entfernen Sie die zuletzt verwendeten Blenden aus dem Mikroskop! Bei diesem Versuchsteil ist die Hilfe der Betreuerin/des Betreuers üblicherweise besonders wichtig. 5. Modell eines Immersionsobjektivs: genügend Platz für Ihre Bilder frei ist, und die Bilder anschließend auch auf den PC übertragen werden können. Ein Formatieren der Karte auf dem PC ist nicht geeignet. Die Bilder können dann u. U. nicht mehr gelesen werden!

6 Versuche zur Optik a) Füllen Sie das Wasserbecken etwa halb mit Wasser. b) Hängen Sie das Prägegitter aus Kunststoff am Rand ein, so dass es ins Wasser hängt. c) Leuchten Sie mit der Laserdiode einmal oberhalb und einmal unterhalb der Wasserlinie durch das Gitter und betrachten Sie am hinteren Ende des Beckens 7 die gebeugten Strahlen. Achten Sie darauf, welchen Einfluss das Wasser hat. d) Machen Sie sich an diesem Modell klar, wodurch der Öffnungswinkel eines Objektivs gegeben ist. Auswertung 1. Beschreiben und erklären Sie ausführlich die aufgenommenen Bilder. Fragen und Aufgaben 1. Skizzieren Sie Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang bei Beleuchtung nach Köhler. Erklären Sie die Vorzüge dieses Beleuchtungsprinzips. 2. Erläutern Sie, warum der kleinste noch auflösbare Abstand zwischen zwei Punkten λ tatsächlich n und nicht λ ist. sin α sin α Wie nennt man das Produkt n sin α üblicherweise? 3. Erklären Sie das Phasenkontrastverfahren. 4. Warum verschiebt man beim Phasenkontrastverfahren ausgerechnet die Phase der nullten Beugungsordnung? 5. Warum benutzt man beim Phasenkontrastmikroskop normalerweise eine ringförmige Lichtquelle und einen Phasenring? Warumistringförmig in diesem Fall besser als punktförmig? Ergänzende Informationen Historisches Der eigentliche Erfinder des Mikroskops ist nicht bekannt. Linsen wurden schon um 500 v. Chr. von Römern und Griechen verwendet, allerdings wohl eher als Brenngläser. Die Verwendung von Lesesteinen wird um 1000 n. Chr. schriftlich erwähnt. Um 1600 entwickelte eine ganze Reihe von Wissenschaftlern unterschiedliche Aufbauten, die immer weiter verbessert wurden. 7 Beobachtung entweder im Wasser kurz vor der Plexiglaswand, was natürlich einen wasserfesten Schirm voraussetzt, oder ganz einfach mit einem Blatt Papier direkt hinter der Wand außerhalb des Beckens.

7 3.14 Mikroskop (Durchführung für den Studiengang Biological Sciences) 407 Dunkelfeldmikroskopie Das bloße Vorhandensein sehr kleiner Teilchen (z. B. Bakterien oder Kolloide) läßt sich mit Hilfe der sogenannten Dunkelfeld- oder Ultramikroskopie nachweisen. 8 Die Methode wurde erstmals 1903 von H. Siedentopf und R. Zsigmondy angegeben. Dabei werden die Teilchen von der Seite her mit sehr intensivem Licht bestrahlt. Beobachtet wird das Streulicht, das in das Objektiv gelangt. Die Größe der beobachteten Lichtscheibchen vor dunklem Hintergrund ( Dunkelfeld ) entspricht dabei allerdings nicht der Größe der Teilchen, sondern ist durch Beugungseffekte im Mikroskop bestimmt. Raumfilter Eine Anwendung eines Mikroskops mit extrem schlechter Auflösung ist der so genannte Raumfilter 9, der in der Optik oft verwendet wird, um völlig strukturlose parallele Strahlen zu erzeugen. Er besteht aus einer Sammellinse, die Licht beliebiger Herkunft auf eine sehr kleine Lochblende (Durchmesser ca. 5 μm) fokussiert. Hinter der Lochblende breitet sich eine fast ideale Kugelwelle aus. Diese wird durch eine weitere Sammellinse in einen Parallelstrahl verwandelt. Literaturhinweise Eine sehr empfehlenswerte und gut verständliche Erklärung des Mikroskops finden Sie im Internet unter [Lin02]. Viele historische Informationen bietet das Mikroskop-Museum im Internet: [Kah]. Natürlich findet man auch in einschlägigen Lehrbüchern Kapitel zur Mikroskopie, so z. B. in [GGG78]. Historische Veröffentlichung von August Köhler zum nach ihm benannten Beleuchtungsprinzip: [Köh93]. Literaturverzeichnis [GGG78] Gobrecht, Heinrich, Jens H. Gobrecht und Klaus H. Gobrecht (Herausgeber): Bergmann-Schaefer Lehrbuch der Experimentalphysik, Band III: Optik. Walter de Gruyter, Berlin, 7. Auflage, [Kah] Kahl, Hauke: Mikroskop-Museum im Internet. mikroskop-museum.de. [Köh93] Köhler, August: Ein neues Beleuchtungsverfahren für mikrophotographische Zwecke. Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie und für mikroskopische Technik, 10(4): , [Lin02] Linkenheld, Christian: Web-Site mikroskopie.de, mikroskopie.de. 8 Im Praktikum nutzen wir dieses Verfahren beim Millikan-Versuch (siehe Abschnitt 4.2 auf Seite 437). 9 Man findet auch den Ausdruck Raumfrequenzfilter.